免疫原性減弱的經修飾血小板生成素的製作方法

2023-10-09 15:14:09 4

專利名稱：免疫原性減弱的經修飾血小板生成素的製作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是用於對人施用的、特別是用於治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽，其中，所述的修飾使得上述多肽在施用於人體時引起免疫應答的傾向減弱。本發明特別涉及對人血小板生成素(TPO)進行修飾以產生TPO蛋白變異體，該變異體在體內使用時基本上無免疫原性，或比未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。本發明還涉及來自上述未經修飾蛋白的T-細胞表位肽，由此可以構建免疫原性減弱的經修飾TPO變異體。
背景技術：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限於針對所述治療蛋白的幹擾性免疫反應。已有若干種小鼠單克隆抗體表現出治療多種人類疾病的前景，但在某些情況下由於誘導出相當程度的人抗小鼠抗體(HAMA)應答而未能成功應用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對於單克隆抗體，已發展了多種技術以試圖減弱HAMA應答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構建體中人的遺傳信息。儘管如此，在許多個體中，所得的「人源化」抗體仍然引起患者的免疫應答[Issacs J.D.(1 990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體並不是唯一一類作為治療劑施用並可引起免疫應答的多肽分子。即使是來源於人且具有與人體內蛋白相同胺基酸序列的蛋白也可以在人體內誘導免疫應答。值得注意的例子包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和幹擾素α2[Russo，D.等(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療性應用。
誘導免疫應答的主要因素是在蛋白中存在可經由MHC II類分子的呈遞作用激活T-細胞活性的肽(即所謂的T-細胞表位)。這種潛在的T-細胞表位通常定義為任何具有與MHC II類分子結合能力的胺基酸序列。可測定此種T-細胞表位以建立MHC結合。隱含地，＂T-細胞表位＂是指當其與MHC分子結合時可被T-細胞受體(TCR)識別的表位，並且至少原則上，這種表位可以通過使TCR促進T-細胞應答而激活這些T-細胞。但可以理解，某些可與MHC II類分子結合的肽可能存留在蛋白序列中，因為這種肽在施用此最終蛋白的生物中被識別為「自身的」。
已知這些T-細胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白在細胞中降解的過程中釋放出來，隨後由主要組織相容性複合體(MHC)分子呈遞以便引發T-細胞激活作用。對於MHC II類分子呈遞的肽，這種T-細胞激活作用可，例如通過直接刺激B細胞產生抗體而引起抗體應答。
MHC II類分子是一組高度多態的蛋白，其對輔助T細胞篩選和激活起重要作用。人白細胞抗原群DR(HLA-DR)是這組蛋白的主要同種型也是本發明的焦點所在。鑑於同種型HLA-DQ和HLA-DP行使類似的功能，本發明對此兩者均適用。MHC II類DR分子由α和β鏈組成，其C-末端插入並穿越細胞膜。每一異源二聚體都具有可與長度在9到20個胺基酸範圍內變化的肽相結合的配體結合結構域，但是結合溝中最多容納11個胺基酸。配體結合結構域由α鏈的1-85位胺基酸和β鏈的1-94位胺基酸組成。最近的研究表明DQ分子具有同源的結構，預期DP家族蛋白也非常類似。在人中已發現了DR同種型的約70種不同同種異型，對於DQ有30種不同的同種異型，對於DP有47種不同的同種異型。每一個體帶有2到4個DR等位基因，兩個DQ及兩個DP等位基因。許多DR分子的結構已闡明，這種結構指向一種帶有許多疏水口袋的開口肽結合溝，所述的疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)相互作用[Brown等，Nature(1993)36433；Stern等，(1994)Nature 368215]。確立不同II類分子同種異型的多態性有助於肽結合溝中的不同肽結合表面的廣泛多樣性，並且在群體水平保證有關識別外來蛋白和引發針對病原生物免疫應答的最大靈活性。在配體結合結構域內存在相當數量的多態性，並且在不同地域和種族群體存在著顯著不同的「家族」。這一多態性影響著肽結合結構域的結合特性，因此，不同的DR分子「家族」對不同序列屬性的肽具有特異性，但也可以有一些重疊。這種特異性決定了最終負責驅動針對B細胞表位的抗體應答的Th-細胞表位識別(II類T-細胞應答)，所述的B細胞表位存在於衍生所述Th-細胞表位的相同蛋白上。因此，個體中針對蛋白的免疫應答在很大程度上受到T-細胞表位識別作用的影響，這種識別作用是個體中與HLA-DR同種異型的肽結合特異性的函數。因而，為對全球種群背景下的肽或蛋白中的T-細胞表位進行鑑定，需要考慮到儘可能多樣的HLA-DR同種異型組的結合特性，由此覆蓋儘可能高比例的世界上的種群。
針對治療性蛋白(如本發明的目的蛋白)的免疫應答通過MHC II類肽呈遞途徑進行。其間外來蛋白經吞噬和加工後與DR、DQ或DP型MHC II類分子結合以進行呈遞。MHC II類分子由專門抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞、樹突狀細胞等表達。通過在T細胞表面的關聯性T-細胞受體與MHC II類肽複合物相互作用，加之與某些其他共同受體，如CD4分子交聯可誘導T-細胞進入激活狀態。上述激活作用可導致細胞因子釋放，進一步激活其他淋巴細胞如B細胞，產生抗體或激活T殺傷細胞形成完整的細胞免疫應答。
肽與給定的MHC II類分子結合以備在APC表面呈遞的能力依賴於多種因素，最主要的是肽的一級結構。這影響其蛋白酶剪切傾向及其在MHC II類分子的肽結合隙中的結合親和性。在APC表面的MHC II類/肽複合物向能識別決定簇的特定T-細胞受體(TCR)呈遞一個結合面，其中所述決定簇由肽和MHC II類分子的暴露殘基共同提供。
本領域中有鑑定能結合MHC II類分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。這種肽不是在所有情況下都行使T細胞表位的功能，特別是在體內會受加工途徑和其他現象的影響。T-細胞表位鑑定是表位清除的第一步。鑑定及從蛋白中去除潛在T-細胞表位先前已有公開。本領域中已有檢測T-細胞表位的方法，通常是通過計算機手段在經試驗確定的T-細胞表位中掃描公認的序列基元，或利用計算機技術預測MHC II類結合肽，特別是DR-結合肽。
WO98/52976和WO00/34317中公開了鑑定具有與人MHC II類DR同種異型亞群結合的潛在能力的多肽序列的計算機穿線方法(computational threading approaches)。這些教導中，通過在人源或非人源治療性抗體或非抗體蛋白一級序列中進行準確的胺基酸替換以去除預測的T-細胞表位。
此外，利用重組MHC分子與合成肽的可溶性複合物(該複合物能與來自於人或受試實驗動物外周血液樣品中的T-細胞克隆相結合)的技術也在本領域中有所應用[Kern，F.等(1998)Nature Medicine 4975-978；Kwok，W.W.等(2001)TRENDS in Immunology 22583-588]，這些技術也可以用於表位鑑定策略中。
根據上述描述，由此可能期望鑑定、去除或至少減少給定的具有重要的治療價值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-細胞表位。
人血小板生成素(TPO)是這些有治療價值的分子之一。TPO是一種參與調節血小板產生的糖蛋白激素。TPO促進骨髓中巨核祖細胞的增殖並促進其成熟為產生血小板的巨核細胞。該蛋白的前體形式有353個胺基酸殘基，切除N-末端的信號序列產生332個胺基酸的成熟蛋白。成熟蛋白包含下述獨特的區域，即N-末端結構域在人和小鼠間高度保守，並與促紅細胞生成素和幹擾素α及幹擾素β顯著同源[Sauvage，F.J.等(1994)Nature 369533-538；Chang，M.等(1995)J.Biol.Chem.270511-514]。C-末端結構域具有幾個N-連接糖基化位點。N-末端結構域對該分子的血栓形成作用而言已足夠，而C-末端區域可能對維持體內循環半衰期是重要的(Foster，D.等(1996)Stem Cells 14102-107)。成熟TPO的胺基酸序列為SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELPNRTSGLLETNFTASARTTGSGLLKWQQGFRAKIPGLLNQTSRSLDQIPGYLNRIHELLNGTRGLFPGPSRRTLGAPDISSGTSDTGSLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYTLFPLPPTLPTPVVQLHPLLPDPSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEGTPO對於血小板減少的病人具有重要的治療價值。特別是患有多種癌症的、由於脊髓抑制性化學治療而造成血小板減少的病人。血小板輸入曾經是這些病人維持生命的支柱。通過重組方法獲得的純化TPO增加了可用於侵害性化學治療方案及其他由於血小板減少而有出血併發症危險的病人的選擇方案[Prow，D.Vadhan-Raj，S.(1998)Oncology121597-1608]。
也有人公開了TPO分子及其類似物[US，5,989,538；US，6,083,913；US，5,879,673]，包括經化學修飾的和截短的形式[US，5,989,538]以及TPO融合蛋白[US，6,066,318]。但這些教導並沒有認識到T-細胞表位對所述蛋白免疫原性的重要性，也不能據此聯想到按照本發明的方案以特異的、可控制的方式直接影響所述蛋白的性質。
但是，一直存在對具有改進的性質的TPO類似物的需要。所需要的改進包括用於表達和純化所述治療劑的可供選擇的方案和形式，以及尤其是所述蛋白生物學性質的改善。特別需要改進的是在施用於人體時在體內的特性。在這方面，非常需要提供對人體具有減弱的或沒有誘導免疫應答可能性的TPO。
發明概述及內容本發明提供了經修飾的人血小板生成素(TPO)，其中，通過減少或去除大量潛在的T-細胞表位的方式對該因子的免疫學特性進行了修飾。
本發明公開了在TPO一級序列內鑑定的序列，由於它們具有與MHC II類分子結合的可能性，所以是潛在的T-細胞表位。這一內容特別涉及具有332個胺基酸殘基的人TPO蛋白。
本發明還公開了在基本上不影響生物學活性的前提下需要通過特定的胺基酸替代、添加或缺失進行改變的本發明分子的一級序列中的特定位點。在只有同時喪失生物學活性才能去掉免疫原性的情況下，可通過在所述蛋白的胺基酸序列中做進一步的改造以恢復所述的活性。
本發明還公開了生產這種經修飾的分子的方法，尤其是鑑定需要改變以減少或去除免疫原性位點的T-細胞表位的方法。
預期本發明的蛋白在人體中的循環時間會延長，因此對慢性或復發性疾病，如TPO的多種適應症特別有益。本發明提供經修飾的人TPO蛋白，預期其在體內將表現出改進的性質。這些經修飾的TPO分子可應用於藥物組合物。
總之，本發明涉及下述內容·一種經修飾的分子，其具有人血小板生成素(TPO)的生物活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物活性但未經修飾的分子；·如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的；·如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的；·如上所述的分子，其中，去除了一個T-細胞表位；·如上所述的分子，其中，原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體，或表現出經II類分子呈遞作用後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列；·如上所述的分子，其中，所述的肽序列選自如表1所示的組；·如上所述的分子，其中，任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個胺基酸殘基，優選1個胺基酸殘基發生了改變；
·如上所述的分子，其中，所述胺基酸殘基的改變是用其他的胺基酸殘基在特定的位置替代、添加或缺失原本存在的胺基酸殘基；·如上所述的分子，其中，按表2所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代；·如上所述的分子，其中，另外還按表3所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代以減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量；·如上所述的分子，其中，在需要時常通過替代，添加或缺失特定的胺基酸作進一步改變以恢復所述分子的生物學活性；·編碼任何上述和下述的經修飾分子的DNA序列或分子；·藥物組合物，其包含如上述和/或權利要求中定義的具有TPO生物學活性的經修飾分子，並可任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；·製造如上引用的任何權利要求中所定義的具有TPO生物學活性的經修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或計算機(insilico)技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計新的序列變異體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變異體，並檢測所述的變異體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變異體；和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv)；·如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的；·如上所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白質序列和/或計算機模擬技術進行的；
·如上所述的方法，其中步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)在所述的肽中選擇一個具有已知胺基酸序列的區域；(b)然後由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個胺基酸殘基組成的重疊胺基酸殘基片段；(c)通過對存在於抽樣胺基酸殘基片段中的每個疏水胺基酸殘基側鏈賦值求和，計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合分值；和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑑定至少一個適於修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變整體的MHC II類結合分值；步驟(c)優選地通過下述步驟利用經改進而包含了12-6範德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數(scoring function)進行，所述步驟為(1)提供MHCII類分子模型第一資料庫；(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈(allowed peptide backbone)的第二資料庫；(3)從第一資料庫中篩選模型；(4)從第二資料庫中篩選容許肽主鏈；(5)鑑定在每個抽樣片段中存在的胺基酸殘基側鏈；(6)確定存在於每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值；以及對每一模型和每一所述的主鏈重複步驟(1)到(5)；·選自表1的具有潛在的MHC II類結合活性且由未經免疫遺傳修飾的TPO構建的13肽T-細胞表位肽，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的TPO中的用途；·由上述的13肽T-細胞表位肽中的至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的TPO中的用途。
·可由上述和下述的任何方法獲得的具有人血小板生成素(TPO)生物學活性的免疫原性經修飾的分子。
根據對本發明的理解，術語＂T-細胞表位＂是指具有下述能力的胺基酸序列，即能結合MCH II、能刺激T-細胞和/或以與MHC II的複合物的形式結合(但不一定可測量地激活)T-細胞。此處及後附權利要求中所用的術語「多肽」是指包含兩個或多個胺基酸的化合物。胺基酸之間通過肽鍵相連(定義見下)。肽的生物生產中涉及20種不同的天然胺基酸，任意數量的所述胺基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環。用於生物生產肽中的天然胺基酸全部具有L-構型。可應用常規的合成方法利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型的胺基酸的各種組合製備合成肽。一些肽僅包含少量的胺基酸單元。例如含有不到10個胺基酸的短肽有時被稱作「寡肽」。其他的包含大量胺基酸殘基，例如達100個或更多個胺基酸殘基的肽稱作「多肽」。習慣上將含有3個或3個以上胺基酸的任何肽鏈多看作「多肽」，而將「寡肽」視為特定類型的短「多肽」。因而本文所提到的「多肽」也包括「寡肽」。而且，所用到的「肽」包括多肽、寡肽和蛋白。不同的胺基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的數量以及可形成的蛋白的數量實際上是無限的。「α碳(Cα)」是肽鏈中碳-氫(CH)組分中的碳原子。「側鏈」是Cα的側基，其可包含簡單的或複雜的基團或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發明可應用於與此處公開的血小板生成素具有基本上相同的一級胺基酸序列的任何TPO分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多於或少於146個胺基酸殘基的TPO分子。
TPO蛋白，如從其他哺乳動物來源中鑑定出的相關蛋白與本發明中公開的肽序列之間存在大量共有序列，且與列表中公開的肽序列間存在大量基本上相同的共有序列。因此這樣的蛋白序列也落入本發明的保護範圍。
本發明是為了克服實際應用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發免疫應答，產生可與所述可溶性蛋白相結合的宿主抗體。其中的一個例子是幹擾素α2，儘管這一蛋白是內源產生的，但許多病人都會產生針對它的抗體[Russo，D.等(1996)出處同上；Stein，R.等(1988)出處同上]。將TPO用於治療用途時也可能存在類似的問題，本發明試圖通過提供在施用於人體時引發免疫應答的傾向發生改變的人TPO蛋白來解決這一問題。
本發明中形成經修飾的TPO的總的方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的胺基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或計算機技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(c)設計新的序列變異體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定。構建此序列變異體以避免由所述的序列變異體產生新的潛在T-細胞表位，否則所述的新的潛在T細胞表位又通過此種方式進行修飾以基本上減弱或消除T-細胞表位活性；和(d)通過重組DNA技術構建所述序列變異體，並檢測所述的變異體以便根據已知的重組技術鑑定一個或多個具有所需功能的變異體。
對於步驟(b)中對潛在T-細胞表位的鑑定可依照本領域已公知的方法進行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公開了適當的方法，並優選用於鑑定TPO-衍生的肽對MHC II類分子的結合傾向。
在實施例部分公開了另一種非常有效的通過計算鑑定T-細胞表位的方法，它是本發明的優選實施方案。
實踐中，將製備許多TPO蛋白變異體並檢測所需的免疫和功能特性。最優選通過重組DNA技術生產所述的變異體蛋白，同時也可以利用其他的方法，包括化學合成TPO片段。
涉及146個胺基酸殘基的TPO蛋白序列的根據上述方案中步驟(b)的分析結果列於表1。
表1具有潛在人MHC II類結合活性的人TPO的肽序列APPACDLRVLSKL， ACDLRVLSKLLRD， LRVLSKLLRDSHV， RVLSKLLRDSHVL，VLSKLLRDSHVLH， SKLLRDSHVLHSR， KLLRDSHVLHSRL， LRDSHVLHSRLSQ，RDSHVLHSRLSQC， SHVLHSRLSQCPE， HVLHSRLSQCPEV， SRLSQCPEVHPLP，PEVHPLPTPVLLP， EVHPLPTPVLLPA， HPLPTPVLLPAVD， PLPTPVLLPAVDF，PTPVLLPAVDFSL， TPVLLPAVDFSLG， PVLLPAVDFSLGE， VLLPAVDFSLGEW，
PAVDFSLGEWKTQ， VDFSLGEWKTQME， FSLGEWKTQMEET， GEWKTQMEETKAQ，EWKTQMEETKAQD， TQMEETKAQDILG， EETKAQDILGAVT， KAQDILGAVTLLL，QDILGAVTLLLEG， DILGAVTLLLEGV， LGAVTLLLEGVMA， GAVTLLLEGVMAA，VTLLLEGVMAARG， TLLLEGVMAARGQ， LLLEGVMAARGQL， LEGVMAARGQLGP，EGVMAARGQLGPT， GVMAARGQLGPTC， AARGQLGPTCLSS， GQLGPTCLSSLLG，TCLSSLLGQLSGQ， SSLLGQLSGQVRL， SLLGQLSGQVRLL， LLGQLSGQVRLLL，GQLSGQVRLLLGA， GQVRLLLGALQSL， VRLLLGALQSLLG， RLLLGALQSLLGT，LLLGALQSLLGTQ， GALQSLLGTQLPP， ALQSLLGTQLPPQ， QSLLGTQLPPQGR，SLLGTQLPPQGRT， TQLPPQGRTTAHK， TTAHKDPNAIFLS， PNAIFLSFQHLLR，NAIFLSFQHLLRG， AIFLSFQHLLRGKIFLSFQHLLRGKV， LSFQHLLRGKVRF，FQHLLRGKVRFLM， QHLLRGKVRFLML， HLLRGKVRFLMLV， GKVRFLMLVGGST，VRFLMLVGGSTLC， RFLMLVGGSTLCV， FLMLVGGSTLCVR， LMLVGGSTLCVRR，MLVGGSTLCVRRA， STLCVRRAPPTTA， LCVRRAPPTTAVP， TAVPSRTSLVLTL，RTSLVLTLNELPN， TSLVLTLNELPNR， SLVLTLNELPNRT， LVLTLNELPNRTS，LTLNELPNRTSGL， NELPNRTSGLLET， NRTSGLLETNFTA， RTSGLLETNFTAS，SGLLETNFTASAR， GLLETNFTASART， TNFTASARTTGSG， GSGLLKWQQGFRA，SGLLKWQQGFRAK， GLLKWQQGFRAKI， LKWQQGFRAKIPG， QGFRAKIPGLLNQ，AKIPGLLNQTSRS， PGLLNQTSRSLDQ， GLLNQTSRSLDQI， TSRSLDQIPGYLN，SRSLDQIPGYLNR， RSLDQIPGYLNRI， DQIPGYLNRIHEL， PGYLNRIHELLNG，GYLNRIHELLNGT， NRIHELLNGTRGL， IHELLNGTRGLFP， HELLNGTRGLFPG，ELLNGTRGLFPGP， RGLFPGPSRRTLG， GLFPGPSRRTLGA， PSRRTLGAPDISS，RTLGAPDISSGTS， PDISSGTSDTGSL， SDTGSLPPNLQPG， GSLPPNLQPGYSP，PNLQPGYSPSPTH， PGYSPSPTHPPTG， PTHPPTGQYTLFP， GQYTLFPLPPTLP，YTLFPLPPTLPTP， TLFPLPPTLPTPV， FPLPPTLPTPVVQ， PLPPTLPTPVVQL，PTLPTPVVQLHPL， TPVVQLHPLLPDP， PVVQLHPLLPDPS， VQLHPLLPDPSAP，HPLLPDPSAPTPT， PLLPDPSAPTPTP， SPLLNTSYTHSQN， PLLNTSYTHSQNL，TSYTHSQNLSQEG肽是13肽，胺基酸用單字母表示。
涉及本發明的經修飾分子的根據上述方案中步驟(c)和(d)所得的設計結果和構建體列於表2和表3。表2導致人TPO的潛在T-細胞表位消除的替代(WT＝野生型)。
表3導致相應於一個或多個MHC同種異型的潛在T-細胞表位去除的額外替代
本發明涉及TPO類似物，其中，在可以導致所述蛋白中潛在的T細胞表位的活性明顯減弱或從所述蛋白中去除一個或多個潛在的T-細胞表位活性的位點替代了至少一個胺基酸殘基。表1中鑑定的任何潛在的MHC II類配體中特定位點的一個或多個胺基酸的替代，可產生當作為治療劑施用於人體時具有減弱的潛在免疫原性的TPO分子。優選地，在預計可以實現基本上減弱或去除T-細胞表位活性的肽序列中的適當位點進行胺基酸替代。實踐中，合適的位點優選等同於在MHC II類結合溝內提供的疏水口袋之一中結合的胺基酸殘基。
最優選是在所述肽中稱作P1或P1錨的位置改變裂縫中第一口袋內的結合。公認地，肽的P1錨殘基和MHC II類結合溝第一口袋之間的結合相互作用的質量是對整個肽的總結合親和性的主要決定因素。在所述肽這一位置的適當替代應當是替換為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替換為更親水的殘基。所述肽中相應與MHC結合裂縫內其他口袋區域結合的位置處的胺基酸殘基也被認為是落入本發明的範圍內。
可以理解，由給定的潛在T-細胞表位內的單一胺基酸替代導致該表位去除的路線是最優選的。也可以進行單一表位內的組合替代，例如，這對於單獨定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外，在給定的表位內一個一個地進行或在一個表位內組合進行的胺基酸替代也可以發生在非對應於MHC II類結合溝的＂口袋殘基＂的位置，而是在所述肽內的任意位點進行。替代可參照同源結構或由本領域已知的計算機技術產生的結構方法，也可以根據本發明分子的已知結構特徵進行。所有此類替代均落入本發明的範圍內。
也可以考慮不在上面所鑑定的肽內進行胺基酸替代，特別是與在所列肽內進行的替代相結合的情況下。例如可以考慮利用某種改變恢復變異體分子的結構或生物學功能。這種補償性的改變和由TPO多肽中缺失或添加特定的胺基酸殘基得到具有所需活性的變異體的改變，以及任何本發明公開的肽中的改變均落入本發明的範圍內。
本發明的範圍涉及經修飾的TPO，含有上述經修飾的TPO蛋白或經修飾的TPO蛋白片段的組合物，及其相關的組合物應認為均落入本發明的範圍內。另一方面，本發明涉及編碼經修飾的TPO實體的核酸。另一方面本發明涉及利用經修飾的TPO蛋白對人進行治療的方法。
實施例有多種因素對決定蛋白或多肽的總體結構起重要作用。首先是肽鍵，即將胺基酸連接在一起形成鏈的鍵，它是一種共價鍵。這種鍵是平面結構的，實質上是一種取代的醯胺。「醯胺」指含-CONH-基團的一組有機化合物中的任何一個化合物。
連接相鄰胺基酸的Cα的平面肽鍵如下所示
由於O＝C和C-N原子位於一個相對剛性的平面中，所以不會發生沿這些軸的自由旋轉。因此，圖中虛線所示的平面有時被稱作「醯胺」平面或「肽平面」，肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位於其中。Cα原子位於醯胺平面中相對的角上。由於肽或醯胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不發生旋轉，所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個對決定多肽或蛋白的整體結構或構象起重要作用的因素是繞共有Cα鍵的每一醯胺平面的轉角。此後術語＂轉角＂和＂扭轉角＂是等同0的術語。假定O、C、N和H原子保留在醯胺平面中(這通常是一種正確的假設，儘管在一些構象中這些原子會輕微的偏移平面)，這些轉角確定了N和R多肽主鏈構象，即相鄰殘基之間的結構。這兩個轉角稱為φ和ψ。因此，一套φi和ψi角(其中，腳標i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規定了多肽鏈的二級結構。在文獻中定義了用於確定φ和ψ角的慣例，即在給定的多肽中醯胺平面形成0度角的參考點，以及哪個角是φ角，哪個角是ψ角的定義。參見Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23283-437(1968)，285-94頁，這些頁中的內容在此引入作為參考。
本發明的方法可應用於任何蛋白，並部分基於下述發現，即人MHCII類分子結合溝的初級口袋1錨定位點可以具有設計好的對特定胺基酸側鏈的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類分子β鏈第86位的胺基酸的身份來確定。這一位點位於口袋1的底部並決定可容納於這一口袋中的胺基酸側鏈的大小。MaFshall，K.W.，J.Immunol.，1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸，則所有的疏水性脂肪族和芳香族胺基酸(疏水性脂肪族胺基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納於所述的口袋中，優選芳香族側鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸，則該胺基酸的側鏈伸到口袋中並限制了可容納的肽側鏈的大小，所以只有疏水性脂肪族側鏈可容納進去。因此在胺基酸殘基序列中，無論哪裡發現了帶有疏水性脂肪族或芳香族側鏈的胺基酸，即有存在MHC II類限制性T-細胞表位的可能性。但是，如果所述的側鏈是疏水性脂肪族側鏈，其與T-細胞表位結合的可能性約是芳香族側鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布於全球種群中)。
將本發明具體化的計算機方法描繪出肽區域包含T-細胞表位的可能性，該方法如下(1)掃描預定長度肽片段的一級序列，並鑑定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側鏈。(2)對疏水性脂肪族側鏈賦予比芳香族側鏈高的值；優選兩倍於賦予芳香族側鏈的值，例如，給疏水性脂肪族側鏈賦值為2，給芳香族側鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預定統一長度的每一重疊胺基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來，再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個單個胺基酸殘基，優選賦予處於抽樣片段(窗口)中間點的胺基酸。將這一過程對每一抽樣的重疊胺基酸殘基片段(窗口)重複進行。因此，所述肽的每一胺基酸殘基均被賦予了一個值，該值與T-細胞表位存在於此特定片段(窗口)中的可能性相關。(4)用按照上述步驟3中的描述計算、賦予的值對被評估的整個胺基酸殘基序列的胺基酸坐標作圖。(5)序列中具有預定值(例如該值為1)的所有部分均被認為可能包含T細胞表位，並且在需要時可進行修飾。
在這一方面本發明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-細胞表位的肽區域。在這些區域中對所述的肽進行修飾有可能改變MHC II類的結合特性。
依照本發明的另一方面，可利用更複雜的計算方法更精確地預測T-細胞表位，該方法考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用。根據這一方面，計算機預測存在於所述肽中的T-細胞表位包括，根據所有已知的MHC II類分子結構構建至少42個MHC II類等位基因模型，將這些模型應用於T-細胞表位計算機鑑定的方法，構建每一模型的肽主鏈文庫以便允許在相關肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性，對於在肽和MHC II類分子相互作用的關鍵位置上的20種可供選擇的胺基酸中的每一種，構建與每個模型對接的每一主鏈的胺基酸側鏈構象文庫，利用這些主鏈和側鏈構象文庫並結合評分函數選擇對與特定MHC II類分子結合的特定肽而言最佳的主鏈和側鏈構象，並從這一相互作用推導出結合分數。
MHC II類分子模型可從Brookhaven蛋白資料庫(＂PDB＂)中的許多類似的結構出發通過同源建模推導得出。它們可通過使用引入了模擬退火算法的半自動同源建模軟體(Modeller，Sali A.Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234779-815)並結合用於能量最小化的CHARMm力場(購自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)來製備。也可以應用其他的建模方法。
本發明的方法與下述的其他計算方法有著顯著的不同，這些方法為利用從實驗中得來的關於一小組MHC II類分子結合溝中每一位點的每一種胺基酸選項的結合數據文庫的方法(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)157-162)(1995)；或利用類似的實驗結合數據以定義所述的溝中特定結合口袋類型的結合特性(同樣利用相對小的MHC II類分子亞組)然後將這一口袋文庫中的口袋類型進行『混合和匹配』以人工構建更「實際的」MHC II類分子的方法(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)555-561(1999)。這兩種現有方法的主要缺陷在於實驗的複雜性和需要合成大量的肽變異體造成僅有少量的MHC II類分子可通過實驗掃描。因此第一種已知的方法僅能預測少量的MHC II類分子。第二種已知的方法還假設在不同II類等位基因的背景下在一個分子中襯有類似胺基酸的口袋將具有相同的結合特性，並且其另外的缺陷在於，僅僅可「實際地」地構建出那些包含口袋文庫中所包含的口袋的MHC II類分子。利用本發明的建模方法可推導出任意數量和類型的MHC II類分子的結構，因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特徵。此外，掃描的MHC II類分子的數量可通過構建更多的模型而增加而無需通過複雜的實驗獲得額外的數據。
利用主鏈文庫使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類分子結合時其Cα原子位置處可進行變化。這也與上述現有技術中的計算機方法不同，在那些方法中依賴於利用簡化的肽主鏈來掃描結合在特定口袋中的胺基酸。這些簡化的主鏈不可能代表在「真正的」肽中的主鏈文庫構象，導致對肽結合的預測不準確。本發明的主鏈文庫是通過疊加蛋白資料庫中所有與MHC II類分子結合的肽的主鏈，並考慮到位於結合溝內的11個胺基酸的每個胺基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構建的。儘管該文庫可來自少量合適的可獲得的小鼠和人的結構(當前為13種)，為了允許存在甚至更大變異的可能性，將每一C＂-α位點的RMS數字提高50％。然後確定每一胺基酸的平均Cα位置，圍繞這一點劃一個球，其半徑等於在該位置的RMS差加50％。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中胺基酸殘基的Cα，等同於結合溝中11個殘基的位置2)起運作，將所述的球三維網格化，網格內的每個頂點作為該胺基酸Cα的可能位置。將後續的醯胺平面(相應於與後續胺基酸的肽鍵)移動到這些Cα的每一個上面，將φ和ψ角以設定的間隔逐步地轉動以便於安置後續的Cα。如果後續的Cα落入對這一Cα而言『可被允許的位置球』中，則此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對每一後續Cα位置均重複這一過程，使肽從所述的口袋1Cα『種子』開始生長，直到全部9個後續的Cα的位置均根據之前Cα的所有可能排列確定下來。
然後對口袋1前的單個Cα重複上述步驟1次以上以構建定位於結合溝內的主鏈Cα位置文庫。生成的主鏈數目取決於幾種因素『可被允許的位置球』的大小；對口袋1位點處『最初的球』網格化的細度；用於定位後續Cα的φ和ψ角逐步旋轉的細度。利用這一程序可以構建大的主鏈文庫。主鏈文庫越大越可能發現對MHC II類分子結合溝內特定肽的最適主鏈。
鑑於和結合結構域的胺基酸可能存在衝突，所以不是所有的主鏈均適合於與所有MHC II類分子模型『對接』(docking)，故對每個等位基因建立包含適合於該等位基因的主鏈的亞文庫。利用所述的主鏈文庫並結合MHC II類分子模型可以構建出由與每一容許主鏈對接的每一MHC II類分子結合溝的每一位點中的每一胺基酸的容許側鏈構象所組成的詳盡資料庫。可以利用簡單的立體重疊函數構建這一數據組，其中，主鏈與MHC II類分子對接，胺基酸側鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側鏈上可旋轉的鍵以設定的間隔逐步旋轉，記錄下依賴於該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結合溝側鏈原子間的相互作用記錄下來，根據下述的標準確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過預定值。因此，構象搜索的嚴謹度是在鍵的逐步旋轉中所用間隔及對總重疊的預定限度的函數。如果已知特定的口袋是剛性的，則後一值可較小，但若已知口袋側鏈位置相對靈活則嚴謹度可放鬆。這樣便可以模擬結合溝口袋內靈活性的變化。針對與每一MHC II類分子對接後每一主鏈的所有位點上的所有胺基酸重複這種構象搜索以建立詳盡的側鏈構象資料庫。
用適當的數學表達式評價MHC II類分子模型與肽配體構象的結合能量，所述的肽配體構象需通過掃描上述的主鏈/側鏈大資料庫根據經驗獲得。這樣，通過對每一長度在9-20個胺基酸範圍內變化(儘管對於每一次掃描長度是一定的)的可能肽進行下述計算，掃描蛋白以搜索潛在的T-細胞表位選擇MHC II類分子及適合於該分子的肽主鏈，將相應於所需肽序列的側鏈移植到其上。對於胺基酸的每一容許構象(由上述資料庫獲得)，收集與主鏈上特定位點的特定側鏈相關的原子身份和原子間距數據。對沿主鏈的每一側鏈重複此過程，利用評分函數推導肽得分。保留該主鏈的最佳得分，對所選模型的每一容許主鏈重複該過程。比較所有容許主鏈的得分，最高的得分被認為是該MHC II類模型中所需肽的得分。對每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重複上述過程，列出肽相對於模型的得分。
在本發明中，用於結合親和力計算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的胺基酸片段。因此所述配體為來自已知序列的肽、多肽或蛋白的長度為約9到20個胺基酸的選定胺基酸鏈。此後術語「胺基酸」和「殘基」視為等同的術語。將移植到選自上述主鏈文庫的主鏈上的待檢測肽中的連續胺基酸形式的配體，通過肽主鏈上C＂-α原子坐標定位到來自MHC II類分子模型庫的MHC II類分子的結合裂縫中，並從所允許的構象數據選擇每一側鏈的允許構象。相關的原子身份和原子間距也來自這一資料庫並用於計算肽結合分數。將對MHC II類結合口袋具有高親和力的配體作為侯選標記出來用於定點誘變。在標記的配體中(也由此在目的蛋白中)進行胺基酸替代，然後用評分函數重新測定以確定使結合親和力降低到預定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細胞表位。
肽配體與MHC II類分子結合溝的結合涉及非共價鍵相互作用，其包括但不限於氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和範德華相互作用。它們包括在下面將詳細描述的肽評分函數中。應當理解，氫鍵是非共價鍵，其可在極性或帶電的基團之間形成，由被兩個其他原子共享的氫原子構成。
氫供體中的氫帶正電荷，而氫受體帶有部分負電荷。為肽/蛋白相互作用的目的，氫鍵供體可以是連接氫的氮，或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒有連接氫的氧、沒有連接氫並具有一或兩個連接的氮或僅有一個連接的硫。某些原子，如連接了氫的氧或亞胺氮(如C＝NH)，既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol，大大強於範德化鍵，但弱於共價鍵。氫鍵具有高度的方向性，且當供體原子、氫原子和受體原子共線時最強。靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對間形成的，根據庫侖定律這種相互作用的強度與原子間距離的平方成反比。離子對間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、組氨酸或賴氨酸和天冬氨酸或穀氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強度依賴於電離基團的pKa和介質的介電常數，儘管其與氫鍵的強度類似。親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現在埋於結合溝口袋中的肽的疏水性胺基酸側鏈間，以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露於溶劑中是非常不利的，因為周圍的溶劑分子被迫在彼此間形成氫鍵而形成籠狀結構。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
範德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周圍的電荷分布隨時間變化，並且在任何瞬間電荷分布均是不對稱的。這種瞬間的電荷不對稱性誘導臨近原子中的類似不對稱性。在範德華接觸距離所導致的原子之間的吸引力達到最大，而在約1到2處迅速消失。相反，當原子間隔的距離小於此接觸距離時，由於原子外部的電子云重疊使不斷增強的斥力成為主導。儘管與靜電和氫鍵相比，此吸引力相對較弱(約0.6Kcal/mol)，但所述斥力對於決定肽配體是否能與蛋白成功結合可能非常重要。
在一個實施方案中，利用Bhm評分函數(SCORE1方法)評估結合常數(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)243-256(1994)，該文獻在此全文引入作為參考)。在另一個實施方案中，用評分函數(SCORE2方法)評估結合親和力作為含有T-細胞表位的配體的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)309-323(1998)，該文獻在此全文引入作為參考)。但是上述文獻中描述的Bhm評分函數是用於評估下述情況中配體對蛋白的結合親和力的，即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結合，且蛋白/配體複合物的結構已解析，這一結構已列於蛋白資料庫(＂PDB＂)中。因此，利用已知的陽性結合數據對評分函數作了發展。為了區分陽性和陰性的結合體，需向方程中加入排斥項。此外，可通過以成對的方式計算親脂相互作用，而非利用上述Bhm函數中基於面積的能量項來進行更理想的結合能量評估。因此，在一個優選實施方案中，用經修飾的Bhm評分函數評估結合能。在經修飾的Bhm評分函數中，在評估蛋白和配體之間的結合能(ΔGbind)時考慮了下述參數由於配體的平移和轉動熵的整體損失造成的結合能減低(ΔG0)；理想氫鍵的貢獻(ΔGhb)，其中至少一個配對物是中性的；無擾離子相互作用的貢獻(ΔGionic)；親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo)；由於配體中內在自由度的凍結，即繞每一C-C鍵的旋轉自由度降低造成的結合能損失(ΔGrot)；蛋白和配體之間相互作用的能量(EvdW)。考慮到這些項給出等式1(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對於特定項限定的相互作用數目，在一個實施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數，其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項依照等式2計算Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR，Δα)是罰函數，其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離，其依照等式3計算f(ΔR，Δ-□)＝f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR＜＝TOL則f1(ΔR)＝1，或者如果ΔR＜＝0.4+TOL則f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者如果ΔR＞0.4+TOL 則f1(ΔR)＝0並且如果Δα＜30°則f2(Δα)＝1，或者如果Δα＜＝80° 則f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者如果Δα＞80°則f2(Δα)＝0TOL是氫鍵鍵長＝0.25中所能允許的偏差ΔR是H-O/N氫鍵鍵長與理想值＝1.9的偏差
Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區分蛋白表面的凹凸部分，並因此賦予口袋中而非蛋白表面的極性相互作用更高的權重。這一函數根據下述等式4計算f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小於5的非氫原子的數量。
Nneighb，0是常數＝25fpcs是用於估計每氫鍵的極性接觸表面面積的函數，由此區分強和弱的氫鍵，其值由下述的標準確定當Apolar/NHB＜102時fpcs＝β當Apolar/NHB＞102時fpcs＝1Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數目β是常數＝1.2由於假定了相同的幾何相關性，在實施經修飾的Bhm評分函數時，離子相互作用的貢獻ΔGionic用與上述有關氫鍵的類似方式計算。Nlipo項按下述的等式5計算Nlipo＝∑ILf(rIL)根據下述標準，對於所有親脂配體原子1和所有親脂蛋白原子L，計算f(rIL)當rIL＜＝R1時f(rIL)＝1當R2＜rIL＞R1時 f(rIL)＝(rIL-R1)/(R2-R1)當rIL＞＝R2時f(rIL)＝0其中R1＝r1vdw+rLvdw+0.5R2＝R1+3.0r1vdw是原子I的範德華半徑rLvdw是原子L的範德華半徑Nrot項是胺基酸側鏈中可旋轉的鍵的數目，其被視為無環的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數目。末端-CH3或-NH3的旋轉未考慮進去。
最終，項Evdw依照如下等式6計算Evdw＝ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6)，其中ε1和ε2是取決於原子身份的常數r1vdw+r2vdw是範德華原子半徑r是原子對間的距離。
關於式6，在一個實施方案中，ε1和ε2常數被賦予如下原子值，分別為C0.245，N0.283，O0.316，S0.316(即分別對於碳、氮、氧和硫原子)。對於式5和6，給予範德華半徑如下原子值，分別為C1.85，N1.75，O1.60，S2.00。
應當理解上述等式中所有預定的值和給定的常數都是在現有的對蛋白配體相互作用的理解局限內具體相對於此處所用的計算類型確定的。因此，隨著這種評分函數的進一步精練，這些值和常數也會因此而改變，任何能在蛋白和配體結合能的評估方面給出所需結果的適宜數值均可使用，而且，其也落入本發明的保護範圍。
如上所述，所述的評分函數應用於由上述側鏈構象、原子身份和原子間距資料庫中提取的數據。為本說明書的目的，該資料庫中包含的MHC II類分子數是42個模型加上4個已解析的結構。從上述描述中可清楚地了解到，本發明的計算機構建方法的模塊性質意味著，可簡單地添加新的模型，並利用肽主鏈文庫和側鏈構象搜索功能進行掃描以創建其它的可通過上述的肽評分函數處理的數據集。這使得經掃描的MHCII類分子庫可以很容易地增加，或者如果可以獲得相關數據，則可以替換結構和相關數據以創建現有等位基因的更精確的模型。
本發明的預測方法可以相對於包含大量已通過實驗確定了其對不同MHC II類分子的親和力的肽的數據集進行校準。將計算值與實驗數據相比較，可確定一截斷值，已知該值之上所有經實驗確定的T-細胞表位都得以正確的預測。
應當理解，儘管上述評分函數與現有的一些複雜方法相比相對簡單，但計算進行得非常迅速。還應當理解的是，其目的並不在於計算出對接到所選擇的MHC II類蛋白結合溝內的每種肽的真正結合能本身。根本的目的在於獲得相對的結合能數據以助於根據所選蛋白的一級結構(即胺基酸序列)預測T-細胞表位的定位。相對高的結合能或結合能高於選定的閾值意味著在配體中存在T-細胞表位。然後可以將所述配體進行至少一輪胺基酸替代，並再次計算結合能。由於計算可迅速進行，對肽序列的這些操作可在現有成本划算的計算機硬體上於程序用戶界面中互動進行。由此不需要對計算機硬體進行大量投資。本領域的技術人員應當了解，也可使用其他軟體達到相同的目的。特別是可以使用能將配體對接入蛋白結合位點的更複雜的軟體，並與能量最小化相結合。對接軟體的例子包括DOCK (Kuntz等，J.Mol.Biol.，161269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3300-308(1995))。分子建模和操作軟體的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(MolecularSimulations Inc.)。使用這些計算機方法將嚴重限制本發明方法的信息吞吐量，這是由於進行必要的計算所需的處理時間導致的。但是可行的方式為，將這些方法作為『二級篩選』以獲得關於通過本發明的方法發現為『陽性結合體』的肽的更精確的肽結合能計算值。用於複雜的分子機械或分子動力學計算的處理時間的限制是由進行所述計算的軟體設計和目前計算機硬體技術限制共同確定的。可以預期在將來，隨著編寫更高效的代碼和計算機處理器速度的不斷提高，在更易控制的時間框架內進行上述計算是可行的。
有關用於大分子的能量函數的其他信息和有關在摺疊蛋白結構內發生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4187-217 (1983)，有關蛋白-配體一般相互作用的信息參見Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)31-47(1988)，這些文獻均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見Fasman，G.D.編，Prediction of Protein Structure and the Principles of ProteinConformation，Plenum Press，New York，ISBN0-306 4313-9。
權利要求
1.一種經修飾的分子，其具有人血小板生成素(TPO)的生物活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物活性但未經修飾的分子。
2.如權利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的。
3.如權利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的。
4.如權利要求2或3所述的分子，其中，去除了一個T-細胞表位。
5.如權利要求2-4中任意一項所述的分子，其中，原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體，或表現出經II類分子呈遞作用後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列。
6.如權利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列選自如表1所示的組。
7.如權利要求2-6中任意一項所述的分子，其中，任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個胺基酸殘基發生了改變。
8.如權利要求7所述的分子，其中，有一個胺基酸殘基發生了改變。
9.如權利要求7或8所述的分子，其中，所述胺基酸殘基的改變是用其他的胺基酸殘基在特定的位置替代原本存在的胺基酸殘基。
10.如權利要求9所述的分子，其中，按表2所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代。
11.如權利要求10所述的分子，其中，另外還按表3所示進行一個或多個胺基酸殘基的替代以減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量。
12.如權利要求9所述的分子，其中，按表3所示進行一個或多個胺基酸的替代。
13.如權利要求7或8所述的分子，其中，所述胺基酸殘基的改變是在特定的位置缺失原本存在的胺基酸殘基。
14.如權利要求7或8所述的分子，其中，所述胺基酸殘基的改變是在特定的位置向原始序列中添加胺基酸殘基。
15.如權利要求7-14中任意一項所述的分子，其中，通過進一步的改變恢復所述分子的生物學活性。
16.如權利要求15所述的分子，其中，進一步的改變是替代、添加或缺失特定的胺基酸。
17.如權利要求7-16中任意一項所述的分子，其中，所述胺基酸的改變是參照同源蛋白序列進行的。
18.如權利要求7-16中任意一項所述的分子，其中，所述胺基酸的改變是參照計算機模擬技術進行的。
19.編碼權利要求1-18中任意一項所述的經修飾TPO的DNA序列。
20.一種藥物組合物，其包含上述任意一項權利要求中所定義的具有TPO生物學活性的經修飾分子，並可任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
21.製造上述任意一項權利要求中所定義的具有TPO生物學活性的經修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i) 確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或計算機技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計新的序列變異體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與M HC分子的結合來確定，或通過肽-MHC複合物與T-細胞的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變異體，並檢測所述的變異體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變異體；和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv)。
22.如權利要求21所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的。
23.如權利要求22所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白序列和/或計算機模擬技術進行的。
24.如權利要求21-23中任意一項所述的方法，其中，步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)在所述的肽中選擇一個具有已知胺基酸序列的區域；(b)然後由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個胺基酸殘基組成的重疊胺基酸殘基片段；(c)通過對存在於抽樣胺基酸殘基片段中的每個疏水胺基酸殘基側鏈賦值求和，計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合值；和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑑定至少一個適於修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變整體的MHC II類的結合分值。
25.如權利要求24所述的方法，其中，步驟(c)通過下述步驟利用經改進而包含了12-6範德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數進行，所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型第一資料庫；(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈的第二資料庫；(3)從所述的第一資料庫中篩選模型；(4)從所述的第二資料庫中篩選容許肽主鏈；(5)鑑定在每個抽樣片段中存在的胺基酸殘基側鏈；(6)確定存在於每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值；以及對每一模型和每一所述的主鏈重複步驟(1)到(5)。
26.一種選自表1所示組的13肽T-細胞表位肽，其具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的TPO構建。
27.一種肽序列，其由如權利要求26所述的13肽T-細胞表位肽中的至少9個連續的胺基酸殘基組成。
28.如權利要求26所述的13肽T-細胞表位肽用於生產在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的TPO的用途。
29.如權利要求27所述的肽序列用於生產在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的TPO的用途。
全文摘要
本發明涉及尤其是用於對人施用的、特別是用於治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽，其中，所述的修飾使得上述多肽在施用於人體時引起免疫應答的傾向減弱。本發明特別涉及對人血小板生成素(TPO)進行修飾以產生TPO蛋白，該蛋白在體內使用時基本上無免疫原性，或比未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。
文檔編號C12P21/02GK1494590SQ02805577
公開日2004年5月5日 申請日期2002年2月22日 優先權日2001年2月26日
發明者F·J·卡爾, G·卡特, F J 卡爾 申請人:默克專利有限公司