用於治療腫瘤的組合物的製作方法

2023-10-25 14:01:07 3

專利名稱：用於治療腫瘤的組合物的製作方法
按照35U.S.Cξ119(e)，本申請要求於2000年1月19日提出的、題目為「治療腫瘤的組合與方法」的美國臨時專利申請序列號為60/177024的優先權權益，其內容完整引述於此作為參考。
別的治療方法經常是無效的。輻射治療只對癌症早期和中期的局部癌症有效，對具有轉移的晚期癌症無效。化療是有效的，但有嚴重的負作用，如嘔吐、白細胞降低(WBC)、脫髮、體重降低和別的毒性作用。因為嚴重的毒性負作用，許多癌症患者不能成功的完成全部的化療過程。一些癌症患者由於對化療的弱耐受性而死於化療。由於抗癌藥物的低靶向特異性而導致抗癌藥物的極大副作用。藥物循環通過患者大多數正常的器官和預期的靶腫瘤。低靶向特異性是因為只有一部分藥物正確地作用於目標，而造成負作用，也降低了化療的有效性。化療的有效性因為抗癌藥物在靶腫瘤內的短滯溜時間，而進一步降低。
免疫療法，包括使用癌症疫苗，如自體疫苗，對於腫瘤荷載少於108腫瘤細胞的癌症患者有效。免疫療法經常作為輔助療法與其它的療法如手術，輻射療法和化療相結合以清除任何殘留的腫瘤細胞。免疫療法和使用癌症疫苗不能證明對於腫瘤荷載大於5X109到1011腫瘤細胞有效，其在具有輕微轉移症狀的患者中是典型的。此外，自體瘤疫苗接種需複雜的程序，且要求對每一患者的腫瘤標本進行處理。
腫瘤內醇注射療法在治療肝臟腫瘤和別的腫瘤中已應用於臨床實踐。單獨的醇注射療法不能殺死全部的腫瘤細胞，因為注射的醇體積有限，醇導致正常的活組織凝固壞死；腫瘤內血液使醇稀釋至無效濃度，特別在治療大的腫瘤；以及別的因素。醇不能注射到關鍵結構附近，如中樞神經系統。腫瘤內醇注射療法與某種抗腫瘤因子共同施用，稱為共注射(YU et al.(1994)J.Current Oncology，197-100)。在這些方法中，醇注射導致的組織凝固團塊作為抗腫瘤因子的緩釋點。
目前，對於具有高腫瘤荷載的患者，還沒有有效的治療方法。因為早期腫瘤不易早期檢出，許多診斷有癌症的患者是處於腫瘤荷載大於5X109到1011腫瘤細胞的癌症晚期，或腫瘤已經轉移到別的組織。對於這些患者，傳統的癌症治療如手術、輻射和化療可能不再有效和/或合適。
儘管癌症治療有一些進展，即便這樣，有效的治療方法仍很少。由於贅生性腫瘤、腫瘤和癌症的嚴重性和廣泛性，很需要有效的治療這些疾病和紊亂的方法。理想的癌症治療應有能力根除身體內多個位點的全身性腫瘤，並特異性地區別腫瘤細胞和非腫瘤細胞。所以，本發明的目的是提供這些疾病和紊亂的治療方法。特別的，本發明的目的是提供根除身體內多個位點的全身性腫瘤，並且特異性區別腫瘤細胞和非腫瘤細胞的癌症治療方法。
在此所示，這些組合物，例如那些包括一種或多種氧化劑和/或還原劑、蛋白質變性劑和半抗原的組合物，在治療多種贅生性腫瘤、腫瘤和癌症，特別是用傳統的癌症治療方法如手術、輻射治療、化療和免疫治療不能有效治療的實體腫瘤中有很大的適用性。
本發明提供了治療贅生性腫瘤、腫瘤和癌症的方法和組合物。在這些方法中包含使用由一種或多種氧化劑或還原劑、蛋白質變性劑和半抗原組成的任何組合物，其能減輕、減少、改善或阻止贅生性腫瘤、腫瘤和癌症；或者調整或保持在臨床症狀或診斷標示的減輕狀態中，臨床症狀或診斷標示是與贅生性腫瘤、腫瘤和癌症相關，特別是用傳統的癌症治療方法如手術、輻射治療、化療和免疫治療不能有效治療的實體腫瘤相關。該組合物可以單獨使用或與別的治療贅生性腫瘤、腫瘤和癌症的方法相結合施用。
能治療的贅生性腫瘤、腫瘤和癌症包括，但不局限於，腎上腺，肛門，聽覺神經，膽管，膀胱，骨，腦，乳房，bruccal，中樞神經系統，子宮頸，結腸，耳，子宮內膜，食管，眼，眼瞼，輸卵管，胃腸道，頭和頸，心臟，腎，喉，肝臟，肺，下頜骨，下頜髁，上頜骨，嘴，鼻咽，鼻，口腔，卵巢，胰腺，腮腺，陰莖，耳廓，垂體，前列腺，直腸，視網膜，唾液腺，皮膚，小腸，脊髓，胃，睪丸，甲狀腺，扁桃體，尿道，子宮，陰道，前庭蝸神經，外陰贅生性腫瘤。優選的是，治療的贅生性腫瘤、腫瘤和癌症是實體腫瘤。對於實體腫瘤，包括大於108個細胞的實體腫瘤，如從大約5X109到1011細胞的實體腫瘤，該組合物特別有效。
提供的所述組合物可以提高大多數癌症患者的癌症治療的治療效果，包括可見腫瘤團塊但不適合作為手術治療的候選者的早期癌症患者和已失去手術機會的腫瘤體積較大或轉移的晚期癌症患者。
每一組分可以為單獨的組合物或試劑或發生組合。組合目的是導致腫瘤凝聚凝固，且提高對凝固組織的發炎反應。
所以，本發明提供了組合物，優選的是以藥物組合物的形式，其中包括一種或多種氧化劑或還原劑，蛋白質變性劑和半抗原。該組合物一般是由包括氧化劑或還原劑，蛋白質變性劑和半抗原配製組成藥物組合物以進行單一劑量給藥。所述化合物和試劑可以分別施用，例如接連地施用，或者能被間斷地施用，或者三種分開的組合物混和為一種單一的組合物一起施用。當接連地或間斷地給藥時，每一給藥的間隔一般小於一天，優選地，小於一小時，但可以長一些。給藥的精確順序和時間選擇可以按經驗決定。
每一組合物的劑量可以由經驗決定，但一般是正常用於治療贅生性腫瘤、腫瘤和癌症的劑量，數量足以進一步強化別的贅生性腫瘤的治療，或當單獨使用時足以減少或改善或以某種方式減輕贅生性腫瘤的症狀。該組合物可以包裝為試劑盒。
該混合物直接施用入腫瘤中。在施用之後，它們使腫瘤凝固，並形成本發明中所稱的腫瘤內自身藥物釋放生物物質庫。這些生物物質庫被稱為IAWBD。
免疫佐劑也可加入組合物中。這些佐劑包括，但不局限於，卡介苗(BCG)、幹擾素、或用低劑量的環磷醯胺(cyclophosphamide)預處理後的集落刺激因子GM-CSF。
當組合物TIO被施用以便形成IAWBD時，治療通過大劑量的氧化(或還原)腫瘤基體和腫瘤組織直接殺死許多腫瘤細胞，導致腫瘤的皺縮。這使腫瘤荷載值降低而可以用免疫治療和腫瘤疫苗治療。同時也形成了發炎區吸引淋巴細胞和別的發炎反應介體到達靶向腫瘤位點。被吸引的淋巴細胞包括腫瘤抗原遞呈細胞(APC)、巨噬細胞、樹突細胞(DC)和活化B細胞。這些淋巴細胞暴露於由腫瘤細胞裂解而產生的腫瘤抗原而引發腫瘤特異性免疫反應。
當TIO形成伴隨發炎和腫瘤細胞裂解的IAWBD時，在形成的位點中，裂解的腫瘤細胞被半抗原修飾，產生修飾的具有更複雜的免疫原的MHC-相關肽，然後被釋放，作為自身腫瘤疫苗發揮作用。這樣的腫瘤疫苗加強了患者自己的腫瘤免疫原性，刺激T淋巴細胞攻擊沒有被先前的凝固殺死的初始的腫瘤內和周邊的活的腫瘤細胞，腫瘤內凝固治療後的轉移腫瘤和微病變腫瘤。自身腫瘤疫苗在阻止腫瘤轉移和初始腫瘤恢復中發揮重要作用。
另外，附加的治療性病毒和核酸，如DNA、cDNA，也能包括在該組合物中。在施用時，這些可以被包裹在IAWBD中，能融合到或轉染入一些保留在IAWBD中和周邊的腫瘤細胞中，原位產生遺傳修飾了的腫瘤疫苗和雜交疫苗。從腫瘤裂解得到的腫瘤DNA和RNA可以轉染入樹突細胞，其直接接受腫瘤抗原信號。化學和遺傳修飾的腫瘤內腫瘤疫苗聯合產生有效的抗原特異性和抗原非特異性的或共刺激信號抗腫瘤免疫反應。
該組合物也可包括別的試劑，如抗血管生成試劑，放射致敏劑和別的癌症治療劑。例如，在施用另外加入別的這樣的試劑的TIO組合物時，得到的凝塊(IAWBD)將緩慢釋放抗癌症藥物，殺死不被先前的凝固殺死的初始腫瘤位點周圍的腫瘤細胞。當需要時，IAWBD也可緩慢在腫瘤周圍釋放放射致敏劑以增加放射治療的有效性。IAWBD也可緩慢釋放抗血管生成試劑以抑制新腫瘤生長所需的微血管的形成。
在該組合物和方法中使用的抗腫瘤(抗癌症)試劑包括，但不局限於，抗血管生成劑，烷化劑，抗代謝物，天然產物，鉑配位複合物，蒽二酮，取代尿素，甲基肼衍生物，腎上腺皮質遏抑劑，激素和拮抗劑，癌基因抑制劑如抗癌基因抗體或抗癌基因反義寡聚核苷酸，抗癌多聚糖，或藥草提取物如中草藥提取物。
抗血管生成試劑包括，但不局限於，基底膜降解抑制劑，細胞遷移抑制劑，內皮細胞增殖抑制劑，三維組織和構建效能抑制劑，血管抑制基因，血管抑制化學因子基因，AGM-1470(TNP-470)，血管抑制類固醇，血管抑素，抗avβ3的抗體，抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體，IL-1的抗體，TNF-α的抗體，VEGF的抗體，金諾芬(auranofin)，咪唑硫嘌呤，BB-94，BB-2156，鹼式可溶FGF受體，羧基胺基三唑類(CAI)，軟骨衍生抑制劑(CDI)，幾丁質，氯喹，順鉑，CM101，可的松/肝素，可的松/hyaluroflan，11-脫氧皮甾醇/肝素，CT-2584，環磷醯胺，環孢菌素A，地塞米松，二氯酚酸/透明質酸糖胺多糖，嗜酸性的主要鹼性蛋白，纖連蛋白肽，明膠酶抑制劑，神經膠質瘤衍生的血管生成抑制因子(GD-AIF)，GM1474，氯化金，硫羥蘋果酸金，肝素酶，透明質酸糖胺多糖(高分子量和低分子量種類)，氫化可的松/β環狀右旋糖苷，布洛芬，吲哚美辛，α-幹擾素，γ-幹擾素誘導蛋白質10，γ-幹擾素，IL-1，IL-2，IL-4，IL-12，層粘連蛋白，左旋咪唑，三羧氨基喹啉，LM609，基質金屬蛋白酶抑制劑，馬馬司他(marimastat(BB-2516))，甲羥孕酮，6-甲基巰基嘌呤核糖核苷，metastat(Col-3)，氨甲喋呤，二甲胺四環素，一氧化氮，奧曲肽(生長激素釋放抑制激素類似物)，杉醇，D-青黴酸衍胺，多硫戊聚糖，胎盤proliferin相關蛋白，胎盤核糖核酸酶抑制劑，纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)，血小板因子-4(PF4)，氫化潑尼松，催乳素(16Kda片斷)，proliferin相關蛋白，前列腺素合酶抑制劑，魚精蛋白，類維生素A，羅喹美克(LS-2616，三羥氨基喹啉)，生長激素釋放抑制激素，基質溶素抑制劑，物質p，蘇拉明，SU101，tecogalan sodium(DS-4152)，四氫皮質醇-sthrombospondins(TSPs)，金屬蛋白質酶組織抑制劑(TIMP1，2，3)，血管內皮生長因子抑制劑，維生素A，vitaxin和玻璃體液。
在一個實施方案中，該組合物包含一單一的組合物，其含有一種或多種氧化劑和/或還原劑，蛋白變性劑和半抗原，由之組成的配方可以用於注射形式的藥物傳輸，或者三種組合物，一個含有一種氧化劑或還原劑，另一個含有一種蛋白變性劑，還有一種含有半抗原，每一種都與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合組成可以注射的形式。同時也提供了特定的醫療程序、藥學組合物和試劑盒。
在一個特定的實施方案中，提供了一種組合物，其含有a)一種蛋白變性劑；和b)一種抗腫瘤(抗癌)劑，如Ara-C，其中蛋白變性劑不能是醇或乙醇。此外，提供一種組合物，其含有a)一種氧化劑或還原劑；b)一種蛋白變性劑；和c)一種抗腫瘤(抗癌)劑，如Arc-C。
在一個特定的實施方案中，提供了一種組合物，其含有a)一種氧化劑或還原劑；和b)一種抗腫瘤(抗癌)劑，如Ara-C。
在另一個特定的實施方案中，提供一種組合物，該組合物包括a)一種半抗原和b)一種蛋白變性劑。
在另一個特定的實施方案中，提供一種組合物，該組合物包括a)一種半抗原；和b)一種氧化劑或還原劑。
同時也提供一種治療哺乳動物優選為人的腫瘤尤其是實體腫瘤的一種方法，包括原位施用有效量的半抗原和凝聚劑或治療劑，其引起腫瘤贅生物的凝固，由此產生針對腫瘤的自身免疫應答，治療腫瘤贅生物。針對腫瘤的自身免疫應答可以是體液的和/或細胞免疫應答。
在治療中應用的半抗原包括，但不限於，三硝基苯酚(TNP)，二硝基苯酚(DNP)，N-碘乙醯基-N』-(5-磺酸基1-萘基)亞乙基二醯胺(AED)，二硝基氟苯(DNFB)和Ovabulin(OVA)。
本方法和組合物所用的氧化劑和組合物包括，但不限於，過氧化氫(H2O2)，臭氧，多元氧O7，多元氧O8，NaIO4，過一硫酸鉀(oxone)，D，L-S-甲基硫辛酸甲酯，叔丁基氫過氧化物，維生素K3，肼，iodogen，N-溴丁二醯亞胺，奧美拉唑和N-乙基馬來醯亞胺。
本方法和組合物中使用的還原劑包括，但不限於，蘇木精，一種含氧量低的還原劑如一種硝基咪唑，和非硝基化合物SR4233。
用於本組合物和治療的蛋白變性劑包括，但不限於，一種醇，鹽酸胍，硫氰酸胍，檸檬酸鈉，2-巰基乙醇，sarcosyl，苯酚，氯仿和尿素。其中醇包括，但不限於，甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，n-戊基，n-己基，n-庚基，n-辛基，n-癸基，n-十二基，n-十四基，n-十六基，n-十八基，異丙基，異丁基，sec-丁基，tert-丁基，異戊基，旋性戊基，tert-戊基，環戊醇，環己醇，丙烯基，巴豆基，甲基乙烯甲醇，苯基，α-苯乙基，β-苯乙基，二苯基甲醇，三苯基甲醇，肉桂基，1，2-乙二醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，甘油和季戊四醇。
優選地，該組合物也包括一種促進劑和該方法進一步包括施用一種促進劑，該促進劑促進了半抗原和一種腫瘤贅生物的腫瘤抗原的接合。促進劑包括，但不限於，螯合劑如甘氨醯酪氨醯基-(N-e-二乙三胺五乙酸)-賴氨酸(GYK-DTPA)或亞德利亞黴素己二酸-二醯肼(ADR-ADH)，或一個化學交聯試劑如碳化二亞胺。
同時優選地，該組合物也包括一個免疫應答增效劑，還進一步包括在腫瘤上施用免疫應答增效劑的方法。該免疫應答增效劑包括，但不限於，多糖，草藥提取物如中草藥提取物，卡介苗(BCG)，小棒狀桿菌，一種酶如霍亂弧菌神經氨酸酶(VCN)，木瓜蛋白酶，β-半乳糖苷酶和伴刀豆球蛋白A，以及非致病性病毒如非致病性的新城疫病毒。也可以施用編碼癌基因的核酸或編碼的基因產物，或者包括於凝聚劑組合物中來提高免疫應答。其中的癌基因的實例包括，但不限於，abl，erbA，erbB，ets，fes(fps)，fgr，fms，fos，hst，int1，int2，jun，hit，B-lym，mas，met，mil(raf)，mos，myb，myc，N-myc，neu(ErbB2)，ral(mil)，Ha-ras，Ki-ras，N-ras，rel，ros，sis，src，ski，trk和yes。
該組合物還可以包括凝聚裂解劑，和該方法進一步包括對腫瘤贅生物施用這種試劑，既可以單獨施用也可以作為組合物的一部分施用。凝聚裂解劑包括，但不限於，蛋白酶K，糖基-磷脂醯肌醇-B7和胰酶製劑。
這些組合物和方法也可以同時施用，連續施用或者與化學治療結合起來施用，如，進一步在凝聚劑組合物中包括一種抗腫瘤劑或者施用在此提供的組合物，然後優選地在同一天、同一周或其它周期下，施用化學治療。
目前的預期方法也可以與基因治療結合，如，進一步在凝聚劑組合物中包括腫瘤抑制基因如p16，p21，p27，p53，RB，WT-1，DCC，NF-1和APC。優選地，腫瘤抑制基因在一個病毒載體中如腺病毒載體，猿病毒載體和條件複製人免疫缺陷病毒載體中。
在一優選的實施方案中，在治療中應用特定的組合物，其中H2O2作為氧化劑，乙醇作為蛋白變性劑和TNP作為半抗原。
在另一優選的實施方案中，使用的氧化劑或還原劑大約從0.01％(w/w)到大約35％(w/w)，使用的蛋白變性劑從大約1％(w/w)到大約98％(w/w)，且使用的半抗原從大約1mg/ml到大約80mg/ml。
凝聚作用也可以通過用某些物理方法處理腫瘤贅生物來進行，包括低溫療法，雷射凝聚(ILC)，經皮膚的微波凝聚治療，射頻誘導凝聚經皮膚壞死，反式瞳孔熱治療和輻射治療。
在一優選的實施方案中，半抗原與凝聚劑通過注射施用於腫瘤贅生物。
在一優選的實施方案中，半抗原與凝聚劑通過與外科手術過程組合施用於腫瘤贅生物。
進一步提供了一種在哺乳動物中優選人類中，治療腫瘤尤其是實體瘤的方法，包括原位施用有效量的抗腫瘤(抗癌)劑，如Ara-C，和凝聚劑或治療劑，其能引起腫瘤的凝聚，由此治療腫瘤。優選地，凝聚劑是一種蛋白變性劑，其不能是醇或乙醇。同時優選的是，凝聚劑是一種蛋白變性劑和一種氧化劑或還原劑的組合物。
在另一個特定的實施方案中，提供了一種在哺乳動物中優選人類中治療腫瘤，尤其是實體腫瘤的方法，該方法包括原位施用有效量的抗腫瘤(抗癌)劑，如Ara-C，和氧化劑或還原劑，其能引起腫瘤的凝聚凝固，由此治療腫瘤。
在其它特定的實施方案中，提供了一種在哺乳動物中優選是人的治療腫瘤的方法尤其是實體腫瘤，該方法包括原位注射有效量的半抗原，和蛋白變性劑，由此產生對腫瘤的自身免疫反應，且治療腫瘤。
在其它特定的實施方案中，提供了一種在哺乳動物中優選是人的治療腫瘤的方法尤其是實體腫瘤，該方法包括原位注射有效量的半抗原，和氧化劑或還原劑，由此產生對腫瘤的自身免疫反應，且治療腫瘤。
特定組合物和結合描述於以下的部分和隨後的小部分中。
圖2表明用於注射所公開的組合物入腫瘤的一些器具和方法。
圖3表示在鼠中的治療研究結果。
圖4表明鼠中的放射性同位素的保留研究結果。
本發明的實施方式本發明提供的是一種用於腫瘤內癌症免疫治療，包括腫瘤贅生物、腫瘤和癌症組織的組合物和方法，優選的是與腫瘤內、聚焦化學療法、基因療法、放射療法和外科手術相組合。在此公開的是在原位傳送半抗原的同時，腫瘤贅生物、腫瘤或癌組織和細胞的凝聚，是治療這些腫瘤贅生物、腫瘤或癌症的有效方法。凝聚可以通過化學方法來完成，如，用組合的氧化劑或還原劑和蛋白變性劑來處理腫瘤組織或細胞。凝聚也可以通過物理方法來完成，如，用不同的物理治療方法來處理腫瘤組織或細胞如低溫治療，雷射凝聚(ILC)，經皮膚的微波凝聚治療，射頻誘導凝聚壞死，反式瞳孔熱治療和輻射治療。
儘管不希望受到在此描述的任何理論或機制的局限，目前了解的是以下凝聚效應和半抗原對於治療腫瘤贅生物、腫瘤和癌症有作用。首先，通過原位的化學的或物理的方法介導腫瘤組織和細胞的凝聚殺死至少部分，大多數情況下，在靶腫瘤中大於50％的瘤細胞。總的來說，凝聚作用類似外科手術，其降低了腫瘤的重量，有利於後續的免疫治療。此外，凝聚也可以導致細胞表面，胞外基質的結構變化，且細胞裂解釋放腫瘤細胞的成分，即局部發炎。這一發炎效應，與加入的半抗原一起，進一步產生更多的複合的免疫原，其中半抗原與通過凝聚作用導致的腫瘤細胞裂解產生的腫瘤特異抗原結合。發炎區域吸引不同的淋巴細胞，如腫瘤抗原遞呈細胞(APC)，巨噬細胞，樹突細胞(DC)和活化的B細胞，淋巴細胞聚集於發炎區域且與腫瘤抗原作用，如，複合的腫瘤抗原，DNA，RNA和其它從細胞裂解釋放的組分。這些相互作用誘導了腫瘤特異的免疫應答，其中包括體液的、細胞的和補體介導的應答。這一局部的腫瘤特異免疫應答通過在鄰近存在的沒有通過開始的凝聚作用殺死的活腫瘤贅生細胞得到更進一步增強。通過這種方式，後續的腫瘤特異免疫應答增強了凝聚作用的效果(原位接種疫苗)並且延伸至轉移的腫瘤贅生物部位，作為「看不見的手術刀」來阻止腫瘤細胞的復發和轉移。
該組合物和方法也可以通過其對胞外基質(EM)的作用效果來達到治療效果。在體內，腫瘤細胞被胞外基質包圍，如膠原，纖維結合素，蛋白聚糖(蛋白/碳水化合物)，透明質酸和其它高分子量的物質。已經顯示，腫瘤細胞與正常細胞的胞外基質是不同的。纖維結合素與膠原，兩個主要的被研究的胞外基質成分，隨著細胞的轉化其質量和數量都會改變。研究表明轉化細胞分泌的纖維結合素與相同的正常組織相比磷酸化增加許多。另外，腫瘤細胞合成的纖維結合素有慢的電泳遷移率。假如有的話，腫瘤細胞表面相關聯的纖維結合素比較少。腫瘤細胞分泌的纖維結合素大大低於正常細胞分泌的纖維結合素。膠原是一種長的蛋白鏈和分子索，它把其它的物質結合在一起且作為細胞的信息載體。已經顯示，包圍細胞的膠原的性質與細胞的形狀、分化和細胞分裂有關。據信癌症的胞外基質的修飾或破壞導致細胞的飢餓，切斷癌症細胞緊急需要的葡萄糖的輸送。
當所述組合物，如發明內容中所描述的組合物或以下B部分描述的組合物，注射入腫瘤，該組合物將分散在腫瘤周圍的胞外基質中。胞外基質會被氧化或還原變性或改變。例如，當過氧化氫(H2O2)作為氧化劑，胞外基質至少會部分被過氧化氫破壞產生羥基自由基(305nm光照)。胞外基質也至少會部分地通過被還原劑如蘇木精反應損傷。這樣的部分破壞會導致胞外基質形狀損傷。另外，當抗癌藥物與所述組合物結合使用時，抗癌症藥物會在一定程度上被膠原和別的胞外基質物包圍。隨著胞外基質的改變，當周圍發生微小的改變時，腫瘤的中心區域會壞死，這就允許初始治療後緩慢釋放抗癌症藥物到腫瘤細胞的周圍。進一步，當腫瘤壞死時，許多腫瘤蛋白會被半抗原，假如包括在所述組合物中的話，如TNP或DNP修飾，以增加腫瘤特異性抗原性。
腫瘤特異性免疫反應可以通過原位施用或通過包含凝固劑、促進半抗原與腫瘤抗原結合的促進劑、免疫反應增效劑、凝固細胞裂解劑、癌基因產物或任何這些物質的組合物而增加。
預期的治療可以單獨使用或與別的癌症治療相結合，例如，但不局限於，手術，輻射治療，化療和傳統的免疫治療。例如，這種治療可以通過在凝固劑組合物中加入抗腫瘤劑，如抗血管生成劑，與化療一起使用。這種組合治療是有利的，因為凝固增加抗腫瘤劑保留在凝固的腫瘤團塊中的時間，使腫瘤團塊暴露於抗腫瘤劑下更長的時間。在這一點上，凝聚是作為控制藥物釋放的工具。
總之，凝固減少至少靶腫瘤內的一些或大於50％的腫瘤細胞。抗腫瘤劑殺死沒有被凝固初始殺死的仍活著的細胞。原位「接種」進一步減少活的腫瘤細胞，導致比分開的任何一種治療更好的效果。
在一實施例中，通過在凝固劑組合物中加入輻射致敏劑，治療可以與輻射治療一起使用。在這方面，凝固作為控制藥物釋放的工具，釋放輻射致敏劑到沒有被凝固初始殺死的仍活著的腫瘤細胞，增加輻射治療的效果。
在另一實施例中，治療可以在手術前使用。在這方面，凝固在預治療腫瘤前發揮重要作用，使手術易於排除腫瘤團塊，減少腫瘤轉移率。
在另一實施例中，通過在凝固劑組合物中加入編碼所要的野生型癌基因、腫瘤抑制基因、免疫細胞因子基因或凋亡基因的核酸，該治療可以與基因治療結合使用。這種組合治療是有利的，因為凝固有利於把這些野生型癌基因或腫瘤抑制基因導入活的腫瘤細胞，然後這些基因會被帶到別的位點。在這方面，受到凝固作用影響的活的腫瘤細胞會被作為基因治療的載體發揮作用。
在所有的治療中，免疫佐劑，如BCG，可以與凝固劑組合物相結合增加對腫瘤細胞的免疫反應。免疫佐劑可以重複地再注射，如每隔2到4周注射。低劑量cyclosphamide，如200到300mg/m2也可以預先施用，例如提前3天，每一原位免疫接種以加強對抗原的細胞介導免疫的發展。
A.定義除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語都有與本發明所屬技術領域的技術人員一般理解的同樣意義。所有在此參考的專利、申請、公開的申請和別的出版物和來自GenBank和其他資料庫的序列是完整的引入此處作為參考。如果此節中闡明的定義與引入此處作為參考的申請、公開的申請和別的出版物和來自GenBank和其他資料庫的序列中闡明的定義相反或不一致，此節中闡明的定義比在此引入作為參考的定義優先。
正如在此使用，「一個」意味著「至少一個」或「一個或多個」。
正如在此使用，氧化-還原反應指電子從供體傳到受體分子的反應。
正如在此使用，氧化試劑(或氧化劑)指在氧化-還原反應中接受電子的試劑。
正如在此使用，還原試劑(或還原劑)指在氧化-還原反應中提供電子的試劑。
正如在此使用，蛋白質變性劑指導致蛋白質變性的試劑，也就是，部分或全部伸展蛋白質多肽鏈特定天然的構象(二級，三級，四級結構)。
正如在此使用，醇指一系列具有一般結構式CnH2n+1的羥基化合物，包括甲醇和乙醇。
正如在此使用，半抗原指除非與載體或分子相結合，才能誘導抗體形成的抗體特異性物質。一旦半抗原與載體/分子結合，用該偶合物產生的抗體可以識別半抗原和/或載體/部分。半抗原-載體/分子的偶合物也可以產生特異的細胞免疫反應。
正如在此使用，抗腫瘤治療指設計的任何減少或改良其症狀的治療腫瘤贅生物、腫瘤或癌症的治療方案。預防腫瘤贅生物、腫瘤或癌症復發或減少其嚴重性的治療方法也在考慮之列。
正如在此使用，腫瘤贅生物指異常的新的生長，所以與腫瘤同義，可以是良性瘤或惡性瘤。不同於增生，腫瘤贅生物的增殖甚至在沒有起始的刺激的情況下還在持續。
正如在此使用，癌症指由任何形式的惡性腫瘤引起的一類疾病的總稱。
正如在此使用，惡性的，當用於腫瘤時，指具有癌擴散轉移能力，同時失去生長控制和位置控制的初級瘤。
正如在此使用，抗腫瘤劑(可以與抗贅生物腫瘤劑，抗瘤或抗癌劑互換使用)指任何用於抗腫瘤治療的試劑。這些試劑包括，當單獨使用或與別的化合物組合使用的任何試劑，它們可以減輕、減少、改善、阻止或調整或保持與贅生性腫瘤、腫瘤或癌症相關聯的臨床症狀或診斷標記的緩解狀態，它們可以用於此處所提供的方法、組合和組合物中。抗贅生物腫瘤劑包括，但不限於，抗血管生成劑，烷化劑，抗代謝物，一些天然產物，鉑配位複合物，蒽二酮，取代脲，甲肼衍生物，腎上腺皮質激素抑制物，某些激素和拮抗劑，抗癌症多糖和某些草藥提取物如中草藥提取物。
正如在此使用，抗腫瘤劑(或抗腫瘤或抗癌劑)或抗贅生物腫瘤治療並不包括包含氧化劑或還原劑，蛋白變性劑；和半抗原的組合物，或採用它們的治療，但包括本技術領域的技術人員所知的為了改善腫瘤贅生物、腫瘤或癌症的一些形式的症狀的所有藥劑和治療形式。
正如在此使用，「血管生成」指從母微血管中產生新的血管。血管生成是由血管生成刺激物和抑制物系統嚴密調控的。病理的血管生成是由血管生成刺激物和抑制物間的淨平衡的移動導致，如，過量產生正常的或畸形的血管生成介體，或由於在此過程中相對缺乏抑制物。
正如在此使用，「不需要的和/或不受控制的血管生成」指病理的血管生成，其中血管生成的刺激物影響超出了血管生成抑制物的影響。
正如在此使用，「抗血管生成治療或藥劑」指包括當單獨使用或與別的化合物組合使用的任何治療方案和化合物，它們可以減輕、減少、改善、阻止或調節或保持與不理想和/或不受控制的血管生成相聯繫的臨床症狀或診斷標記的緩解狀態。正如在這裡所用，「內皮酶抑制劑」不認為是「抗血管生成處理或抗血管生成劑」。
正如在此使用，「腫瘤抑制基因」(或抗癌基因，癌症易感基因)指編碼正常地負調控細胞周期的產物的基因，它們在細胞進行快速分裂前必須變異否則是無活性。腫瘤抑制基因的實例包括，但不局限於，p16，p21，p53，RB(成視網膜細胞瘤)，WT-1(胚性癌肉瘤)，DCC(在結腸癌中發生缺失)，NF-1(神經纖維肉瘤)和APC(結腸息肉樣腺瘤)。
正如在此使用，「癌基因」指動物細胞(原癌基因)的正常基因的變異和/或過度表達形式，其佔優勢時能使細胞脫離正常的生長抑制，從而單獨，或與其它變化相結合，可把細胞轉變為腫瘤細胞。腫瘤抑制基因的實例包括，但不局限於，abl，erbB，ets，fes(fps)，fgr，fms，fos，hst，intl，int2，jun，hit，B-lym，mas，met，mil(raf)，mos，myb，myc，N-myc，neu(ErbB2)，ral(mil)，Ha-ras，Ki-ras，N-ras，rel，ros，sis，src，ski，trk和yes。
正如在此使用，「反義寡核苷酸」指與mRNA或雙鏈DNA的有意鏈互補的核苷酸鹼基的合成序列。有意和反義寡聚核苷酸混合物在合適條件下可以導致兩種分子的配對或雜交。當這些寡聚核苷酸與mRNA配對(雜交)，發生阻礙蛋白合成(翻譯)。當這些寡聚核苷酸與雙鏈DNA配對，發生阻礙RNA合成(轉錄)。所致翻譯和/或轉錄的抑制導致有意鏈編碼的蛋白的合成受阻。
正如在此使用，抗體包括抗體片段，如Fab片段，其由輕鏈和重鏈的可變區組成。
正如在此使用，人源化抗體指通過修飾以便包括「人」胺基酸序列的抗體，以至施用於人而不會引起免疫應答。製備這些抗體的方法是已知的。例如，表達單克隆抗體的雜交瘤已經被重組DNA技術改變從而來表達其中的不變區的胺基酸組成是以人抗體為基礎的抗體。已經設計了電腦程式來確定這些區域。
正如在此使用，「促進劑，它們促進半抗原與一個腫瘤抗原的結合」指一種交聯半抗原與腫瘤抗原的試劑，或任何促進交聯反應的試劑。半抗原與腫瘤抗原的交聯可以是共價鍵或非共價鍵，可以通過疏水、極性、離子靜電或其它相互作用介導。
正如在此使用，「免疫應答」指一個生物體在應答一個抗原時，其免疫系統的反應性的變化；在脊椎動物中，這可以包括抗體的產生，誘導細胞介導的免疫，補體激活或免疫耐受性的發展。
正如在此使用，「免疫應答增效劑」指一種可以增強抗原引起一種免疫應答效應的物質。
正如在此使用，「凝聚作用」指引起細胞、其中的成分和胞外基質轉化為一種軟的、半固體或固體塊的過程。
正如在此使用，「凝聚裂解劑」指一種可以鬆散化或溶解凝聚物的試劑。
正如在此使用，「腫瘤的凝聚」指引起腫瘤細胞、其中的成分和胞外基質轉化為一種軟的、半固體或固體塊的過程，這種轉化導致凝聚的腫瘤細胞的死亡。並且增強凝聚的腫瘤細胞中施用入腫瘤的試劑的保持力。
正如在此使用，細胞因子是一種因子，如淋巴因子或單核因子，它由細胞產生，影響相同或別的細胞。「細胞因子」是在免疫反應中在細胞之間傳遞信號的分子組中的一種。細胞因子是蛋白質或肽；一些是糖蛋白。
正如在此使用，「白細胞介素(IL)」指主要由T細胞產生的一大組細胞因子，雖然一些由單核吞噬細胞產生，或由組織細胞產生。它們有多種功能，但大多數直接參與指導別的細胞分裂和分化。每一種白細胞介素作用於特定的，有限的表達此種細胞因子的正確受體的細胞。
正如在此使用，白細胞介素-1(IL-1)指某種腫瘤抗原遞呈細胞(APC)產生的白細胞介素，與IL-6一起，作為T細胞激活的共刺激信號。IL-1基因組包括IL-1α，IL-1β和IL-1受體拮抗物(IL-1Rα)(Dinarello，Eur，CytokineNetw.，5(6)517-522(1994))。每一種成員首先合成為前體蛋白；IL-1前體(ProIL-1α，ProIL-1β)的分子量是大約31000道爾頓。ProIL-1α和成熟的17000道爾頓的IL-1α都有生物活性，然而ProIL-1β需要切割成17000道爾頓的肽而有最佳的生物活性。IL-1Rα前體有一前導序列，切割後成為成熟形式，象大多數蛋白一樣分泌。IL-1α和IL-1β是強效的激動劑，IL-Ra是特定的受體拮抗劑。而且，IL-Ra顯然是純粹的受體拮抗劑而在體外或體內沒有激動劑活性。雖然IL-1Rα是分泌蛋白，但這種分子有別的保留在細胞內的形式。它被叫做「胞內」(ic)IL-1Ra。IcIL-1Rα由改變的IL-1Rα基因的mRNA拼接插入物替代編碼信號肽的外顯子而產生。IL-1Rα形式在功能性上是不可區別的。
因而，例如，提及的「IL-1」包括所有的由IL-1基因家族包括IL-1α，IL-1β，IL-1Rα，和icIL-1Ra編碼的蛋白質，或別的來源或合成製備的同等分子。預計包含保守胺基酸被取代，但取代不改變其活性的IL-1。本技術領域的技術人員知道合適的保守取代胺基酸，並且這些取代一般不改變得到的分子的生物活性。本技術領域的技術人員認識到，一般地，在多肽的非必需區單個胺基酸取代並不一定改變生物活性(參見，如，Watson et al MolecularBiology of the Gene，4thedition，1987，the Bejacmin/Cummings Pub co，p224)優選的這些取代與表1列出的一致，如下所示表1
也允許別的取代，可以經驗決定或根據已知的保守取代確定。
正如在此使用，在此出現的多種胺基酸序列中的胺基酸根據它們眾所周知的三個字母或一個字母的縮寫來表示。在多種DNA片段中出現的核苷酸用本技術領域中常規使用的標準單字母表示來表達。
正如在此使用，術語「治療劑」，「治療法」「輻射防護劑」，「化療藥劑」指傳統的藥物和藥物治療，包括疫苗，其為本技術領域的技術人員所知。「輻射治療」劑在本技術領域也是已知的。
正如在此使用，「疫苗」指用於積極的免疫學預防的任何組合物。疫苗可以在治療上用作治療疾病，或者主動地或在感染後阻止疾病的發展或減輕疾病的嚴重性。疫苗的實例包括，但不局限於，已被殺死的烈性菌株細菌或減毒(變種或變異)菌株的活細菌，或微生物，真菌植物，原生動物，後生動物衍生物或產物的製備物。「疫苗」也包含基於蛋白質/肽和核苷酸的疫苗。
正如在此使用，「細胞毒性細胞」指殺死病毒性感染靶細胞的細胞，靶細胞表達MHC1型分子抗原肽。
正如在此使用，「血清」指除去了纖維蛋白凝塊和血細胞後得到的血液液體部分，區別於循環血中的血漿。
正如在此使用，治療特定疾病的化合物的有效量是足以改善或以某種方式減少與疾病相關的症狀的量。此量可以作為單一劑量施用或根據情況決定，藉此可以有效治療。藥物劑量可以治癒疾病，但一般的，治療是為了緩解疾病症狀。重複的施用可以得到理想的症狀緩解效果。
正如在此使用，這種偶合物的藥物可接受鹽，酯或別的衍生物包括任何鹽，酯或衍生物，這些物質可以由本技術領域的技術人員使用已知的此種衍生方法容易地製備它們，這一過程產生施用到動物或人，不會產生實質毒性作用的化合物，這些化合物或者有藥物活性或者是前體藥物。
正如在此使用，治療意味著任何方式，其中一種情況、紊亂或疾病的症狀發生好轉或有利的改變。治療也包括在此討論的組合物的藥物上的用途。
正如在此使用，通過施用特定藥物組合物發生特定紊亂的症狀的改善指任何減輕，或者是永久的或者是暫時的，持續的或短暫的，都可以歸為或與該組合物的施用有關。
正如在此使用，充分純粹是指足夠均一，通過常規的分析方法確定沒有容易檢出的雜質的狀態，這些分析方法包括薄層色譜(TLC)，凝膠電泳和高效液相色譜(HPLC)，本技術領域的技術人員使用這些方法達到這種純度，或者足夠純粹，以致進一步的純化不能可檢測地改變物質的物理或化學性質，例如酶或生物活性。化合物通過純化得到充分化學純的化合物的方法對於本技術領域的技術人員來說是熟知的。但是，一種充分化學純的化合物可以是立體異構體或異構體的混合物。在這些例子中，進一步的純化可能會增加化合物的特異活性。
正如在此使用，前體藥物是一種化合物，一旦進入體內，其可以代謝為或轉化為具有生物活性，藥學活性或治療活性形式的化合物。為了製作一種前體藥物，藥學活性的化合物經過修飾以使活性化合物可以通過代謝過程再生。前體藥物可以設計成改變了代謝穩定性或藥物的運輸特性，屏蔽了藥物的副作用或毒性，改進了藥物的味道或改變了藥物的其它特點或性質。依靠在體內的藥物動力學過程和藥物代謝的知識，本技術領域的技術人員，一旦知道了藥物活性形式的化合物，就可以設計該化合物的前體藥物(參見，如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach，Oxford University Press(牛津大學出版社)，NewYork，388-392頁)。
正如在此使用，生物活性指對於體內施用一種化合物、組合物或其它混合物，該化合物在體內的活性或它們引起的生理性反應。這樣，生物學活性包括治療效應和這些化合物、組合物和混合物的藥理學活性。生物學活性可以通過設計用於檢測或利用這些活性的體外系統來觀察。這樣，在此所述的用途中，螢光素酶的生物活性是其氧合酶活性，即，通過氧化一種底物而發光。
正如在此使用，受體指對於一種特定的配體具有親和性的分子。受體可以是天然產生的或合成的分子。受體在本技術領域也可以指抗配體。在此所用，受體和抗配體可以互換使用。受體可以以其未變化的狀態或與其它種類分子形成聚集體使用。受體可以直接或經由一個特殊的結合物或連接物間接地附著，共價或非共價，或物理接觸結合到結合成員上。受體的例子包括，但不限於；抗體，細胞膜受體表面受體和內在化的受體，單克隆抗體和與特定的抗原決定族作用[如病毒，細胞，或其它物質]的抗血清，藥物，多聚核苷酸，核酸，肽，輔因子，凝集素，糖，多糖，細胞，細胞膜，和細胞器。
受體和使用這些受體的應用的例子包括，但不限於a)酶對於微生物的生存而必須的特定轉運蛋白或酶，其可以作為抗生素[配體]選擇的靶子；b)抗體研究確定與有關抗原的表位結合的抗體分子的配體結合位點；通過模仿抗原表位序列的確定可以導致以一個或多個這些序列為基礎的免疫原的疫苗的發展，或導致對於如自身免疫疾病的治療有用的相關診斷劑或治療中有用化合物的發展c)核酸確定配體，如蛋白或RNA，結合位點；d)催化性多肽；聚合物，優選為多肽，其可以加速包括轉化一種或多種反應物為一種或多種產物的化學反應；這些多肽一般包括與至少一種反應物或反應中間物特異結合的位點和一個靠近結合位點的活性功能基，其中的功能基是可以化學修飾所結合的反應物[參見，如，U.S.專利5,215,899]；e)激素受體以高親和力結合於受體的配體的確定對於發展激素替代療法有用；如，確定結合於這樣的受體的配體可以導致控制血壓的藥物的發展；且f)阿片製劑受體確定與在腦中的阿片製劑受體結合的配體對於發展低成癮替換嗎啡和相關藥物有用。
正如在此使用，抗體包括抗體片段，如Fab片段，其由一條輕鏈和一條重鏈的可變區組成。
正如在此使用，人源化抗體指抗體經修飾包含「人」抗體胺基酸序列以便用於人而不會引起免疫反應。製備這些抗體的方法是已知。例如，表達單克隆抗體的雜交瘤被重組DNA技術改變以便表達其非可變區的胺基酸組成以人抗體為基礎的抗體。已經設計了電腦程式來辨別這樣的區域。
正如在此使用，通過重組子生產是指通過使用重組DNA技術，是指使用已熟知的分子生物學方法來表達克隆的DNA編碼的蛋白。
正如在此使用，一種產品的實質相同是指足夠相似，以便相關的性質足以保持不變化，以至於這種充分一致的產物可以代替該產品。
正如在此所用，等效的，當提到核苷酸的兩個序列時，意味著討論的兩個序列編碼相同序列的胺基酸或等效的蛋白質。當在提到兩種蛋白或肽時，使用「等效」意味著兩種蛋白或肽實質上有相同的胺基酸序列，只有保守的胺基酸代替(參見，如，以上表1)，並不實質上改變蛋白或肽的活性或功能。當「等效」指性質時，性質並不需要達到同樣的程度(如，兩種肽可以表現出同樣類型的酶活性，但具有不同的速度)，但活性實質上優選為相同的。當指出兩個核苷酸序列「互補」時，意味著核苷酸的兩個序列能雜交，優選的少於25％，更優選的少於15％，甚至更優選的少於5％，最優選的是相對的核苷酸之間沒有錯配。優選的兩個分子在高度嚴格的條件下雜交。
正如在此使用雜交的條件嚴緊度以錯配百分率確定，情況如下1)高度嚴緊0.1XSSPE，0.1％SDS，65℃2)中度嚴緊0.2XSSPE，0.1％SDS，50℃
3)低度嚴緊1.0XSSPE，0.1％SDS，50℃應當能理解到，當使用可替換的緩衝液、鹽和溫度時，可以達到等效的嚴格條件。
術語「實質上」相同或同源或相似在本上下文中發生變化，正如相關技術領域的技術人員所理解的那樣，一般意味著至少70％，優選的至少80％，更優選的至少90％，最優選的至少95％的同一性。
正如在此使用，組合物指任何混合物。它可以是溶液，懸浮液，液體，粉末，糊劑，含水的，不含水的，或它們的任何組合物。
正如在此使用，組合指兩個或多個項目的聯合。組合包括兩種或多種組分包含在一個單一的混合物中的組合物；它也包括相關的兩種獨立的組合物。
正如在此使用，液體指任何可以流動的組合物。所以液體包含以半固體、糊劑、溶液、含水的混合物、凝膠、洗劑、乳膏和別的這樣的組合物形式的組合物。
正如在此使用，保護基團、胺基酸和其它化合物的縮寫，除非特別指明，均與其普遍用法、公認縮寫方式或國際理論與應用化學聯合會-國際生物化學聯合會(IUPAC-IUB)所制定的生物化學命名相一致(參見，1972)Biochem，111726)。
為公開的清楚起見，但並不受其限制，對本發明的詳細描述分為以下幾個小部分。
B.組合物在一個特定的實施方案中，其中所提供的是一種應用於腫瘤內治療的組合物，該組合物包括A)一種氧化劑和/或一種還原劑；B)一種蛋白質變性劑；和C)一種半抗原。
該氧化或還原劑、蛋白質變性劑和半抗原可以配製為一種單一的藥劑組合物，或每一種可分別配製為藥劑組合物。
任何一種具生物耐受性的氧化劑可用於該組合物中。在一個優選的實施方案中，所使用的氧化劑為過氧化氫(H2O2)、臭氧、多元氧(O7)、多元氧(O8)、過氧碘化鈉(NaIO4)、過一硫酸鉀(oxone)(Wozniak等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8(19)2641-6(1998))，D，L-S-甲基硫辛酸甲基脂(Pan和Jordan，Biochemistry，37(5)1357-64(1998))，叔丁基氫過氧化物(Tarin等人，Mol Hum Reprod，2(12)895-901，(1996)；維生素K3(Santini等人，Free Radic Biol Med，20(7)915-24(1996))，二醯胺(Bosin和Kasper，J Biochem Toxicol，7(3)139-45(1992))，iodogen(Saha等人，Int J Rad Appl Instrum，16(4)431-3(1989))，N-溴丁二醯亞胺(Sinn等人，Anal Biochem，170(1)186-92(1988)，奧美拉唑(Im等人，J Biol Chem260(8)4591-7(1985))，N-乙基馬來醯亞胺(Marzulli等人，Boll.Soc.Ital.Biol.Sper，61(1)121-7(1985))。
任何一種具生物耐受性的還原劑可用於該組合物中。在一個優選的實施方案中，所使用的還原劑為蘇木精、一種如硝基咪唑的低氧還原劑或無氮化合物替拉扎明(SR-4233)(Zhang和Stevens，Melanoma Res.，8(6)510-5(1998))。
任何一種具生物耐受性的蛋白質變性劑可用於該組合物中。在一個優選的實施方案中，所使用的蛋白質變性劑為醇、鹽酸胍(Inouye等人，J Clin Microbiol，20(3)525-9(1984))、硫氰酸胍、檸檬酸鈉、2-巰基乙醇、離子去垢劑sarcosyl(Klekamp和Weil，Arch.Biochem.Biophys.，246(2)783-800(1986))、苯酚、氯仿、尿素或一種酸。可用於該組合物中的醇有無數的例子，包括甲基、乙基、n-丙基、n-丁基、n-戊基、n-已基、n-庚基、n-辛基、n-葵基、n-十二烷基、n-十四烷基、n-十六烷基、n-十八烷基、異丙基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、異-戊基、旋性戊基、tert-戊基、環戊醇、環已醇、烯丙基、丁烯基、乙烯基甲醇、苯甲基、α-苯乙基、β-苯乙基、二苯基甲醇、三苯基甲醇、苯丙烯基、1，2-乙烷二醇、1，2-丙烷二醇、1，3-丙烷二醇、丙三醇、或季戊四醇。在一個更優選的實施方案中，所使用的醇是乙醇。
任何一種具生物耐受性的半抗原可用於該組合物中。在一個優選的實施方案中，所使用的半抗原為三硝基苯(TNP)(Dieli等人，Int.Immunol.，9(1)1-8(1997))，二硝基苯(DNP)(Stjarnkvist等人，J.Pharm.Sci.，80(5)436-40(1991))，N-碘乙醯-N』-(5-磺基1-萘基)亞乙基二醯胺(AED)(Mizuochi等人，J.Immunol.，134(2)673-6(1985))，二硝基氟苯(DNFB)(Claman，J.Immunol.，116(3)704-9(1976))或Ovabulin(OVA)(Katz等人，J.Immunol.，107(5)1319-28(1971))。
在另一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種抗腫瘤試劑，用於聯合腫瘤內治療和化療。
任何抗腫瘤試劑可用於這種組合物中。在一個優選的實施方案中，所使用的抗腫瘤試劑是一種抗血管生成劑。更加優選的，這種抗血管生成劑是一種基底膜降解抑制劑、一種細胞遷移抑制劑、一種內皮細胞增殖的抑制劑、一種組織和構建三維結構效能的抑制劑。該類抗血管生成劑的實例進一步表現在下面的表2中(Auerbach和Auerbach，Pharmacol.Ther.，63(3)265-311(1994)))。
表2 抗血管生成劑
在另一個優選的實施方案中，所使用的抗血管生成劑是AGM-1470(TNP-470)，血管抑制類固醇、血管抑素、抗avβ3的抗體、抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體、抗白介素-1抗體、抗腫瘤壞死因子α抗體、抗血管內皮細胞生長因子抗體、金諾芬、咪唑硫嘌呤、BB-94、BB-2516、鹼性成纖維細胞生長因子的可溶性受體、羧基醯胺三唑類(CAI)、軟骨衍生抑制劑(CDI)、幾丁質、氯奎、順鉑、CM101、可的松/肝素、可的松/透明質酸、11-脫氧皮甾醇/肝素、CT-2584、環磷醯胺、環孢菌素A、地塞米松、二氯酚酸/透明質酸、嗜酸性的主要鹼性蛋白、纖連蛋白肽、白明膠酶抑制劑、神經膠質瘤衍生的血管生成抑制因子(GD-AIF)、GM1474、氯化金、硫羥蘋果酸金、肝素酶、透明質酸糖胺多糖、(高和低分子量的種類)，氫化可的松/β環右旋糖苷、布洛芬、吲哚美辛、α幹擾素、γ幹擾素誘導的蛋白質10、γ幹擾素、白介素1、白介素2、白介素4、白介素12、層粘連蛋白、左旋咪唑、三羧氨基喹啉、LM609、基質金屬蛋白酶抑制劑、馬馬司他(BB2516)、甲羥孕酮、6-甲基硫基嘌呤、metastat(Col-3)、甲氨蝶呤、美滿黴素、氧化氮、奧曲肽(生長激素抑制劑類似物)、紫杉醇、D-青黴酸衍胺、多聚硫酸戊糖、胎盤proliferin相關蛋白、胎盤核糖核酸酶抑制劑、纖溶酶原激活因子抑制物(PAI)、血小板因子4(PF4)、氫化潑尼松、催乳素(16Kda片段)、proliferin相關蛋白、前列腺素合成酶抑制劑、魚魚精蛋白、類維生素A、羅喹美克(LS-2616，三羧氨基喹啉)、生長抑素、基質溶素抑制劑、P物質、蘇拉明、SU101、tecogalan sodium、四氫皮質醇-sthrombospondins(TSPs)、組織基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1，2，3)、血管內皮細胞生長因子抑制劑、維生素A、Vitaxin、玻璃體液、沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羥基沙利度胺及沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羥基沙利度胺的代謝物或水解物(O』Reilly，Investigational New Drugs，155-13(1997)；J Nat』1 Cancer Instit，88786-788(1996)；美國專利5593990、5629327和5712291)。同樣優選的，使用的抗血管生成劑是一種血管抑制基因，如血管阻素、內皮他丁、kringle-5、PEX、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4、endo∷angio、或endo∷PEX、或是一種血管抑制趨化因子基因，如IP-10、Mig或SDF-1α。
在另一個更加優選的實施方案中，所使用的抗腫瘤試劑是一種烷化劑、一種抗代謝物、一種天然產品、一種鉑配位複合物、一種恩二酮、一種替代的尿素、一種甲基肼衍生物、一種腎上腺皮質激素抑制劑、一種激素和一種拮抗劑。該類抗腫瘤試劑的實例見下面的表3。
表3 用於腫瘤疾病的化療劑
在另一個優選的實施方案中，使用的抗腫瘤藥劑是胞嘧啶類似物如胞苷阿糖腺苷(araC)、道諾黴素、阿黴素、氨甲蝶呤(MTX)、氟化嘧啶如5-氟尿嘧啶(5-FU)、羥基脲、6-巰基嘌呤、植物生物鹼如長春新鹼(VCR)、VP-16和長春鹼(VLB)；烷化劑如環磷醯胺腫瘤細胞裂解劑、美司鈉、美法侖、1，3-雙氯乙基亞硝基脲(BCNU)、順鉑、氮芥(HN2)、三胺(HN3)，非典型烷化劑如甲基苄肼、博來黴素、絲裂黴素C、放線菌素D(DACT)，或一種酶如L-天冬醯胺酶。
在另一個優選的實施方案中，使用的抗腫瘤藥劑是一種癌基因抑制劑。更優選的，該癌基因抑制劑是抗癌基因抗體或抗癌基因反義寡核苷酸。例如，下面表4中所列的寡核苷酸抗體和反義寡核苷酸可用於該組合物。
在另一個實施方案中，使用的抗腫瘤藥劑是一種細胞基質抑制劑。更加優選的，細胞基質抑制劑是一種抗細胞基質抗體或抗細胞基質反義寡核苷酸。例如，可使用抗以下細胞基質或細胞基質基因的抗體和反義寡核苷酸小窩蛋白-1、核心蛋白多糖、鈣粘蛋白、連環蛋白、整連蛋白。
在一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種用於聯合腫瘤內治療和基因治療的腫瘤抑制基因。在一個優選的實施方案中，使用的腫瘤抑制基因是p16，p21，p27，p53，RB，WT-1，DCC，NF-1和APC。在另一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種自殺基因如HSV1tk(1型單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶)、tdktmk(胸腺嘧啶激酶胸苷酸激酶)、codaupp(胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶)；一種溶細胞基因如粒酶A、粒酶B、穿孔素；或一種凋亡基因如Bak，Bax，Bcl-XL，Bcl-XS，Bik，Sarp-2，TRAIL。在另一個更加優選的實施方案中，該組合物進一步包括一種細胞因子基因，如白介素1β、白介素2、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、白介素12、白介素15、GM-CSF、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ、腫瘤壞死因子α、B7.1或B7.2以增強免疫應答。
作為基因轉運系統原件的基因可使用裸DNA、複合DNA、cDNA、質粒DNA、RNA或它們的其它組合物。在另一個實施方案中，腫瘤抑制基因包含於一個病毒載體中。任何適用於基因治療的病毒載體均可應用於該組合物中。例如，可應用一種腺病毒載體(美國專利5869305)、一種猿病毒載體(美國專利5962274)、一種條件複製型人免疫缺陷病毒載體(美國專利5888767)，逆轉錄病毒，SV40，單純皰疹病毒複製子載體和痘苗病毒載體。另外，可以用非病毒載體系統如脂質體轉運基因，其中的脂質可保護DNA或其它生物材料在凝集過程中免於氧化。
在另一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種輻射致敏劑用於聯合腫瘤內治療和放療。在一個優選的實施方案中，所使用的輻射致敏劑是SR2508(依他硝唑)(Chang等人，Int J Radiat Oncol Biol Phys，40(1)65-70(1998))或Buthionine sulfoximine(BSO)(Vahrmeijer等人，Cancer Chemother Pharmacol，44(2)111-6(1999))。
在另一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種促進劑，可促進半抗原與腫瘤抗原之間的偶聯以提高自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，所使用的促進劑是一種螯合劑或是一種化學交聯劑。更優選的，使用的螯合劑是甘氨醯酪氨醯基-(N-e-二乙三胺五乙酸)-賴氨酸(GYK-DTPA)或亞德利亞黴素己二酸-二醯肼(ADR-ADH)。同樣更優選的，使用的化學交聯劑是碳化二亞胺。
在另一個特定的實施方案中，該組合物進一步包括一種免疫應答增效劑以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，所使用的增效劑是卡介苗(BCG)(Ratliff，Eur Urol，217-21(1992))，小棒狀桿菌(Lillehoj等人，Avian Dis，37(3)371-40(1993))，流產布氏桿菌提取物，葡聚糖，左旋咪唑，泰洛倫，一種酶，一種非毒性病毒，多糖，或草藥提取物如中草藥提取物。更優選的，所使用的酶是霍亂孤菌神經醯氨酶(VCN)(Seiler和Sedlacek，Recent Results Cancer Res，7553-60(1980))；木瓜蛋白酶(Helting和Nau，Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand，92(1)59-63(1984)；和Hess，Eur J Immunol，6(3)188-93(1976))，β-半乳糖苷酶或伴刀豆球蛋白A。同樣更優選的，所使用的非毒性病毒是一種非毒性新城疫病毒(Meulemans等人，Vet Rec，143(11)300-3(1998)；和Adams，Poult Sci，49(1)229-33(1970))。進一步更優選的，所使用的多聚糖是來源於液體培養的蘑菇屬blazei mill菌絲體的抗腫瘤多聚糖(起先為葡苷露聚糖，主鏈為β-1，2-連接-D-甘露吡喃殘基，側鏈為β-D-葡萄糖吡喃殘基-3-O-β-D-葡萄糖吡喃殘基)(Mizuno等人，Biochem Mol Biol Int，47(4)707-14(1999))；從絨狀火菇得到的抗腫瘤多聚糖製備物(多聚糖的主鏈主要含β-(1-＞3)-D-連接葡萄糖，其分子量大約為200KD)(Leung等人，Immunopharmacology，35(3)255-63(1997))；西佐糖(SPG)(Tanji等人，Yakugaku Zasshi，110(11)869-75(1990))；schizophyllan(Sakagami等人，Biochem Biophys Res Commun，155(2)650-5(1998))；甘露聚糖(Gavrilenko等人，Vopr Onkol，29(4)67-70(1983))；蘑菇多糖(Haba等人，Int J Cancer，18(1)93-104(1976))；Su-多糖(Su-Ps)(Kumazawa等人，Gan To Kagaku Ryoho，14(12)3329-35(1987))；mannozym(Zastrow，Padiatr Grenzgeb，24(3)229-36(1985))。
在另一個特定的實施方案中，該組合物也可含一種凝集溶解劑以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，所使用的凝集溶解劑是一種蛋白酶K，糖基-磷脂醯肌醇-B7(Brunschwig等人，J Immunother，22(5)390-400(1999)；和McHugh等人，Cancer Res，59(10)2433-7(1999))和胰酶製劑。
在另一個特定的實施方案中，該組合物也可含一種細胞因子以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，給予的細胞因子是用於儲存配方的脂質體包埋的白介素2(Krup等人，JImmunother，22(6)525-38(1999))，或儲存配方為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(Leong等人，J Immunother，22(2)166-74(1999))。
在另一個特定的實施方案中，該組合物可進一步含一種癌基因以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，可使用以上表4中所列的癌基因。
在另一個實施方案中，該組合物可以包括一種減毒的、可複製的病毒載體以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，使用的減毒的、可複製的病毒載體是1型單純皰疹病毒(HSV-1)的突變體G207，它可在人腫瘤細胞中複製並引起細胞死亡，從而抑制腫瘤的生長，但對正常組織沒有致病性(Toda等人，Hum.Gene.Ther.，10(3)385-93(1999))。
在另一個實施方案中，該組合物可以包括一種報告子來監測治療進程。該報告子可以是化學製品或酶。優選的，這種報告酶是β-半乳糖苷酶或它的基因。也可用其它在本技術領域中已知的報告子。
在一個典範的實施方案中，該組合物含過氧化氫作為氧化劑，乙醇作為蛋白質變性劑，TNP為半抗原。也可以含碳化二亞胺作為促進劑。
氧化劑或還原劑以組合物的方式給藥，濃度大約0.01％(w/w)到35％(w/w)，蛋白質變性劑的濃度約為大約1％(w/w)到98％(w/w)，半抗原的濃度約為1mg/ml到80mg/ml。
本發明也提供用於腫瘤內治療的試劑盒，該試劑盒含這種組合物，其中包括的成分為一種或多種A)一種氧化劑和/或一種還原劑；B)一種蛋白質變性劑；和C)一種半抗原。試劑盒也包含用於將所述組合物給藥的注射器以及給藥說明書。
本發明也提供用於腫瘤內治療的生產商品。該生產商品包括A)包裝材料；B)一種或多種氧化劑或一種還原劑，一種蛋白質變性劑和一種半抗原；以及C)一種標籤，指明該商品用於治療腫瘤。
C.治療方法本發明提供的是用於治療哺乳動物體內腫瘤的方法，該方法通過在哺乳動物的腫瘤原位施用有效劑量的半抗原和凝集劑，導致腫瘤的凝集，通過對腫瘤產生自身免疫應答從而治療該腫瘤。在一個特定的實施方案中，所治療的哺乳動物是人。
在另一個特定的實施方案中，所使用的半抗原為三硝基苯(TNP)、二硝基苯(DNP)、N-碘乙醯-N』-(5-磺基1-萘基)亞乙基二醯胺(AED)、二硝基氟苯(DNFB)和ovabulin(OVA)。
在另外一個特定的實施方案中，該治療方法可進一步包括原位給予一種促進劑，通過促進半抗原和腫瘤抗原之間的偶聯來增強腫瘤特異性自身免疫應答。優選的，所使用的促進劑是一種螯合劑或是一種化學交聯劑。更優選的，使用的螯合劑是甘氨醯酪氨醯基-(N-e-二乙三胺五乙酸)-賴氨酸(GYK-DTPA)或亞德利亞黴素己二酸-二醯肼(ADR-ADH)。同樣更優選的，使用的化學交聯劑是碳化二亞胺。
在另外一個特定的實施方案中，該治療方法可進一步包括原位給予一種免疫應答增效劑，以增強腫瘤特異性自身免疫應答。優選的，所使用的免疫應答增效劑是卡介苗(BCG)(Ratliff，Eur Urol，217-21(1992))，小棒狀桿菌(Lillehoj等人，Avian Dis，37(3)371-40(1993))，流產布氏桿菌提取物，葡聚糖，左旋咪唑，泰洛倫，一種酶，一種非毒性病毒，多糖，或草藥提取物如中草藥提取物。更優選的，所使用的酶是霍亂孤菌神經醯氨酶(VCN)、木瓜蛋白酶、β-半乳糖苷酶或伴刀豆球蛋白A。同樣更優選的，所使用的非毒性病毒是一種非毒性新城疫病毒。
在另外一個特定的實施方案中，治療方法可進一步包括原位給予一種凝集溶解劑，以增強腫瘤特異性自身免疫應答。優選的，所使用的凝集溶解劑是一種蛋白酶K，糖基-磷脂醯肌醇-B7或胰酶製劑。
可以使用任何可能凝集腫瘤組織或細胞的方法，如化學或物理方法。在一個特定的實施方案中，通過原位給予一種組合物來達到凝集腫瘤的目的。這種組合物包括A)一種氧化劑和/或一種還原劑；B)一種蛋白質變性劑。
該氧化或還原劑、蛋白質變性劑和半抗原可以配製為一種藥劑組合物，或每一種可分別配製為藥劑組合物。
在一個優選的實施方案中，所使用的氧化劑為過氧化氫、臭氧、多元氧(O7)、多元氧(O8)、過氧碘化鈉(NaIO4)、過一硫酸鉀(oxone)(Wozniak等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8(19)2641-6(1998))，D，L-S甲基硫辛酸甲基脂(Pan和Jordan，Biochemistry，37(5)1357-64(1998))，叔丁基氫過氧化物(Tarin等人，Mol Hum Reprod，2(12)895-901，(1996)；維生素K3(Santini等人，Free Radic Biol Med，20(7)915-24(1996))，二醯胺(Bosin和Kasper，JBiochem Toxicol，7(3)139-45(1992))，iodogen(Saha等人，Int J Rad Appl Instrum，16(4)431-3(1989))，N-溴丁二醯亞胺(Sinn等人，Anal Biochem，170(1)186-92(1988)，奧美拉唑(Im等人，J Biol Chem260(8)4591-7(1985))，N-乙基馬來醯亞胺(Marzulli等人，Boll Soc ItalBiol Sper，61(1)121-7(1985))。
在一個特定的實施方案中，所使用的還原劑為蘇木精、一種如硝基咪唑的低氧還原劑、或無氮化合物(SR-4233)。
在另一個特定的實施方案中，所使用的蛋白質變性劑為醇、鹽酸胍、硫氰酸胍、檸檬酸鈉、2-巰基乙醇、sarcosyl、苯酚、氯仿或尿素。例如在治療中可使用甲基、乙基、n-丙基、n-丁基、n-戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基、n-葵基、n-十二烷基、n-十四烷基、n-十六烷基、n-十八烷基、異丙基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、異戊基、旋性戊基、tert-戊基、環戊醇、環己醇、烯丙基、 丁烯基、乙烯基甲醇、苯甲基、α-苯乙基、β-苯乙基、二苯基甲醇、三苯基甲醇、苯丙烯基、1，2-乙烷二醇、1，2-丙烷二醇、丙三醇、或季戊四醇。優選的，所使用的醇是乙醇。可通過化學的或物理學的處理造成酸性條件，如大約pH2-5來使蛋白質變性。
本發明提供的腫瘤內治療可單獨或與其它癌症治療法聯合應用。在一個特定的實施方案中，該腫瘤內療法與化療聯合應用，即進一步原位給予一種抗腫瘤劑。
可應用任何抗腫瘤劑。在一個優選的實施方案中，所使用的抗腫瘤試劑是一種抗血管生成劑。更加優選的，這種抗血管生成劑是一種基底膜降解抑制劑、一種細胞遷移的抑制劑、內皮細胞增殖的抑制劑、組織和構建三維結構的抑制劑。更加優選的，所使用的抗血管生成劑是AGM-1470(TNP-470)，血管抑制類固醇、新血管抑素、抗avβ3的抗體、抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體、抗白介素-1抗體、抗腫瘤壞死因子α抗體、抗血管內皮細胞生長因子抗體、金諾芬、咪唑硫嘌呤、BB-94、BB-2516、鹼性成纖維細胞生長因子的可溶性受體、羧基胺三唑類(CAI)、軟骨抑制劑、幾丁質、氯奎、順式鉑氨、CM101、可的松/肝素、可的松/透明質酸、11-脫氧皮甾醇/肝素、CT-2584、環磷醯胺、環孢菌素A、地塞米松、二氯酚酸/透明質酸糖胺多糖、嗜酸性的主要鹼性蛋白、纖維連接肽、白明膠酶抑制劑、神經膠質瘤來源的抗生血抑制因子(GD-AIF)、GM1474、金卡方氯化物、硫羥蘋果酸金、肝素酶、透明質酸糖胺多糖(高和低分子量的種類)，氫化可的松/β環右旋糖苷、布洛芬、吲哚美辛、α幹擾素、γ幹擾素誘導的蛋白質10、γ幹擾素、白介素1、白介素2、白介素4、白介素12、層粘連蛋白、左旋咪唑、三羧氨基喹啉、LM609、基質蛋白酶抑制劑、馬馬司他(BB2516)、甲羥孕酮、6-甲基硫基嘌呤、metastat(Col-3)、甲氨蝶呤、美滿黴素、氧化氮、奧曲肽(生長激素抑制劑類似物)、紫杉醇、D-青黴酸衍胺、多聚硫酸戊糖、胎盤proliferin相關蛋白、胎盤核糖核酸酶抑制劑、纖溶酶原激活因子抑制物(PAI)、血小板因子4(PF4)、氫化潑尼松、催乳素(16Kda片段)、proliferin相關蛋白、前列腺素合成酶抑制劑、魚魚精蛋白、類維生素A、羅喹美克(LS-2616)、生長抑素、基質降解酶抑制劑、P物質、蘇拉明、SU101、tecogalan sodium(-4152)、四氫皮質醇-sthrombospondins(TSPs)、組織基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1，2，3)、血管內皮細胞生長因子抑制劑、維生素A、Vitaxin、玻璃體液、沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羥基沙利度胺及沙利度胺、3-氨基沙利度胺、3-羥基沙利度胺的代謝物或水解物。也可以應用在B節中描述的其它抗血管生長劑。同樣優選的，所使用的抗血管生長劑是一種血管抑制基因，如血管抑素、內皮他丁、kringle-5、PEX、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4、endo∷angio、或endo∷PEX、或是一種血管抑制趨化因子基因，如IP-10、Mig或SDF-1α。
在另一個優選的實施方案中，所使用的抗腫瘤試劑是一種烷化劑、一種抗代謝物、一種天然產品、鉑配位複合物、一種蒽二酮、一種取代的尿素、一種甲基肼衍生物、一種腎上腺皮質抑制素、、一種激素、一種拮抗劑、一種抗癌多糖、或草藥提取物如中草藥提取物。也可能使用B節中所描述的另外的抗腫瘤劑。
在另一個優選的實施方案中，使用的抗腫瘤藥劑是一種癌基因抑制劑如抗癌基因抗體或抗癌基因反義寡核苷酸。例如，可使用抗以下癌基因的抗癌基因抗體或抗癌基因反義寡核苷酸abl、erbA、erbB、ets、fes(fps)、fgr、fms、fos、hst、int1、int2、Jun、hit、B-lym、mas、met、mil(raf)、mos、myb、myc、N-myc、neu(ErbB2)、ral(mil)、Ha-ras、Ki-ras、rel、ros、sis、src、ski、trk和yes。
在另一個特定的實施方案中，通過進一步給腫瘤原位注射一種腫瘤抑制基因序列，將腫瘤內治療和基因治療聯合應用。優選的，使用的腫瘤抑制基因序列是p16，p21，p27，p53，RB，WT-1，DCC，NF-1和APC。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種自殺基因如HSV1tk(單純皰疹病毒1胸腺嘧啶激酶)、tdktmk(胸腺嘧啶激酶胸苷酸激酶)、codaupp(胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶)；一種溶細胞基因如粒酶A、粒酶B、穿孔素；或一種凋亡基因如Bak，Bax，Bcl-XL，Bcl-XB，Bik，Sarp-2，TRAIL。在另一個更加特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種細胞因子基因，如白介素1β、白介素2、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、白介素12、白介素15、GM-CSF、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ、腫瘤壞死因子α、B7.1或B7.2以增強免疫應答。
作為該組合物成分的基因轉運系統中的基因可使用的形式為裸DNA、複合DNA、cDNA、質粒DNA。在另一個優選的實施方案中，腫瘤抑制基因序列由一個病毒載體攜帶。任何適用於基因治療的病毒載體均可應用於該組合物中。例如，可應用一種腺病毒載體(美國專利5869305)、一種猿病毒載體(美國專利5962274)、一種條件複製型人免疫缺陷病毒載體和痘病毒載體(美國專利5888767)，逆轉錄病毒，SV40，表達相關基因的單純皰疹病毒擴增子載體和痘病毒載體。另外，可以用非病毒載體系統如脂質體轉運基因，其中的脂質可保護DNA或其它生物材料在凝集過程中免於氧化。
在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種輻射致敏劑用於腫瘤內治療和放療的聯合應用。在一個優選的實施方案中，所使用的輻射致敏劑是raf的反義脫氧寡核苷酸(Gokhale等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，9(2)191-201(1999)；)SR2508(依他硝唑)(Chang等人，Int J Radiat Oncol Biol Phys，40(1)65-70(1998))或Buthioninesulfoximine(BSO)(Vahrmeijer等人，Cancer Chemother Pharmaeol，44(2)111-6(1999))。
在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種含細胞因子的儲存體以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，所使用的含細胞因子的儲存體是一種配方為脂質體包埋的IL-2(Krup等人，J Immunother，22(6)525-38(1999))，或配方為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Leong等人，J Immunother，22(2)166-74(1999))。
在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種癌基因序列以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，可使用上面表4中所顯示的癌基因序列。
在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種減毒的、可複製的病毒載體以增強自身腫瘤特異性免疫應答。優選的，使用的減毒的、可複製的病毒載體是1型單純皰疹病毒(HSV-1)的突變體G207，它可在人腫瘤細胞中複製並引起細胞死亡，從而抑制腫瘤的生長，但對正常組織沒有致病性(Toda等人，Hum Gene Ther，10(3)385-93(1999))。
在另一個實施方案中，該方法進一步包括原位給予一種報告子來監測治療進程。該報告子可以是化學製品或酶。優選的，這種報告酶是β-半乳糖苷酶或它的基因。也可用其它在本技術領域中已知的報告子。
在一個特定的實施方案中，在治療中使用過氧化氫作為氧化劑，乙醇作為蛋白質變性劑，TNP作為半抗原。
在另一個特定的實施方案中，在治療中使用的氧化劑或還原劑的濃度大約為0.01％(w/w)到35％(w/w)，蛋白質變性劑的濃度約為大約1％(w/w)到99％(w/w)，半抗原的濃度約為1mg/ml到80mg/ml。
可以通過物理法處理達到聚集腫瘤組織和細胞的目的，如冷凍療法(Morris，HPB Surg，9(2)118-20(1996)；Seifert等人，World J Surg，23(10)1019-26(1999)；和August，Clin Dermatol，13(6)589-92(1995))，雷射聚集(ILC)(Jocham，Recent Results CancerRes，126135-42(1993)；Chang等人，BrJ Plast Surg，52(3)178-81(1999)；和Jiao和Habib，Br J Surg，86(9)1224(1999)，皮下微波聚集療法(Ohmoto等人，Am J Roentgenol，173(5)1231-3(1999)；Seki等人，Am J Gastroenterol，94(2)322-7(1999)；和Shibata等人，Gan ToKagaku Ryoho，26(12)1760-3(1999)，射頻誘導的凝集壞死(Francica和Marone，Eur JUltrasound，9(2)145-53(1999)；Goldberg等人，Radiology，209(3)371-9(1998)；Strmen和Furdova，Cesk Slow Oftalmol，55(3)176-80(1999)，超聲治療(Lu等人，Int J Hyperthermia，12(3)375-99(1996)；和Saitoh等人，Urology，43(3)342-8(1983)；和Strashinin等人，Vopr.Onkok.，17(1)78-9(1971)。
在一個特定的實施方案中，由半抗原和凝集劑或治療的聯合作用所產生的自身免疫應答是一種體液和/或細胞免疫應答。
任何腫瘤贅生物、腫瘤或癌都可由這裡提供的方法治療。例如，可治療以下部位的腫瘤腎上腺、肛門、耳神經、膽道、膀胱、骨、腦、胸、bruccal、中樞神經系統、子宮頸、結腸、耳、子宮內膜、食管、眼、眼瞼、輸卵管、胃腸道、頭和頸、心臟、腎臟、喉、肝臟、肺、下顎、下顎骨齒突、上頜骨、口、鼻咽、鼻、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、陰莖、耳廓、垂體、前列腺、直腸、視網膜、唾液腺、皮膚、小腸、脊髓、胃、睪丸、甲狀腺、扁桃體、尿道、子宮、陰道、前庭耳蝸神經、或外陰。
可用這種方法治療的其它腫瘤和癌的例子包括乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌、胰腺腫瘤、膽囊肝管腫瘤、肝腫瘤、胃腫瘤、食管癌、惡性黑色素瘤、尿道和男性生殖器癌、皮膚癌、頭頸和甲狀腺癌、中樞神經系統和垂體癌、眼和眼附屬器腫瘤、骨惡性腫瘤、軟組織肉瘤、霍奇金疾病和非霍奇金疾病、多發性骨髓瘤、小兒實體瘤、婦產科癌。其它的例子還包括A.間質來源的腫瘤(1)結締組織及其衍生物肉瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤。
(2)內皮及相關組織血管血管肉瘤、淋巴血管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、侵襲性腦膜瘤。
B.上皮來源的腫瘤(1)鱗狀分層的癌、鱗狀細胞或表皮樣癌(2)皮膚或附件基細胞基細胞癌(3)皮膚附屬器腺體汗腺癌、皮脂腺癌(4)上皮內層腺癌、乳頭癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓癌、未分化腺癌(5)呼吸道支氣管腺癌(6)神經外胚層黑色素瘤(7)腎上皮腎細胞癌、腎上腺樣瘤(8)肝細胞肝細胞瘤(肝細胞癌)(9)膽道膽管癌、滴蟲血管肉瘤(chlangiocarcinoma)(10)泌尿道上皮乳頭癌、移行性細胞癌、鱗狀細胞癌(11)胎盤上皮絨毛膜癌(12)睪丸上皮(胚細胞)精原細胞癌、胚癌進一步，也可以治療來源於一種類型以上瘤細胞或一個以上胚層的腫瘤。
在一個優選的實施方案中，所治療的腫瘤是一種實體瘤。更優選的，這種實體瘤的大小大於108個細胞。最優選的，實體瘤的大小為5×109到1011個細胞。
在另一個優選的實施方案中，半抗原和凝集素是通過注射到腫瘤內的方式給藥的。為更好地分配注射到腫瘤內的液體，可以在高壓下緩慢注射，如達到6AMP的注射器。該溶液也可以用一種規格為15-35的針進行注射。在注射的過程中，可通過轉動針柄使針在腫瘤內轉動。需根據腫瘤的性質、大小和位置來調整注射的劑量和頻率，以及治療的進程。為使溶液在腫瘤內達到更好的分布，在對腫瘤實際注射之前，可通過使用脊柱針進行預注射來準備注射渠道。注射也可以在計算機X射線斷層造影(CT)、磁共振(MR)、超聲或其它合適的影像技術指導下進行操作。
在一個特定的實施方案中，可使用美國專利5651986中所描述的方法和儀器將半抗原和凝集素向實體瘤中進行有控制的定位給藥。美國專利5651986中所描述的方法和儀器是用來向實體瘤定位給予化療藥劑的，其中的藥劑不通過血腦屏障，其特點是在體內具低生物藥效和/或短的半衰期。該儀器具備儲存器，可在延長的時間內給藥，並同時保持藥劑的生物活性和該藥劑的生物有效度。
在另一個特定的實施方案中，半抗原和凝集素針對腫瘤的給藥或治療是與外科操作聯合進行的。例如，半抗原和凝集素針對腫瘤的給藥或治療可在外科操作之前、同時或之後進行。
D.實施例實施例1與化療聯合治療對31例晚期的IV期肝癌病人用本發明提供的原位接種療法進行治療。這組病人男24名、女7名，年齡為30-70歲之間。20名病人患原發性肝癌，其中的18名肝功異常，14名有腹水，20名患者近期均有體重減輕。其餘的11名病人患繼發性肝癌5名有從食道轉移來的肝癌，2名是從胃轉移的肝癌，3名是從結腸、1名是從肺轉移的肝癌。在治療之前，給予病人低劑量的鎮靜劑或止痛藥。病人完全安靜並用現代醫學影像進行監控。局部麻醉後，用脊柱針經皮下穿刺直接注射進腫瘤。脊柱針連接在一個高功率注射器上，注射器內含由乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC(8 mg/ml)和hemotoxilin(5 mg/ml)的組合物。將組合物直接注入到腫瘤內並充分分布到整個腫瘤的基質中。注射後，聲波及影像學顯示出代表凝集區的陌生回聲波圖。在由聲波及影像監測發現液化回聲波表明凝集溶解而且腫瘤細胞死亡之後，腫瘤開始萎縮並消失。正常組織生長並代替腫瘤。這一過程用醫學影像系統進行監測。組合物成分往腫瘤中的注入量由腫瘤的直徑(以釐米表示)來決定，每釐米注入2毫升組合物。一至二周之後重複這一過程。每個病人平均進行3次注射治療。建立計算機影像數據用於進一步的研究，以監測整個治療過程。
在所有治療的患者中，未發現嚴重的副作用。1至2天後，一些病人在注射部位出現了可忍受的疼痛。個別患者在第1周發生輕微的發熱。大約1周後，所有的副作用均消失。任何患者均未發生嚴重的併發症。
治療效果總結如下1.聲像圖顯示僅在治療的1至2天後，經治療的腫瘤出現了增強的回聲波。治療一周後，聲像圖中增強的回聲波轉變為減弱的回聲波，這是腫瘤凝集及腫瘤細胞溶解的結果。二周後，聲像圖顯示腫瘤的中心部分(凝集區)回聲波減弱，只在腫瘤的邊緣回聲波增強，這表明腫瘤的中心部分已壞死並凝集溶解。腫瘤或凝集區外膜的回聲波增強是一種正常的免疫防禦，以對抗最初未被凝集作用殺死的腫瘤活細胞。外膜結構可支撐壞死的組織及腫瘤內的抗癌藥，以進一步殺死存留的腫瘤細胞。這個階段以後，觀察到腫瘤的持續萎縮。
2. 31例病人中的27例顯示腫瘤萎縮，21例病人中的4例顯示腫瘤消失。病人仍在住院期間的總體療效是100％。
3. 10例肝功異常的病人中，50％肝功恢復正常。
4.有腹水的14例病人中，64％腹水減少，2例完全恢復正常。
這項研究顯示使用這種治療可以產生對腫瘤的局部免疫應答，抗癌藥去除了病人身體內的腫瘤。這組患者的平均存活期為一年半。
實施例2 與放療聯合治療A. 20例食道癌患者用這裡提供的方法進行放療。食道的X片顯示，10名患者有3至4釐米的中等食道腫瘤，另外10名有5-8釐米的腫瘤。臨床診斷是中度食道癌。1名患者處於IIa期、T2N0M0、PKS分數是80。另1名患者是IIa期、T3N0M0，細胞病理診斷是鱗狀細胞肉瘤。這些患者在食管內窺鏡指導下進行治療。將含乙醇、過氧化氫、半抗原和抗癌藥AraC的組合物用針注射進腫瘤，然後進行放療，劑量為60Gy/30次/6周。食管X射線顯示腫瘤消失。治療1年5個月後，患者情況良好，未觀察到腫瘤局部復發。
B. 16例晚期肺癌患者用A中所描述的方法進行治療。其中一名患者在治療前做了外科手術，3名有癌轉移，6名在肺中心有腫瘤，10名在肺側面有腫瘤。所有患者均有病理診斷9名為鱗狀細胞肉瘤、7名為腺癌。這組患者中12名男性、4名女性，年齡為35-85歲。KPS分數為40-80，平均為65.6。5名患者處於IIa期、4名為IIIb期、7名為IV期。所有患者均在X-射線模擬器監測下採用腫瘤內注射治療，組合物含乙醇、過氧化氫、半抗原、抗癌藥AraC和輻射致敏劑SR2508。注射後緊接劑量為60Gy/30次/6周的放療。療效如下一般93.8％，CR 4例(25％)，PR 11例(68.8％)，SD 1例(6.3)。每個患者的KPS分數增加10度多。治療後1年多，所有患者仍存活。
實施例3 治療卵巢癌一名56歲的女性卵巢癌患者8年前進行了外科手術。患者在治療前下腹部有一個很大的團塊。聲像學顯示體積為5×4.1×3釐米。病人做了化療結果導致腫瘤生長。患者接受了含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和半抗原的組合物的治療。兩周後，腫瘤體積減小為3.4×3.5×2釐米。病人感覺良好，血細胞計數正常。
實施例4 與外科手術聯合治療乳腺癌第1名患者，女性，34歲，病理診斷為右側乳腺管內侵入性癌。兩年前，通過外科手術切除了乳腺癌。在採用本發明提供的方法治療之前，身體同測的鎖骨上淋巴結有腫瘤轉移。聲像學顯示有1.30×0.97釐米和7×6釐米大小的硬團塊。患者用這裡提供的方法進行治療，組合物含乙醇、過氧化氫、半抗原和抗癌藥AraC。腫瘤團塊萎縮為0.3×0.6釐米和1.5×1.5釐米，表現為疤痕。病人感覺良好，血細胞計數正常。
第2名患者，女性，左側乳房有一個3×3釐米的團塊，沒有淋巴結轉移，病理診斷為管內侵入性癌。她用在第1名患者中描述的方法進行治療。治療後，在兩周內腫瘤萎縮為1.1×1.9釐米的疤痕。4個月後，用外科術切除了這個疤痕。至今，病理檢查未發現疤痕中有腫瘤細胞，病人情況良好，血細胞計數正常。
第3名患者，女性，54歲，左側乳房有一個6×8×6釐米的團塊。生物標本病理診斷為腺癌，臨床分期為T3N1M0，身體同側腋窩有一個淋巴結轉移。她用第1名患者中描述的方法治療了三周。一個月後，腫瘤有輕微的萎縮。治療後二個月，用外科術切除了腫瘤，病理檢查未發現腫瘤細胞。病人情況非常好，血細胞計數正常。
實施例5 治療胰腺癌1名患者，女性，68歲，患胰腺癌並侵入到主動脈。KPS分數是70，聲像學顯示腫瘤大小為4.6×5.3釐米，呈不規則球形。臨床診斷為II期胰腺癌，T3N1M0。她接受了一次治療，組合物含乙醇、過氧化氫、半抗原和抗癌藥AraC。4周後，腫瘤萎縮為3.7×4.5釐米。病人情況非常好，血細胞計數正常。
實施例6 治療結腸癌1名患者，男性，68歲，X射線顯示有結腸癌，病理診斷為類癌，乙狀結腸鏡檢測到在結腸和直腸連接點有一個1.5×2釐米的腫瘤，侵入到結腸內並阻斷了糞便的運動。在乙狀結腸鏡檢測下，在4天內向腫瘤內注射了二次含乙醇、過氧化氫、半抗原和抗癌藥AraC的組合物。兩天後，病人感覺好轉，糞便通過。三周後，腫瘤消失。病人情況非常好，血細胞計數正常。
實施例7 與免疫佐劑聯合治療肝癌A.一名肝癌病人，男性，56歲，有14年的B肝。聲像學顯示在肝右葉有一大小為5.7×4釐米的團塊和一個小團塊。KPS分數為60，血細胞計數為血紅蛋白14g/l，白細胞4.5×10/L，L0.38/1，M0.04/L，AFP＞400ug/L。臨床診斷為初期肝癌，II期，T2N0M0。預處理為低劑量(200至300mg/m2)環磷醯胺IV點滴3天。在2周內向大腫瘤注射了2次含乙醇、過氧化氫、半抗原、抗癌藥AraC和BCG的組合物。治療後繼續注射三周GM-CSF。第一次治療後，病人感覺注射部位有輕微的疼痛，有兩天不超過38℃的發熱。三周後，大腫瘤萎縮為4×4釐米，小腫瘤也有萎縮。至今，病人已有六個月情況非常好，KPS分數為80，血細胞正常。
B.一名肝癌病人，男性，71歲，CT掃描發現左肝有一個大小為3.3×3.6釐米的團塊。KPS分為70，血細胞計數為血細胞計數為血紅蛋白14.8g/l，白細胞4.3×10/L，L0.38，M:0.02，AFP＞400ug/L。聲像學顯示腫瘤大小為4.7×5.7釐米。臨床診斷為原發肝癌，II期，T3N0M0。預處理為低劑量(200至300mg/m2)CYCCLOSPHAMIDE IV點滴3天。向腫瘤內注射含乙醇、過氧化氫、半抗原、抗癌藥AraC和BCG的組合物。治療後繼續注射3周GM-CSF。病人感覺注射部位有輕微的疼痛，有5天不超過38℃的發熱。二周後，腫瘤萎縮為3×4釐米。為了使療效更好，進行了另一次注射。病人情況非常好，血細胞計數為血紅蛋白12g/l，白細胞8.84×10/L，L0.20，M0.02。
C.一名病人，男性，74歲，有從腎癌來的原發腫瘤。兩年前，手術切除了腎癌。CT和聲像學顯示肝臟有多個團塊，整個肝臟有約26個團塊。病人體重95公斤，KPS為60，血細胞計數如下血紅蛋白12g/L，白細胞8.5×10/L，肝功正常。預處理為低劑量(200至300mg/m2)環磷醯胺IV點滴3天。向12個腫瘤塊內注射了5次含乙醇、過氧化氫、半抗原、抗癌藥AraC和BCG的組合物。治療後繼續注射三周GM-CSF。病人感覺注射部位有輕微的疼痛。聲像學顯示肝臟中12個腫瘤塊有不同程度的萎縮。2個大腫瘤塊消失，未注射的腫瘤塊也有萎縮，有些腫瘤的大小無明顯改變。病人情況良好，血細胞計數正常，肝功正常。這項研究顯示使用這裡提供的組合物和免疫佐劑聯合治療，效果優於其它治療之處在於治療一個靶腫瘤時可同時引起另一個腫瘤的萎縮。
實施例8 治療肝、肺和食道癌患者的其它例子表5 原發肝癌對治療的應答分期全部應答(CR)部分應答(PR)無變化(NC)癌發展(PD) 總計III 1 1III 6 171 24IV 10 351 46總計16 532 71應答率 22.5％ 74.6％2.8％對有不可切除的成人原發性肝癌的患者，用已知的治療方法如從皮下切口或埋殖泵通過導管注入化療藥，患者的應答率為15％-30％，但結果未顯示有明顯的存活優勢。對於有III和IV期肝癌的病人，採用已知治療方法的平均存活時間為2-4個月。相對比，當患不可切除的成人原發性肝癌的病人採用實施例1中所描述的方法治療，即用含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin的組合物治療，全部和部分應答率大於95％(見表5)。
表6 臨床影像實驗數據累積存活率的計算時間(月) 危險數 死亡數 仍存活數 累積存活1 34 331 31/34＝91.8％2 31 625 0.91×25/31＝73％3 25 124 0.73×24/25＝70％4 24 420 0.70×20/24＝58.8％5 20 317 0.58×17/20＝50％6 17 215 0.50×15/17＝44.12％7 15 015 44.12％8 15 114 41.18％9 14 014 41.18％10 14 311 32.35％11 11 011 32.35％12 11 011 32.35％13 11 110 29.41％14 10 010 29.41％15 10 28 23.53％16 808 23.53％17 817 20.59％對於III或IV期的肝癌，用已知的方法治療，病人通常在4-6個月死亡。這些病人的平均5年存活率約為5％。相對比，用實施例1中所描述的方法治療，即用含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin的組合物治療，這些病人的一年存活率接近30％(見表6)。
表7 二期肝癌對治療的應答分期 全部應答 部分應答 無變化 癌發展 總計IIIIIIIV2 1819 2 41總計 2 1819 2 41應答率4.9％ 44％ 46.3％ 4.9％表8 對二期肝癌治療的累積存活率計算時間(月) 危險數死亡數 仍存活數累積存活1 16214 14/16＝87.5％2 14014 87.5％3 14212 75％4 1239 56.25％5 9 09 56.25％69 0 9 56.25％79 1 8 50％88 0 8 50％98 1 7 43.75％10 8 1 7 43.75％11 8 1 7 43.75％12 8 1 7 43.75％13 7 1 6 37.5％表9 非小細胞肺癌對治療的應答分期全部應答 部分應答 無變化 癌發展 總計IIb 1 1 2IIIa 1 1IIIb 4 5 9IV 8 8總計 5 15 20應答率25％ 75％表10 NSCLC對治療與放療的應答階段 全部反應 部分反應 沒有變化 癌進展 總計Ia1 1Ib 1 1IIaIIb 2 2IIIa 1 9 4 14IIIb 2 8 1 11IV2 5 5 12總計 6 251041反應率14.6％61％ 24.3％全部應答+部分應答＝75.6％對於患IIIa期非小細胞肺癌的患者，未見對放療有完全應答的報導。相對比，觀察到部分病人對用含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin的組合物與放療的聯合治療(見實施例2)，有完全應答(見表10)。對於患IIIa和IV期非小細胞肺癌的患者，對用已知方法中的單藥劑治療的應答率在21％-24％之間。即使是採用紫杉醇加卡鉑的雙攝生法治療，應答率的範圍為27％-73％。相對比，對有可比性的病人採用實施例2中所描述的方法治療，應答率約為75.6％(見表10)。
表11 NSCLC臨床試驗數據的累積存活率計算時間(月) 危險數 死亡數 仍存活數 累積存活1 31 2 29 29/31＝93.5％2 29 1 28 0.935×28/29＝90.3％3 28 2 26 83.87％4 26 1 25 80.65％5 25 2 23 74.19％6 23 0 23 74.19％7 23 1 22 70.97％8 22 2 20 64.52％9 20 2 18 58.06％10 18 0 18 58.06％11 18 0 18 58.06％12 18 2 16 51.61％13 16 0 16 51.61％14 16 0 16 51.61％15 16 1 15 48.31％16 15 0 15 48.31％17 15 0 15 48.31％18 15 0 15 48.31％19 15 0 15 48.31％20 14 1 13 41.94％對於患IIIa期非小細胞肺癌的患者，無論有無成功的化療，平均存活時間約為6個月，只有10％的病人能活到1年。採用傳統的化療，應答率約為25％-30％，平均存活時間約為8-9個月。採用改進的傳統化療，一年存活率可達到約25％，儘管很少，但可有部分病人(大約5％)可存活2年。使用在實施例1和2中所描述的方法，可使病人的1年存活率提高到51.61％，並且1年半的存活率可達42％(見表11)。
表12.食道癌對治療的應答階段 全部反應 部分反應 沒有變化 癌進展 總計III 9 4 1 14III9 7 16IV 4 6 151 26總計 2217161 56應答率 39.8％30％ 28.5％1.78％表13 食道癌試驗累積存活率的計算時間(月)危險數死亡數存活累積存活1 153 12 12/15＝80％2 120 12 80％3 120 12 80％4 120 12 80％5 121 11 73.35％6 110 11 73.35％7 11 0 11 73.35％8 11 0 11 73.35％9 11 1 10 66.67％10 10 0 10 66.67％11 10 0 10 66.67％12 10 0 10 66.67％13 10 2 8 53.33％實施例9. 動物模型的療效研究本試驗採用Kuiking小鼠，實驗鼠的平均體重約為23克。將大約103個肝癌細胞植入小鼠的左凹陷處。大約在第10天，小鼠皮膚下有小腫瘤生長。大約在第15天，腫瘤長至約1cm大小。將小鼠分為三組對照組、治療組和免疫治療組。在對照組，將0.1ml生理鹽水配製的阿糖胞嘧啶通過腫瘤內注射注入到腫瘤中。對照組的實驗結果總結於下面的表14。
在治療組，將0.1ml用生理鹽水配製的含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin的組合物通過腫瘤內注射注入到腫瘤。治療組的實驗結果總結於下面的表15。
在免疫治療組，將0.1ml用生理鹽水配製的含乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin以及TNP的組合物通過腫瘤內注射注入到腫瘤。治療組的實驗結果總結於下面的表16。
對照組、治療組以及免疫治療組的結果也表示於圖3中。如圖3所顯示，在10天之內，治療組和免疫治療組中腫瘤的大小大體上小於對照組。
實施例10 動物模型的放射性同位素保留實驗在對照組，將0.1ml用生理鹽水配製的24微居(μci)99mTc游離同位素通過腫瘤內注射注入到小鼠的每個腫瘤中。在試驗組，將0.1ml的24μci99mTc用在實施例1-2中所描述的組合物即乙醇、過氧化氫、抗癌藥AraC和hemotoxilin進行配製，並通過腫瘤內注射注入到小鼠的每個腫瘤中。在腫瘤內注射後，將小鼠放到伽馬照相機下的框架中開始圖像研究。在10、15、30、60、120分鐘和19、48小時時照相。用於計算99mTc伽馬計數的腫瘤及全身的感興趣區域(IOA)由計算機進行繪製。保留比例是以腫瘤IOA/全身IOA的比例*％來計數。結果表示於圖4。在對照組，10分鐘時99mTc開始漫出腫瘤，30分鐘時，50％以上的同位素漫出腫瘤。在試驗組，90％的同位素在10分鐘時仍留在腫瘤內，2小時時，對照組中只有30％的同位素仍留在腫瘤中，而在試驗組約90％的同位素仍留在腫瘤中。第19小時時，對照組中99mTc同位素消失，相比較，48小時時試驗組約50％的99mTc同位素仍存留於腫瘤中(見圖4)。
由於對本技術領域的技術人員來講，修改是顯然的，因此本發明只受限於附加的權利要求所要求的領域。
表14對照組 瘤體積單位(cm3)
表15 治療組 瘤體積單位(cm3)
表16.免疫治療組瘤體積單位(cm3)
權利要求
1.一種組合物，其中包括a)一種氧化劑或一種還原劑b)一種蛋白質變性劑；和c)一種半抗原
2.如權利要求1的組合物，其中所述氧化劑或還原劑、蛋白質變性劑和半抗原配成單一的藥物組合物或每個配成獨立的藥物組合物。
3.如權利要求1的組合物，其中所述氧化劑選自過氧化氫(H2O2)，臭氧(O3)，多元氧O7，多元氧O8，NaIO4，過氧硫酸鉀(過氧一硫酸鉀)，D，L-S-甲基硫辛酸甲酯，奧美拉唑，和N-乙基馬來醯亞胺。
4.如權利要求1的組合物，其中所述還原劑是選自蘇木精，一種含氧量低的還原劑，和非硝基化合物替拉扎明(SR-4233)。
5.如權利要求4的組合物，其中所述含氧量低的還原劑是硝基咪唑。
6.如權利要求1的組合物，其中所述蛋白變性劑是選自醇，鹽酸胍，硫氰酸胍，檸檬酸鈉，2-巰基乙醇，離子去汙劑sarcosyl，苯酚，氯仿和脲。
7.如權利要求6的組合物，其中所述醇是選自甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，n-戊基，n-己基，n-庚基，n-辛基，n-癸基，n-十二基，n-十四基，n-十六基，n-十八基，異丙基，異丁基，sec-丁基，tert-丁基，異戊基，旋性戊基，tert-戊基，環戊醇，環己醇，丙烯基，巴豆基，甲基乙烯甲醇，苯基，α-苯乙基，β-苯乙基，二苯基甲醇，三苯基甲醇，肉桂基，1，2-乙二醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，甘油和季戊四醇。
8.如權利要求7所述的組合物，其中所述醇是乙醇。
9.如權利要求1所述的組合物，其中所述半抗原是選自三硝基苯酚(TNP)，二硝基苯酚(DNP)，N-碘乙醯基-N』-(5-磺酸基1-萘基)亞乙基二醯胺(AED)，二硝基氟苯(DNFB)和Ovabulin(OVA)。
10.如權利要求1所述的組合物，更進一步包含一種抗腫瘤劑。
11.如權利要求10所述的組合物，其中所述抗腫瘤劑是一種抗血管生成劑。
12.如權利要求11所述的組合物，其中所述抗血管生成劑是選自一種基底膜降解抑制劑，一種細胞遷移抑制劑，一種內皮細胞增生抑制劑，一種三維結構和效能的建立的抑制劑。
13.如權利要求11所述的組合物，其中所述抗血管生成劑是選自一種血管抑制基因，一種血管抑制趨化因子基因，AGM--1470(TNP-470)，血管抑制類固醇，血管抑素，抗avβ3抗體，抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體，抗IL-1抗體，抗TNF-α抗體，抗VEGF抗體，金諾芬，咪唑硫嘌呤，BB-94，BB-2516，鹼性FGF-可溶性受體，羧基氨基三唑類(CAI)，軟骨衍生抑制劑(CDI)，幾丁質，氯喹，順鉑，CM101，可的松/肝素，可的松/hyaluroflan，cortexolone/肝素，CT-2584，環磷醯胺，環孢菌素A，地塞米松，二氯酚酸/透明質酸糖胺多糖，嗜酸性的主要鹼性蛋白，纖連蛋白肽，明膠酶抑制劑，神經膠質瘤血管生成抑制因子(GD-AIF)，GM1474，氯化金，硫羥蘋果酸金，肝素酶，透明質酸糖胺多糖(高分子量和低分子量種類)，氫化可的松，β環狀右旋糖苷，布洛芬，吲哚美辛，α-幹擾素，γ-幹擾素誘導蛋白質10，γ-幹擾素，IL-1，IL-2，IL-4，IL-12，層粘連蛋白，左旋咪唑，三羥氨基喹啉，LM609，基質金屬蛋白酶抑制劑，marimastat(BB-2516)，甲羥孕酮，6-甲基巰基嘌呤核糖核苷，metastat(Col-3)，氨甲喋呤，二甲胺四環素，一氧化氮，奧曲肽(生長激素釋放抑制激素類似物)，杉醇，D-青黴酸衍胺，多硫戊聚糖，胎盤proliferin相關蛋白，胎盤核糖核酸酶抑制劑，纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)，血小板因子-4(PF4)，氫化潑尼松，催乳素(16Kda片斷)，proliferin相關蛋白，前列腺素合酶抑制劑，魚精蛋白，類維生素A，羅喹美克(LS-2616，三羥氨基喹啉)，生長激素釋放抑制激素，基質溶素抑制劑，物質p，蘇拉明，SU101，tecogalan sodium(DS-4152)，四氫皮質醇-sthrombospondins(TSPs)，金屬蛋白質酶組織抑制劑(TIMP1，2，3)，血管內皮生長因子抑制劑，維生素A，vitaxin和玻璃體液。
14.如權利要求10所述的組合物，其中所述抗腫瘤劑是選自一種烷化劑，一種抗代謝劑，一種天然產物，一種鉑配位複合物，一種蒽二酮，取代脲，甲肼衍生物，皮質激素抑制物，某些激素和拮抗劑，抗癌症多糖和某些草藥提取物如中藥提取物。
15.如權利要求10所述的組合物，其中所述抗腫瘤劑是一種癌基因抑制物或一種腫瘤抑制基因或蛋白。
16.如權利要求15所述的組合物，其中所述癌基因抑制物是一個抗癌基因抗體或一種抗癌基因反義寡聚核苷酸。
17.如權利要求15所述的組合物，其中所述癌基因是選自abl，erbA，erbB，ets，fes(fps)，fgr，fms，fos，hst，intl，int2，jun，hit，B-lym，mas，met，mil(raf)，mos，myb，myc，N-myc，neu(ErbB2)，ral(mil)，Ha-ras，Ki-ras，N-ras，rel，ros，sis，src，ski，trk和yes。
18.如權利要求15所述的組合物，其中所述腫瘤抑制基因是選自p16，p21，p27，p53，RB，WT-1，DCC，NF-1和APC。
19.如權利要求1所述的組合物，進一步包含含有癌基因或腫瘤抑制基因序列的病毒載體。
20.如權利要求19所述的組合物，其中所述病毒載體選自腺病毒載體，猿病毒載體和條件複製人免疫缺陷病毒載體，反轉錄病毒載體，SV40載體，單純孢疹病毒擴增子載體和痘病毒載體。
21.如權利要求1所述的組合物，進一步包含在半抗原和腫瘤抗原之間促進結合的促進劑。
22.如權利要求21所述的組合物，其中所述促進劑是螯合劑或化學交聯劑。
23.如權利要求22所述的組合物，其中所述螯合劑是甘氨醯酪氨醯基-(N-e-二乙三胺五乙酸)-賴氨酸(GYK-DTPA)或亞德利亞黴素己二酸-二醯肼(ADR-ADH)。
24.如權利要求22所述的組合物，其中所述化學連接劑是碳二醯亞胺。
25.如權利要求1所述的組合物，進一步包含免疫受體增效劑。
26.如權利要求25所述的組合物，其中所述免疫受體增效劑選自卡介苗(BCG)，小棒狀桿菌，流產布魯氏菌，葡聚糖，左旋咪唑，泰洛倫，一種酶和非烈性病毒。
27.如權利要求26所述的組合物，其中所述酶選自霍亂弧菌神經氨酸酶(VCN)，木瓜蛋白酶，β-半乳糖苷酶和伴刀豆球蛋白A。
28.如權利要求26所述的組合物，其中所述非烈性病毒是非烈性新城疫病毒。
29.如權利要求1所述的組合物，進一步包含凝固裂解劑。
30.如權利要求29所述的組合物，其中所述凝固裂解劑選自蛋白酶K，糖基-磷脂醯肌醇-B7和胰酶製劑。
31.如權利要求1所述的組合物，其中所述氧化劑是H2O2，所述蛋白變性劑是乙醇以及所述半抗原是TNP。
32.如權利要求21所述的組合物，其中所述氧化劑是H2O2，所述蛋白變性劑是乙醇以及所述半抗原是TNP，且所述促進劑是碳化二亞胺。
33.如權利要求1所述的組合物，其中所述氧化劑或還原劑大約從0.01％(w/w)到大約35％(w/w)，使用的蛋白變性劑從大約1％(w/w)到大約98％(w/w)，且使用的半抗原從大約1mg/ml到大約80mg/ml。
34.一種包含權利要求1所述組合物的試劑盒。
35.一種生產的製品，其中包括a)包裝材料；b)權利要求1所述的組合物；且c)一個表明所述製品是用於治療腫瘤的標籤。
36.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，包括原位施用入哺乳動物腫瘤有效量的半抗原和凝聚劑或治療劑，其引起腫瘤的凝聚，由此產生針對腫瘤的自身免疫應答且治療腫瘤。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
38.如權利要求36所述的方法，其中所述半抗原是選自三硝基苯酚(TNP)，二硝基苯酚(DNP)，N-碘乙醯基-N』-(5-磺酸基1-萘基)亞乙基二醯胺(AED)，二硝基氟苯(DNFB)和Ovabulin(OVA)。
39.如權利要求36所述的方法，其中進一步包括對腫瘤施用促進劑，其有助於半抗原和腫瘤贅生物的腫瘤抗原的結合。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述促進劑是一種螯合劑或化學交聯試劑。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述螯合劑是甘氨醯酪氨醯基-(N-e-二乙三胺五乙酸)-賴氨酸(GYK-DTPA)或亞德利亞黴素己二酸-二醯肼(ADR-ADH)。
42.如權利要求40所述的方法，其中所述化學交聯劑是碳化二亞胺。
43.如權利要求36所述的方法，其中進一步包括對腫瘤施用免疫應答增效劑。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述免疫應答增效劑選自卡介苗(BCG)，小棒狀桿菌，流產布氏菌提取物，葡聚糖，左旋咪唑，泰洛倫，酶，非致病性病毒，多糖和草藥提取物。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述酶選自霍亂弧菌神經氨酸酶(VCN)，木瓜蛋白酶，β-半乳糖苷酶和伴刀豆球蛋白A。
46.如權利要求44所述的方法，其中所述非致病性病毒是非致病性的新城疫病毒。
47.如權利要求36所述的方法，進一步包括對腫瘤施用凝聚裂解試劑。
48.如權利要求47所述的方法，其中所述凝固性細胞溶解劑選自蛋白酶K，糖基-磷脂醯肌醇-B7和胰酶製劑。
49.如權利要求36所述的方法，其中所述凝聚劑是一種組合物，其中包括a)一種氧化劑或還原劑；且b)一種蛋白變性劑
50.如權利要求49所述的方法，其中所述氧化劑或還原劑，蛋白變性劑和半抗原可以配製成單一的藥物組合物，或分別以每一種藥物的組合物形式組成配方。
51.如權利要求49所述的方法，其中所述氧化劑選自雙氧水(H2O2)，臭氧，多元氧O7，多元氧O8，NaIO4，過氧一硫酸鉀(oxone)，D，L-S-甲基硫辛酸甲酯，叔丁基氫過氧化物，維生素K3，肼，iodogen，N-溴丁二醯亞胺，奧美拉唑和N-乙基馬來醯亞胺。
52.如權利要求49所述的方法，其中所述還原劑選自蘇木精，一種含氧量低的還原劑，和非硝基化合物SR4233。
53.如權利要求52所述的方法，其中所述含氧量低的還原劑是硝基咪唑。
54.如權利要求49所述的方法，其中所述蛋白變性劑選自醇，鹽酸胍，硫氰酸胍，檸檬酸鈉，2-巰基乙醇，sarcosyl，苯酚，氯仿和尿素。
55.如權利要求54所述的方法，其中所述醇選自甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，n-戊基，n-己基，n-庚基，n-辛基，n-癸基，n-十二基，n-十四基，n-十六基，n-十八基，異丙基，異丁基，sec-丁基，tert-丁基，異戊基，旋性戊基，tert-戊基，環戊醇，環己醇，丙烯基，巴豆基，甲基乙烯甲醇，苯基，α-苯乙基，β-苯乙基，二苯基甲醇，三苯基甲醇，肉桂基，1，2-乙二醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，甘油和季戊四醇。
56.如權利要求55所述的方法，其中所述醇是乙醇。
57.如權利要求49所述的方法，其中所述組合物進一步包括一種抗腫瘤劑。
58.如權利要求57所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是一種抗血管生成劑。
59.如權利要求58所述的方法，其中所述抗血管生成劑選自基底膜降解的抑制物，一種細胞遷移抑制物，一種內皮細胞增生抑制物，一種三維結構和效能的建立的抑制物。
60.如權利要求58所述的方法，其中所述抗血管生成劑是選自一種血管抑制基因，一種血管抑制趨化因子基因，AGM--1470(TNP-470)，血管抑制類固醇，血管抑素，抗avβ3抗體，抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體，抗IL-1抗體，抗TNF-α抗體，抗VEGF抗體，金諾芬，咪唑硫嘌呤，BB-94，BB-2516，鹼性FGF-可溶性受體，羧基氨基三唑類(CAI)，軟骨衍生抑制劑(CDI)，幾丁質，氯喹，順鉑，CM101，可的松/肝素，可的松/hyaluroflan，cortexolone/肝素，CT-2584，環磷醯胺，環孢菌素A，地塞米松，二氯酚酸/透明質酸糖胺多糖，嗜酸性的主要鹼性蛋白，纖連蛋白肽，明膠酶抑制劑，神經膠質瘤血管生成抑制因子(GD-AIF)，GM1474，氯化金，硫羥蘋果酸金，肝素酶，透明質酸糖胺多糖(高分子量和低分子量種類)，氫化可的松，β環狀右旋糖苷，布洛芬，吲哚美辛，α-幹擾素，γ-幹擾素誘導蛋白質10，γ-幹擾素，IL-1，IL-2，IL-4，IL-12，層粘連蛋白，左旋咪唑，三羥氨基喹啉，LM609，基質金屬蛋白酶抑制劑，marimastat(BB-2516)，甲羥孕酮，6-甲基巰基嘌呤核糖核苷，metastat(Col-3)，氨甲喋呤，二甲胺四環素，一氧化氮，奧曲肽(生長激素釋放抑制激素類似物)，杉醇，D-青黴酸衍胺，多硫戊聚糖，胎盤proliferin相關蛋白，胎盤核糖核酸酶抑制劑，纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)，血小板因子-4(PF4)，氫化潑尼松，催乳素(16Kda片斷)，proliferin相關蛋白，前列腺素合酶抑制劑，魚精蛋白，類維生素A，羅喹美克(LS-2616，三羥氨基喹啉)，生長激素釋放抑制激素，基質溶素抑制劑，物質p，蘇拉明，SU101，tecogalan sodium(DS-4152)，四氫皮質醇-sthrombospondins(TSPs)，金屬蛋白質酶組織抑制劑(TIMP1，2，3)，血管內皮生長因子抑制劑，維生素A，Vitaxin和玻璃體液。
61.如權利要求57所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是選自一種烷化劑，一種抗代謝劑，一種天然產物，一種鉑配位複合物，一種蒽二酮，取代脲，甲肼衍生物，皮質激素抑制物，激素和拮抗劑。
62.如權利要求57所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是一種癌基因抑制物或一種腫瘤抑制基因或蛋白。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述癌基因抑制物是一個抗癌基因抗體或一種抗癌基因反義寡聚核苷酸。
64.如權利要求62所述的方法，其中所述癌基因是選自abl，erbA，erbB。Ets，fes(fps)，fgr，fms，fos，hst，int1，int2，jun，hit，B-lym，mas，met，mil(raf)，mos，myb，myc，N-myc，neu(ErbB2)，ral(mil)，Ha-ras，Ki-ras，N-ras，rel，ros，sis，src，ski，trk和yes。
65.如權利要求62所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因是選自p16，p21，p27，p53，RB，WT-1，DCC，NF-1和APC。
66.如權利要求49所述的方法，其中所述組合物進一步包含含有癌基因或腫瘤抑制基因序列的病毒載體。
67.如權利要求66所述的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒載體，猿病毒載體和條件複製人免疫缺陷病毒載體，逆轉錄病毒載體，SV40載體，單純孢疹病毒擴增子載體和痘病毒載體。
68.如權利要求49所述的方法，其中所述氧化劑是H2O2，所述蛋白變性劑是乙醇以及所述半抗原是TNP。
69.如權利要求49所述的方法，其中所述氧化劑或還原劑大約從0.01％(w/w)到大約35％(w/w)，使用的蛋白變性劑從大約1％(w/w)到大約98％(w/w)，且使用的半抗原從大約1mg/ml到80mg/ml。
70.如權利要求36所述的方法，其中所述凝聚治療是選自低溫療法，雷射凝聚(ILC)，經皮膚的微波凝聚治療，射頻誘導凝聚壞死，反式瞳孔熱治療，超聲波治療和輻射治療。
71.如權利要求36所述的方法，其中所述自身免疫應答通過組合半抗原的作用和凝聚劑或治療劑的作用，可以包括或者是體液的和/或細胞的免疫應答。
72.如權利要求36所述的方法，其中所述用於治療的腫瘤是選自腎上腺，肛門，聽覺神經，膽管，膀胱，骨，腦，乳房，中樞神經系統，子宮頸，結腸，耳，子宮黏膜，食管，眼，眼瞼，輸卵管，腸胃束，頭和頸，心臟，腎，喉，肝臟，肺，上顎，下頜髁，上頜骨，嘴，鼻咽，鼻，口腔，卵巢，胰腺，腮腺，陰莖，耳廓，垂體，前列腺，直腸，視網膜，唾液腺，皮膚，小腸，脊髓，胃，睪丸，甲狀腺，扁桃體，尿道，子宮，陰道，前庭蝸神經，和外陰。
73.如權利要求36所述的方法，其中所述用於治療的腫瘤是實體腫瘤。
74.如權利要求73所述的方法，其中所述實體腫瘤的大小大於108個細胞。
75.如權利要求74所述的方法，其中所述實體腫瘤的大小從大約5X109到大約1011個細胞。
76.如權利要求36所述的方法，其中所述半抗原與所述凝聚劑是通過注射施於腫瘤的。
77.如權利要求36所述的方法，其中所述半抗原與所述凝聚劑是通過與外科手術程序結合的方式施於腫瘤的。
78.如權利要求1所述的組合物，進一步包括選自自殺基因序列，細胞裂解基因序列，細胞因子基因序列，輻射致敏劑，含細胞因子的貯存庫，報告子和報告基因序列的分子。
79.如權利要求36所述的方法，進一步包括原位施用選自自殺基因序列，細胞裂解基因序列，細胞因子基因序列，輻射致敏劑，含細胞因子的貯存庫，報告子和報告基因序列的分子。
全文摘要
本發明提供了用一種或多種半抗原和凝固劑或治療劑治療腫瘤贅生物、腫瘤和癌症的方法，它們可以單獨使用或與其它抗腫瘤劑或治療劑一起使用。本發明也提供了組合物，和含有所述組合物用於有效治療的試劑盒。
文檔編號A61K31/4164GK1431909SQ01806830
公開日2003年7月23日 申請日期2001年1月18日 優先權日2000年1月19日
發明者B·於 申請人:B·於