一種具有長連接橋的聚乙二醇化ω-幹擾素及其製備工藝的製作方法
2023-10-07 23:20:54
一種具有長連接橋的聚乙二醇化ω-幹擾素及其製備工藝的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種具有長連接橋的聚乙二醇（PEG）化ω-幹擾素，以及其製備方法。所述方法包括以下：（1）2-亞氨基硫雜環戊烷與ω-幹擾素的伯胺基反應引入巰基，ω-幹擾素表面的巰基與PEG-馬來醯亞胺反應，實現PEG修飾ω-幹擾素；（2）由於PEG與ω-幹擾素之間存在著較長的連接橋，預計可以降低PEG對ω-幹擾素的空間屏蔽作用，提高ω-幹擾素的生物活性；（3）與未修飾的ω-幹擾素相比，PEG化ω-幹擾素在體內具有更長的循環半衰期，能夠明顯減少用藥次數，降低毒副作用，特別適用於治療對α-幹擾素耐藥的病人，在臨床上具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—種具有長連接橋的聚乙二醇化ω-幹擾素及其製備工藝【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種具有長連接橋的聚乙二醇(PEG)化ω-幹擾素，以及其製備工藝。
【背景技術】
[0002]幹擾素(interfeix)n，IFN)是機體被病毒感染後，由白細胞通過抗病毒免疫應答而產生的一種糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等生物活性。自1986年以來，幹擾素成為首個被美國FDA批准，且用於臨床的細胞因子。幹擾素最早分為I型與II型。I型中又有兩種成分，可分為α與β兩類。隨後發現的ε，K，ω，δ-1FN均屬於I型幹擾素。II型則定義為Y類幹擾素。ω-幹擾素是奧地利科學家Rudelf Hamptan等人於1985年發現的I型幹擾素。GuntherR.Adolf等在1987年發現ω-幹擾素與α-幹擾素功能相近，但是抗原性和免疫原性不同。Tiefenthaler等在1997年發現，ω-幹擾素與a _2a_幹擾素在體外抑制腫瘤細胞活性，尤其是抑制慢性骨髓細胞性白血病(CML)的骨髓細胞增殖有非常相似的作用。Hagelstein等人發現，人ω-幹擾素具有與α -幹擾素、Y -幹擾素以及腫瘤壞死因子相似的抗病毒複製與抗細胞增殖等作用。由於ω-幹擾素具有較強的抗病毒複製，抗細胞增殖和免疫調節等作用，ω-幹擾素在多種腫瘤、病毒性疾病的治療及對α-幹擾素具有耐藥的患者具有廣闊的應用前景，其臨床應用已經逐漸展開。
[0003]幹擾素是治療慢性B型肝炎或慢性C型肝炎的首選藥物，可以有效地抑制或清除病毒，並可阻止肝硬化或肝癌的發生。由於B型肝炎病毒(HBV)和C型肝炎病毒(HCV)複製很快，幹擾素治療時需要維持恆定的血藥濃度才能發揮最大的病毒抑制作用。幹擾素一般為每隔一天給藥一次，給藥後血藥濃度迅速達到峰值。用藥後24小時和給藥的間歇期，幹擾素的血藥濃度降至很低，病毒重新開始複製，這就是幹擾素的「峰-谷」效應。這主要是由於幹擾素分子量小、在體內易被蛋白酶降解和腎小球過濾，導致幹擾素在體內的循環半衰期短。另外，幹擾素在臨床應用中還同時存在血小板減少、心律失常、流感樣症狀、蕁麻疹、斑丘疹等過敏反應和一系列的毒副作用。這些問題是由外源性蛋白在人體內產生免疫反應而引起的，嚴重製約了其臨床應用。
[0004]因此，國內外學者競相開展了長效幹擾素的研究。其中，聚乙二醇(PEG)修飾是目前製備長效蛋白質和多肽藥物最為成功的策略之一。PEG是一個以-CH2CH2O-為基礎結構的大分子聚合物，常用來進行蛋白質的修飾。PEG修飾對蛋白質藥物有空間屏蔽作用，能有效地減少蛋白水解酶的降解作用，降低其抗原性和免疫原性，延長循環半衰期，同時提高穩定性和溶解性。PEG修飾在幹擾素的長效劑型開發中得到了成功的應用，如PEG化的a 2a_幹擾素(Pegasys, Roche 公司)和 PEG 化的 a 2b_ 幹擾素(PEG-1ntron, Schering 公司)等，通過與利巴韋林聯合廣泛應用於肝炎的治療。Pegasys是被分子量為40kDa的分枝型PEG隨機修飾的a 2a_幹擾素。Pegasys的循環半衰期為96小時，能保持幹擾素a 2a抗病毒活性的7%。PEG-1ntron是被分子量為12kDa的線型PEG隨機修飾的a 2b_幹擾素。PEG-1ntron的循環半衰期為45小時，能保持a 2b_幹擾素抗病毒活性的28%。目前，PEG修飾的ω-幹擾素尚未上市。
[0005]儘管PEG修飾可延長ω-幹擾素的循環半衰期，改善ω-幹擾素的藥學性質，目前PEG修飾ω-幹擾素也存在一些問題。例如，由於PEG為鏈狀高分子聚合物，不可避免地會在一定程度上遮蔽ω-幹擾素表面的活性位點，從而降低ω-幹擾素的生物活性。因此，需要在延長ω-幹擾素循環半衰期的同時，降低PEG對ω-幹擾素的空間屏蔽作用，提高ω-幹擾素的生物活性。2-亞氨基硫雜環戊烷(2-1minothiolane)是環狀硫代亞胺酯化合物，能與ω-幹擾素的伯胺基反應引入巰基。ω-幹擾素分子表面的巰基與PEG-馬來醯亞胺反應，可實現PEG修飾ω-幹擾素(圖1)。由於PEG與ω -幹擾素之間存在著較長的連接橋，預計可以降低PEG對ω-幹擾素的空間屏蔽作用，提高ω-幹擾素的生物活性。本發明採用2-亞氨基硫雜環戊烷輔助ω-幹擾素的PEG修飾。目前市場上在售的幹擾素藥物大多是基於α-幹擾素和幹擾素，尚未出現ω-幹擾素的PEG修飾產品。
【發明內容】
[0006]針對上述問題，本文發明提出了一種PEG修飾ω-幹擾素的方法。用2_亞氨基硫雜環戊烷與ω-幹擾素的伯胺基反應，引入的巰基分別與分子量為20kDa和40kDa的PEG-馬來醯亞胺反應，可實現PEG修飾ω-幹擾素。通過分離純化，得到分子量均一的PEG修飾ω-幹擾素，即每個ω-幹擾素分子結合I個PEG分子。該修飾方法預期能減少ω-幹擾素生物活性的損失。
[0007]本發明涉及製備PEG修飾ω -幹擾素的方法，包括以下步驟:
[0008](I)確定IFN-mal_P20K的製備條件:將ω -幹擾素溶液置換到20mM的磷酸緩衝液(PH7.0-7.4)中。調整ω-幹擾素濃度為2.2毫克/毫升(0.1mM)，按ω-幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:的不同摩爾比`例，於4°C分別反應2-24小時。隨後，用截留分子量為IOkDa的超濾管離心除去未反應的2-亞氨基硫雜環戊烷。加入不同摩爾比例的PEG-馬來醯亞胺(20kDa)，於4°C分別反應2-24小時，完成PEG對ω-幹擾素的化學修飾。其中，ω-幹擾素與分子量為20kDa的PEG以摩爾比為1:1的產物為目的產物，即IFN-mal_P20K。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm,美國GE Healthcare公司)檢測在不同反應條件下製備的PEG修飾產物，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.4)，流速為0.5毫升/分鐘。通過檢測IFN-mal-P20K的產率，確定最優的反應條件。
[0009](2)確定IFN-mal_P40K的製備條件:將ω-幹擾素溶液置換到20mM的磷酸緩衝液(PH7.0-7.4)中。調整ω-幹擾素濃度為2.2毫克/毫升(0.1mM)，按ω-幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:的不同摩爾比例，於4°C分別反應2-24小時。隨後，用截留分子量為IOkDa的超濾管離心除去未反應的2-亞氨基硫雜環戊烷。加入不同摩爾比例的PEG-馬來醯亞胺(40kDa)，於4°C分別反應2-24小時，完成PEG對ω-幹擾素的化學修飾。其中，ω-幹擾素與分子量為40kDa的PEG以摩爾比為1:1的產物為目的產物，即IFN-mal_P40K。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm,美國GE Healthcare公司)檢測在不同反應條件下製備的PEG修飾產物，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.4)，流速為0.5毫升/分鐘。通過檢測IFN-mal-P40K的產率，確定最優的反應條件。
[0010](3)將步驟I和步驟2所得到的反應混合物首先由SP Sepharose HP柱(1.6cmX25cm,美國 GE Healthcare 公司)進行純化。SP Sepharose HP 柱由 20mM 乙酸鈉-乙酸緩衝液(PH5.0)進行平衡。上樣後繼續用該緩衝液進行充分洗脫，流速為1.0毫升/分鐘，可以除去未反應的PEG-馬來醯亞胺。用含有0.5M氯化鈉的20mM乙酸鈉-乙酸緩衝液(pH5.0)繼續洗脫，流速為1.0毫升/分鐘，收集洗脫峰。洗脫峰繼續由Superdex200柱(2.6cmX60cm,美國GEHealthcare公司)進行純化。Superdex200柱由20mM的憐酸緩衝液(pH7.4)平衡，上樣後繼續用該緩衝液進行洗脫，流速為3.0毫升/分鐘。收集對應於ω -幹擾素的PEG單修飾產物，濃縮後用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜進行產物鑑定。
[0011](4)PEG修飾位點的鑑定:將ω-幹擾素和PEG修飾產物置換到含2.0M脲的NH4HCO3(0.05Μ, ρΗ8.3)溶液中，將蛋白濃度調整為1.0毫克/毫升。將胰蛋白酶和蛋白以質量比為1:100的比例，於37°C下孵育10小時，酶解產物使用反相HPLC柱(0.46cmX25cm,日本Proteonavi公司)進行酶切片段的分離和鑑定。
[0012](5)PEG修飾ω-幹擾素的抗病毒活性:通過測定皰疹性口炎病毒對WISH細胞的細胞病理效應，可評估ω-幹擾素的抗病毒活性。測定ω-幹擾素對病毒誘發的細胞溶解的抑制效率，可計算出PEG修飾ω-幹擾素的抗病毒活性。
[0013](6)PEG修飾ω-幹擾素的藥代動力學:選取2.3_2.8公斤雄性紐西蘭大耳白兔15隻，隨機分為3組。其中，第I組為ω-幹擾素組，第2組為分子量為20kDa PEG修飾的ω-幹擾素(IFN-mal-P20K)組，第3組為分子量為40kDa PEG修飾的ω -幹擾素(IFN-mal-P40K)組。注射劑量為20微克ω-幹擾素/公斤白兔。經皮下注射後，於第0、0.1、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、288和312小時進行耳靜脈取血，離心收集血漿。用人ω-幹擾素ELISA試劑盒測定血漿中的ω-幹擾素含量。 [0014]本發明的優點在於，修飾產物中的單修飾產率較高，且生成的二修飾和多修飾產物較少，有利於PEG單修飾產物的分離純化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1PEG化ω -幹擾素的製備反應式。
[0016]圖2分子量為20kDa的PEG化ω-幹擾素的凝膠過濾色譜圖。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)，洗脫液流速為0.5毫升/分鐘，洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(PH7.4)。樣品I為ω-幹擾素，樣品2-6為ω -幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:PEG-馬來醯亞胺(20kDa)摩爾比為1:1: 1、1: 1: 2、1:2: 2、1:2:4和1:4:4的比例下製備的PEG修飾產物。
[0017]圖3分子量為40kDa的PEG化ω-幹擾素的凝膠過濾色譜圖。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)，洗脫液流速為0.5毫升/分鐘，洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(PH7.4)。樣品1-5為ω-幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:PEG-馬來醯亞胺(40kDa)摩爾比為1:1: 1、1:1:2、1:2:2、1:2:4和1:4:4的比例下製備的PEG修飾產物。
[0018]圖4SDS-PAGE分析PEG化ω -幹擾素。第I泳道是標準蛋白，第2泳道是ω -幹擾素，第3泳道是IFN-mal-P20K，第4泳道是IFN-mal_P40K。
[0019]圖5凝膠過濾色譜分析PEG化ω -幹擾素。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)，洗脫液流速為0.5毫升/分鐘，洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(pH7.4)。
[0020]圖6IFN-mal-P20K的修飾位點鑑定。使用反相HPLC柱(0.46cmX25cm,日本Proteonavi公司)進行酶切肽段分離。[0021]圖7PEG化ω-幹擾素的抗病毒活性。通過測定ω -幹擾素對病毒誘發的細胞溶解的抑制效率，計算PEG化ω -幹擾素的抗病毒活性。
[0022]圖8紐西蘭大耳白兔血漿中ω-幹擾素的濃度變化曲線。紐西蘭大耳白兔經皮下注射PEG修飾產物，血漿中ω -幹擾素的含量由ELISA定量試劑盒測定。
【具體實施方式】
[0023]實施例lIFN-mal_P20K製備條件的確定
[0024]將ω-幹擾素置換到50mM NaAc-HAc緩衝液(pH5.5)中，調整ω-幹擾素濃度為
2.2mg/mL (即0.1mM)。按ω -幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:PEG-馬來醯亞胺(20kDa)摩爾比為1:1:1、1:1:2、1:2:2、1:2:4和1:4:4，於4°C分別反應過夜(~16小時)。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)對修飾產物進行檢測，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.4)。20kDa PEG-馬來醯亞胺修飾ω -幹擾素的結果如圖2所示，以IFN-mal_P20K的峰面積(2峰)與總的峰面積比值大小來衡量產率。隨著2-亞氨基硫雜環戊烷和20kDaPEG-馬來醯亞胺反應比例的提高，IFN-mal-P20K的產率也隨之提高，而ω-幹擾素的峰面積減少(3峰)。但是，隨著反應比例的增加，出現了多修飾的ω-幹擾素(1峰)，並隨著反應比例的增加而增加。雖然摩爾比為1:4:4時能夠得到較高的IFN-mal-P20K，但考慮到IFN-mal-P20K與多修飾的ω -幹擾素不易分離，因此選用摩爾比為1:2:4的反應比例來製備 IFN-mal-P20K。
[0025]實施例2IFN-mal_P40K製備條件的確定
[0026]將ω-幹擾素置換到50mM NaAc-HAc緩衝液(pH5.5)中，調整ω-幹擾素濃度為
2.2mg/mL (即0.1mM)。按ω -幹擾素:2_亞氨基硫雜環戊烷:PEG-馬來醯亞胺(40kDa)摩爾比為1:1:1、1:1:2、1:2:2、1:2:4和1:4:4，於41:分別反應過夜(~16小時)。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)對修飾產物進行檢測，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.4)。40kDa PEG-馬來醯亞胺修飾ω -幹擾素的結果如圖3所示，以IFN-mal_P40K的峰面積(2峰)與總的峰面積比值大小來衡量產率。隨著2-亞氨基硫雜環戊烷和40kDaPEG-馬來醯亞胺反應比例的提高，IFN-mal-P40K的產率也隨之提高，而ω-幹擾素的峰面積減少(3峰)。但是，隨著反應比例的增加，出現了多修飾的《-幹擾素(1峰)，並隨著反應比例的增加而增加。雖然摩爾比為1:2:4和1:4:4時能夠得到較高的IFN-mal-P40K，但考慮到IFN-mal-P40K與多修飾的ω -幹擾素不易分離，因此選用摩爾比為1:2:2的反應比例來製備 IFN-mal-P40K。
[0027]實施例3IFN-mal_P20K 與 IFN-mal_P40K 的鑑定
[0028]用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜鑑定IFN-mal_P20K與IFN-mal_P40K。如圖4所示，IFN-mal-P20K與IFN-mal_P40K在SDS-PAGE電泳圖上均表現出一條帶，這表明這兩種PEG修飾產物具有較高的純度。IFN-mal-P40K電泳帶的遷移速率要慢於IFN-mal_P20K，而IFN-mal_P20K要慢於ω-幹擾素。這表明PEG修飾能增加ω-幹擾素的分子量，且IFN-mal-P40K的分子量要高於IFN-mal_P20K。如圖5所示，經緩衝液洗脫後，IFN-mal-P20K與IFN-mal_P40K分別在Superdex200凝膠過濾柱(1.0cmX30cm)出現I個單一的洗脫峰。其中，IFN-mal-P20K的出峰時間要快於IFN-mal-P40K，而要慢於ω-幹擾素。這表明IFN-mal-P20K與IFN-mal-P40K具有較高的純度，且分子量要大於ω-幹擾素。[0029]實施例4PEG修飾位點的鑑定
[0030]將ω -幹擾素與 IFN-mal_P20K 經含 2.0M 脲的 NH4HCO3 (0.05M, pH8.3)的緩衝液中充分透析，而後調節濃度至1.0毫克/毫升。取胰蛋白酶，用超純水配置濃度為1.0毫克/毫升的儲液。按照胰蛋白酶和蛋白的質量比為1:100的比例，分別加入胰蛋白酶儲液，於37°C孵育10小時。使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)進行酶切肽段分離。反相HPLC柱使用95%的溶液A (含0.1%三氟乙酸的超純水)和5%的溶液B (含0.1%三氟乙酸的乙腈)充分平衡，流速為0.5毫升/分鐘。採用線性洗脫方式於100分鐘從5%溶液B升至50%溶 液B，檢測流出液在214納米的吸收值。
[0031]結果如圖6所示，胰蛋白酶可以將ω-幹擾素與IFN-mal_P20K切成不同的肽段。其中以Tll(75-123)肽段作為對照。與未修飾的
肽段、T4 (26-33)肽段、T14 (131-134)肽段和T17+18 (138-152)肽段所對應的峰高均有所降低。這表明PEG分子與這些肽段發生了化學修飾，導致這些肽段所對應的峰高降低。除此之外，其它酶切片段與ω-幹擾素相比無顯著變化。由於2-亞氨基硫雜環戊烷能與N-末端的亮氨酸(Leu1)的α -氨基和賴氨酸(Lys)的ε -氨基反應，因而PEG的修飾位點集中在Leu1,第33位的賴氨酸(Lys33),第134位的賴氨酸(Lys134)和第152位的賴氨酸(Lys152)。
[0032]實施例5IFN-mal_P20K 與 IFN-mal_P40K 的抗病毒活性
[0033]通過測定皰疹性口炎病毒對WISH細胞的細胞病理效應，可評估ω -幹擾素的抗病毒活性。如圖7所示，與未修飾的ω -幹擾素相比，IFN-mal-P20K與IFN-mal_P40K分別能保持25.4%和10.2%的抗病毒活性。這說明PEG修飾會降低ω -幹擾素的抗病毒活性，而且PEG分子量越高，抗病毒活性下降越多。另一方面，IFN-mal-P40K保留的抗病毒活性要高於Pegasys (7%)。其中，IFNial-P40K是結合了 I個分子量為40kDa的分枝型PEG的ω-幹擾素，而Pegasys是結合了 I個分子量為40kDa的分枝型PEG的a 2a-幹擾素。這表明延長PEG與ω-幹擾素的連接橋，可有效提高PEG修飾ω-幹擾素的抗病毒活性。
[0034]實施例6IFN-mal_P20K與IFN-mal_P40K的藥代動力學評價
[0035]選取2.3-2.8公斤雄性紐西蘭大耳白兔15隻，隨機分為3組。其中，第I組為ω -幹擾素組，第2組為IFN-mal-P20K組，第3組為IFN-mal_P40K組。皮下注射樣品後於不同時間取血，隨後測定血漿中的ω-幹擾素濃度。如圖7所示，ω-幹擾素被快速從血漿中清除，其循環半衰期(Τ1/2)僅為1.54小時。與ω-幹擾素相比，IFN-mal-P20K和IFN-mal-P40K不易被清除，其循環半衰期分別為41.71小時和130.4小時。與ω -幹擾素相比，IFN-mal-P20K和IFN-mal-P40K的生物利用度(CL)分別增加了 27.1倍和84.7倍。ω-幹擾素能被機體快速吸收，保留時間峰值(Tmax)為0.5小時，隨後快速下降。相比之下，IFN-mal-P20K和IFN-mal_P40K吸收速度慢，保留時間峰值分別為4.0小時和8.0小時。與ω-幹擾素相比，IFN-mal-P20K和IFN-mal_P40K的血漿濃度峰值(Cmax)分別增加了 1.23倍和1.36倍；IFN-mal-P20K和IFN-mal_P40K的藥物濃度隨時間變化的曲線下面積(AUC)分別增加了 16.3倍和29.8倍。這些數據表明，PEG修飾能顯著增強ω-幹擾素的藥代動力學特性；且PEG分子量越大，ω-幹擾素的藥代動力學特性增加越多。
【權利要求】
1.一種聚乙二醇(PEG)化ω-幹擾素，其特徵在於PEG與ω-幹擾素之間存在著較長的連接橋，可以降低PEG對ω -幹擾素的空間屏蔽作用。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其製備過程是由2-亞氨基硫雜環戊烷(2-1minothiolane)與ω -幹擾素的伯胺基反應引入巰基，ω -幹擾素的巰基與PEG-馬來醯亞胺共價結合。
3.根據權利要求1所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其特徵在於每個ω-幹擾素分子僅結合I個PEG分子。
4.根據權利要求1所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其特徵在於PEG是單甲氧基聚乙二IKmPEG) ο
5.根據權利要求1所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其特徵在於PEG-馬來醯亞胺的分子量在5kDa~40kDa之間，優選的PEG分子量是20kDa，。
6.根據權利要求2所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其特徵在於2-亞氨基硫雜環戊烷與ω-幹擾素反應的摩爾比為1-20之間，優選的摩爾比在2-4之間。
7.根據權利要求2所述的聚乙二醇化ω-幹擾素，其特徵在於PEG-馬來醯亞胺與ω -幹擾素的摩爾比為1-20之間，優選的摩爾比在2-4之間。
8.根據權利要求1所述的PEG修飾`的ω-幹擾素，用於製備抗病毒藥物和抗腫瘤藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK103694335SQ201310700756
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】胡濤, 陳薇, 於長明, 房婷, 付玲, 張金龍, 於婷 申請人:中國科學院過程工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所