一種類芽孢桿菌在麩皮培養基生產凝乳酶的方法
2023-10-10 06:52:49
一種類芽孢桿菌在麩皮培養基生產凝乳酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種類芽孢桿菌(Paenibacillus?damxungensis?sp.nov.)CGMCC?No.8333在麩皮培養基發酵生產凝乳酶的方法。該方法包括以下步驟：將所述的類芽孢桿菌種子液接種於麩皮培養基進行發酵，以250mL錐形瓶為標準裝液量為20～40mL，發酵溫度為28℃～32℃，發酵時間為16～20小時，獲得具有凝乳酶活性的發酵液。經測定凝乳酶活力最高可達到6733.81SU/mL。利用優化的培養條件可以獲得具有較高凝乳酶活性的類芽孢桿菌發酵液提取物，該發酵液提取物在乾酪生產加工產業中具有廣闊應用前景。
【專利說明】一種類芽孢桿菌在麩皮培養基生產凝乳酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種類芽孢桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333在麩皮培養基發酵生產凝乳酶的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，乾酪產業發展較快，凝乳是生產原制乾酪的關鍵步驟，凝乳酶在此過程中 發揮至關重要的作用，並直接關係到乾酪的品質和得率。因而隨著世界乾酪產量保持增長 勢頭，凝乳酶的需求量也不斷增長。世界上凝乳劑年需求量25X 106L，產量佔全世界酶製劑 總量的20%左右，成為第一大酶製劑。凝乳酶主要功能是專一性的水解乳中κ-酪蛋白多 肽鏈，形成副酪蛋白及親水性的糖巨肽，當酪蛋白被水解到一定程度後，體系中的鈣離子通 過酪蛋白膠粒間形成的化學鍵形成凝塊，以此用於乾酪生產。
[0003] 傳統的凝乳酶來源於小牛皺胃，然而自1961年以來，世界乾酪產量大約增加了 3. 5倍，小牛皺胃凝乳酶供應量卻呈下降趨勢，目前，世界小牛皺胃凝乳酶的僅能滿足世界 乾酪產量所需凝乳酶的20?30%，無法滿足快速增加的乾酪產量的需求。因此必須通過微 生物發酵的方式以獲得凝乳活力高的提取物。目前，國內對於微生物源凝乳酶也有部分的 研究。如孫健等利用60CO-Y射線誘變初篩的產凝乳酶黴菌，最終獲得提取物凝乳酶的活 力為4000SU/mL。郭光遠等篩選了高溫鏈黴菌凝乳酶活性較高的為100SU/mL。丁明亮等利 用枯草芽孢桿菌進行發酵產生凝乳酶，通過響應面法進行優化，最終獲得凝乳活性最高為 1129SU/mL，但其所獲得的凝乳酶活性仍比較有限。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是針對目前微生物來源凝乳酶活力（milk clotting activity，MCA)不高、產量較低的缺陷，提供一種微生物來源凝乳酶的生產方法。本發明所 述的方法米用類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333 在鼓皮 液體培養基發酵生產凝乳酶，並且在較佳的培養條件下，獲得的凝乳酶具有高於現有利用 微生物發酵產生凝乳酶的MCA值。
[0005] 本發明採用以下技術方案來解決上述技術問題：
[0006] 本發明的技術方案為：
[0007] 一種類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333 在鼓皮 培養基發酵生產凝乳酶的方法，包括以下步驟：將類芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子液接種 於麩皮培養基進行發酵，以250mL錐形瓶為標準裝液量為20?40mL，發酵溫度為28°C? 32°C，發酵時間為16?20小時，獲得具有凝乳酶活性的發酵液。
[0008] 本發明所述的種子液可以是常規的，較佳的，由包括以下步驟的方法製備而得：將 類芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種於TYC培養基，28?32°C活化培養18?20小時後，即得種 子液。
[0009] 本發明所述的接種可以是常規的，較佳的使用單菌落。
[0010] 本發明所述的種子液的接種量可以為常規的接種量，較佳的為4?6%，更佳的為 5%，所述百分比為體積百分比。
[0011] 本發明所述的麩皮培養基可以為常規的麩皮培養基，較佳的包括麩皮和水，所述 麩皮含量為1 %?14%，較佳的為2%?6%，最佳的為3%，所述百分比為質量百分比。
[0012] 本發明所述的麩皮可以為常規的麩皮，較佳的，所述麩皮為小麥麩皮。
[0013] 本發明所述的一種類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333在麩皮培養基發酵生產凝乳酶的方法，所述的種子液由包括以下步驟的方法製備 而得：將類芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種於TYC培養基，28?32°C活化培養18?20小時 後，即得種子液；所述的種子液的接種量為4?6%，所述百分比為體積百分比；所述的麩皮 培養基包括麩皮和水，其中麩皮含量為1%?14%，所述百分比為質量百分比。
[0014] 本發明所述的TYC培養基為常規的TYC培養基，較佳的由以下組分組成：酪蛋 白腖或胰蛋白腖15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. Og/L，L-胱氨酸0. 2g/L，乙酸鈉20g/L， Na2S040. lg/L，NaCllg/L，Na2HP04 · 12H202g/L，NaHC032g/L，瓊脂 15 ?20g/L，餘量為水。
[0015] 本發明所述的發酵的方法為常規，較佳的，在需氧條件下進行。
[0016] 本發明所述的發酵可以為常規的發酵培養方式，較佳的，使用振蕩培養，轉速為 300r/min。
[0017] 本發明所述的類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333,由西藏當雄縣採集的犛牛乳樣品中分離獲得，但不僅限於所述的來源。本發明所 用的類芽孢桿菌CGMCC No. 8333已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，並且在中國專利申請CN103740618A中公開，該專利申請的全文為本發明所引用。
[0018] 本發明的一較佳的實施例是，將所述的類芽孢桿菌發酵，在以250mL錐形瓶為標 準裝液量為29mL，發酵溫度為30°C，發酵時間為18小時的條件下獲得具有凝乳酶活性的發 酵液，所述的發酵使用振蕩培養，轉速為300r/min。
[0019] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0020] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0021] 本發明的積極進步效果在於：本發明的方法，將類芽孢桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov.) CGMCC No. 8333,於麩皮培養基中發酵，通過實驗和研究發現發酵 溫度、三角瓶裝液量、發酵時間是三個顯著影響發酵的因素，在調整這三個因素之後，獲得 CGMCC No. 8333麩皮液體發酵液提取物的凝乳酶活力最高達到6733. 81SU/mL。採用本發明 的生產方法製備凝乳酶的活力得到了顯著的提升，較目前國內凝乳酶活力方面研究MCA值 100-4000SU/mL有了較大幅度的提高，並且利用低成本的麩皮作為培養基來源，有效節約了 社會資源。因此，本發明的有效實施不僅解決了微生物源凝乳酶產量及活力不高的現象，同 樣帶來了良好的經濟和社會效益。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實 施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0023] 本發明所述的凝乳酶活力（MCA)值的測得包括以下步驟：按發酵時間培養類芽 抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov.) CGMCC No. 8333 後，取 5mL 發酵液，經 4°C, 9000r/min離心後得到的上清即為粗酶液，將得到的粗酶液稀釋5倍，取0. 5mL的稀釋液； 將脫脂奶粉以10% (w/v)的比例配置成pH6. 0含有10mm〇l/L CaCl2的溶液，在35°C水浴中 孵育lOmin後，獲得脫脂乳溶液；將所述的0. 5mL的稀釋液加入所述的脫脂乳溶液獲得樣 品。將所述的樣品取出並傾斜45°觀察組織狀態，以所述的樣品形成不連續顆粒的時間計 作凝乳時間，計算MCA值。
[0024]
【權利要求】
1. 一種類芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp. ηον·)CGMCC No. 8333 在鼓皮培 養基發酵生產凝乳酶的方法，包括以下步驟：將類芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子液接種於麩 皮培養基進行發酵，以250mL錐形瓶為標準裝液量為20?40mL，發酵溫度為28°C?32°C， 發酵時間為16?20小時，獲得具有凝乳酶活性的發酵液。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的種子液由包括以下步驟的方法製備 而得：將類芽孢桿菌CGMCC No. 8333接種於TYC培養基，28?32°C活化培養18?20小時 後，即得種子液。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的種子液的接種量為4?6%，所述百 分比為體積百分比。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的麩皮培養基包括麩皮和水，其中麩皮 含量為2%?6%，所述百分比為質量百分比。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的麩皮培養基中麩皮的含量為3 %，所 述百分比為質量百分比。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的裝液量是29mL。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的發酵溫度是30°C。
8. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的發酵時間是18小時。
9. 如權利要求1所述的方法，其特點在於，所述的發酵溫度為30°C，裝液量為29mL，發 酵時間為18小時。
10. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的發酵使用振蕩培養，轉速為300r/ min〇
【文檔編號】C12R1/01GK104059899SQ201410323806
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】杭鋒, 郭本恆, 王欽博, 韓瑨, 劉振民, 陳衛, 宋馨, 吳正鈞, 張灝 申請人:光明乳業股份有限公司