一種紅參中5種皂苷類成分的含量測定方法與流程

2023-10-09 18:58:54 2

本發明涉及到一種紅參中人參皂苷類成分的含量測定方法，屬中藥技術領域，具體的，涉及一種紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1和人參皂苷Ro五種成分同時測定的含量測定方法。

背景技術：

紅參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的栽培品經蒸製後的乾燥根及根莖，秋季採挖，洗淨，蒸製後，乾燥，是藥用歷史悠久的傳統名貴中藥。人參被列為《神農本草經》三十六種上品之一，在歷代中醫藥典籍中也均有記載。本經中稱，人參：「主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智，久服輕身延年」，是滋補養生保健的必備聖藥，其功效長期以來被中醫推崇備至。自古代起就有把採集到的野生人參，用煮、蒸、焯等方法進行加工處理，得到熟人參，這種加工方式逐漸演變成以後的紅參。紅參作為我國傳統名貴中藥，具有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血的功效，長期以來深受廣大人民群眾的喜愛。人參皂苷類成分是紅參的主要有效活性成分，是衡量紅參內在質量優劣的重要標準，目前尚無紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1及人參皂苷Ro五種人參皂苷類成分同時測定的含量測定方法。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供了一種紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1及人參皂苷Ro五種人參皂苷類成分同時測定的含量測定方法。

本發明含量測定方法採用超高效液相色譜法，該方法如下：

色譜條件與系統適用性試驗色譜柱採用BEH C18色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05％～0.10％磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A：18％→20％；9～11分鐘，流動相A：20％→28％；11～40分鐘，流動相A保持28％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的製備取紅參粉末，過四號篩，0.8～1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1～2小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1～2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

本發明含量測定方法中，流動相B優選為0.05％磷酸；取樣量優選為1.0g；測定法中分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液的量優選為1μl，注入液相色譜儀。

本發明含量測定方法最優的技術方案為：

色譜條件與系統適用性試驗色譜柱採用BEH C18色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05％磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A：18％→20％；9～11分鐘，流動相A：20％→28％；11～40分鐘，流動相A保持28％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的製備取紅參粉末，過四號篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

為了驗證測定含量方法的穩定性、準確性、專屬性及系統適應性，對方法進行了以下方法學驗證實驗，以確保該含量測定方法可以用於紅參的質量控制。

1、儀器與材料

儀器：Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(雙三元泵，DAD檢測器)，METTLER AE240電子天平，METTLER AE163電子天平。

對照品：人參皂苷Rg1(中檢院，批號：110703～201529)、人參皂苷Re(中檢院，批號：110754～201525)、人參皂苷Rf(中檢院，批號：111719～201505)、人參皂苷Rb1(中檢院，批號：110704～201424)、人參皂苷Ro(中檢院，批號：111903～201102)購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈為色譜純(Merck)，水為超純水(由MILLIPORE超純水制水機自製)，其它試劑均為分析純。

2、方法與結果

2.1混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得。

2.2供試品溶液的製備

取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)

流動相：以乙腈為流動相A，0.05％磷酸水溶液為流動相B，進行梯度洗脫，梯度洗脫程序詳見表1；流速0.4ml·min-1，柱溫為40℃，檢測波長為203nm，對照品溶液與供試品溶液進樣量各1μl。

表1流動相梯度洗脫表

含量測定的色譜圖見圖1，可見各人參皂苷類成分分離良好，待測成分峰附近沒有幹擾峰，專屬性較好。

2.4流動相選擇

皂苷類物質紫外吸收非常弱，紫外檢測器通常採用203nm波長檢測，由於有機羧酸存在末端吸收現象，在203nm波長下基線噪音很大，幹擾皂苷類含量測定，所以不選擇甲酸、乙酸水溶液或甲酸鹽、乙酸鹽緩衝鹽溶液作為流動相水相。實驗摸索過程中考察了乙腈～水、乙腈～0.1％磷酸溶液、乙腈～0.05％磷酸溶液、乙腈～磷酸緩衝鹽溶液等不同梯度的洗脫系統，發現用乙腈～水作為流動相時，人參皂苷Ro不能被洗脫分離；選用乙腈～磷酸緩衝鹽溶液作為流動相時，人參皂苷Rb1與其他未知色譜峰不易分離，幹擾準確測定含量。經反覆試驗，當採用乙腈～0.05％磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時，基線平穩，5種人參皂苷分離度良好且峰形較佳。

2.5提取方式的選擇

取同一批樣品適量，選取80％甲醇作為提取溶劑，分別採用超聲、回流兩種提取方式進行試驗，按擬定色譜條件測定。結果表明採用超聲與回流兩種提取方式，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Ro的測定結果沒有差別，而人參皂苷Rb1的測定結果回流明顯高於超聲，因此，選用回流作為本實驗的提取方式(結果見表2)。

表2不同提取方式五種成分的含量測定結果

2.6提取溶劑的選擇

取同一批樣品適量，分別以甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇作為提取溶劑，回流處理1h。結果表明採用80％的甲醇作為提取溶劑五種成分的含量測定結果均較高，因此，選用80％的甲醇作為提取溶劑(結果見表3)。

表3不同提取溶劑五種成分的含量測定結果

2.7提取時間的選擇

取同一批樣品適量，回流提取時間分別為0.5、1、1.5、2h，按擬定色譜條件測定。結果表明回流1.5h能保證所有成分提取完全，故選擇回流提取1.5h(結果見表4)。

表4不同提取時間四種成分的含量測定結果

2.8線性關係考察

精密量取人參皂苷Rg1(濃度依次為：0.01650mg/ml、0.06602mg/ml、0.082520mg/ml、0.1650mg/ml、0.3301mg/ml、0.8252mg/ml)、人參皂苷Re(濃度依次為：0.01323mg/ml、0.02646mg/ml、0.05293mg/ml、0.06616mg/ml、0.1323mg/ml、0.6616mg/ml)、人參皂苷Rf(濃度依次為：0.009568mg/ml、0.01914mg/ml、0.04784mg/ml、0.09568mg/ml、0.1914mg/ml、0.4784mg/ml)、人參皂苷Rb1(濃度依次為：0.02261mg/ml、0.09045mg/ml、0.1809mg/ml、0.4522mg/ml、0.9045mg/ml、2.261mg/ml)、人參皂苷Ro(濃度依次為：0.01202mg/ml、0.04809mg/ml、0.09619mg/ml、0.2405mg/ml、0.4809mg/ml、1.202mg/ml)1μl分別注入液相色譜儀，按「2.3」項下色譜條件測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪製標準曲線。結果表明，人參皂苷Rg1在0.01650～0.8252μg之間呈良好的線性關係，回歸方程為：y＝644011x-593.85(r＝0.9999)；人參皂苷Re在0.01323～0.6616μg之間呈良好的線性關係，回歸方程為：y＝488436x+413.18(r＝0.9999)；人參皂苷Rf在0.009568～0.4784μg之間呈良好的線性關係，回歸方程為：y＝779269x～2959.3(r＝0.9999)，人參皂苷Rb1在0.02261～2.2612μg之間呈良好的線性關係，回歸方程為：y＝586991x+1538.7(r＝0.9999)，人參皂苷Ro在0.01202～1.202μg之間呈良好的線性關係，回歸方程為：y＝722156x～955.27(r＝0.9999)。實驗結果見表5。

表5紅參五成分線性關係考察結果

2.9精密度試驗

取混合對照品溶液，按「2.3」項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄色譜峰面積。結果顯示各人參皂苷色譜峰面積R SD(n＝6)均不大於2.0％。表明本方法的儀器精密度良好(結果見表6)。

表6精密度試驗結果

2.10穩定性試驗

取同一批樣品適量，按「2.2」項下方法製備成供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件測定，考察0、2、4、6、9、12、24h，結果顯示各人參皂苷峰面積R SD(n＝7)均不大於2.0％。結果表明，供試品溶液在24h內基本穩定(結果見表7)。

表7穩定性試驗結果

2.11重複性試驗

取同一批樣品，研細，取0.5g、1.0g、1.5g各三份，精密稱定，平行製成供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件測定。結果表明，本方法重複性良好(結果見表8)。

表8重複性試驗結果

2.12回收率試驗

取已知含量的樣品粉末9份，每份約0.5g，精密稱定，每三份為一組，分別加入用80％甲醇溶液配製的低、中、高三個濃度的上述5種人參皂苷對照品溶液25ml，按供試品溶液製備項下方法製備供試品溶液。按「2.3」項下色譜條件測定，計算回收率。結果見表9～13。表明本方法回收率較好。

表9人參皂苷Rg1回收率試驗結果

表10人參皂苷Re回收率試驗結果

表11人參皂苷Rf回收率試驗結果

表12人參皂苷Rb1回收率試驗結果

表13人參皂苷Ro回收率試驗結果

2.13樣品測定

取收集到的紅參藥材、飲片共15批，按「2.2」項下方法製備成供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件測定，計算含量，結果見表14。

表14紅參樣品含量測定結果

附圖說明

圖1紅參中五種人參皂苷類成分含量測定色譜圖；

具體實施方式

實施例1

色譜條件與系統適用性試驗色譜柱採用BEH C18色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05％磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A：18％→20％；9～11分鐘，流動相A：20％→28％；11～40分鐘，流動相A保持28％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的製備取紅參粉末，過四號篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

實施例2

色譜條件與系統適用性試驗色譜柱採用BEH C18色譜柱；以乙腈為流動相A，0.10％磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A：18％→20％；9～11分鐘，流動相A：20％→28％；11～40分鐘，流動相A保持28％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的製備取紅參粉末，過四號篩，0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

實施例3

色譜條件與系統適用性試驗色譜柱採用BEH C18色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05％磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A：18％→20％；9～11分鐘，流動相A：20％→28％；11～40分鐘，流動相A保持28％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的製備

取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Ro對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含人參皂苷Rg1對照品80μg、人參皂苷Re對照品60μg、人參皂苷Rf對照品50μg、人參皂苷Rb1對照品150μg、人參皂苷Ro對照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的製備取紅參粉末，過四號篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取2小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

上述實施例均按照藥典進行方法學驗證，結果顯示方法準確可靠、靈敏、專屬，各項指標均符合質量控制的要求。