葡糖澱粉酶變體的製作方法

2023-10-25 12:54:17 2

專利名稱：：葡糖澱粉酶變體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有改進性質的葡糖澱粉酶變體和使用所述葡糖澱粉酶變體的方法。背景葡糖澱粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(1，4-alpha-D-glucanglucohydrolase)，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從澱粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原端釋放的酶。葡糖澱粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產生。商業上，使用葡糖澱粉酶將已經用α-澱粉酶部分水解的玉米澱粉轉化為葡萄糖。在高果糖玉米糖漿(HFCQ生產中，通過葡萄糖異構酶進一步將葡萄糖轉化為由幾乎相等的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物是普遍使用的高果糖玉米糖漿，其商業化遍布全球。對於高果糖玉米糖漿使用最多的是源自埃默森踝節菌(Talaromycesemersonii)和黑麴黴(Aspergillusniger)的葡糖澱粉酶。在商業上用於高果糖玉米糖漿生產的高固體濃度下，葡糖澱粉酶由通過縮合產生的葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。這種情況的發生是由於澱粉中α-(1-6)-D-糖苷鍵的緩慢水解和由D-葡萄糖形成多種積累的縮合產物，主要是異麥芽糖。因此，轉化方法中的葡萄糖產率不超過理論產率的95%。全世界通過這種方法產生的HFCS量非常大，而在每噸澱粉的葡萄糖產率上即使非常小的增加在商業上也是重要的。本發明的目的是減少特定葡糖澱粉酶的縮合產物的形成，所述葡糖澱粉酶可以從真菌生物，特別是踝節菌屬(Talaromycesgenus)和麴黴屬(Aspergillusgenus)的菌株獲得，並且已經基於它們的合適性質，例如澱粉轉化中的性質，對所述葡糖澱粉酶本身進行了選擇。發明簡述申請人:們目前發現通過在親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的特殊區域中的特殊位置引入一些變化，來降低形成α-(1-6)鍵的速率，和/或減少異麥芽糖的形成。葡糖澱粉酶切割並因而形成α-(1-6)鍵的速率相對於其切割α-(1-4)鍵的速率的降低具有實際意義。葡糖澱粉酶能夠在副產品量顯著減少的情況下產生葡萄糖，這將有重要的商業意義，例如，從澱粉生產甜味劑時。本發明的發明人提供了親本葡糖澱粉酶的許多變體，所述變體顯示減少的縮合。通過在糖化方法中使用本發明的葡糖澱粉酶變體，能夠產生具有非常高葡萄糖百分比的糖漿。通過突變，例如通過在親本葡糖澱粉酶中取代和/或缺失和/或插入選擇的位置來獲得減少的縮合。這將在下文中詳細描述。因此，在第一個方面，本發明涉及親本葡糖澱粉酶的變體，當與親本葡糖澱粉酶比較時，所述變體葡糖澱粉酶的縮合產物產量減少。因此，在第二個方面，本發明涉及親本葡糖澱粉酶的變體，其在以下區域之一中包含變化區域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個或多個中，區域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個或多個中，和/或區域409-415，例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個或多個中，其中(a)所述變化獨立地是(i)在佔據該位置的胺基酸的下遊插入胺基酸，缺失佔據該位置的胺基酸，或(iii)用不同的胺基酸取代佔據該位置的胺基酸，(b)所述變體具有葡糖澱粉酶活性，並且(c)各位置相應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的區域或位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或相應於同源葡糖澱粉酶中的區域或位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列具有至少50%同一性程度。在第三個方面，本發明涉及DNA構建體，其包含編碼根據第一個方面的葡糖澱粉酶變體的DNA序列。在第四個方面，本發明涉及重組表達載體，其攜帶根據第二個方面的DNA構建體。在第五個方面，本發明涉及細胞，將所述細胞用根據第二個方面的DNA構建體或根據第三個方面的載體轉化。在第六個方面，本發明涉及根據第四個方面的細胞，所述細胞是微生物，尤其是細菌或真菌。在第七個方面，本發明涉及用於將澱粉或部分水解的澱粉轉化為含有葡萄糖(dextrose)的糖漿的方法，所述方法包括在根據第一個方面的葡糖澱粉酶變體存在下糖化澱粉水解物。在另外的方面，本發明涉及第一或第二方面中任一的葡糖澱粉酶在澱粉轉化方法中，優選在連續澱粉轉化方法中的用途；在用於產生寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的方法中的用途；在用於產生高果糖玉米糖漿的方法中的用途；在用於產生酒精飲料(alcoholicbeverage)、燃料或飲用乙醇的方法中的用途；和/或在用於產生有機化合物的發酵方法中的用途。本發明還涉及以下1.親本葡糖澱粉酶的變體，所述變體葡糖澱粉酶與親本葡糖澱粉酶相比縮合產物的產量降低。2.項1的變體，其中所述縮合產物是異麥芽糖。3.親本葡糖澱粉酶的變體，其在以下區域之一中包含變化區域M8-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個或多個中，區域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個或多個中，和/或區域409-415，例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個或多個中，其中(a)所述變化獨立地是(i)在佔據所述位置的胺基酸的下遊插入胺基酸，(ii)將佔據所述位置的胺基酸缺失，或(iii)用不同的胺基酸取代佔據所述位置的胺基酸，(b)所述變體具有葡糖澱粉酶活性並且(c)各區域或位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的區域或位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。4.項1-3中任一項的變體，所述變體在以下位置的一個或多個包含變化252、312、314、315、412，其中各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。5.項1或4中任一項的變體，所述變體包含以下變化中的一種或多種在位置252取代為A、F、G或V；在位置312取代為S，在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y；在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D，或在位置314和315之間插入胺基酸殘基I，其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。6.項1至5中任一項的變體，所述變體包含以下取代中的一個或多個V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入胺基酸殘基I(Q314QI)，其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。7.項1至6中任一項的變體，所述變體包含取代G315F，其中所述位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。8.項1至6中任一項的變體，所述變體包含取代G315Y，其中所述位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。9.項1至8中任一項的變體，所述變體包含取代L252A，其中所述位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。10.項1至9中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N，其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。11.項1至10中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個Q314F+G315N、Q314W+G315N、Q314Y+G315N、Q314L+G315A、Q314N+G315R、Q314R+G315D、G315R+A463T、G315R+K556E、G315L+D529N,其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO:1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。12.項1至11中任一項的變體，其中所述親本葡糖澱粉酶具有的胺基酸序列與SEQIDNO1的胺基酸序列有至少60%，優選至少60%，更優選至少大約70%，還更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且最優選至少98%同一性程度。13.項1至12中任一項的變體，其中所述親本葡糖澱粉酶由核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴緊條件下，在中嚴緊條件下，或在高嚴緊條件下與SEQIDNO1的核酸序列或其互補鏈雜交。14.項1至13中任一項的變體，其中所述親本葡糖澱粉酶獲得自踝節菌屬，尤其是埃默森碟節菌(Talaromycesemersonii)。15.項1至14中任一項的變體，其中所述變體與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的縮合。16.DNA構建體，其包含編碼根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體的DNA序列。17.重組表達載體，其攜帶根據項16的DNA構建體。18.用根據項16的DNA構建體或根據項17的載體轉化的細胞。19.根據項18的細胞，所述細胞是微生物，具體而言是細菌或真菌。20.根據項19的細胞，所述細胞是來自踝節菌屬菌種的菌株。21.根據項20的細胞，所述細胞是來自埃默森踝節菌的菌株。22.用於將澱粉轉化或部分水解成為含有葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體存在下將澱粉水解物糖化。23.項22的方法，其中所述葡糖澱粉酶變體的劑量以0.05至0.5AGU每克幹固體的範圍存在。24.項22或23中任一項的方法，其包括糖化澱粉水解物，優選按重量計具有至少30%幹固體的澱粉水解物。25.項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體在澱粉轉化方法中的用途，優選在連續澱粉轉化方法中的用途。26.根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的方法中的用途。27.根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生高果糖玉米糖漿的方法中的用途。28.根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的方法中的用途。29.根據項1至15中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生有機化合物的發酵方法中的用途。發明詳述使用的定義命名法在本說明書和權利要求書中，對於胺基酸殘基使用常規的一字母和三字母密碼子。為了易於參考，通過以下命名法的使用來描述本發明的葡糖澱粉酶變體原始胺基酸位置取代胺基酸。根據這種命名法，例如在位置30用天冬醯胺取代丙氨酸表示為A30N，在相同位置中缺失丙氨酸表示為A30*，而插入額外的胺基酸殘基例如賴氨酸顯示為A30AK。缺失相鄰的胺基酸殘基段，例如胺基酸殘基30-33，表示為Δ(Α30-Ν33)。當特定葡糖澱粉酶與其它葡糖澱粉酶相比含有"缺失"並且在此位置進行插入時，將在位置36中插入天冬氨酸的情況表示為*36D。通過加號分隔多個突變A30N+E34S分別代表在位置30和34用天冬醯胺和絲氨酸取代丙氨酸和穀氨酸的突變。也可如下分隔多個突變，意思與加號相同，即A30N/E34S當在給定位置可以插入一種或多種可選胺基酸殘基時，表示為A30N或A30E。此外，當本文鑑定了適合於修飾的位置未建議任何具體的修飾時，應理解為任何胺基酸殘基可取代該位置存在的胺基酸殘基。因此，例如，當提到在位置30的丙氨酸的修飾但是未指定時，應理解為可將所述丙氨酸缺失或由任何其它胺基酸取代，即R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V中的任一。根據W.R.TaylorinTheClassificationofAminoAcidConservation,J.Theor.Biol.119(1986)205-218中的定義，將術語「極性」(C、T、S、D、N、Y、W、H、K、E、R、Q)、「非極性」(A、C、V、I、L、M、K、F、Y、W、H)、「脂肪族」(V、I、L)、「芳族」(F、Y、W、H)、「小」(A、C、D、G、N、P、T、S)、「微小(tiny)，，(A、C、G、T、S)、「帶電荷」(K、R、D、E)用於胺基酸殘基。此外，將術語「六元環芳族」用於含有非融合六元芳香環體系的胺基酸殘基(即F、Y)。還將術語「陰性」用於在中性PH具有帶負電的側鏈的胺基酸殘基(即D、E)。在本發明的上下文中，可將同源性作為兩個序列之間同一性的程度測定，表示第一序列從第二序列衍生。可以通過本領域已知的電腦程式的方法來合適地測定同源性，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP(上文所述)。因此，可以按照用於同一性的默認計分矩陣和以下默認參數來使用GapGCGvS對於核酸序列比較分別是GAP產生罰分(GAPcreationpenalty)為5.0和GAP延伸罰分(GAPextensionpenalty)為0·3；而對於蛋白質序列比較分別是GAP創造罰分為3.0和GAP延伸罰分為0.1。GAP使用NeedlemanandWunsch,(1970)，J.Mol.Biol.48，p.443-453的方法來進行比對並且計算同一性。可以將SEQIDNO:1和另一種葡糖澱粉酶之間的結構比對用於鑑定等同/相應的位置。獲得所述結構比對的一種方法是使用來自GCG程序包的PileUp程序，使用缺口罰分(gappenalty)的默認值，S卩，缺口產生罰分為3.0和缺口延伸罰分為0.1。其它結構比對方法包括疏水簇分析(Gaboriaudetal.，(1987)，FEBSLETTERS224，pp.149-155)和反向穿線(reversethreading)(Huber,T；Torda,AE,PROTEINSCIENCEVol.7，No.lpp.142-149(1998)。在本發明的上下文中，「源自"不僅表示由所述生物的菌株產生或可由所述生物的菌株產生的葡糖澱粉酶，並且還表示由分離自這種菌株的DNA序列編碼的葡糖澱粉酶和用所述DNA序列轉化的宿主生物中產生的葡糖澱粉酶。最終，該術語旨在表示由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼的葡糖澱粉酶，並且其具有所述葡糖澱粉酶的鑑別特徵。該術語還旨在表示親本葡糖澱粉酶可以是天然存在的葡糖澱粉酶的變體，即作為修飾(插入、取代、缺失)天然存在的葡糖澱粉酶的一個或多個胺基酸殘基的結果而得到的變體。本發明的葡糖澱粉酶變體本發明提供親本葡糖澱粉酶的變體，其包含在以下區域之一中的變化區域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255中，區域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318中，和/或區域409-415，例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415，其中(a)所述變化獨立地是(i)在佔據該位置的胺基酸的下遊插入胺基酸，(ii)缺失佔據該位置的胺基酸，或(iii)用不同的胺基酸取代佔據該位置的胺基酸，(b)所述變體具有葡糖澱粉酶活性，並且(c)各區域和/或位置相應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，和/或相應於同源葡糖澱粉酶中的區域和/或位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列具有至少50%同一性程度。優選在以下位置中的一個或多個包含變化的變體252、312、314、315、412，其中每個位置相應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列中的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列。優選在相應於SEQIDNO:1中L252的位置是被任何非極性殘基取代(A、C、F、G、H、I、K、M、V、W、Y)；更優選是被非極性殘基，同時也是小殘基取代(V、C、A、G)；甚至更優選是被非極性殘基，同時也是微小殘基取代(A、G)，並且最優選是被殘基A取代。優選在相應於SEQIDNO:1中V312的位置是被任何極性殘基取代(C、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y)；更優選是被極性殘基，同時也是小殘基取代(C、T、S、D、N)；甚至更優選是被極性殘基，同時也是微小殘基取代(C、T、S)，並且最優選是被殘基S取代。優選在相應於SEQIDNO1中Q314的位置是被任何極性、脂肪族或芳族殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W、Y)；更優選是被帶電荷、脂肪族或芳族殘基取代(D、E、F、H、I、K、L、R、V、W、Y)；更優選是被脂肪族或芳族殘基取代(F、H、I、L、V、W、Y)；更優選是被芳族殘基取代(F、H、W、Y)；甚至更優選是被芳族殘基，同時也是六元環芳族殘基取代(F、Y)，並且最優選是被殘基Y取代。優選在相應的位置中，在SEQIDNO1的Q314之後的插入是以任何脂肪族或芳族殘基插入(V、I、L、F、Y、W、H)；更優選是以脂肪族殘基插入(V、I、L)；並且最優選插入殘基IO優選在相應於SEQIDNO:1中G315的位置是被任何非極性殘基(A、C、F、H、I、K、L、M、V、W、Y)取代、被極性殘基取代或被不是小殘基的殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、Y)；還優選是被小殘基或帶電荷殘基取代(D、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y)；更優選是被不是小殘基的殘基取代(E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y)或被既不是小殘基也不是正電殘基的殘基取代(E、F、H、I、L、M、Q、W、Y)或被既不是小殘基也不是負電殘基的殘基取代(I、L、M、F、Y、W、H、K、R)，或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基也不是小殘基(F、Y、W、H、I、L)，或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基既不是小殘基也不是帶電荷殘基(F、Y、W、I、L)；或更優選是被芳族殘基並且不是帶電荷殘基(F、Y、W)取代；甚至更優選是芳族殘基並且還是六元環芳族殘基(F、Y)；並且最優選是被殘基Y取代。優選在相應於SEQIDNO1中L412的位置是被任何極性殘基(C，D，E，H，K，N，Q，R，S，T，W，Y)取代；更優選是被帶電荷殘基(H，K，R，E，D)取代；還更優選是被負電殘基(D，E)取代；並且最優選是被殘基D取代。更優選的是包含以下變化中的一種或多種的變體在位置252取代為A、F、G或V；在位置312取代為S，在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y；在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D，或在位置314和315之間插入胺基酸殘基I，其中每個位置對應於具有SEQIDNO:1的胺基酸序列的親本葡糖澱粉酶胺基酸序列中的位置。甚至更優選的是包含以下取代組合中的一個或多個的變體314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+5^N，其中每個位置相應於具有SEQIDNO:1的胺基酸序列的親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列中的位置，並且尤其是包含一個或多個以下取代的變體V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入胺基酸殘基I(Q314QI)，其中每個位置對應於具有SEQIDNO:1的胺基酸序列的親本葡糖澱粉酶胺基酸序列中的位置。更優選的是包含以下取代組合中的一個或多個的變體Q314F和G315N、Q314W和G315N、Q314Y禾口G315N、Q314L禾口G315A、Q314N禾口G315R、Q314R禾口G315D、G315R禾口A463T、G315R和K556E、G315L和D5^N，其中每個位置對應於具有SEQIDNO:1的胺基酸序列的親本葡糖澱粉酶胺基酸序列中的位置。本發明的變體可以具有SEQIDNO1的成熟葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶活性的至少20%，優選至少40%，更優選至少60%，甚至更優選至少80%，甚至更優選至少90%，並且最優選至少100%。相對於SEQIDNO1的親本葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶，本發明的變體可以具有降低至少5%，優選至少10%，更優選至少15%，甚至更優選至少20%，更優選至少25%，並且最優選至少30%的縮合。親本葡糖澱粉酶根據本發明預期的親本葡糖澱粉酶包括野生型葡糖澱粉酶、真菌葡糖澱粉酶，尤其是可以從踝節菌屬獲得的真菌葡糖澱粉酶，尤其是可以從1099/^28448中(參見WO99/28448的SEQIDNO7)和本文SEQIDNO1中公開的T.emersonii獲得的真菌葡糖澱粉酶。在另外的實施方式中，葡糖澱粉酶主鏈源自麴黴屬菌株，例如黑麴黴(Aspergillusniger)或泡盛麴黴(Aspergillusawamori)葡糖澱粉酶和它們的變體或突變體，同源葡糖澱粉酶，和與它們在結構和/或功能上相似的其它葡糖澱粉酶。優選地，親本葡糖澱粉酶包含選自下列的一個或多個特異性胺基酸殘基；位置252的胺基酸殘基L，位置314的胺基酸殘基Q，位置315的胺基酸殘基G和位置412的胺基酸殘基L。優選地，親本葡糖澱粉酶包含SEQIDNO=I的胺基酸序列；或其等位變體；或其具有葡糖澱粉酶活性的片段。SEQIDNO1的片段是從此胺基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個胺基酸的多肽。等位變體表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。合適的親本葡糖澱粉酶可以是具有以下胺基酸序列的葡糖澱粉酶，所述胺基酸序列與SEQIDNO1的胺基酸序列具有至少50%，優選至少60%，更優選至少大約70%，還更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且最優選至少98%的同一性程度(即同源親本葡糖澱粉酶)。同源親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列可以因插入或缺失一個或多個胺基酸殘基和/或用不同的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基而不同於SEQIDNO=I的胺基酸序列。優選地，胺基酸改變對性質是不重要的(ofaminornature)，即不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性的保守胺基酸取代；小缺失，通常為1至大約30個胺基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸區(tract)、抗原表位或結合域。親本多肽還可以是具有葡糖澱粉酶活性的所述多肽等位變體或片段。SEQIDNO:1的胺基酸序列或其片段可以用於設計核酸探針以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株中鑑定和克隆編碼具有葡糖澱粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以在其中鑑定和分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少15，優選至少25，更優選至少35個核苷酸。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。因此，可篩選由這些其它生物製備的基因組DNA或cDNA文庫中的DNA，所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有葡糖澱粉酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或其它分離技術來分離來自這些其它生物的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。對於長度至少100個核苷酸的長探針，使用2xSSC、0.2%SDS，優選在45°C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50°C(低嚴緊性)，更優選至少在55°C(中嚴緊性)，更優選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴緊性)，並且最優選至少在700C(非常高嚴緊性)，將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。期望的親本葡糖澱粉酶具有至少20%，優選至少40%，更優選至少60%，甚至更優選至少80%，甚至更優選至少90%，並且最優選至少100%的SEQIDNO1的成熟葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶活性。克隆編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列可以使用多種本領域熟知的方法，從產生所述葡糖澱粉酶的任何細胞或微生物分離編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列。首先，應該使用染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫，所述染色體DNA或信使RNA來自產生待研究的葡糖澱粉酶的生物。然後，如果葡糖澱粉酶的胺基酸序列是已知的，可以合成標記的寡核苷酸探針並且用於從由所述生物製備的基因組文庫中鑑定編碼葡糖澱粉酶的克隆。或者，可以使用非常低至非常高嚴緊性的雜交和洗滌條件，使用含有與其它已知葡糖澱粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針作為探針來鑑定編碼葡糖澱粉酶的克隆。這在上文描述。用於鑑定編碼葡糖澱粉酶的克隆的另一種方法可涉及將基因組DNA的片段插入表達載體，例如質粒；用所得基因組DNA文庫轉化葡糖澱粉酶陰性細菌；其後將轉化的細菌塗布在含有用於葡糖澱粉酶的底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，從而使表達該葡糖澱粉酶的克隆得以鑑定。或者，可以通過已經建立的標準方法，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，TetrahedronLetters22，p.1859-1869描述的亞磷醯胺(phosphoroamidite)方法，或由Matthesetal.，(1984)，EMBOJ.3，p.801-805描述的方法來合成製備編碼所述酶的DNA序列。在亞磷醯胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自動DNA合成儀中合成；純化；退火；連接並且克隆到適當的載體中。最後，該DNA序列可以是基因組和合成混合來源，合成和cDNA混合來源，或基因組和cDNA混合來源，根據標準技術通過連接合成來源、基因組來源或cDNA來源的片段來製備(這些片段對應於整個DNA序列的不同部分，視情況而定)。也可以使用特異性引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)來製備該DNA序列，例如US4，683，202或R.K.Saikietal.，(1988)，Science239，1988，pp.487-491中所述。定點誘變一旦將編碼葡糖澱粉酶的DNA序列分離，並且鑑定了用於突變的期望位點，則可以使用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有側翼為期望突變位點的核苷酸序列。在特定方法中，在含有所述葡糖澱粉酶基因的載體中產生DNA的單鏈缺口，所述DNA是編碼葡糖澱粉酶的序列。然後將含有期望突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。然後用DNA聚合酶I(Klenow片段)填補剩餘的缺口，並且使用T4連接酶連接構建體。這種方法的特定實例在Morinagaetal.，(1984)，Biotechnology2，p.646-639中描述。US4,760,025公開了通過進行盒的較小改變(minoralterationofthecassette)來引入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，因為能夠引入多種長度的大量寡核苷酸，可以通過Morinaga方法在任一時間引入甚至更多種突變。用於將突變引入編碼葡糖澱粉酶的DNA序列的另一種方法在NelsonandLong,(1989),AnalyticalBiochemistry180，p.147-151中描述。其涉及三步產生包含期望突變的PCR片段，所述突變通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的引物之一來引入。從PCR產生的片段中，可以通過用限制性內切酶切割來分離攜帶所述突變的DNA片段，並且再插入至表達質粒。此夕卜，Sierks.etal.，(1989)"Site-directedmutagenesisattheactivesiteTrpl20ofAspergillusawamoriglucoamylase.ProteinEng.,2,621-625；Sierksetal.,(1990),"DeterminationofAspergillusawamoriglucoamylasecatalyticmechanismbysite-directedmutagenesisatactivesiteAspl76,Glul79,andGlul80".ProteinEng.vol.3,193-198；也描述麴黴屬葡糖澱粉酶中的定點誘變。表達葡糖澱粉酶變體根據本發明，可以使用表達載體以酶的形式來表達通過上述方法或通過本領域已知的任何可選方法產生的編碼葡糖澱粉酶變體的DNA序列，所述表達載體通常包含調控序列，其編碼啟動子、操縱基因、核糖體結合位點、翻譯初始信號和任選地阻抑基因或多種激活基因。表達載體攜帶編碼本發明的葡糖澱粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是任何載體，其可以方便地進行重組DNA方法，並且載體的選擇將通常依賴於待引入該載體的宿主細胞。載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到宿主細胞基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。合適的表達載體的實例包括PMT838。啟動子在載體中，應該將DNA序列與合適的啟動子序列可操作地連接。啟動子可以是任何DNA序列，其在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性，並且可以源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用於指導編碼本發明的葡糖澱粉酶變體的DNA序列的轉錄，特別是在細菌宿主中的轉錄的合適啟動子的實例是大腸桿菌的Iac操縱子的啟動子、天藍色鏈黴菌(Sti^ptomycescoelicolor)瓊月旨酶基因dagA啟動子、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-澱粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)的啟動子、解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-澱粉酶(amyQ)的啟動子、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)xylA和xylB基因的啟動子等。對於在真菌宿主中的轉錄，有用啟動子的實例是源自下列的那些啟動子編碼米麴黴(A.oryZae)TAKA澱粉酶的基因、來自釀酒酵母(S.cerevisiae)的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alberetal.(1982),J.Mol.Appl.Genet1，ρ·419-434)、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(A.niger)中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定α-澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴(A.nidulans)乙醯胺酶。表達載體本發明的表達載體還可以包含合適的轉錄終止子，並且在真核生物中還可以包含聚腺苷酸化序列，它們與編碼本發明的葡糖澱粉酶變體的DNA序列可操作地連接。終止序列和聚腺苷酸化序列可以適當地源自與啟動子相同的來源。載體可以進一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細胞中複製的DNA序列。這些序列的實例是以下質粒的複製起點pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702。載體還可以包含選擇標記，例如其產物補足宿主細胞中缺陷的基因，例如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性。此外，該載體可以包含麴黴屬選擇性標記例如amdS、argB、niaD和sC，產生潮黴素抗性的標記，或所述選擇可以通過共轉化完成，例如WO91/17243中所述。分別用於連接編碼葡糖澱粉酶變體的本發明的DNA構建體、啟動子、終止子和其它元件，並將它們插入含有複製必需的信息的合適載體中的方法，對本領域的技術人員而言是熟失口的(參見，例如，Sambrooketal.，MolecularCloninR:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarbor,1989)。宿主細胞在本發明的葡糖澱粉酶變體的重組生產中，將包含如上限定的本發明的DNA構建體或表達載體的本發明的細胞有利地用作宿主細胞。方便地通過將DNA構建體(以一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，可以將細胞用編碼變體的本發明的DNA構建體轉化。通常認為這種整合是有利的，因為該DNA序列更有可能穩定地保持在所述細胞中。將所述DNA構建體整合入宿主染色體可以根據常規方法，例如通過同源或異源重組進行。或者，可以用如上所述與不同類型的宿主細胞相關的表達載體轉化所述細胞。本發明的細胞可以是高等生物的細胞，例如哺乳動物、昆蟲或植物的細胞，但優選是微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。合適細菌的實例是革蘭氏陽性細菌例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢Ifisf(Bacillusalkalophilus)|1>M^n^ifelflif(Bacilluscoagulans)>環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis),或淺青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)或鼠灰鏈黴菌(Str印tomycesmurinus),或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。細菌轉化可以例如通過原生質體轉化或使用感受態細胞以本身已知的方式來實現。酵母生物可以有利地選自酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬的菌種,例如釀酒酵母。宿主細胞還可以是絲狀真菌，例如屬於麴黴屬菌種的菌株，最優選是米麴黴或黑麴黴，或鐮孢屬(Fusarium)的菌株，例如下列菌種的菌株尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)(在完全階段命名為玉蜀黍赤黴(Gibberellazeae)，曾命名為玉米球果菌(Sphaeriazeae)，與粉紅赤黴(Gibberellaroseum)和粉紅赤黴禾穀專化型(Gibberellaroseumf.sp.Cerealis)為同物異名)或硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)(在完全階段命名為蝨狀赤黴(Gibberellapuricaris)，與擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)和粉紅鐮孢禾本科變種(Fusariumroseumvar.graminearum)為同物異名)，禾穀鍵抱(Fusariumcerealis)(與庫威鐮孢(Fusariumcrokkwellense)為同物異名)或鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)。在本發明的優選實施方式中，宿主細胞是蛋白酶缺陷型或蛋白酶陰性菌株。例如這可以是蛋白酶缺陷菌株米麴黴JaL125，其缺失名為「alp」的鹼性蛋白酶基因。這種菌株在WO97/35956(NovoNordisk)或EP專利號429，490中描述。可以通過涉及原生質體形成和原生質體的轉化其後再生細胞壁的方法，以本身已知的方式來轉化絲狀真菌細胞。使用麴黴屬作為宿主微生物在EP238，023(NovoNordiskA/S)中描述，將其內容通過參考併入本文。在植物中表達葡糖澱粉酶變體可以將編碼感興趣的多肽的DNA序列，例如編碼本發明的葡糖澱粉酶的DNA序列如下所述轉化到轉基因植物中並且在其中表達。轉基因植物可以是雙子葉或單子葉的，簡稱雙子葉植物(dicot)或單子葉植物(monocot)。單子葉植物的實例是草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),禾本科(Poa))，牧草(foragegrass)例如羊茅屬(i^estuca)、黑麥草屬(Lolium)，溫帶草例如剪股穎屬(Agrostis)，以及穀類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物實例為菸草，豆類例如羽扇豆，馬鈴薯，糖甜菜，豌豆，菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))例如花椰菜、油菜(oilseedrape)以及緊密相關的模型生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖，以及包含這些部分的獨立組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。在本上下文中，特定植物細胞區室，例如葉綠體(chloroplast)、質外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧物酶體(peroxisome)和細胞質，也都認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論其組織來源，都認為是植物部分。類似地，植物部分，如分離以利於本發明利用的特定組織和細胞，也都認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)禾口禾中皮(seedcoat)。這些植物、植物部分和植物細胞的子代也包括在本發明的範圍內。表達感興趣的多肽的轉基因植物或植物細胞可按本領域的已知方法構建。簡言之，所述植物或植物細胞通過如下方法來構建將編碼感興趣的多肽的一個或多個表達構建體併入植物宿主基因組，並且將所得的經修飾的植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞。方便的是，表達構建體是DNA構建體，所述DNA構建體包含編碼感興趣的多肽的基因，所述基因與該基因在所選植物或植物部分中表達所需的適當調節序列可操作地連接。此外，表達構建體可包含用於鑑定已整合了表達構建體的宿主細胞的選擇標記和用於將構建體引入所述植物所必需的DNA序列(後者取決於所用的DNA引入方法)。調節序列，如啟動子和終止子序列以及任選地信號或轉運序列的選擇，例如基於期望表達酶的時間(when)、地點(where)和方式(how)來確定。例如，編碼本發明的酶的基因的表達可以是組成型或誘導型，或可以是發育、階段或組織特異性的，並且基因產物可以靶向特定細胞區室、組織或植物部分，例如種子或葉。調節序列例如由Tagueetal,Plant,Phys.，86，506，1988描述。就組成型表達而言，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Francketal.1980.Cell21:285_294，ChristensenAH,SharrockRAandQuail1992.Maizepolyubiquitingenes-structure，thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation.PlantMo.Biol.18,675-689.；ZhangW,McElroyD.andWuR1991,AnalysisofriceActl5'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如，來自貯存庫組織(storagesinktissue)如種子、馬鈴薯塊蓮和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990.Annu.Rev.Genet.24275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)如分生組織的啟動子(Itoetal.,1994,PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子，如來自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wuetal.，PlantandCellPhysiologyVol.39，No.8pp.885-889(1998))，來自豆球蛋白B4的蠶豆(Viciafaba)啟動子和ConradU.etadjournalofPlantPhysiologyVol.152,No.6pp.708-711(1998)所述的來自蠶豆的未知種子蛋白基因，來自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動子(Chenetal.，Plantandcellphysiologyvol.39，No.9ρρ·9；35_941(1998)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯存蛋白napA啟動子，或本領域已知的任何其它種子特異性啟動子，例如在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子也可以是葉特異性啟動子，例如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozukaetal.，PlantPhysiologyVol.102，No.3pp.991-1000(1993)，小球藻病毒腺曙呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra，A.andHiggins,Dff,PlantMolecularBiologyVol.26,No.lpp.85-93(1994)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagayaetal.，MolecularandGeneralGeneticsVol.248，No.6pp.668-674(1995)，或傷口誘導的啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xuetal,PlantMolecularBiologyVol.22,No.4ρρ·573-588(1993)。類似地，啟動子可通過非生物處理例如溫度、乾旱或鹽度改變來誘導，或由激活啟動子的外源施加的物質，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脫落酸和赤黴酸以及重金屬來誘導。啟動子增強元件中可用於取得酶在植物的較高表達。例如，啟動子增強元件可以是位於啟動子和編碼酶的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xuetal.(前文已引用)公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子來增強表達。選擇標記基因和表達構建體的任何其它部分可由本領域可用的那些來選擇。用本領域已知的常規技術將DNA構建體整合至植物基因組，所述常規技術包括農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasseretal,Science,244,1293；Potrykus,Bio/Techn.8,535,1990；Shimamotoetal，Nature，338，274，1989)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移是用於產生轉基因雙子葉植物的優選方法(參見綜述Hooykas&Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，並且也能用於轉化單子葉植物，儘管對這些植物通常使用其它轉化方法。目前，補充土壤桿菌(Agrobacterium)法用於產生轉基因單子葉植物的優選方法是胚愈傷組織或發育中的胚的粒子轟擊(用轉化DNA塗覆的微觀的(microscopic)金或鎢顆)(Christou,1992.PlantJ.2:275-281；Shimamoto,1994.Curr.Opin.Biotechnol.5158-162；Vasiletal.,1992.Bio/Technology10:667-674)。轉化單子葉植物的可選方法基於原生質體轉化，如OmirullehS,etal.，PlantMolecularbiologyVol.21,No.3pp.415-428(1993)所述。轉化後，根據本領域熟知的方法選擇併入表達構建體的轉化體並將其再生成全植物。通常將轉化方法設計成通過使用例如兩種獨立T-DNA構建體的共轉化或使用特異性重組酶位點特異性切除選擇基因，從而在再生期間或在後代中選擇性地消除選擇基因。產生葡糖澱粉酶變體的方法本發明還涉及產生本發明葡糖澱粉酶變體的方法，所述方法包括在有益於產生所述變體的條件下培養宿主細胞，和從所述細胞和/或培養基中回收該變體。用於培養細胞的培養基可以是任何方便的培養基，其適合於培養所述宿主細胞和獲得本發明葡糖澱粉酶變體的表達。適合的培養基可以從商業供應商獲得，或可以根據公開的配方製備(例如美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中所述)。可以通過熟知的方法方便地從培養基中回收由宿主細胞分泌的葡糖澱粉酶變體，所述熟知的方法包括通過離心或過濾從培養基分離細胞；藉助鹽例如硫酸銨沉澱培養基中的蛋白質成分；其後使用層析方法例如離子交換層析、親和層析等。葡糖澱粉酶變體的用途可以將本發明的變體用於澱粉轉化方法中，例如任何澱粉降解方法中，其中將澱粉降解成例如葡萄糖，例如用於甜味劑的生產中或在用於產生有機化合物的發酵方法中，所述有機化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、檸檬酸、穀氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸δ內酯(gluconodeltalactone)、異抗壞血酸鈉(sodiumerythorbate)、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；胺基酸，穀氨酸(一穀氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青黴素、四環素；酶；維生素，例如核黃素、B12、β-胡蘿蔔素或激素。常規澱粉轉化方法，例如液化和糖化方法在例如美國專利No.3，912，590和EP專利公開Nos.252，730和63，909中描述，將它們作為參考併入本文。本發明的變體對於澱粉轉化，例如在甜味劑高果糖玉米糖漿(HFCS)的產生中尤其有用。可以將本發明的變體用在用於產生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的澱粉糖化(mashing)和/或發酵方法中。澱粉轉化本發明提供使用本發明的葡糖澱粉酶變體用於從澱粉產生葡萄糖等的方法。通常所述方法包括以下步驟在α「澱粉酶的存在下將前體澱粉部分水解，其後在葡糖澱粉酶存在下，通過切割α-(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵，進一步從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端水解釋放D-葡萄糖。使用α_澱粉酶部分水解前體澱粉通過水解內部的α-(1-4)-連接來提供澱粉分子的初始分解。在商業應用中，使用α-澱粉酶的初始水解在大約105°C的溫度進行。加工的澱粉濃度非常高，通常是30%至40%固體。初始水解通常在這種高溫進行5分鐘。其後可將部分水解的澱粉轉移至第二罐並且在85至90°C的溫度溫育大約1小時以得到10至15的葡萄糖當量(D.E.)。進一步水解的步驟在葡糖澱粉酶存在下從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端釋放D-葡萄糖，該步驟通常在分開的罐中在降低的溫度30-60°C進行。優選將底物液體的溫度降低至55°C-60°C。溶液的pH從6-6.5降低至3-5.5。優選地，溶液的pH是4-4.5。將葡糖澱粉酶添加至溶液，並且將反應進行24-72小時，優選36-48小時。可以使用本發明的葡糖澱粉酶變體的糖化方法實例包括JP3-224493；JP1-191693JP62-272987；和EP452,238中描述的方法。可以將本發明的葡糖澱粉酶變體與僅水解具有至少四個葡糖殘基的分子中α_(1-6)-糖苷鍵的酶組合用於本發明的方法中。優選地，可將本發明的葡糖澱粉酶變體與支鏈澱粉酶或異澱粉酶組合使用。異澱粉酶和支鏈澱粉酶用於脫支(debranching)的用途、所述酶的分子性質和所述酶與葡糖澱粉酶一起的潛在用途在G.M.A.vanBeynumetal.,StarchConversionTechnology,MarcelDekker,NewYork,1985,101-142中描述。本發明還涉及本發明的葡糖澱粉酶變體在澱粉轉化方法中的用途，優選在連續糖化步驟中的用途。本發明的葡糖澱粉酶變體還可以固定化的形式使用。這是合適的並且通常用於生產麥芽糊精或葡萄糖糖漿或特殊糖漿(specialitysyrup)，例如麥芽糖糖漿；並且還用於與果糖糖漿生產有關的寡糖殘液液流(raffinatestream)。當期望的最終糖產品是例如高果糖糖漿時，可將葡萄糖糖漿轉化為果糖。在糖化方法之後，將PH升高至6-8的值，優選pH7.5，並且通過離子交換去除鈣。其後使用例如固定化葡萄糖異構酶(例如SweetzymeTMIT)將葡萄糖糖漿轉化為高果糖糖漿。發酵方法可以將麥芽糖和/或葡萄糖發酵成乙醇產品或其它發酵產物，例如檸檬酸、穀氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸δ內酯或異抗壞血酸鈉、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；胺基酸，穀氨酸(一穀氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青黴素、四環素；酶；維生素，例如核黃素、B12、β-胡蘿蔔素或激素。通常基於整穀粒的發酵方法，例如乙醇方法，可分為4個主要步驟磨碎(milling)、液化、糖化、發酵。磨碎穀粒以打開結構和允許進一步加工。使用溼磨和幹磨兩種方法。在幹磨中，研磨整穀粒並且用在方法的剩餘部分中。溼磨提供胚芽(germ)和粗粉(meal)(澱粉顆粒和蛋白質)的良好分離，並且除了少數例外，將溼磨應用於存在平行生產糖漿的場合。在液化方法中，通過水解成主要為DP大於4的麥芽糊精來溶解澱粉顆粒。可以通過酸處理或通過α-澱粉酶的酶處理來進行所述水解。酸水解在有限的基礎上使用。原料可以是磨碎的整穀粒或來自澱粉加工的側流(sidestream)。酶液化通常作為三步熱漿方法進行。將漿料加熱至60_95°C，優選80_85°C，並添加酶。其後將漿料在95-140°C，優選105-125°C蒸汽熱壓蒸煮(jet-cook)以將澱粉凝膠化，冷卻至60-95°C，再添加更多的酶以獲得最終水解。所述液化方法在pH4.5-6.5，通常在pH5-6進行。經磨碎和液化的穀物也稱為醪(mash)。為了產生酵母能夠代謝的低分子糖DP"，必須將來自液化的麥芽糊精進一步水解。所述水解通常通過葡糖澱粉酶以酶方法進行，或者可以使用α-葡糖苷酶或酸性α-澱粉酶。完整糖化步驟可以持續多至72小時，然而，一般僅進行通常為40-90分鐘的預糖化，然後是發酵期間的完全糖化(SSF)。糖化通常在30-65°C，通常大約60°C的溫度，並且在pH4.5進行。將通常源自酵母屬菌種(Saccharomycesspp.)的酵母添加至所述醪並且將發酵進行M-96小時，例如通常為35-60小時。溫度是，通常是大約32°C，並且pH是pH3-6，優選大約pH4-5。注意到最廣泛使用的方法是同時糖化和發酵(SSF)方法，其中不存在用於糖化的保持階段(holdingstage)，意思是將酵母和酶一起添加。當進行SSF時，通常在即將發酵之前引入溫度在50°C以上的預糖化步驟。也可以不使澱粉凝膠化而以所謂的生澱粉水解方法來進行液化和糖化，例如在WO2004/080923,WO2004/081193或WO2003/668中所述。生澱粉水解方法優選作為SSF方法進行。在發酵之後，蒸餾醪以提取乙醇。根據本發明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，可飲用的精製酒精(potableneutralspirits)；或工業乙醇。發酵的剩餘物(leftover)是酒糟(spendgrain)，酒糟通常用於液體形式或乾燥的動物飼料。關於如何進行液化、糖化、發酵、蒸餾和回收乙醇的更多細節是技術人員熟知的。方法葡糖澱粉酶活件(AGU)可以將葡糖澱粉酶活性以AGU單位測量。將IAGU定義為在標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量，所述標準條件是37°C，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM，緩衝液乙酸鹽0.1M，反應時間5分鐘。可使用自動分析系統。將變旋酶添加至葡萄糖脫氫酶試劑，從而將存在的任何α-D-葡萄糖轉化成β-D-葡萄糖。在上述反應中葡萄糖脫氫酶與β-D-葡萄糖特異性地反應，形成NADH，使用光度計在340nm測定NADH作為原始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩衝液乙酸鹽0.IMpH4.30士0.05溫育溫度37°C士1反應時間5分鐘酶工作範圍0.5-4.OAGU/mL顯餼反應GlucDH430U/L變旋酶9U/LNAD0.2ImM緩衝液磷酸鹽0.12M；0.15MNaClpH7.60士0.05溫育溫度37°C士1反應時間5分鐘波長340nm更詳細描述這種分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01)可以根據要求從NovozymesA/S,Denmark獲得，將該文件夾作為參考併入本文。實施例實施例1用30%DS的DEll液化澱粉，在pH4.3和60°C在糖化試驗中測試來自埃默森踝節菌的親本葡糖澱粉酶(SEQIDNO:1)和選擇的包含特定取代的變體。所述DEll液化澱粉從在PH5.2具有15ppmCa++的33%DSCerestar玉米澱粉製備，並且用TermamylSupra(120KNU(T)/g)液化。將所述試驗一式兩份地進行。在不含或含有下述額外的酶的條件下進行所述測試；0.012AFAU/gDS來自黑麴黴的酸性α-澱粉酶和0.2NPUN/gDS來自Bacillusamyloderamificans的支鏈澱粉酶。表1.使用0.04mg葡糖澱粉酵/gDS的糖化。LSD對於DPl為+-0.2,而對於DP2為+-0.1小時L252AG315FG315YSEQIDNOrlDPlDP2DPlDP2DPlDP2DPlDP22482,81,281,41,082,21,081,41,44887,81,786,81,387,51,486,52,07289,62,489,11,789,81,788,42,89690,62,990,32,090,82,189,13,5表2.使用0.04mg葡糖澱粉酵/gDS+0.012AFAU/gDS+0.2NPUN/gDS的糖化。LSD對於DPl為+-0.2,對於DP2為+-0.1小時L252AG315FG315YSEQIDNOrlDPlDP2DPlDP2DPlDP2DPIDP22494,42,292,22,293,32,094,12,44896,62,296,71,796,91,796,32,57296,32,796,82,196,82,195,93,29696,03,296,72,396,72,595,43,9權利要求1.一種親本葡糖澱粉酶的變體，所述變體在位置315包含變化，其中(a)所述變化是(i)在佔據所述位置的胺基酸的下遊插入胺基酸，將佔據所述位置的胺基酸缺失，或(iii)用不同的胺基酸取代佔據所述位置的胺基酸，(b)所述變體具有葡糖澱粉酶活性並且(c)所述位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。2.權利要求1的變體，所述變體包含在位置315的以下取代中的一個或多個F、Y、A、0、!1、1(、1^、0、1、3或1103.權利要求1或2中任一項的變體，所述變體包含以下取代中的一個或多個G315F、G315Y、G315A、G315D、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T，其中所述位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。4.權利要求1至3中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個:314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N，其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。5.權利要求1至4中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個Q314F+G315N、Q314W+G315N、Q314Y+G315N、Q314L+G315A、Q314N+G315R、Q314R+G315D、G315R+A463T、G315L+D529N，其中所述各位置對應於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列的位置，所述親本葡糖澱粉酶具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，和/或對應於同源葡糖澱粉酶中的位置，所述同源葡糖澱粉酶與SEQIDNO1中所示胺基酸序列顯示至少50%同源性。6.權利要求1至5中任一項的變體，其中所述親本葡糖澱粉酶具有的胺基酸序列與SEQIDNO1的胺基酸序列有至少60%，優選至少60%，更優選至少大約70%，還更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且最優選至少98%同一性程度。7.權利要求1至6中任一項的變體，其中所述親本葡糖澱粉酶獲得自踝節菌屬，尤其是埃默森躁節菌(Talaromycesemersonii)。8.權利要求1至7中任一項的變體，其中所述變體與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的縮合。9.DNA構建體，其包含編碼根據權利要求1至8中任一項的葡糖澱粉酶變體的DNA序列。10.用根據權利要求9的DNA構建體轉化的細胞。11.根據權利要求10的細胞，所述細胞是微生物，具體而言是細菌或真菌。12.用於將澱粉轉化或部分水解成為含有葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在根據權利要求1至8中任一項的葡糖澱粉酶變體存在下將澱粉水解物糖化。13.根據權利要求1至8中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的方法中的用途。14.根據權利要求1至8中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生高果糖玉米糖漿的方法中的用途。15.根據權利要求1至8中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於產生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的方法中的用途。全文摘要本發明涉及葡糖澱粉酶變體，更具體地，本發明涉及具有改進性質的葡糖澱粉酶變體和使用所述葡糖澱粉酶變體的方法。文檔編號C12N1/21GK102174489SQ20111005227公開日2011年9月7日申請日期2006年11月17日優先權日2005年11月18日發明者埃斯本.P.弗裡斯,史蒂芬.丹尼爾森,傑普.W.塔姆斯申請人:諾維信公司