搔癢症治療藥的製作方法

2023-10-07 23:46:54

專利名稱：搔癢症治療藥的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療或預防搔癢症的藥物。
背景技術：
作為參與各種細胞的增殖分化或分化成熟的細胞的功能激活的體液因素，已知存 在多種細胞因子。在機體內，接受了細胞因子刺激的細胞產生其他細胞因子，由多個細胞因 子形成網絡。機體的恆定性通過該網絡的相互調節而保持微妙的平衡。認為多種免疫炎症 性疾病是由這些細胞因子、網絡的破綻產生的，利用單克隆抗體進行的抗細胞因子療法受 到關注。例如，抗TNF抗體及抗IL-6受體抗體在臨床上顯示出高的療效。但另一方面，在 實際病情中是補償途徑在起作用，僅憑阻斷IL-4等一個細胞因子，無法取得治療效果，失 敗的例子頗多。本發明人等成功地分離了與IL-6的信號傳遞受體gpl30的同源性高的新型細 胞因子受體NRlO (專利文獻1)。NRlO與制癌蛋白M受體(OSMR)形成異源二聚體，發揮 IL-31受體的功能(非專利文獻1)。NRlO還以glm-r (非專利文獻2)、GPL (非專利文獻3)、 IL-31RA(非專利文獻4)等名稱而已知。有報導稱過剩表達IL-31的轉基因小鼠自然發 生搔癢性皮炎(非專利文獻4)。但還不能斷定小鼠體內細胞因子的強制表達、或病態小鼠的血中細胞因子濃度高 實際上就是致病原因。還完全不明確利用抗體阻斷信號時是否會取得治療效果。例如，使 IL-18在角質形成細胞中過剩表達的轉基因小鼠出現搔癢性皮炎。此外，在特應性皮炎自然 發病模型NC/Nga小鼠中，血中IL-18濃度隨著病情的進展而升高。由此推測IL_18的過剩 表達是致病原因。但實際上尚未確認到給予中和抗體所產生的治療效果(非專利文獻5)。如上所述，在細胞因子的表達上升的疾病中，即使抑制其細胞因子的功能，也未必 能夠取得治療效果，難以根據細胞因子的表達量來推測實際中會取得治療效果的疾病。因 此，重要的在於發現通過抑制作為靶的細胞因子的信號傳遞而在實際中取得治療效果的 疾病。需要說明的是，本發明的在先技術文獻如下所示。專利文獻1 :W000/75314非專 利文獻 1 :IL_31i s associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.， JAllergy Clin Immunol. 2006 Feb ； 117 (2) :418_25·非專利文獻 2 :A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes, signals proliferation, and activates STAT—3 and STAT—5. JBiol Chem 277，16831-6，2002.非專利文獻3:GPL,a novel cytokine receptor related to GP130 andleukemia inhibitory factor receptor. J Biol Chem 278，49850-9，2003.__專禾Ij文獻 4 :Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells,induces dermatitis in mice. Nat Immunol 5,752-60,2004.__專禾Ij文獻 5 !Administration of anti-interleukin 18 antibodyfails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model miceNC/Nga., British Journal of Dermatology 149:39-45,2003.

發明內容
發明所要解決的課題本發明鑑於上述背景而設，其課題在於提供用於治療或預防搔癢症的藥物。解決課題的方法本發明人等為了解決上述課題進行了深入研究。本發明人等發現抗NRlO中和抗 體等的NRlO拮抗劑作為搔癢症的治療藥或預防藥有效，從而完成了本發明。本發明涉及用於治療或預防搔癢症的藥物，更具體而言，本發明提供以下[1] [6][1]搔癢症的預防或治療藥，其中含有NRlO拮抗劑作為有效成分。[2] [1]所述的預防或治療藥，其中NRlO拮抗劑為對NRlO具有中和活性的抗體。[3] [2]所述的預防或治療藥，其中抗體為單克隆抗體。[4] [3]所述的預防或治療藥，其中抗體為對人NRlO具有中和活性的單克隆抗體。[5] [2] [4]中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為重組抗體。[6] [2] [5]中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為嵌合抗體、人源化抗體 或人抗體。


圖1是評價IL-31誘發的搔癢行為的曲線圖。平均值士標準偏差。圖2是評價蟎抗原誘發的搔癢行為的圖。平均值士標準偏差。圖3是顯示DSS大腸炎模型小鼠的體重變化率的推移的曲線圖。圖4是顯示急性苦基氯(picryl chloride)接觸性皮炎模型的耳廓厚度變化的推 移的圖。圖5是顯示以搔癢次數為指標的、抗NRlO抗體H0L0對搔癢症的抑制效果的圖。
具體實施例方式NRlO是與制癌蛋白M受體(OSMR)形成異源二聚體、發揮IL-31的受體作用的蛋 白。其還以 glm-r(J Biol Chem 277，16831-6，2002)、GPL (J Biol Chem 278,49850-9, 2003)、IL3IRA(Nat Immunol 5，752-60，2004)等名稱而已知，本發明的NRlO還包括以這些 名稱命名的蛋白。本發明的NRlO也包括來自人、小鼠和其他哺乳動物的NR10，對其沒有特別限定， 優選的NRlO的例子有來自人或小鼠的NR10。作為來自人的NR10，已知有多個剪接變體 (W000/075314)。上述剪接變體中，NR10. 1的特徵在於包括662個胺基酸，具有跨膜區。 而NR10. 2是包括252個胺基酸序列的、不具有跨膜區的可溶性受體樣蛋白。另一方面，作 為發揮跨膜型受體蛋白作用的NRlO剪接變體，已知有NR10. 3和IL31RAv3。本發明中的人NRlO只要與制癌蛋白M受體(OSMR)形成異源二聚體、且發揮IL-31受體作用即可，沒有 特別限定，優選的 NRlO 例如有 NR10. 3 (也稱作 ILRAv4 (Nat Immunol 5，752-60，2004))和 IL31RAv3。NR10. 3(IL31RAv4)包括 662 個胺基酸(W000/075314，Nat Immunol 5，752-60， 2004)，IL31RAv3 包括 732 個胺基酸(GenBank 檢索號NM_139017)。IL_31RAv4 的胺基酸序 列見SEQ ID NO :6，IL-31RAv3的胺基酸序列見SEQ ID NO :7。另一方面，來自小鼠的NRlO 的例子有包含SEQ ID NO 5記載的胺基酸序列的蛋白。本發明中，NRlO拮抗劑是指，通過與NRlO結合，阻斷基於NRlO活化的細胞內信號 傳遞，從而使細胞的生理活性喪失或抑制的物質。其中，作為生理活性，例如有生理活性物 質(例如趨化因子、炎症性細胞因子等)的產生誘導活性、產生抑制活性、分泌促進活性、分 泌抑制活性、增殖活性、增殖誘導活性、生存活性、分化活性、分化誘導活性、轉錄活性、膜輸 送活性、結合活性、蛋白分解活性、磷酸化/脫磷酸化活性、氧化還原活性、轉移活性、核酸 分解活性、脫水活性、細胞死亡誘導活性、凋亡誘導活性等，但並不限於這些。判定是否具有拮抗劑活性，可以通過本領域技術人員所公知的方法來進行。例如， 在配體存在下，使被檢化合物與在細胞表面上表達的NRlO接觸，判定是否產生作為NRlO的 活化指標的細胞內信號傳遞。上述判定例如可以按照文獻「Dillon SR等人，Interleukin 31, acytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004J ul ；5(7) :752_60. 」中記載的方法來進行。認為抑制對配體刺激作出響應 的細胞內信號傳遞的化合物是NRlO拮抗劑。本發明中的拮抗劑可以是天然化合物，也可以是人工化合物。作為本發明中的拮 抗劑，可以使用公知物質。還可以使用通過上述方法判定為具有拮抗劑活性的新型化合物。本發明中的NRlO拮抗劑的一個方式為與NRlO結合的抗體。對與NRlO結合的 抗體沒有特別限定，優選為與NRlO特異性結合的抗體。與NRlO結合的抗體的優選方式為 具有NRlO中和活性的抗體。本發明中的「具有NRlO中和活性的抗體」是指，具有抑制基於 NRlO的生理活性的作用的抗體。本發明中的「具有NRlO中和活性的抗體」可以是多克隆抗 體，也可以是單克隆抗體，但優選的方式為單克隆抗體。本發明的抗體只要是與NRlO結合的抗體即可，沒有特別限定，還包括嵌合 (chimeric)抗體、人源化(humanized)抗體、人抗體等重組抗體。嵌合抗體是指包含人以外 的哺乳動物、例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區和人抗體的重鏈、輕鏈的恆定區的抗體。 嵌合抗體可以利用已知的方法來製備。例如，由雜交瘤克隆抗體基因，將其插入到適當的 載體中，再將其導入宿主中，即可製備嵌合抗體(例如參照Carl，Α. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC M0N0CL0NALANTIB0DIES, Published in the United Kingdom by MACMILLANPUBLISHERS LTD，1990)。具體而言，使用逆轉錄酶，由雜交瘤的mRNA合成抗體可 變區(V區)的cDNA。得到編碼目標抗體V區的DNA時，將其與編碼所期望的人抗體恆定區 (C區)的DNA連接，再將其插入到表達載體中。或者，可以將編碼抗體V區的DNA插入到包 含人抗體C區的DNA的表達載體中。將其插入到表達載體中，使之在表達調節區、例如增強 子、啟動子的調節下表達。接下來，利用該表達載體轉化宿主細胞，可以使嵌合抗體表達。人源化抗體也稱作重構(reshaped)人抗體，是將人以外的哺乳動物、例如小鼠抗 體的互補性決定區(CDR)移植到人抗體的互補性決定區中的人源化抗體，其常規基因重組 方法也是已知的。具體而言，利用PCR法，由多個製作成在末端部位具有重疊部分的寡核苷酸合成DNA序列，所述DNA序列設計成連接小鼠抗體的CDR和人抗體的構架區(framework region ；FR)。將所得DNA與編碼人抗體恆定區的DNA連接，接著插入到表達載體中，再將 其導入宿主中使之產生抗體，從而得到人源化抗體(參照歐州專利申請公開號EP 239400、 國際專利申請公開號W096/02576)。經由⑶R連接的人抗體的FR，選擇互補性決定區形成 良好的抗原結合位點的FR。根據需要，還可以取代抗體可變區的構架區的胺基酸，使重構 人抗體的互補性決定區形成適當的抗原結合位點(Sato, K.等人，Cancer Res. (1993)53， 851-856)。另外，人抗體的獲得方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原或表達所需抗原 的細胞致敏人淋巴細胞，使致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞、例如U266融合，從而可以獲得 與抗原具有結合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878)。另外，通過用所需抗原對 具有完全人抗體基因的所有組成成分的轉基因動物進行免疫，可以獲得所需的人抗體(參 照國際專利申請公開號 W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、 W096/33735)。並且，還已知使用人抗體噬菌體文庫，通過淘選法獲得人抗體的技術。例如，利用 噬菌體展示法，使人抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面表達，可以選擇與抗 原結合的噬菌體。分析所選擇的噬菌體的基因時，可以確定編碼與抗原結合的人抗體可變 區的DNA序列。明確了與抗原結合的scFv的DNA序列後，製作具有該序列的適當的表達載 體，可以獲得人抗體。這些方法眾所周知，可以參考W092/01047、W092/20791、W093/06213、 W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388 等。重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列，只要具有NRlO中和活性即可，在確認 到NRlO中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列中，有1個或多個氨 基酸可以被取代、缺失、添加和/或插入。作為用於製備在重鏈可變區或輕鏈可變區的 胺基酸序列中，有1個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入，並具有NRlO中和活 性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列的、本領域技術人員所熟知的方法， 已知有向蛋白中導入突變的方法。例如，本領域技術人員可以採用位點特異性誘變法 (Hashimoto-Gotoh, Τ, Mizuno, Τ, Ogasahara, Y 禾口 Nakagawa, Μ. (1995)An oligodeoxyri bonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis(寡脫 氧核糖核苷酸定向雙琥珀色法位點定向誘變).Gene 152，271-275 ；Zoller, MJ和Smith， Μ. (1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors (DNA片段克隆到M13載體的寡聚核苷酸定向誘變).Methods Enzymo 1. 100， 468-500、Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, Hff, Kramer, B, Pflugfelder, M 禾口 Fritz, HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction(帶缺口的雙鏈體DNA接近於寡聚核苷酸定向突變結構).Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W 禾口 Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods (經由帶缺 O 的雙鏈體 DNA 法突變的寡聚核苷酸定向結構).Enzymol. 154，350-367、Kunkel，TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection (無表型蹄選的 迅速及高效的位點特異性誘變法).Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492)等，向具有NRlO 中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列中導入適當突變，從而可以製備與具有NRlO中和活性的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區功能同等的突變體。這樣，重鏈可 變區或輕鏈可變區中有1個或多個胺基酸發生突變、且具有NRlO中和活性的抗體的重鏈可 變區或輕鏈可變區也包含在本發明的重鏈可變區或輕鏈可變區中。當改變胺基酸殘基時，優選突變成保存有胺基酸側鏈的性質的其它胺基酸。例如， 胺基酸側鏈的性質有疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；親水性胺基酸(R、D、N、C、E、 Q、G、H、K、S、T)；具有脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羥基側鏈的胺基酸(S、T、 Y)；具有含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)；具有含羧酸和醯胺側鏈的胺基酸(D、N、E、Q)；具有 含鹼性側鏈的胺基酸(R、K、H)；以及具有含芳香族側鏈的胺基酸(H、F、Y、W)(括號內均表示 胺基酸的單字母符號)。將上述各組內的胺基酸的取代稱作保守取代。已知具有對某一氨基 酸序列通過1個或多個胺基酸殘基的缺失、添加和/或用其它胺基酸的取代進行修飾的氨 基酸序列的多肽維持其生物學活性(Mark, D. F.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81 5662-6 ；Zoller, Μ. J.和 Smith, Μ.，Nucleic Acids Res. (1982) 10 6487-500 ；Wang，Α.等 人，Science (1984) 224 :1431—3 ；Dalbadie-McFarland, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79 :6409_13)。這樣的突變體與胺基酸突變前的重鏈可變區或輕鏈可變區的氨基 酸序列具有至少70 %、更優選至少75 %、更優選至少80 %、進一步優選至少85 %、更進一步 優選至少90%、而且最優選至少95%的胺基酸序列的同源性。本說明書中，序列的同源性 如下定義根據需要將序列整列化和導入適當的缺口，使序列同源性達到最大，之後以殘基 與原始重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列的殘基相同的比例來定義。胺基酸序列的同 源性可以通過上述方法來確定。另外，重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列中有1個或多個胺基酸被取代、缺 失、添加和/或插入、且具有NRlO中和活性的重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列，還 可以由在嚴格條件下與包含編碼該重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列 的核酸雜交的核酸而得到。作為用於分離在嚴格條件下與包含編碼重鏈可變區或輕鏈可變 區的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸雜交的核酸的嚴格的雜交條件，可以例示6M尿素、 0.4% SDS、0.5XSSC、37°C的條件或與其同等的嚴格的雜交條件。採用更嚴格的條件、例如 6M尿素、0.4% SDS,0. IXSSC的條件、42°C時，有望分離同源性更高的核酸。分離的核酸的 序列可以利用後述公知的方法來確定。所分離的核酸的同源性，以核苷酸序列整體計，具 有至少50%以上、進一步優選70%以上、更進一步優選90%以上(例如95%、96%、97%、 98%、99%以上)的序列同源性。除利用上述雜交技術的方法以外，還可以利用使用根據編碼重鏈可變區或輕鏈可 變區的胺基酸序列的核苷酸序列信息合成的引物的基因擴增法、例如聚合酶鏈反應(PCR) 法，分離在嚴格條件下與包含編碼重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列的 核酸雜交的核酸。核苷酸序列和胺基酸序列的同源性可以根據Karl in和Altschul的算法 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90 :5873_7)來確定。根據該算法，開發了 被稱作 BLASTN 和 BLASTX 的程序(Altschul 等人，J. Mol. Biol. (1990) 215 :403_10)。根據 BLAST, 通過BLASTN分析核苷酸序列時，參數例如為分值(score) = 100、讀取詞長(wordlength) =12。此外，根據BLAST，通過BLASTX分析胺基酸序列時，參數例如為分值=50、讀取詞 長=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的預設參數。上述分析方法的具體方法是公知的(參照 NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)的網址；http://www. ncbi. nlm. nih. gov)。本發明中的抗體可以是低分子抗體。本發明的低分子抗體只要包括全長抗體 (whole antibody，例如全長IgG等)的一部分缺失的抗體片段、且具有NRlO中和活性即可， 沒有特別限定。本發明的低分子抗體只要包含全長抗體的一部分即可，沒有特別限定，但優 選含有重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)，特別優選為包含VH和VL兩者的低分子抗體。 此外，本發明的低分子抗體的其他優選例子有包含抗體的CDR的低分子抗體。低分子抗體 中所含的CDR可以包含抗體的全部6個CDR，也可以包含一部分CDR。本發明中的低分子抗體優選比全長抗體的分子量小，但有時例如形成二聚體、三 聚體、四聚體等多聚體等，有時分子量比全長抗體的分子量大。作為本發明中的低分子抗體之一，例如有scFv抗體。scFv抗體是重鏈可變區 ([VH])和輕鏈可變區([VL])通過接頭等連接形成單鏈多肽的抗體(Huston，J. S.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988) 85, 5879-5883> Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，，第 113 卷，Resenburg 禾口 Moore 編，Springer Verlag, New York, 第269-315頁，(1994))。對所結合的重鏈可變區和輕鏈可變區的順序沒有特別限定，可以 按照任何順序進行排列，例如包括以下的排列。[VH]接頭[VL][VL]接頭[VH]重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列可以被取代、缺失、添加和/或插入。並 且，使重鏈可變區與輕鏈可變區連接時，只要具有抗原結合活性即可，可以缺失一部分，也 可以添加其他多肽。還可以將可變區嵌合化或人源化。本發明中，連接抗體可變區的接頭可以使用能夠通過基因工程導入的任意肽接 頭、或合成接頭(synthetic linker)，例如可以使用 Protein Engineering，9 (3)，299 305，1996中公開的接頭。本發明中優選的接頭為肽接頭。對肽接頭的長度沒有特別限定，本領域技術人員 根據目的可以適當選擇。通常為1 100個胺基酸，優選3 50個胺基酸，進一步優選5 30個胺基酸，特別優選為12 18個胺基酸(例如15個胺基酸)。作為肽接頭的胺基酸j宇列，例如有以下的序列。
Ser
GlySer
GlyGlySer
SerGlyGly
GlyGlyGly Ser (SEQ ID NO 8)
SerGlyGly Gly(SEQ ID NO 9)
GlyGlyGly Gly Ser (SEQ ID NO 10)
SerGlyGly Gly Gly(SEQ ID NO 11)
GlyGlyGly Gly Gly · Ser(SEQ ID NO 12)
SerGlyGly Gly Gly · Gly(SEQ ID NO 13)
GlyGlyGly Gly Gly · Gly · Ser(SEQ ID NO 14)
8
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 15)(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :10))n(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 11)) η[η為1以上的整數]等。合成接頭(化學交聯劑)是通常用於交聯肽的交聯劑，例如有Ν-羥基琥珀醯亞 胺(NHS)、二琥珀醯亞氨基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞氨基)辛二酸酯(BS3)、二 硫代雙(琥珀醯亞氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代雙(磺基琥珀醯亞氨基丙酸酯)(DTSSP)、雙 (琥珀醯亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、雙(磺基琥珀醯亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺 基-EGS)、二琥珀醯亞氨基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀醯亞氨基酒石酸鹽(磺基-DST)、雙 [2-(琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(BS0C0ES)、以及雙[2-(磺基琥珀醯亞胺氧基羰 基氧基)乙基]碸(磺基-BS0C0ES)等，這些交聯劑均有銷售。本發明的抗體還包括在本發明抗體的胺基酸序列中添加有多個胺基酸殘基的 抗體。而且，還包括這些抗體與其他肽或蛋白融合的融合蛋白。關於製作融合蛋白的方 法，只要連接編碼本發明抗體的多核苷酸和編碼其他肽或多肽的多核苷酸使構架一致， 再將其導入表達載體中，使之在宿主中表達即可，可以採用本領域技術人員所公知的方 法。作為用於與本發明抗體融合的其他肽或多肽，例如可以使用FLAG(Hopp，Τ.Ρ.等人， BioTechnology (1988) 6，1204-1210)、包含 6 個His (組氨酸)殘基的 6XHis、10XHis、流感 血凝素(HA)、人 c-myc 片段、VSV-GP 片段、pl8HIV 片段、T7_tag、HSV-tag、Ε-tag, SV40T 抗 原片段、Ick tag、α-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C的片段等公知的肽。作為用於與本發明 抗體融合的其他多肽，例如可以使用GST (穀胱甘肽-S-轉移酶)、HA (流感血凝素)、免疫 球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。使市售的編碼這些肽或多肽的 多核苷酸與編碼本發明抗體的多核苷酸融合，再使由此製備的融合多核苷酸表達，從而可 以製備融合多肽。本發明的抗體可以是與聚乙二醇(PEG)、透明質酸、放射性物質、螢光物質、發光 物質、酶、毒素等各種分子結合的綴合抗體。這樣的綴合抗體可以通過對所得抗體實施 化學修飾而得到。需要說明的是，抗體的修飾方法在該領域已經確立(例如US5057313、 US5156840)。本發明中的「抗體」也包括這些綴合抗體。雖然沒有特別限定，但本發明中的抗NRlO抗體的優選方式之一為識別結構域1 的抗體。本發明中，結構域1是指，在SEQ ID NO :7記載的人NRlO的胺基酸序列中，以包含 信號肽的狀態下的序號計，第21位胺基酸 第120位胺基酸的區(LPAKP LENIA)。本發明的抗體，根據後述的產生其的細胞或宿主或純化方法，其胺基酸序列、分子 量、等電點或糖鏈的有無及形態等可以不同。但只要所得抗體具有NRlO拮抗劑的功能，即 包含在本發明中。例如，使本發明的抗體在原核細胞、例如大腸桿菌中表達時，在原抗體的 胺基酸序列的N末端添加甲硫氨酸殘基。本發明的抗體也包含這樣的抗體。具有NRlO中和活性的單克隆抗體可如下得到例如以來自人或小鼠等哺乳動物 的NRlO或其片段肽作為免疫原，利用公知方法製備抗NRlO單克隆抗體，之後從所得的抗 NRlO單克隆抗體中選擇具有NRlO中和活性的抗體，即可得到單克隆抗體。即，使用所需的 抗原或表達所需抗原的細胞作為致敏抗原，按照常規免疫方法對其進行免疫。按照通常的 細胞融合法使所得的免疫細胞與公知的親本細胞融合，利用通常的篩選法篩選產生單克隆抗體的細胞(雜交瘤)，從而可以製作抗NRlO單克隆抗體。被免疫的動物可以使用例如 小鼠、大鼠、兔、綿羊、猴、山羊、驢、牛、馬、豬等哺乳動物。抗原的製備可以使用公知NRlO基 因序列，按照公知方法、例如使用杆狀病毒的方法(W098/46777等)等來進行。雜交瘤的製作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler. G.和Milstein, C.， Methods Enzymo 1. (1981)73:3-46)等來進行。抗原的免疫原性低時，可以使其與白蛋白等 具有免疫原性的巨大分子結合後再進行免疫。本發明的具有NRlO中和活性的抗體的一個方式為具有人NRlO中和活性的單克 隆抗體。作為用於製作具有人NRlO中和活性的單克隆抗體的免疫原，只要可以製作具有人 NRlO中和活性的抗體即可，沒有特別限定。例如已知人NRlO中存在多個變體，但只要可以 製作具有人NRlO中和活性的抗體即可，可以以任一種變體作為免疫原。或者，在同樣的條 件下，可以以NRlO的片段肽或在天然NRlO序列中導入了人工突變的蛋白作為免疫原。人 NR10. 3除了可以製作與本發明的NRlO具有結合活性和/或中和活性的抗體，還是優選的免 疫原之一。抗體的NRlO中和活性的測定，例如可以按照參考例所述的、觀察該IL-31依賴性 細胞株的增殖抑制效果的方法來進行。一方面，單克隆抗體還可以通過DNA免疫(DNA Immunization)而得到。所謂DNA 免疫，是指將在免疫動物中以編碼抗原蛋白的基因能夠表達的方式構建的載體DNA給予該 免疫動物，使免疫抗原在免疫動物體內表達，從而給予免疫刺激的方法。與給予蛋白抗原的 普通免疫方法相比，DNA免疫可期待下述的優勢。-可以維持膜蛋白結構而給予免疫刺激-不必純化免疫抗原但另一方面，在DNA免疫中難以與佐劑等免疫刺激手段組合。為了通過DNA免疫獲得單克隆抗體，首先，對免疫動物給予編碼NRlO的DNA。編碼 NRlO的DNA可以通過PCR等公知方法來合成。將得到的DNA插入適當的表達載體中，之後 給予免疫動物。作為表達載體，例如可以使用pcDNA3. 1等市售的表達載體。對生物體給予 載體的方法也可採用通常所用的方法。例如，用基因槍(gene gun)將吸附有表達載體的金 顆粒射入細胞內，從而可以進行DNA免疫。在DNA免疫後利用NRlO表達細胞進行追加免疫 (加強免疫)，這是獲得單克隆抗體的優選方法。如此地對哺乳動物進行免疫，確認血清中所需抗體量升高後，從哺乳動物中採集 免疫細胞用於細胞融合。優選特別使用脾細胞作為免疫細胞。與上述免疫細胞融合的細胞使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。優選骨髓瘤細胞具備用 於篩選的適當的選擇標誌物。選擇標誌物是指，可以(或者不可以)在特定的培養條件下 生存的特性。選擇標誌物中，次黃嘌呤-鳥嘌呤_磷酸核糖轉移酶缺陷(以下簡記為HGPRT 缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下簡記為TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺 陷的細胞具有次黃嘌呤_氨基蝶呤_胸苷感受性(以下簡記為HAT感受性)。HAT感受性 的細胞在HAT選擇培養基中無法進行DNA合成而死亡，但與正常細胞融合時，利用正常細胞 的補救途徑可以繼續進行DNA的合成，因此在HAT選擇培養基中也能夠增殖。HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞，各自可以在含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤(以下 簡記為8AG)或5』 -溴脫氧尿苷的培養基中進行選擇。正常細胞由於將上述嘧啶類似物攝入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的細胞由於不能攝入上述嘧啶類似物，所以可以在選擇 培養基中生存。此外，被稱作G418耐性的選擇標誌物通過新黴素耐性基因，提供對2-脫氧 鏈黴胺類抗生素(慶大黴素類似物)的耐性。適於細胞融合的各種骨髓瘤細胞是公知的。基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler. G.和 Milstein,C. ,Methods Enzymo 1. (1981)73,3-46)等，進行免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融
口 O更具體而言，例如在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養培養液中，可以實施 細胞融合。融合促進劑例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。為了進一步提高 融合效率，根據需要，還可以添加二甲基亞碸等輔助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，優選使免疫細胞為骨 髓瘤細胞的1 10倍。用於細胞融合的培養液例如可以使用適合骨髓瘤細胞株增殖的 RPMI1640培養液、MEM培養液、以及用於該種細胞培養的常規培養液。並且，可以在培養液 中添加胎牛血清(FCS)等血清補液。細胞融合可如下進行將規定量的免疫細胞和骨髓瘤細胞在培養液中充分混合， 再混合預先加熱至37°C左右的PEG溶液，從而形成目標融合細胞(雜交瘤)。在細胞融合法 中，通常可以以30 60% (w/v)的濃度添加例如平均分子量為1000 6000左右的PEG。 接著，依次添加上述列舉的適當培養液，離心以除去上清，通過重複該操作，除去不利於雜 交瘤生長的細胞融合劑等。如此操作得到的雜交瘤，可以通過使用選擇培養液而進行選擇，所述選擇培養液 對應於用於細胞融合的雜交瘤所具有的選擇標誌物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的細胞， 可通過在HAT培養液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養液)中培養來進行選擇。 即，將HAT感受性的骨髓瘤細胞用於細胞融合時，在HAT培養液中，成功地與正常細胞進行 細胞融合的細胞能夠選擇性地增殖。為了使目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡， 使用上述HAT培養液繼續培養足夠的時間。具體而言，通常通過培養數天至數周，可以選擇 目標雜交瘤。接著，通過實施常規的極限稀釋法，可以實施產生目標抗體的雜交瘤的篩選和 單克隆。或者，還可以按照國際公開W003/104453中所述的方法製備識別NRlO的抗體。目標抗體的篩選和單克隆可優選按照基於公知的抗原抗體反應的篩選方法來實 施。例如，使抗原與用聚苯乙烯等製成的珠或市售96孔微量滴定板等載體結合，再與雜交 瘤的培養上清反應。然後清洗載體，之後與用酶標記的二次抗體等反應。當培養上清中含 有與致敏抗原反應的目標抗體時，二次抗體經由該抗體與載體結合。最終，通過檢測與載體 結合的二次抗體，可以確定培養上清中是否存在目標抗體。利用極限稀釋法等可以克隆產 生對抗原具有結合能力的所需抗體的雜交瘤。此時，抗原不僅可以使用用於免疫的抗原，還 可以適當使用實質上為相同性質的NRlO蛋白。例如，可以使用表達NRlO的細胞株、NRlO的 胞外域、或者包含構成該區的部分胺基酸序列的寡肽作為抗原。除通過用抗原對人以外的動物進行免疫而獲得上述雜交瘤的方法外，對人淋巴細 胞進行抗原致敏，也可得到目標抗體。具體而言，首先，在體外用NRlO蛋白致敏人淋巴細 胞。然後，使免疫致敏的淋巴細胞與適當的融合配偶體融合。融合配偶體可以使用例如來 自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞(參照日本特公平1-59878號公報)。通過該方法 得到的抗體是與NRlO蛋白具有結合活性的人抗體。
如上操作取得的抗體，可以利用本領域技術人員所公知的方法來製作。例如，可 以根據識別NRlO的抗體的序列，使用本領域技術人員所公知的基因重組技術來製作。具 體而言，根據識別NRlO的抗體的序列構建編碼抗體的多核苷酸，將其導入表達載體中，之 後使之在適當的宿主細胞中表達即可(例如參照Co, M. S. et al.，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976 ；Better, Μ.禾口 Horwitz，Α. H.，Methods Enzymol. (1989) 178,476-496 ； Pluckthun, Α.禾口 Skerra, Α. , Methods Enzymol. (1989) 178,497—515 ；Lamoyi, Ε. , Methods Enzymol. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J.等人，Methods Enzymol. (1986) 121,663-669 ； Bird, R. Ε.和 Walker，B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9,132-137) 載體的例子有M13系載體、pUC 系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等。另 外，為了亞克隆、切出cDNA時，除上述載體外，例如還有pGEM-T、pDIRECT、pT7等。為了生產 本發明的抗體而使用載體時，表達載體特別有用。作為表達載體，例如為了在大腸桿菌中表 達時，載體除了具有在大腸桿菌中擴增的上述特徵外，當以JM109、DH5 α、HB101、XLl-Blue 等大腸桿菌作為宿主時，還必需具有可以在大腸桿菌中高效率表達的啟動子、例如IacZ啟 動子(Ward 等人，Nature (1989) 341，544-546 ；FASEB J. (1992)6,2422-2427)、araB 啟動 子(Better等人，Science (1988) 240，1041-1043)、或T7啟動子等。作為這樣的載體，除上 述載體外，還有 PGEX-5X-1 (Pharmacia 制)、"QIAexpress system」 (Qiagen 制)、pEGFP 或 pET(此時，宿主優選表達T7RNA聚合酶的BL21)等。另外，載體中可以包含用於抗體分泌的信號序列。作為用於抗體分泌的信號序列， 當其在大腸桿菌的周質中產生時，可以使用PelB信號序列(Lei, S. P.等人，J. Bacteriol. (1987) 169,4379)。向宿主細胞中導入載體，例如可以採用氯化鈣法、電穿孔法來進行。除大腸桿菌外，作為用於製備本發明抗體的載體，例如有來自哺乳動物的表達載 體(例如 pcDNA3 (Invitrogen 社制)或 pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990，18(17)，第 5322頁)、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細胞的表達載體(例如「Bac-to-BAC杆狀病毒表達系 統」 (Gibco-BRL制)、pBacPAK8)、來自植物的表達載體(例如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、來自動物病毒的 表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自逆轉錄病毒的表達載體(例如pZIPneo)、來自 酵母的表達載體(例如「Pichia表達試劑盒」(Invitrogen制)、pNVll、SP-QO1)、來自枯草 桿菌的表達載體(例如pPL608、pKTH50)。為了在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表達時，必需具有用於在 細胞內表達所需的啟動子、例如SV40啟動子(Mulligan等人，Nature (1979) 277，108)、 MMLV-LTR 啟動子、EFl α 啟動子(Mizushima 等人，Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322)、 CMV啟動子等，進一步優選具有用於選擇轉化細胞的基因(例如利用藥物(新黴素、G418 等)可以判別的耐藥基因)。作為具有這樣的特性的載體，例如有pMAM、pDR2、pBK-RSV、 pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。並且，為了使基因穩定表達、且擴增細胞內的基因拷貝數時，可以列舉向 缺失核酸合成途徑的CHO細胞中導入攜帶補償該途徑的DHFR基因的載體(例如 pSV2~dhfr("Molecular Cloning 2nd edition"Cold Spring Harbor Laboratory Press， (1989))等)，之後利用甲氨蝶呤(MTX)使其擴增的方法；為了實現基因的一過性表達時， 使用染色體上具有表達SV40T抗原的基因的COS細胞，利用具有SV40的複製起點的載體 (pcD等)進行轉化的方法。作為複製起點，還可以使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病
12毒(BPV)等的複製起點。並且，為了在宿主細胞體系中擴增基因拷貝數，表達載體中可以包 含氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌 呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標誌物。由此得到的本發明的抗體，可以將其從宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離，並 純化成實質上純粹且均勻的抗體。抗體的分離、純化可以使用通常抗體的純化中所使用的 分離、純化方法，但對其沒有任何限定。例如，可以適當選擇、組合層析柱、過濾器、超濾、鹽 析、溶劑沉澱、溶劑提取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、 重結晶等來分離和純化抗體。層析例如有親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、反相層析、吸附 MIiT^ (Strategies for Protein Purification and Characterization (胃白Mt屯U與 鑑定實驗指南):A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。上述層析可以使用液相層析、例如HPLC、FPLC等液相層 析來進行。用於親合層析的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有=Hyper D.P0R0S,Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)等。本發明還包括利用上述純化方法 進行高度純化的抗體。抗體的NRlO結合活性的測定，可以採用本領域技術人員所公知的方法來進行。例 如，作為測定抗體的抗原結合活性的方法，可以使用ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、EIA(酶 免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光抗體法。例如，採用酶免疫測定法時，向包被 有抗原的板中加入含有抗體的試樣、例如抗體產生細胞的培養上清或純化抗體。添加用鹼 性磷酸酶等酶標記的二次抗體，將板溫育、清洗，之後加入對硝基苯基磷酸等酶底物，測定 吸光度，從而可以評價抗原結合活性。抗體的NRlO中和活性的測定，例如可以按照參考例所述的、觀察該IL-31依賴性 細胞株的增殖抑制效果的方法來進行。本發明的NRlO拮抗劑或具有NRlO中和活性的抗體，可在搔癢症的預防藥或治療 藥中使用。本發明人等證實了 將抗小鼠NRlO中和抗體給予搔癢症模型動物，取得了顯著 療效。並且，認為即使是抗體以外的NRlO拮抗劑，與本實施例之所見一樣，對搔癢症也有療 效。本發明人等發現抗NRlO拮抗抗體對搔癢症具有療效。另一方面，判定在急性接 觸性皮炎和DSS急性大腸炎模型中，抗NRlO拮抗抗體對這些疾病本身沒有療效。本發明中，搔癢症的治療有別於引起搔癢症的疾病或症狀(例如以下記載的特應 性皮炎、C型肝炎等疾病)的治療。因此，本發明的搔癢症的治療藥或預防藥，並不是治療 或預防引起搔癢症的疾病或症狀本身，而是以搔癢症本身的預防或治療為目的。本發明的 治療藥或預防藥的給藥目的不是治療或預防引起搔癢症的疾病或症狀，而是對需要治療或 預防搔癢症的患者，為了治療或預防搔癢症而進行給藥。對利用本發明來治療的搔癢症沒有特別限定，可以是任何搔癢症。利用本發明治 療的搔癢症的具體例子有例如疥癬、蝨病、蟲咬傷和刺傷、蕁麻疹、特應性皮炎、接觸性皮 炎、扁平苔癬、汗疹、皰疹樣皮炎、幹皮病、膽道阻塞、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、C型肝炎 等傳染性肝炎、尿毒症、慢性腎功能衰竭、腎透析、淋巴瘤、白血病、真性一次性紅細胞增多 症、妊娠、藥物的服用(巴比妥鹽、水楊酸等)、甲狀腺功能亢進、真性糖尿病、內臟癌症等中的搔癢症。本發明的搔癢症的預防或治療藥的特徵在於含有上述NRlO拮抗劑或具有NRlO 中和活性的抗體作為有效成分。「含有NRlO拮抗劑作為有效成分」是指，含有NRlO拮抗劑 作為活性成分的至少一種，不限定其含量。此外，本發明的搔癢症的預防或治療藥可以在含 有NRlO拮抗劑的同時，一併含有其他促進搔癢症的預防或治療的成分。本發明的搔癢症治療藥或預防藥對作為對象的搔癢症沒有特別限定，可以是任何 原因引起的搔癢症，但優選為IL-31參與的搔癢症。IL-31參與的搔癢症的例子有由IL-31 引起的搔癢症、IL-31高度表達的搔癢症等。本發明的NRlO拮抗劑可以按照常規方法製成製劑(例如Remington，s Pharmaceutical Science，latest edition,Mark Publishing Company，Easton，U. S. A)0並 且，根據需要，可以同時含有藥學上可接受的載體和/或添加劑。例如有表面活性劑(PEG、 Tween等)、賦形劑、抗氧劑(抗壞血酸等)、著色劑、香料、保存劑、穩定劑、緩衝劑(磷酸、 枸櫞酸、其他有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動 性促進劑、矯味劑等。但本發明的炎症性疾病的預防或治療藥並不限於這些，可以適當含有 其它常用的載體。載體具體有輕質矽酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露糖醇、澱粉、羧甲纖維素 鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚 乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、 玉米澱粉、無機鹽類等。還可以含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白 等蛋白、以及甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸和賴氨酸等胺基酸。製成注射用水溶液 時，將NRlO拮抗劑溶於含有例如生理鹽水、葡萄糖或其他輔劑的等滲溶液中。輔劑例如有 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，並且，上述注射用水溶液可以和適當的助溶劑、例 如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山梨醇酯80、HC0-50) 等結合使用。根據需要，還可以將NRlO拮抗劑封入微囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙烯 酸]等的微囊)中、或者製成膠體給藥系統(脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米 囊等)(參照 Remington』 s Pharmaceutical Science 16th edition &，Oslo Ed. (1980) 等)。並且，將藥物製成緩釋製劑的方法也是公知的，該方法可適用於NRlO拮抗劑 (Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15 167-277 ；Langer, Chem. Tech. (1982) 12 98-105 ；美國專利第3，773，919號；歐州專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman等人， Biopolymers(1983) 22 :547_56 ；EP 第 133，988 號)。本發明的搔癢症的預防或治療藥可以口服給藥，也可以胃腸外給藥，優選胃腸外 給藥。具體通過注射和經皮給藥對患者進行給藥。注射劑型的例子有例如通過靜脈內注 射、肌肉內注射或皮下注射等進行全身或局部給藥。可以對想要抑制炎症的部位或其周邊 進行局部注入、特別是肌肉內注射。可以根據患者的年齡、症狀選擇適當的給藥方法。作為 給藥量，例如可以在每次每kg體重、活性成分為0. OOOlmg IOOmg的範圍內選擇。或者， 例如對病人給藥時，每名患者在活性成分為0. 001 1000mg/kg體重的範圍內選擇，每次的 給藥量例如優選NRlO拮抗劑的含量為0. 01 50mg/kg體重左右。但本發明的搔癢症的預 防或治療藥並不限於上述給藥量。本發明還提供含有IL-31拮抗劑作為有效成分的搔癢症治療藥。IL-31拮抗劑只要是與IL-31結合、抑制IL-31的生物學活性的物質即可，沒有特別限定。IL-31拮抗劑的優 選例子有抗 IL-31 抗體(例如 W02006/088955、W02006/88956、W02006/122079)。抗 IL-31 抗體的製作、改變、修飾、製造、純化、給藥、製劑化等均可按照上述抗NRlO抗體的記載來進 行。需要說明的是，本說明書中引用的所有在先技術文獻均作為參照而納入本說明書中。
實施例以下，利用實施例來具體地說明本發明，但本發明並不限於這些實施例。[實施例1]評價IL-31誘發的搔癢行為對9周齡的雌性正常BALB/c小鼠(日本Charles River)靜脈內給予10 μ g小鼠 IL-31 (室內)，使用搔癢測定裝置(MicroAclNeuroScience)測定、分析自剛剛給藥直後起 12個小時的搔癢行為。其結果，與溶劑(Vehicle)(含有0. 5% BALB/c小鼠血清的PBS)給 藥組(η = 8)相比，在IL-31給藥組(η = 8)中確認到以給藥後約5小時為峰值的搔癢次 數的明顯增加。此外，通過在IL-31給藥前以350mg/kg靜脈內給予抗小鼠NRlO中和抗體 BM095 (η = 8),使該IL-31誘發的搔癢行為完全被抑制(圖1)。該結果證實抗NRlO中和 抗體對IL-31引起的搔癢症具有抑制效果。抗NRlO Φ禾Π抗體對_抗1!^秀髮皮炎It型的效果在9周齡的SPF雌性NC/Nga Tnd Crlj小鼠(日本Charles River)的腹側耳廓 皮內給予5 μ g作為蟎抗原的屋塵蟎(Dp)粗提取物(Cosmo BioLSL)，每周3次、給藥3周， 以誘發皮炎(Int Arch Allergy Immunol 2004 ;133 :55_63)。Dp的溶劑對照組則按照同樣 的時間表給予5μ L生理鹽水(大塚製藥)(η = 7)。對於該病態模型，於第0、3、7、10、14、 17,21天以20mg/kg靜脈內給予抗小鼠RlO中和抗體ΒΜ-095 (η = 8)。對於溶劑對照組，按 照同樣的時間表靜脈內給予200mmol/L NaCl/20mmol/L乙酸鈉緩衝液(pH5. 5) (η = 8)。搔癢症的評價如下進行在第21天，使用搔癢測定裝置(MicroAct， NeuroScience)，計測12小時測定期間內的搔癢次數(抓癢)。其結果，相對於Dp的溶劑對 照組，溶劑對照組的搔癢次數顯著(P < 0. 005)增加。此時，相對於溶劑對照組，BM095給 藥組的搔癢次數得到顯著(P < 0. 05)抑制(圖2)。該結果顯示抗NRlO中和抗體對搔癢症具有抑制效果。[實施例2]H0L0對食蟹猴中的IL-31誘發搔癢症的抑制效果對4-5歲的食蟹猴靜脈內給予食蟹猴IL-31以誘發搔癢症，研究抗人NRlO抗體 H0L0 (重鏈胺基酸序列/SEQ ID NO 17、輕鏈胺基酸序列/SEQ ID NO 18)對上述搔癢症的 影響。靜脈內給予PBS (溶劑)或0. 01、0. 03、0. 06、0. 3、0. 6mg/kg的H0L0，於之後的第24 小時以lg/kg靜脈內給予食蟹猴IL-31，用攝像機對之後2小時的行為進行錄像。重放錄製 的錄像，以連續3次以上的搔破行為作為搔癢行為，計測搔癢次數。其結果，H0L0用量依賴 性地抑制由食蟹猴IL-31誘發的搔癢次數(圖5)。該結果表明抗NRlO抗體H0L0對搔癢 症具有抑制效果。[參考例1]確立表達NRlO和OSMR的Ba/F3細胞株將人NR10cDNA(W00075314SEQ ID No :1/SEQ ID NO 16)插入到表達載體
15pCOSl (Biochem Biophys Res Commun. 228，第 838-45 頁，1996)中，構建 pCosNRlO. 3。利用 PCR法從人胎盤文庫中分離制癌蛋白M受體cDNA(OSMR，GenBank檢索號NM003999)，同樣構 建表達載體pCosl-hOSMR。利用電穿孔法，將各IOyg的載體同時導入來自小鼠IL-3依賴 性 pro-B 細胞的細胞株 Ba/F3 中(BioRad Gene Pulser，960 μ F，0. 33kV)。導入後，添加人 IL-31並培養，得到顯示IL-31依賴性增殖的細胞株。同樣，由表達小鼠NRlO和小鼠OSMR 基因的Ba/F3細胞製作小鼠IL-31依賴性細胞株。上述細胞株均顯示出數ng/mL的ED50，得到了良好增殖的細胞株。人IL-31依賴 性細胞株不與小鼠IL-31反應，通過添加人NRlO蛋白(胞外區)而被抑制。小鼠IL-31依 賴性細胞株不與人IL-31反應，不受小鼠NRlO添加蛋白(胞外區)的抑制。[參考例2]NRlO蛋白(胞外區)的製備以人NRlOcDNA為模板，利用PCR法僅擴增胞外區，並在C末端添加FLAG tag序列， 再將其插入到表達載體PCXND3 (W02005/005636)中(pCXND3_NR10-flag)。利用電穿孔法， 將10 μ g直鏈狀的該載體導入中國倉鼠卵巢細胞株DG44中(BioRad GenePulserII，25 μ F， 1.5kV)，得到顯示高度表達的細胞株。大量培養該細胞株，利用抗FLAG抗體柱(SIGMA制)、 凝膠過濾法從培養上清中得到純化標準品，用於以下實驗。同樣製備在C末端添加有FLAG tag序列的小鼠NRlO (胞外區)。[參考例3]具有抗小鼠NRlO中和活性的scFv的分離和嵌合IgG化BM095的製備使用生物素化的小鼠NRlO蛋白(胞外區)，通過淘選法從人抗體噬菌體文庫中篩 選候選克隆。從這些克隆中純化分泌scFv，將其添加到參考例1記載的IL-31依賴性Ba/ F3細胞增殖測定系統中。其結果，成功地獲得了顯示強的增殖抑制活性的克隆BM095。利用PCR法，將BM095的人H鏈可變區序列(VH)與小鼠IgG2a恆定區(CHl後)連 接、並將人L鏈可變區序列(VL)與小鼠λ鏈恆定區連接，構建表達載體。此時，VH的氨基 酸序列見SEQ ID NO :1，編碼該胺基酸序列的核苷酸序列見SEQ ID NO :2。VL的胺基酸序 列見SEQ ID NO :3，編碼該胺基酸序列的核苷酸序列見SEQ ID NO :4。將直鏈狀的各表達載 體同時導入DG44株中，選擇顯示高水平表達嵌合IgG的細胞株。大量培養該細胞株，利用 蛋白 A(rProtein A Sepharose Fast Flow,GE Amersham Biosciences 制)柱、陽離子交換 (SP-T0Y0PEARL 650M，T0S0H制)柱層析，從培養上清中得到純化標準品。再利用ActiClean Etox(Sterogen制)樹脂將致熱原降低至檢測限以下。[參考例4]BM095對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發大腸炎的藥效製作作為炎症性腸疾病(IBD)的病態模型報導的DSS誘發大腸炎模型(J Immunol 2003 ；171 :5507-5513)，研究抗小鼠NRlO中和抗體BM-095的效果。使用經0.22μπι濾器 (Millipore制)過濾滅菌的蒸餾水，製備5% (w/v)的葡聚糖硫酸鈉鹽(和光純藥制)水 溶液，讓6周齡的雄性Balb/cAnN Crj小鼠(日本Charles River制)通過供水瓶自由飲 水7天，測定體重，以相對於DSS給藥起始日的體重的變化率作為藥效的評價項目。本模型中，有關是否通過中和IL-31信號而使病情得到改善，於DSS給藥前1天 將抗小鼠NRlO中和抗體BM095以10mg/kg的用量進行靜脈內給藥，評價體重的減少(η = 10)。設定在DSS給藥前1天靜脈內給予溶劑(乙酸緩衝液[20mmol/L乙酸鈉、20mmol/L氯 化鈉]與磷酸緩衝生理鹽水[PBS，GIBCO制]以容量比1 5混合的混合液)的組(溶劑 組，η = 10)，作為溶劑對照組。為了把握正常小鼠的體重變化率的推移，還觀察與DSS給藥組相同周齡、性別的Balb/cAnN Crj小鼠的體重變化率的推移(η = 1)。體重變化見圖3。在溶劑組中，通過給予DSS，體重變化率下降。而在ΒΜ095給藥 組中，也顯示出與溶劑組同樣的體重變化，但在DSS給藥後的4天和5天後，與溶劑組相比， ΒΜ095組的體重變化率顯著下降。根據上述結果，沒有確認到ΒΜ095給藥所產生的本模型的 大腸炎治療效果。有報導稱在本模型中IL-31RA表達亢進(W02004/003140)，但由上述實驗結果可 知同分子的中和抗體對本模型的大腸炎沒有療效。[參考例5]ΒΜ095對急性苦基氯接觸性皮炎模型的藥效製作作為急性接觸性皮炎模型報導的(Clin Immunol 2003 ； 108 :257_262)、通過 敷用苦基氯而致敏/誘發的延遲型過敏症反應的結果導致的皮炎，研究抗小鼠NRlO中和抗 體BM-095的效果。在8周齡雌性Balb/cAnN Crj小鼠(日本Charles River制)的腹部 皮膚上敷用50μ L的7%苦基氯(nacalai tesque,Inc.)溶液(乙醇丙酮=3 l,v/v) 進行致敏，5天後在右耳耳廓皮膚上敷用20yL的苦基氯溶液(丙酮橄欖油=1 4， v/v)，引發接觸性皮炎(誘發)。作為用於評價溶劑對耳廓厚度的影響的對照，在同一隻小 鼠左耳耳廓皮膚上敷用20 μ L溶劑(丙酮橄欖油=1 4，ν/ν)(陽性對照組，η = 6)。 在臨誘發前和誘發後24、48、72小時，使用錶盤式厚度規(dial thickness gauge)(尾崎制 作所制)測定左右耳的厚度，以相對於臨誘發前的耳廓厚度的變化作為藥效評價項目。作為用於評價病態成立的對照組，設定致敏時在腹部皮膚上敷用不含苦基氯的乙 醇丙酮混合液(3 l，v/v)、5天後在右耳耳廓皮膚上敷用20yL的苦基氯溶液、在左 耳耳廓皮膚上敷用20 μ L溶劑(丙酮橄欖油=1 4，ν/ν)的組(陰性對照組，η = 6)。為了評價本模型病態中抗NRlO抗體的給藥效果，設定以下各組按照上述陽性對 照組的方法引發急性接觸性皮炎，在致敏前1天和誘發前1天以10mg/kg靜脈內給予ΒΜ095 的組(BM095組，η = 6)；以及按照相同時間表給予溶劑(乙酸緩衝液[20mmol/L乙酸鈉、 20mmol/L氯化鈉]與磷酸緩衝生理鹽水[PBS，GIBCO制]以容量比1 5混合的混合液) 的組(溶劑組、η = 5)。直至誘發後72小時的耳廓的厚度變化見圖4。相對於陰性對照組，陽性對照組在 誘發後24、48、72小時耳廓均明顯肥厚，這表明病態成立。此時，ΒΜ-095組顯示出與溶劑組 同樣的耳廓厚度的變化，沒有確認到明顯的抑制。根據上述結果判明沒有確認到給予ΒΜ095對本模型中觀察到的急性接觸性皮炎 的療效。產業實用性本發明提供的抗NRlO中和抗體等NRlO拮抗劑，可以作為搔癢症的治療藥或預防藥。
權利要求
搔癢症的預防或治療藥，其中含有NR10拮抗劑作為有效成分。
2.權利要求1所述的預防或治療藥，其中NRlO拮抗劑為對NRlO具有中和活性的抗體。
3.權利要求2所述的預防或治療藥，其中抗體為單克隆抗體。
4.權利要求3所述的預防或治療藥，其中抗體為對人NRlO具有中和活性的單克隆抗體。
5.權利要求2 4中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為重組抗體。
6.權利要求2 5中任一項所述的預防或治療藥，其中抗體為嵌合抗體、人源化抗體或 人抗體。
全文摘要
本發明人等在IL-31依賴性Ba/F3細胞增殖測定系統中由人抗體噬菌體文庫得到了顯示強的增殖抑制活性的克隆BM095。使用該抗小鼠NR10中和抗體對搔癢症模型小鼠進行給藥時，顯示出顯著的抑制症狀的效果。明確了抗NR10中和抗體作為搔癢症治療藥是有效的。
文檔編號A61P17/04GK101939025SQ20088012653
公開日2011年1月5日 申請日期2008年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者北村秀智, 樋口義信, 糟谷惠子, 長谷川雅一 申請人:中外製藥株式會社