聚乙二醇化重組人DesB30胰島素及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-07 18:38:44

專利名稱：聚乙二醇化重組人DesB30胰島素及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及去B^重組人胰島素(重組人DesB30胰島素)製備方法及 採用化學修飾的方法使該胰島素的合適部位結合聚乙二醇。具體涉及DesB30人胰島素的 P. Pastoris表達系統載體構建、重組質粒轉化、發酵、純化、酶切以及聚乙二醇化人DesB30 胰島素的製備方法。
技術背景胰島素是胰島13細胞所分泌的一種激素，胰島素通過與體內細胞膜 上受體的相互作用，調節血糖維持在正常水平。Kjeldsen(A卯l Microbiol Biotechnol， 2000,54(3) :277 286)在S. cerevisiae中表達人胰島素原時，最終不能有效地分泌 胰島素原或胰島素，但若在在編碼胰島素原cDNA的分子中去除B3°蘇氨酸(T)，並使之與 S. cerevisiae的前導肽a因子相連，然後將人胰島素原的C肽用短C肽代替或直接將 B29賴氨酸(K)與A 1甘氨酸(G)相連，能有效提高單鏈胰島素原類似物的分泌表達水平。 Annibali(US Patent, 7091032. 2006-08-15)用巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)分泌表達出 短C肽人胰島素原B(l-30)-Yl-Y2-A(l-21)，其中Yl、 Y2可以是賴氨酸(K)或精氨酸(R)。 本發明選用P. pastoris作為基因表達系統，是因為與以往的基因表達系統相比，它具有高 表達特性，被認為是最具有發展前景的生產蛋白質的工具之一。在P.pasoris中表達的蛋 白既可存在於胞內，又可分泌至胞外。P. pasoris自身分泌的蛋白非常少，十分有利於純化。 分泌表達的短C肽人胰島素原類似物的純化和酶切的工藝相對簡單，具有實際價值，本發 明建立了僅用胰蛋白酶單一酶切除去短C肽AEDAK的方法和條件，建立的純化工藝回收率 高，為工業化製備和研究重組胰島素具有重要意義 長效胰島素的理想效果是通過儘可能少的胰島素注射次數，在糖尿病患者體內 重建胰島素基礎分泌。頻繁地注射胰島素，給糖尿病患者帶來諸多的不便和痛苦，臨床上 需要注射間隔時間更長的超長效胰島素。化學修飾是獲得長效胰島素的途徑之一，經過化 學修飾，可使胰島素在保持生物活性的同時，半衰期延長，抗原性降低。化學修飾劑的結 構必須穩定、無毒性、無抗原性並具有合適大小的分子量。諾沃挪第克公司(中國專利， 200480021733. 8，
公開日2006年9月6日)發明了一種新型胰島素衍生物，該胰島素衍生 物是在母體胰島素B鏈N-末端胺基酸殘基的a -氨基處或者在母體胰島素B鏈上存在的 Lys殘基的e -氨基處連接了側鏈的天然存在的胰島素或其類似物，該胰島素衍生物在生 理pH值下可溶。聚乙二醇(PEG)是一種具有較好生物相容性的高分子化合物，對人體無毒 性。用PEG活性酯修飾蛋白質或多肽藥物，可在蛋白質或多肽分子上形成保護層，增大相對 分子質量並增加藥物的水溶性。相對分子質量的增大會降低腎小球的清除速率，增加藥物 在體內循環的半衰期，從而獲得長效。耐科塔醫藥公司(中國專利，200710085552. 7，公開 日2007年10月3日)發明了具有活性的親水聚合物修飾的胰島素衍生物。鬱正豔等(中 國專利，200410089050. 8，
公開日2005年8月10日)發明了一種單甲氧基聚乙二醇-胰島 素複合物，胰島素和單甲氧基聚乙二醇通過前者的游離氨基和後者的具有活性的丙醛基團 連接在一起，分子量介於10. 8 25. 8KD。印春華等(中國專利，200610118923. 2，
公開日: 2007年5月30日)發明了一種單修飾的聚乙二醇化胰島素(PheBl-PEG-胰島素)，聚乙二 醇與胰島素以碳氮鍵相連，分子量範圍6. 55 10. 8KD。本發明選用單甲氧基聚乙二醇通過琥珀醯亞胺基活性基團與重組人DesB30胰島素的LysB29或LysB29和GlyA1的游離氨基形成 醯氨鍵，製備而成的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素性質穩定，保留了胰島素降血糖生物 活性。經糖尿病動物模型證明本發明的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素可維持48-72小 時的降血糖作用，可作為一種治療I型和II型糖尿病的長效胰島素藥物。

發明內容
1、目的基因獲得 選擇DesB30人胰島素(HIDesB30)的胺基酸序列，在A鏈與B鏈間加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰島素原(HMPIDesB30)的胺基酸序列。根據酵母偏愛密碼子，在 5'端引入畢赤酵母表達載體的分泌信號肽a因子的Stel3識別位點和XhoI位點，3'端引 入Notl位點和終止子，合成全基因。
2、畢赤酵母表達載體構建 上述基因合成後，用Xhol， Notl雙酶切後，與Xhol， Notl雙酶切後的pPIC9用T4 連接酶進行連接，轉化DH5 a菌，塗布LB-Ampicillin平板，培養LB-Ampicillin平板上長 出的菌落，提質粒，用XhoI，NotI雙酶切鑑定。再用Sail和Sacl雙酶切pPIC9重組質粒獲 得小片段，與Sail和Sacl雙酶切後的pPIC9K大片段用T4連接酶進行連接，轉化DH5 a菌， 塗布LB-Ampicillin平板，培養LB-Ampicillin平板上長出的菌落，提質粒，用Xhol， Notl 雙酶切鑑定。 3 、酵母表達工程菌的獲得 用Sail單酶切線性化質粒pPIC9K-HMPIDesB30，回收，電轉酵母GS115，將電轉後 的GS115塗MD平板，各菌落進行培養和表達，經電泳檢測和G418高拷貝篩選，獲得高效表 達工程菌。 4、重組酵母工程菌發酵和純化 畢赤酵母工程菌經發酵罐發酵培養72h後菌液0D6。。達到300以上後，培養液過濾， 上樣大孔吸附樹脂，再用陽離子交換層析獲得純度大於95X的重組人DesB30胰島素原。
5、酶切獲得重組人DesB30胰島素 胰蛋白酶單酶切重組人DesB30胰島素原，酶切效率大於90%。
6、重組人DesB30胰島素聚乙二醇修飾 胰島素分子中有三個裸露的氨基，即GlyA、pKa " 8. 0) 、 PheB1 (pKa 9. 5時LysB29上 e-氨基的單修飾佔主要[Hinds K et al Bioconjug Chem. 2000， 11 (2) : 195-201.]。通過 控制反應緩衝的pH值通過調節胰島素與修飾劑的摩爾比及修飾後的純化得到比較均一的 LysB29單修飾產物以及GlyA1和LysB29雙修飾產物。本發明的單分子聚乙二醇化及兩分子聚 乙二醇化重組人DesB30胰島素的製備方法如下 (1)將1份DesB30人胰島素溶於Na2PH04溶液(pH值為10. 0)(份數以摩爾計)；
(2)將3. 0份mPEG-SPA (5k)溶於Na2PH04溶液(pH值為10. 0)(份數以摩爾計)；
(3)胰島素溶液與mPEG-SPA(5k)溶液混合，室溫攪拌20 30min，稀釋後調pH值至3終止反應； (4)反相HPLC回收修飾產物。 所說的磷酸鹽緩衝液的pH值為8. 5 11. O，優選的pH值為10. 0。所說的mPEG-SPA和胰島素的用量摩爾比為2. 0 5. O，mPEG-SPA和胰島素的用量
摩爾比過低，胰島素不能充分被修飾，過高，則其他位點被更多修飾。 所說反應溫度為室溫，反應溫度過低會使反應速度慢，但過高則會使蛋白質變性。
所說的反應時間為20 30min，低於20min，大量胰島素不能被修飾，超過 30minmPEG-SPA水解，修飾不能繼續進行。
本發明具有以下的創新和實用性。 (1)採用P. Pastoris分泌表達短C肽AEDAK的人胰島素原類似物HMPIDesB3°。表 達產物未產生糖基化，未出現二聚體和多聚體。這種分泌表達的短C肽DesB30人胰島素原 的純化和酶切的工藝相對簡單。 (2)本發明克服傳統的酵母分泌表達產物超濾濃縮工藝無法除去大量色素的缺 點，選用大孔吸附樹脂代替超濾建立了 P. Pasotoris酵母分泌表達純化工藝。建立的純化 工藝回收率高。 (3)建立了僅用胰蛋白酶單一酶切除去短C肽的方法和條件，為工業化製備和研 究重組人DesB30胰島素具有實用價值。 (4)單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素保持了胰島素 原有的生物活性，延長了降血糖作用時間，代謝平穩，使胰島素的生物利用度提高；
(5)mPEG與胰島素連接的醯氨鍵比較穩定，單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇 化重組人DesB30胰島保留了重組胰島素的降血糖生物活性。 (6)單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，通過控制pH、 反應時間及修飾劑比例可實現胰島素的定位修飾。 (7)聚乙二醇化重組人DesB30胰島素可作為一種治療糖尿病的長效胰島素製劑。


圖1為實施例2-3中畢赤酵母表達質粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30
構建示意圖。 圖2為實施例5中重組人DesB30胰島素原蛋白的純化過程高效液相色譜圖，檢測 波長214nm，目的蛋白吸收峰保時間在14min左右。(a)發酵液上清；(b)60X (v/v)乙醇大 孔吸附樹脂洗脫液；(c) 25mMol/LTris-HCl pH 9SP柱洗脫液；(d) ZnCl2沉澱目的蛋白溶解 於含5mMol/L EDTA的25mMol/L Tris-HCl。 圖3為實施例5中胰蛋白酶酶切獲得重組人DesB30胰島素的高效液相色譜圖，檢 測波長214nm。 (a)酶切前HMPIDesB30 ; (b)HMPIDesB30與胰蛋白酶按質量比5000 : 1，4°C 酶切過夜，酶切後吸收峰後移，酶切效率大於90%。 圖4為酶切後回收產物重組人DesB30胰島素分子量質譜結果酶切產物的理論分 子量為5694. 5，質譜測定分子量為5705. 43，測定值在誤差允許的範圍內與理論值一致。
圖5為實施例9中重組人DesB30胰島素單分子聚乙二醇修飾後的高效液相色譜 圖，檢測波長214nm，峰1為單分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。
7
圖6為實施例8中重組人DesB30胰島素雙分子聚乙二醇修飾後的高效液相色譜 圖，檢測波長214nm，峰2為雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。 圖7為實施例7中重組人DesB30胰島素LysB29單分子聚乙二醇修飾並純化後，質 譜測定結果與DesB30-PEGl分子量一致。 圖8為實施例8中重組人DesB30胰島素LysB29和GlyA1雙分子聚乙二醇修飾並純 化後，質譜測定結果與DesB30-PEG2分子量一致。 圖9為實施例9中二種PEG修飾DesB30胰島素降血糖持續時間的比較。
圖10為實施例10中DesB30-PEG2的代謝特徵。
具體實施例方式
通過下面的具體實施例可進一步了解本發明。但它們不是對本發明的限定。
實施例l:目的基因的獲得 選擇DesB30人胰島素(HIDesB30)的胺基酸序列，在A鏈與B鏈間加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰島素原(HMPIDesB30)的胺基酸序列。根據酵母偏愛密碼子，在 5'端引入畢赤酵母表達載體的分泌信號肽a因子的Stel3識別位點和XhoI位點，3'端引 入Notl位點和終止子，合成全基因。單鏈核苷酸序列如下 5' CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCCCAC TTG GTT GM GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACTCCA MG GCT GAG GAT GCT MG GGT ATC GTT GM CAA TGT TGT ACT TCC ATC TGTTCC TTG TAC CAATTG GAAAAC TAC TGTAAC TGATAA GCGG CCGC 3' 畢赤酵母表達質粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30構建(重組質粒的
設計和構建見示意圖1) 實施例2 :pPIC9-HMPIDesB30構建 上述基因合成後，用XhoI，NotI雙酶切後，與XhoI，NotI雙酶切後的pPIC9在16°C 下用T4連接酶反應過夜。用CaCl2法轉到DH5 a中，並均勻塗布LB-Ampicillin平板，37°C ， 20h，挑取長出的菌落，經培養後提質粒，用Xhol， Notl雙酶切鑑定，選出嵌合上HMPIDesB30 片段的菌(命名為pPIC9-HMPIDesB30)，培養並提取質粒。 實施例3 :pPIC9K-HMPIDesB30構建用Sail和Sacl雙酶切pPIC9-HMPIDesB30獲得 小片段，與Sail和Sacl雙酶切後的pPIC9K大片段在16。C下用T4連接酶反應過夜。用CaCl2 法轉到DH5 a中，並均勻塗布LB-Ampici 11 in平板，37 °C ， 20h，挑取長出的菌落，提質粒，用 Xhol， Notl雙酶切鑑定，選出嵌合上HMPIDesB30片段的菌(命名為pPIC9K-HMPIDesB30)，測序。 實施例4 :HMPIDesB30的誘導表達及酵母表達工程菌的獲得 將pPIC9K-HMPIDesB30質粒用Sail線性化後電轉入畢赤酵母宿主菌GS115，電轉 後立即向電轉杯中加lmL lmol/L預冷的山梨醇懸浮菌體，取200iiL菌液塗布含有G418濃 度差(0. 5， 1， 2， 3， 4)的MD板，30。C烘箱培養5-7天，長出的菌落數分別為75， 30， 11， 6， 3 個，說明多拷貝篩選成功。從含G4184mg/mL MD平板上選出一個高表達菌株，經過72h誘導， 採用HPLC法檢定，獲得一株表達量相對較高的菌定為工程菌。
實施例5 :重組人DesB30胰島素的純化(純化結果見示意圖2)
步驟1 :大孔吸附樹脂層析 發酵液經高速冷凍離心機(23，000g，4°C )連續流離心後，收集上清。為防止微 小顆粒堵塞填料，發酵上清液用0. 45 m濾紙過濾。平衡緩衝用乙酸調去離子水pH值至 3-4，上樣後用25%乙醇(乙酸調pH值至3-4)清洗雜質，表達產物由60%乙醇(乙酸調pH 至3-4)洗脫。平衡速率30mL/min ;上樣速率10mL/min洗脫速率20mL/min。
步驟2 :陽離子交換層析選用5mMol/L乙酸-乙酸鈉作為平衡緩衝，25mMol/L Tris-HCl pH 9. 0洗脫。平 衡速率25mL/min，上樣速率13mL/min，洗脫速率13mL/min。
步驟3 :ZnCl2沉澱 向SP柱的洗脫液中加入lmMol/LZnCl2，4t:靜置過夜。高速冷凍離心棄沉澱，再向 上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4。C靜置過夜，離心後將沉澱溶解於含10-20mMol/L EDTA 的25mMol/L Tris—HCl (pH9. 0)中。
步驟4:胰蛋白酶酶切 酶切緩衝25mMol/LTris-HCl (pH9. 0)，按酶/蛋白質量比1 : 5000加入經TPCK 處理過的胰蛋白酶，混勻，4t:酶切過夜。用lmol/L HCl調整pH至3.0以下終止反應。反 相回收酶切產物獲得重組人DesB30胰島素樣品後凍幹。(酶切效率見示意圖3，4)
實施例6 :重組人DesB30胰島素LysB29單分子聚乙二醇修飾(DesB30-PEGl)
(1)將1份DesB30人胰島素溶於DMF和Na2PH04混合溶液(pH值為9. 5 10. 5) (份數以摩爾計)； (2)將2份mPEG-SPA (5K)溶於DMF (份數以摩爾計)； (3)胰島素溶液與mPEG-SPA溶液冰上混合，室溫攪拌20 30min， DDW稀釋10倍 加稀HC1至pH值為3終止反應；(修飾結果見示意圖5、7) [OOes] (4)反相HPLC回收修飾產物(圖4峰1)。 實施例7 :重組人DesB30胰島素LysB29和GlyA1雙分子聚乙二醇修飾 (DesB30-PEG2) (1)將1份DesB30人胰島素溶於DMF和Na2PH04混合溶液(pH值為9. 5 10. 5) (份數以摩爾計)； (2)將4份mPEG-SPA(5K)溶於DMF(份數以摩爾計)； (3)胰島素溶液與mPEG-SPA溶液冰上混合，冷卻至室溫攪拌20 30min， DDW稀 釋10倍加稀HC1至pH值為3終止反應；(修飾結果見示意圖6、8)
(4)反相HPLC回收修飾產物(圖5峰2)。
實施例8 :STZ致小鼠糖尿病模型的建立 按200mg/kg劑量腹腔注射STZ (用0. lmol/L檸檬酸鈉緩衝液pH 4. 4現用現配成 20mg/mL的溶液)進行損傷。注射後提供充足的食物和水，觀察是否有多飲、多食、多尿及體 重減輕的現象。注射STZ 72h後，測定體重和空腹(6h)血糖值，體重明顯減輕，並且血糖值 > 16. 7mmol/L確定為模型 實施例9 :幾種修飾胰島素藥效持續時間的比較 將成模小鼠，隨機分為4組A陰性對照組(不注射任何藥物)，B陽性對照組 (Detemir)組，C DesB30-PEGl組，D DesB30-PEG2組。B、 C、 D、組按0. 5me/kg給藥，給藥後4、8U2、24、36、48h斷尾測空腹(6h)血糖值，採血時若血糖值高於成模時血糖值則終止取
樣。藥效持續時間長短排序DesB30-PEG2 > DesB30-PEGl > Detemir
空腹血糖值 體重
胰島素-成模前成模後4h8h12h24 h36 h48 h成模前成模後
不注射 (陰性對照)3.7±0.419.4±2.120.8±2.323.3±1.725.5土1.226.2±0.526.3±0.722.2士2.418-5±2-7"
Detemir (陽性對照)3.7±0.220.肚3.0"16.4土2甲88113.0±2.3*17.9±3 0*22.0±2.222.5±2.219.8±2.0**
DesB30-PEG23.8±0.218.9±2.3**8.5±2-5*8.7±2.4*8.2±2.4*17.7±2.4*23.9土3.821.2±2.317.3士2.1"
DesB30-PEG13.8±0.219.3±3.0**13.5±2.7*14.2±2.116.4±2.522.3±1.823,3±1.919.7士1.9" 血糖濃度與時間關係見附圖9 實施例10 :DesB30-PEG2的代謝特徵實驗將成模小鼠，隨機分為2組ADesB30-PEG2，B Detemir組。空腹4h後按0. 5mg/kg 給藥。給藥後1、2、3、4、6h斷尾測血糖值。DesB30-PEG2未出現代謝的波峰與波谷，代謝特 徵與Detemir類似。(見附圖10)
_成模時 1 h_^_^_￡^_6h
Detemir 19.0±1.8 16.3±1.9 13.2±2.0 10.2±2.1 8.9±1.9 9.5±2.0
DesB30-PEG2 19.6±2.0 17.3±2.0 14.6±2.1 11.7±2.2 9.4±2.0 9.4±1.9
權利要求
聚乙二醇化重組人DesB30胰島素包括(1)重組人DesB30胰島素的製備方法。(2)重組人DesB30胰島素的LysB29或者GlyA1和LysB29的聚乙二醇修飾。
2. 根據權利要求l所述的中重組人DesB30胰島素由基因工程重組表達載體經轉化、發 酵、純化、酶切而製得。
3. 權利要求1或2所述的重組表達載體的宿主細胞為P. Pastoris酵母。
4. 權利要求1或2所述的重組人DesB30胰島素的製備方法，其特徵在於純化和酶切具 體步驟如下(1) 發酵液經離心和O. 45iim濾紙過濾後上樣非極性大孔吸附樹脂。用乙酸調pH值至 3-4，上樣後用25%乙醇(乙酸調pH值至3-4)清洗雜質，表達產物由60%乙醇(乙酸調pH 至3-4)洗脫；(2) 強陽離子柱層析。選用5mMol/L乙酸-乙酸鈉(pH3-4)作為平衡緩衝，20mMol/L Tris-HCl(pH 9)洗脫目的蛋白；(3) ZnCl2沉澱。向洗脫液中加入lmMol/L ZnCl2， 4。C靜置過夜。高速冷凍離心棄沉澱，再 向上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4"靜置過夜，離心後將沉澱溶解於含10-20mMol/LEDTA 的25mMol/L Tris—HCl(pH9. 0)中；(4) 酶切。按質量比1 : 5000加入經TPCK處理過的胰蛋白酶，4t:酶切過夜。用1Mo1/ LHC1調整pH至3. 0以下終止反應。
5. 權利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素由DesB30胰島素與單甲氧基 聚乙二醇(mPEG)琥珀醯亞胺基活性基因，通過胰島素上的游離氨基結合形成醯氨鍵而成。 單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺基活性基因包括琥珀醯亞胺基包括琥珀醯亞胺基琥珀酸酯 (SS)、琥珀醯亞胺基碳酸酯(SC)、琥珀醯胺基丙酸酯(SPA)、琥珀醯亞胺基丁酸酯(SBA)、琥 珀醯亞胺基甲酸酯(SCM)、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺(SSA)或N-羥基-琥珀醯亞胺(NHS)。
6. 權利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素包括LysB29單修飾聚乙二醇化 DesB30重組人胰島素和GlyA1和LysB29雙修飾聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。
7. 權利要求1的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素具有下式formula see original document page 3
8.權利要求1的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素具有下式
9. 權利要求7，8所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，式中(OCH2CH2)n的n代表 20-200。
10. 權利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素的修飾方法，其特徵在於具體 步驟如下(1) 將1份人DesB30胰島素溶於0. 2mol/L Na2ra04混合溶液(pH值為9. 0-10. 5)(份 數以摩爾計)；(2) 將1 : 2 5份mPEG溶於DMF (份數以摩爾計)；(3) 胰島素溶液與mPEG溶液混合，室溫攪拌20 30min，稀釋並將pH降至3終止反應；(4) 反相HPLC回收修飾產物。
11.權利要求5 9中所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素適應I和II型糖尿病 的治療。
全文摘要
本發明涉及一種去B30人胰島素(重組人DesB30胰島素)的重組製備方法及採用化學修飾的方法對該胰島素LysB29或者GlyA1和LysB29結合聚乙二醇。本發明製備的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，聚乙二醇與胰島素以醯氨鍵相連，其中聚乙二醇分子量範圍為500-10000。經動物實驗證明聚乙二醇化重組人DesB30胰島素保留了胰島素的生物活性，在被試動物體內代謝平穩，降血糖持續作用時間延長。可作為一種治療糖尿病的長效胰島素製劑。
文檔編號C07K1/30GK101717442SQ200810232828
公開日2010年6月2日 申請日期2008年10月9日 優先權日2008年10月9日
發明者張益 , 範開, 陳海容, 高劍坤 申請人:重慶富進生物醫藥有限公司