一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法及應用的製作方法

2023-10-10 14:18:19

一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，含以下步驟：採集羅非魚血清經純化處理得純化的羅非魚IgM；將羅非魚IgM免疫兔得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，採用ELISA檢測兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的抗羅非魚血清效價；將純化的羅非魚IgM加強免疫後，收集、分離得含有兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的血清，經純化處理，加入生物素混勻，得生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體；採用該法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體特異性好，純度和效價高，能與羅非魚IgM發生特異性結合反應；還公開了上述方法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA中的應用及在Western-Blot中的應用。
【專利說明】一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於多克隆抗體【技術領域】，具體涉及為一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法及應用。
【背景技術】
[0002]免疫球蛋白是動物體液免疫應答中的重要分子，作為低等脊椎動物的硬骨魚類的主要免疫球蛋白就是IgM。該分子是一個四聚體，每個單體包含2條重鏈和2條輕鏈。高度純化的魚類血清IgM在魚類免疫學中有重要的用途，如製備單克隆、多克隆抗體，檢測魚類病原體及魚類免疫應答水平；探索IgM的產生、分布，還可用於研究免疫系統的進化。
[0003]羅非魚已被農業部列為產業化開發的優質魚類品種，近年來，隨著養殖環境的破壞，養殖密度的增加，導致病害日趨嚴重，進而導致藥物濫用、殘留嚴重，商品魚出口受阻，嚴重影響了我國羅非魚養殖產業的可持續發展，研究開發魚類疫苗，對羅非魚的養殖與病害防制有重要意義。高純度血清免疫球蛋白IgM及其抗體的製備是研究魚類免疫應答、免疫檢測方法的基礎。目前，市面上還沒有兔抗羅非魚IgM抗體商品的出現，這為羅非魚免疫應答水平的監測、及其免疫檢測方法的建立提供了不利因素。因此，有必要製備特異性好、高純度、高效價的兔抗羅非魚IgM的多克隆抗體，為羅非魚病害防治研究提供基礎材料。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，採用該製備方法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體特異性好，且純度和效價高，並能與羅非魚IgM發生特異性結合反應。
[0005]本發明的目的還在與提供採用上述生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0006]本發明的第三個目的在於提供採用上述方法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應用。
[0007]本發明的第四個目的在於提供採用上述方法製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應用。
[0008]本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的:一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，含以下步驟:
[0009](I)選取健康羅非魚的尾動脈血，靜置使血清充分析出，離心，取上清，得羅非魚血清；
[0010](2)取羅非魚的血清，用等體積PBS稀釋後，加入飽和硫酸銨攪拌處理，離心，取沉澱，溶解後，進行純化處理，得純化的羅非魚IgM ；
[0011](3)第一次免疫時，按200 μ g/只SPF級紐西蘭兔的免疫劑量，取步驟(2)純化的羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化後在SPF級紐西蘭兔背部皮下進行多點注射免疫，10-14天後進行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是將純化的羅非魚IgM按200 μ g/只SPF級紐西蘭兔的免疫劑量與等體積的不完全弗氏佐劑混合，充分乳化，在紐西蘭兔背部皮下多點注射免疫，每次間隔10-14天，第四次免疫後第10天，對免疫的紐西蘭兔耳靜脈採血，ELISA檢測紐西蘭兔血清中抗羅非魚IgM抗體的效價；
[0012](4)四免後，用純化的羅非魚IgM按100μ g/只的免疫劑量加強免疫紐西蘭兔，
2?4天內進行心臟採血，收集、分離得到含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，再經純化處理，得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，獲得生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0013]本發明步驟⑵中飽和硫酸銨的用量為羅非魚血清的1.5?3倍，其pH為7.4，PBS的pH也為7.4。
[0014]本發明步驟(2)和步驟(4)中純化處理採用ProteinA+ProteinG親和層析柱過柱純化處理。
[0015]本發明步驟(4)中四免後血清效價達到1:640000以上，用純化的羅非魚IgM按100 μ g/只的免疫劑量加強免疫紐西蘭兔。
[0016]本發明步驟(4)中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在與生物素混勻前先經透析處理。
[0017]本發明步驟(4)中所述的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素的濃度和用量相同。
[0018]本發明步驟⑷中將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，作用3?5小時後，進行透析處理以及採用BCA試劑盒測定其濃度並分裝，獲得生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0019]本發明步驟(I)中優選在37°C靜置2小時，4°C冰箱過夜使血清充分析出，4000rpm/min離心IOmin,取上清,得羅非魚血清。
[0020]本發明步驟⑵中離心時的轉速優選為7000rpm,離心時間優選為30min。
[0021]本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的:一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，其特徵是:採用上述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法製成。
[0022]本發明的第三個目的是通過如下技術方案來實現的:上述生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應用。
[0023]本發明的第四個目的是通過如下技術方案來實現的:上述生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方製成的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應用。
[0024]本發明具有如下有益效果:
[0025]本發明製備的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體具有特異性好、純度高、效價高的特點，可與羅非魚IgM發生特異性結合反應、可用於ELISA實驗的要求。本發明生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備與應用，為羅非魚有害細菌、病毒的疫苗研製、免疫水平檢測以及免疫檢測方法的建立提供一個重要工具，具有重要的理論意義和生產價值。【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例1中羅非魚IgM純化的SDS-PAGE圖譜；
[0027]圖2為實施例3中螢光掃描儀掃描顯色圖，為Western-blot顯色圖譜，在80KD處重鏈有一明顯的雜交條帶。
【具體實施方式】
[0028]結合附圖和實施例對本發明作進一步說明:
[0029]實施例1
[0030]本實施例提供的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，步驟如下所示:
[0031](I)健康的羅非魚5尾，體重400_450g，從尾動脈採血，37°C放置2h，4°C靜置過夜使血清充分析出，4°C 4000rpm/min,離心30min,取上清；
[0032](2)將羅非魚血清用等體積0.01mol/L PBS (pH7.4)稀釋後，加入兩倍ρΗ7.4的飽和硫酸銨，邊加溶液邊攪拌；加完後繼續攪拌I小時，進行離心，7000rpm，30min，取沉澱；
[0033](3)將沉澱用PBS溶解後，ProteinG+ProteinA親和層析柱過柱純化IgM，BCA試劑盒測定濃度，如圖1所示，為純化後IgM SDS-PAGE圖譜；
[0034](4)將200 μ g純化羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化後在兔背部皮下多點注射免疫，10-14天內，用200 μ g純化羅非魚IgM與等體積的不完全弗氏佐劑混合進行第二次、第三次、第四次免疫，乳化充分後，在兔背部皮下多點注射免疫，先後共注射免疫四次，每次免疫間隔10-14天，第四次免疫10後，兔耳靜脈採血，ELISA檢測血清中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的效價；
[0035](5)用100 μ g純化的羅非魚IgM加強免疫第四次免疫後的紐西蘭兔，2-4天後，收集、分離得到的含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，ELISA檢測兔血清抗羅非魚IgM的效價；
[0036]所測兔血清抗羅非魚IgM的效價為1:640000以上；
[0037](6)用蛋白純化儀,ProteinG+ProteinA親和層析柱過柱純化兔抗羅非魚IgM的多克隆抗體；
[0038](7)用BCA試劑盒測定收集樣品的濃度進行分裝，所測純化多抗濃度為1.539mg/mL ；ELISA測定純化後兔多抗的滴度；
[0039]所測純化兔抗羅非魚IgM多克隆抗體滴度為3.125μ g/mL,即效價為1:320000。
[0040](8)純化的兔抗IgM多克隆抗體，過夜透析，與等量的生物素溶液混合,作用4個小時以上，標記好的生物素-兔抗IgM多克隆抗體過夜透析，得生物素-兔抗羅非魚IgM多克隆抗體用於ELISA檢測得到良好的線性數據，證實生物素、兔抗羅非魚IgM多克隆抗體標記成功，ELISA測定抗體滴度和最佳工作稀釋度。測定抗體滴度為5.69μ g/mL，抗體效價為1:160000，最佳工作稀釋度為1:10000。
[0041]實施例2
[0042]本實施例提供的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體應用步驟如下:
[0043](I)試驗羅非魚經1.93 X IO3Cfu/尾低劑量無乳鏈球菌腹腔注射，採集48h，72h，一周、12天尾動脈血,37°C靜置2小時，4°C冰箱過夜使血清充分析出，4000rpm/min離心lOmin，取上清，得羅非魚血清；[0044](2)取無乳鏈球菌菌液，12000rpm/min離心5min，超聲波破碎，BCA試劑盒測定裂解菌液濃度，按80 μ g/ml濃度100 μ I/孔包被100 μ L/孔包被ELISA板，4°C過夜；
[0045](3)甩掉包被液，1%牛血清白蛋白封閉ELISA板，37°C作用2個小時；
[0046](4) PBST洗板三次，PBS溶液梯度稀釋(I)步所得血清，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0047](5) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀釋生物素-兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，
100μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0048](6) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀釋HRP-鏈親和黴素，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0049](7) PBST洗板三次，每孔加入100 μ LTMB工作液，37°C作用20分鐘；
[0050](8)每孔加入50 μ L終止液終止反應，酶標儀讀數，確定羅非魚血清效價。結果顯示48h羅非魚血清效價最高，達1:51200，隨後血清效價降低，12天血清效價為1:6400。證實所製備的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體可以用於檢測羅非魚血清抗體效價的監測。
[0051]實施例3
[0052]本實施例提供的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體應用於Western-blot,步驟如下:
[0053](I)將5 μ g羅非魚IgM用12%分離膠進行常規SDS-PAGE電泳；
[0054](2)電泳結束後，電轉至硝酸纖維素膜(NC)上；
[0055](3)轉膜結束後，剪下Marker條帶在氨基黑染液中染5min，再用脫色液脫色，直到蛋白帶清晰為止；
[0056]⑷NC膜加入5%脫脂奶粉中，37°C封閉lh，TBST洗3次，每次IOmin ；
[0057](5)加入純化後的多抗(稀釋至3.125 μ g/mL)，37°C孵育60min，TBST洗3次』每次 IOmin ；
[0058](6)加入突光標記 Donkey ant1-Rabbit IgGl: 15000, 37°C溫育 60min, TBST 洗 3次，每次IOmin ；
[0059](7)螢光掃描儀掃描顯色，如圖2所示，為Western-blot顯色圖譜，在80KD處重鏈有一明顯的雜交條帶。
[0060]以上實施例僅用於闡述本發明，而本發明的保護範圍並非僅僅局限於以上實施例。所述【技術領域】的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取範圍，均可實現本發明的目的。
【權利要求】
1.一種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是含以下步驟: (1)選取健康羅非魚的尾動脈血，靜置使血清充分析出，離心，取上清，得羅非魚血清； (2)取羅非魚的血清，用等體積PBS稀釋後，加入飽和硫酸銨攪拌處理，離心，取沉澱，溶解後，進行純化處理，得純化的羅非魚IgM ； (3)第一次免疫時，按200μ g/只SPF級紐西蘭兔的免疫劑量，取步驟(2)純化的羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化後在SPF級紐西蘭兔背部皮下進行多點注射免疫，10-14天後進行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是將純化的羅非魚IgM按200 μ g/只SPF級紐西蘭兔的免疫劑量與等體積的不完全弗氏佐劑混合，充分乳化，在紐西蘭兔背部皮下多點注射免疫，每次間隔10-14天，第四次免疫後第10天，對免疫的紐西蘭兔耳靜脈採血，ELISA檢測紐西蘭兔血清中抗羅非魚IgM抗體的效價； (4)四免後，用純化的羅非魚IgM按100μ g/只的免疫劑量加強免疫紐西蘭兔，2?4天內進行心臟採血，收集、分離得到含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，再經純化處理，得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，獲得生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟⑵中飽和硫酸銨的用量為羅非魚血清的1.5?3倍，其pH為7.4，PBS的pH也為7.4。
3.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟⑵和步驟⑷中純化處理採用ProteinA+ProteinG親和層析柱過柱純化處理。
4.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟⑷中四免後血清效價達到1:640000以上，用純化的羅非魚IgM按100 μ g/只的免疫劑量加強免疫紐西蘭兔。
5.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟(4)中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在與生物素混勻前先經透析處理。
6.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟(4)中所述的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素的濃度和用量相同。
7.根據權利要求1所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法，其特徵是:步驟(4)中將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，作用3?5小時後，進行透析處理以及採用BCA試劑盒測定其濃度並分裝，獲得生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
8.—種生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，其特徵是:採用權利要求1-7任一項所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的製備方法製成。
9.權利要求8所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應用。
10.權利要求8所述的生物素標記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應用。
【文檔編號】G01N33/573GK103454411SQ201310268486
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月28日 優先權日:2013年5月27日
【發明者】馬豔平, 柯浩, 劉振興, 馮國清, 郝樂 申請人:廣東省農業科學院動物衛生研究所