細胞因子蛋白質家族的製作方法

2023-10-10 13:52:14 2

專利名稱：：細胞因子蛋白質家族的製作方法細胞因子蛋白質家族
背景技術：
：多細胞生物的細胞分化由激素和多肽生長因子控制。這些可擴散的分子使得細胞能夠彼此交流並彼此相呼應地行動以形成組織和器官、以及修復和再生損壞的組織。激素和生長因子的實例包括尤其是類固醇激素、甲狀旁腺激素、促濾泡激素、幹擾素、白細胞介素、血小板來源的生長因子、表皮生長因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。激素和生長因子通過和受體蛋白結合影響細胞代謝。某些受體是膜內在蛋白質，它們在細胞外與激素或生長因子結合，並在細胞內與信號轉導途徑，如第二信使系統連接。其它類型的受體是可溶性細胞內分子。細胞因子一般刺激造血細胞譜系細胞的增殖或分化，或參與機體的免疫和炎症應答機制。影響血細胞生成的細胞因子的實例有刺激紅細胞發育的紅細胞生成素(EPO);刺激巨核細胞譜系的細胞發育的血小板生成素(TPO);和刺激中性粒細胞發育的粒細胞集落剌激因子(G-CSF)。這些細胞因子可用於恢復貧血症、血小板減少症及中性粒細胞減少症患者或接受癌症化療的患者的正常血細胞水平，細胞因子在調節血細胞生成和免疫應答中有重要作用，並可以影響淋巴細胞的發育。人II類細胞因子家族包括幹擾素-a(IFN-a)亞型、幹擾素-P(IFN-p)、幹擾素-y(IFN-y)、IL-10、IL-19(美國專利5，985，614)、MDA—7(Jiang等，Oncogene11，2477—2486，(1995))、IL-20(Jiang等，Oncogene11，2477-2486，(1995))、IL-22(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335-31339，(2000))和AK-155(Knappe等，J.Virol.74，3881-3887(2000))。大多數細胞因子通過與I類或II類細胞因子受體結合和轉導信號。人II類細胞因子受體家族的成員包括千擾素-aRl(IFN-aRl)、幹擾素-y-R2(IFN-y-R2)、幹擾素，R1(IFN，Rl)、幹擾素-yR2(IFN-yR2)、IL-10R(Liu等，J.Im畫o1.152,182卜1829'(1994))、CRF2-4(Lutfalla等，Genomics16，366-373，(1993))、IL—20Rp(Blumberg等，Cell,104，9一19，(2001))(又稱作zcytor7(美國專利5，945，511)和CRF2-8(Kotenko等，Oncogene19，2557-2565,(200))、IL-20叩(Blumberg等，同上，(2001))(又稱作DIRS1(PCTW099/46379))、IL-22RA1(IL-22受體al，提交HUGO要求批准)(又稱作IL-22R(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335—31339，(2000))、zcytor11(美國專利5，965，704)和CRF2-9(Kotenko等，Oncogene,19，2557-2565，(2000))及組織因子。II類細胞因子受體典型地是異二聚體，由兩個不同的受體鏈，即a和P受體亞基組成(Stahl等，Cell,74，587-590，(1993))。一般地，a亞基是主要的細胞因子結合蛋白，而[J亞基是形成高親和結合位點以及進行信號轉導所必需的。IL-20受體是一個例外，其中的兩個亞基均是IL-20結合所必需的(Blumberg等，同上(2001))。II類細胞因子受體可以通過受體的細胞外部分中大約200個胺基酸(D200)的保守細胞因子結合域來鑑定。該細胞因子結合域由兩個III型纖連蛋白(FnIII)域(各大約有100個胺基酸)組成(BazanJ.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，6934-6938(1990);Thoreau等，FEBSLett.282，16-31(1991))。每個FnIII域都含有保守的Cys、Pro和Trp殘基，這些殘基決定了7個P鏈的特徵性摺疊方式，其類似於免疫球蛋白的恆定區(Uze等，J.InterferonCytokinRes.15,3-26(1995))。II類細胞因子受體家族的保守結構元件使得可以基於一級胺基酸序列同源性l定該家族的新成員。使用該方法，先前我們已經成功地鑑定到兩個II類細胞因子受體家族新成員，zcytor7(美國專利5,945,511)(又稱作IL—22Ra(Blumberg等，同上(2001))和zcytorll(美國專利5，965，704)(又稱作IL-22R(Blumberg等，同上(2001))。由於細胞因子在生物學應答的調節中的重要作用，因此鑑定ii類細胞因子受體家族的其它新成員是有意義的。il-22，又稱作il-tif(il-10相關的t細胞來源的可誘導因子)(Du匪tier等，J.Immunology164，1814-1819，(2000))，是新近描述的IL-10同系物。小鼠的IL-22最初被鑑定為在體外T細胞和肥大細胞中IL-9謙導的基因(D聽utier等，J.I畫nology,164,1814-1819，(2000))。注射IL-22後在小鼠肝中觀察到急性期反應物誘導活性，並且在注射脂多糖(LPS)後快速誘導了il-22的表達，這提示IL-22參與體內的炎症應答(Dumoutier等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA，97，10144-10149(2000))。白細胞介素是介導免疫學應答(包括炎症)的細胞因子家族。白細胞介素介導多種炎性病理。t細胞是免疫應答的中樞，其產生許多細胞因子和針對抗原的獲得性免疫。t細胞產生的細胞因子被劃分為1型和2型(Kelso，A.，Immun.CellBiol.76:300—317，1998)。1型細胞因子包括il-2、ifn-y、lt-a，其參與炎症應答、病毒免疫、細胞內寄生物免疫和同種異體移植排斥。2型細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，其參與體液應答、蠕蟲免疫和過敏反應。l型和2型共有的細胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-a。有一些證據提示產生1型和2型的T細胞群體偏好向不同類型的發炎組織中遷移。從治療的角度出發，幹擾素尤其有意義(關於幹擾素的綜述見DeMaeyer和DeMaeyer-Guignard，"幹擾素，，，《細胞因子手冊》(TheCytokineHandbook),第3版，Thompson(編)，第491-516頁(AcademicPressLtd.1998)和Walsh,Biopharmaceuticals:BiochemistryandBiotechnology,第158-188頁(JohnWiley&Sons1998))。幹擾素顯示出多種生物學活性，可用於治療某些自身免疫疾病(尤其是癌症)和增強對感染劑(包括病毒、細菌、真菌和原生生物)的免疫應答。迄今，已經鑑定到6種形式的幹擾素，它們分為兩個大組。所謂的"i型"幹擾素包括幹擾素a、幹擾素p、幹擾素(o、幹擾素3、幹擾素t。目前，幹擾素y和幹擾素a的一個亞類是僅有的ii型幹擾素。i型幹擾素被認為來源於相同的祖先基因，保留了充分相似的結構以致可以通過相同的細胞表面受體起作用。人幹擾素a/(5受體的a鏈包含n端細胞外域，其具有ii類細胞因子受體的特徵。千擾素y與i型幹擾素或ii型幹擾素a亞型沒有顯著的同源性，但與i型幹擾素有許多相同的生物學活性。對於人而言，至少有16個非等位基因編碼不同亞型的幹擾素a,而幹擾素p和(0僅由單個基因編碼。i型幹擾素基因成簇排列在9號染色體的短臂中。與人類的典型結構基因不同，幹擾素a、幹擾素(J和幹擾素co缺少內含子。編碼人幹擾素y的單個基因位於第12號染色體上並含有3個內含子。迄今，幹擾素T僅在牛和綿羊中有過描述，而幹擾素5僅在豬中有過描述。臨床醫師藉助幹擾素的多種活性利用該蛋白治療多種疾病。例如，一種形式的幹擾素a已被50多個國家批准用於治療醫學疾病，如多毛細胞白血病、腎細胞癌、基層細胞癌、惡性黑素瘤、aids相關的卡波西肉瘤、多發性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、喉乳頭狀瘤、蕈樣肉芽腫病、尖銳溼疣、慢性B型肝炎、C型肝炎、慢性丁型肝炎、慢性非甲非乙/C型肝炎。美國藥品和食品管理局已經批准使用幹擾素P治療多發性硬化、神經系統的慢性疾病。幹擾素7被用於治療慢性肉芽腫性疾病，幹擾素在其中增強患者的免疫應答以破壞感染性細菌、真菌和原生生物病原體。臨床研究還指出，幹擾素y可以用於治療aids、利什曼病和瘤型麻風。已證實的細胞因子家族的體內活性說明其它細胞因子、細胞因子激動劑和細胞因子拮抗劑的巨大臨床潛力和需求。本發明通過提供刺激造血細胞譜系的細胞的新細胞因子以及相關的組合物和方法來滿足這些需求。發明詳述在詳細闡述本發明之前，定義如下術語可能有助於本發明的理解。術語"親和標籤"在本文中用於指可以和第二多肽結合以便於該第二多肽的純化或檢測或為第二多肽和底物的結合提供位點的多肽片斷。原則上，可以獲得其抗體或其它特異性結合劑的任何肽或蛋白質均可以用作親和標籤。親和標籤包括多聚組氨酸序列段、A蛋白(Nilsson等，EMBOJ.4:1075，1985;Nilsson等，MethodsEnzymol.198:3，1991)、穀胱甘肽S轉移酶(Smith和Johnson等，Gene67:31，1988)、Glu-Glu親和標籤(Grusse廳yer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7952-4，1985)、P物質、FlagTl(Hopp等，Biotechnology6;1204-10，1988)、鏈黴親和素結合肽、或其它抗原性表位或結合域。一般參見Ford等,ProteinExpressionandPurification2:95-107，199L編碼親和標籤的DNA可從供應商(例如PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)處獲得。術語,位變體"在本文中用於指佔據相同的染色體座位的兩個或多個不同基因形式中的任一個。等位變異可以通過突變自然產生，並可以在群體內導致表型多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有改變)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。術語等位變體在本文中也用於指由等位基因變體編碼的蛋白質。術語嚷基端"和繁基端"在本文中用於指多肽內的位置。在上下文允許的情況下，參考多肽的特定序列或部分，這些術語用於指鄰近或相對的位置。例如，在一個多肽中位於參考序列羧基端的某個序列指該序列位於該參考序列的羧基端近側的位置，但不一定位於完整多肽的羧基端。術語"互補物/反互補物對"是指不相同的部分，這些部分在適當的條件將形成通過非共價方式連接的穩定對。例如，生物素和親和素(或鏈黴親和素)是互補物/反互補物對的典型成員。互補物/反互補物對的其它實例包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、有義/反義多核苷酸對等。當期望隨後使互補物/反互補物對解離時，優選該互補物/反互補物對具有小於109\T的結合親和力。術語"多核苷酸分子的互補分子"是指與參考序列相比具有互補鹼基序列並取向相反的多核苷酸分子。例如，序列5，ATGCACGGG3，與5，CCCGTGCAT3，互補。術語1f並核苷酸序列"是指包括一個或多個筒並密碼子(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。筒並密碼子含有不同的核苷酸三聯體，但編碼相同的胺基酸殘基(例如，GAU和GAC三聯體均編碼Asp)。術語"表達載體"用於指包含編碼目的多肽的區段的線性或環狀DNA分子，其中所述的多肽編碼區段在該DNA分子中與幫助其轉錄的其它區段可操作地連接。這些其它區段包括啟動子和終止序列，並還可以包括一個或多個複製起點、一個或多個選擇標記、增強子、多腺苦酸化信號等。表達載體一般來源於質粒或病毒DNA，或可以含有兩者的元件。術語"分離的"當應用於多核苷酸時是指該多核普酸已經離開其天然遺傳環境並因此不含有其它無關或不需要的編碼序列，而且它以適合在遺傳工程化蛋白質製備系統中使用的形式存在。該分離的分子是從其天然環境中被分離出來的那些分子，包括cDNA和基因組克隆。本發明的分離的DNA分子不含有原來與之相連接的其它基因，但可以包括天然存在的5，和3，非翻譯區，如啟動子和終止子。相連區域的鑑定對於本領域普通技術人員而言是明顯的(參見例如，Dynan和Tijan，Nature316:774-78，1985)。"分離的"多肽或蛋白質是在非其天然環境的條件下，例如離開血液和動物組織存在的多肽或蛋白質。在優選形式中，分離的多肽基本上不含有其它多肽，尤其是動物來源的其它多肽。優選提供高度純化形式，即純度大於95%、更優選純度大於99%的多肽。在上下文中，術語"分離的"不排除存在其它可能的物理形式(如二聚體)或其它可能的糖基化或衍生形式的相同多肽。術語,生"當指細胞時表示細胞正在經歷新的異常增殖，尤其是在增殖不受控制和進行性發展的組織中，從而導致贅生物的產生。贅生性細胞可以是惡性的，例如侵入性的和轉移性的，或是良性的。術語，操作地連接的"當指DNA區段時表示這些區段按一定方式排列以致它們可以協調地為其預期的目的發揮作用，例如在啟動子中起始轉錄並前行通過編碼區段到達終止子。術語，向進化同源物"(ortholog)是指從一個物種獲得的多肽或蛋白質，其是來自不同物種的多肽或蛋白質的功能對應物。定向進化同源物之間的序列差異是物種形成的結果。"平行進化同源物"(paralog)是生物體產生的不同的但結構上相關的蛋白質。平行進化同源物被認為起源於基因重複。例如，a珠蛋白、p珠蛋白和肌紅蛋白彼此是平行進化同源物。"多核苷酸"是指從5，向3，末端閱讀的脫氧核糖核普酸或核糖核香酸鹼基的單鏈或雙鏈多聚物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以從天然來源分離、體外合成或通過天然和合成的分子的組合來製備。多核苷酸的大小表示為鹼基對(縮寫"bp")、核苷酸("nt")或千鹼基("kb")。在上下文允許的情況下，後兩個術語可以描述單鏈或雙鏈的多核苷酸。當該術語應用於雙鏈分子時，其用於指整個長度，並且應理解為相當於術語誠基對"。本領域技術人員明了，雙鏈多核苷酸的兩條鏈可以在長度上稍有差異而且它們的末端可以因酶促切割而是交錯的；因此在雙鏈多核苷酸分子中可能並非所有的核苷酸都是配對的。"多肽"是指通過肽鍵連接的胺基酸殘基的多聚物，它們可以是天然產生的或合成產生的。少於約10個胺基酸殘基的多肽通常被稱作肽"。術語"啟動子"在本文中用於表示其所在領域認可的含義，指含有為RNA聚合酶結合和轉錄起始提供條件的DNA序列的基因部分。啟動子序列通常，但並不總是，存在於基因的5'非編碼區。"蛋白質"是指包含一個或多個多肽鏈的大分子。蛋白質還可以包含非肽成分，如糖基。糖和其它非肽取代基可以由產生蛋白質的細胞添加至蛋白質上，並且它們將隨細胞類型的不同而不同。蛋白質在本文中以其胺基酸主鏈結構來定義；諸如糖基等這樣的取代基一般不作詳細說明，但可以存在。術語"受體"是指與生物活性分子(即配體)結合併介導配體對細胞的作用的細胞相關蛋白質。膜結合受體的特徵在於包含細胞外配體結合域和細胞內效應域(典型地參與信號轉導)的多個肽的結構。配體與受體的結合導致受體構象改變，引起效應域和細胞內的其它分子之間發生相互作用。該相互作用又導致細胞代謝的改變。與受體-配體相互作用聯繫的代謝事件包括基因轉錄、磷酸化、去磷酸化、環AMP產生的增加、細胞鈣動員、膜脂動員、細胞粘著、肌醇脂的水解和磷脂的水解。受體一般可以是膜結合的、細胞質的或細胞核的；單體(例如促甲狀腺激素受體、p腎上腺素受體)或多體(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅細胞生成素受體和IL-6受體)。術語"分泌信號序列"是指編碼如下多肽("分泌肽")的DNA序列，所述多肽作為更大多肽的一個成分指導該更大多肽通過合成它的細胞的分泌途徑。該更大多肽通常在運輸通過分泌途徑的過程中被切割而除去分泌肽。術語"拼接變體"在本文中用於指基因轉錄產生的RNA的多種可選擇形式。拼接變異通過利用存在於轉錄的RNA分子中的、或較少情況下單獨轉錄的RNA分子之間的多個可供選擇的拼接位點而自然產生，並可以導致從相同的基因轉錄產生幾種mRNA。拼接變體可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。術語拼接變體在本文中也用於指基因轉錄產生的mRNA拼接變體編碼的蛋白質。應當理解通過粗略的分析方法(例如凝膠電泳)測定的多聚物的分子量和長度是近似值。當該值以"約"X或"大約"X表示時，X的所述值應理解為精確到±10%。本文引用的所有參考文獻均完整地併入作為參考。本發明包括與幹擾素具有功能和結構相似性的一類多核苷酸和多肽分子。此新家族包括命名為zcyto20(SEQIDN0S:1和2)、zcyto21(SEQIDNOS:4和5)、zcyto22(SEQIDNOS:6和7)、zcyto24(SEQIDN0S:8和9)、zcyto25(SEQIDNOS:10和11)的分子，其中zcyto20、21和22是人的序列而zcyto24和25是小鼠的序列。表1顯示了核普酸和胺基酸水平上該家族內的同源性，該同源性在核苷酸水平上為大約72%至98%,而在胺基酸水平上為大約51%至97%。表1tableseeoriginaldocumentpage12表2顯示了zcyto20、zcyto21、zcyto22、IFNa、IFNp、IFNy和IL-10在胺基酸水平上的序列一致性。表2tableseeoriginaldocumentpage12該家族的所有成員均被證實和相同的II類細胞因子受體結合，該受體被命名為zcytorl9受體。而且，已經證實家族中的所有成員均表現出某些生物學活性。這些活性包括例如抗病毒活性和增加循環的髓樣細胞水平。儘管不想受到理論的束綽，但這些分子似乎均通過zcyt0rl9受體沿著相同的途徑傳導信號。zcyto加基因編碼Z05個胺基酸的多肽，顯示在SEQIDN0:2中。可以預測出Zcyto20的信號序列包含SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基(Met)至第21位胺基酸殘基(Ala)。Zcyto20的成熟肽起始於第22位胺基酸殘基(Val)。Zcyto21基因編碼200個胺基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:5中。可以預測出Zcyto21的信號序列包含SEQIDNO:5第1位胺基酸殘基(Met)至第19位胺基酸殘基(Ala)。Zcyto21的成熟肽起始於第20位胺基酸殘基(Gly)。Zcyto21描述在PCT申請WO02/02627。Zcyto22基因編碼205個胺基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:7中。可以預測出Zcyto22的信號序列包含SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基(Met)至第21位胺基酸殘基(Ala)。Zcyto22的成熟肽起始於第22位胺基酸殘基(Val)。Zcyto24基因編碼202個胺基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:9中。Zcyto24的分泌信號序列包含SEQIDNO:9第1位胺基酸殘基(Met)至第28位胺基酸殘基(Ala)。可以在第24位胺基酸殘基(Thr)位置找到該分泌信號序列的另一個可選擇的切割位點。成熟多肽包含第29位胺基酸殘基(Asp)至第202位胺基酸殘基(Val)。Zcyto25基因編碼202個胺基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:11中。Zcyto25的分泌信號序列包含SEQIDNO:11的第1位胺基酸殘基(Met)至第28位胺基酸殘基(Ala)。可以在第24位胺基酸殘基(Thr)位置找到該分泌信號序列的另一個可選擇的切割位點。成熟多肽包含第29位胺基酸殘基(Asp)至第202位胺基酸殘基(Val)。Zcyto20、zcyto21和zcyto22基因已經被作圖定位在人類染色體19ql3.13。基於這些基因的發現，19號染色體的該區域被確定為包含一簇幹擾素樣基因。這是一個新的基因家族的另一證據是在小鼠第7號染色體上鑑定到一簇同線基因，zcyto24(SEQIDNO:8)和zcyto25(SEQIDNO:10)。正如下述，本發明提供具有與SEQIDNO:2的第22位至第205位胺基酸殘基或SEQIDNO:2第1位至第205位胺基酸殘基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的胺基酸序列的分離的多肽，或其某些片斷。本發明還包括進一步含有位於第一胺基酸序列的氨基端位置的信號分泌序列的多肽，其中該信號分泌序列包含SEQIDNO:2胺基酸序列第1至第21位胺基酸殘基。在另一實施方案中，本發明提供具有與SEQIDNO:7第22至205位胺基酸殘基或SEQIDNO:7第1至205位胺基酸殘基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的胺基酸序列的分離的多肽。本發明還包括進一步含有位於此第一胺基酸序列的氨基端位置的信號分泌序列的多肽，其中該信號分泌序列包含SEQIDNO:7胺基酸序列的第1至21位胺基酸殘基。一般地，象紅細胞生成素(EP0)這樣的細胞因子被預測具有4個a螺旋結構(其中螺旋A、C和D在配體和受體的相互作用中最為重要)，而且是該家族成員中更為高度保守的。然而，幹擾素(IFN),尤其是幹擾素a和幹擾素t的特徵在於6個螺旋束。EP0螺旋A相當於zcyto20的螺旋A;EP0螺旋B相當於zcyto20的螺旋C;EP0螺旋C相當於zcyto20的螺旋D;EPO螺旋D相當於zcyto20的螺旋F。這樣，EPO的AB環和CD環之間的環在zcyto20中被擴展而含有zcyto20的短螺旋B和E。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋結構與幹擾素中發現的6螺旋結構相似。蛋白質中二級結構的邊界一般從蛋白質的3維模型根據蛋白質主鏈的一系列PHI和PSI角來確定。可以從例如x射線晶體學或NMR數據、或基於已闡明的結構的同源性模擬來構建模型。根據所用技術，包括晶體形成和柔性NMR溶液結構測定所用的條件，這些二級結構的邊界可以稍有不同。因此，本領域技術人員明了，根據環境的不同，螺旋邊界及一般而言二級結構可以移動多達2、3、4或更多個殘基，但螺旋區域基本上如下面的描述。(見Brandon和Toosze,IntroductiontoProteinStructure,GarlandPublishingCo,inc.紐約，1991;Anderson等，Structure,10(2):175-84，2002。)預測的Zcyto20的螺旋如下螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位胺基酸殘基確定；螺旋B為第78(Arg)至87(Val)位胺基酸殘基；螺旋C為第91(Pro)至第108(Thr)位胺基酸殘基；螺旋D為第116(Val)至138(Ser)位胺基酸殘基；螺旋E為第151(Thr)至172(Lys)位胺基酸殘基；和螺旋F為第177(Gly)至197(Cys)位胺基酸殘基；參見SEQIDNO:2。4個半胱氨酸殘基在Zcyto20、Zcyto21和IFN-a中是保守的。此外，zcyto20還具有3個其它的半胱氨酸。胺基酸殘基第204位的半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵，尤其是和其它zcyto20分子形成同二聚體。基於多重比對的zcyto20進一步分析預測，胺基酸殘基第37和136位；第69和197位；和第71和178位的半胱氨酸(顯示在SEQIDNO:2)將形成分子內二硫鍵。編碼本文所述Zcyto20多肽區域、域、基序、殘基和序列的相應多核苷酸顯示在SEQIDNO:1中。預測的zcyto21的螺旋如下螺旋A由第49(Ser)至63(Leu)位胺基酸殘基確定；螺旋B為第76(Asn)至84(Val)位胺基酸殘基；螺旋C為第89(Val)至第104(Ala)位胺基酸殘基；螺旋D為第111(Glu)至133(Gln)位胺基酸殘基；螺旋E為第137(Thr)至158(Lys)位胺基酸殘基；和螺旋F為第163(Gly)至189(Leu)位胺基酸殘基；如SEQIDN0:5所示。這些半胱氨酸殘基在zcyto21、zcyto21和IFN-a中是保守的，可以形成分子間二硫鍵，尤其是和其它zcyto21分子形成同二聚體。基於多重比對進行的zcyto21的進一步分析預測，胺基酸殘基第34和131位，及第68和164位的半胱氨酸將形成分子內二硫鍵。第190位半胱氨酸是游離的，可以形成分子間二疏鍵。編碼本文所述zcyto21多肽區域、域、基序、殘基和序列的相應多核苷酸顯示在SEQIDNO:4中。預測的zcyto22的螺旋如下螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位胺基酸殘基確定；螺旋B為第78(Arg)至87(Val)位胺基酸殘基；螺旋C為第91(Pro)至第108(Thr)位胺基酸殘基；螺旋D為第116(Val)至138(Ser)位胺基酸殘基；螺旋E為第151(Thr)至172(Lys)位胺基酸殘基；和螺旋F為第177(Gly)至197(Cys)位胺基酸殘基；如SEQIDNO:7所示。4個半胱氨酸殘基在zcyto22、zcyto21和IFN-a中是保守的。此外，zcyto22還具有3個其它的半胱氨酸。胺基酸殘基第204位的半胱氨酸可以形成分子間二疏鍵，尤其是和其它zcyto22分子形成同二聚體。基於多重比對進行的zcyto22的進一步分析預測，胺基酸殘基第37和136位；第69和197位；和第71和178位的半胱氨酸(顯示在SEQIDNO:7)將形成分子內二硫鍵。編碼本文所述zcyto22多肽區域、域、基序、殘基和序列的相應多核苷酸顯示在SEQIDNO:6中。Zcyto24的保守半胱氨酸被證實在SEQIDNO:9的殘基第44、78、141和175位。基於多重比對進行的zcyto24的進一步分析預測，胺基酸殘基第44位和第141位；第78位和第175位(顯示在SEQIDNO:9)之間將形成二硫鍵。編碼本文所述zcyto24多肽區域、域、基序、殘基和序列的相應多核苷酸顯示在SEQIDNO:9中。預測的Zcyto24中的螺旋(如SEQIDNO:9所示)是殘基第59-73位(螺旋A);殘基第85-94位(螺旋B);殘基第98-115位(殘基C);殘基第121-143位(螺旋D);殘基第147-169位(螺旋E);殘基第174-194位(螺旋F)。Zcyto25的保守半胱氨酸被證實在SEQIDNO:11的殘基第44、78、141和175位。基於多重比對進行的zcyto25的進一步分析預測，胺基酸殘基第44位和第141位；第78位和第175位(顯示在SEQIDNO:ll)之間將形成二發f鍵。編碼本文所述zcyto25多肽區域、域、基序、殘基和序列的相應多核苷酸顯示在SEQIDNO:11中。預測的Zcyto25中的螺旋(如SEQIDNO:11所示)是殘基第59-73位(螺旋A);殘基第85-94位(螺旋B);殘基第98-115位(殘基C);殘基第121-143位(螺旋D);殘基第147-169位(螺旋E);殘基第174-194位(螺旋F)。對鼠IL-2的詳細突變分析(Zurawski等，EMBOJ.12:5113-5119，1993)顯示螺旋A和C中的殘基對於與IL-2鄧的結合是重要的；關鍵性殘基是Asp34、Asn99和Asn啦。鼠IL-2的A/B環和螺旋B中的多個殘基對於IL-2Ra的結合是重要的，而螺旋D中僅一個殘基Gln出對於與IL-2Ra的結合是至關重要的。類似地，螺旋A和C是IL-4和IL-4Ra(結構類似於IL-2Ra)之間相互作用的位點，而且螺旋D中的殘基對於與IL-2Ra的相互作用是至關重要的。(Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1657-1662，1997;Kruse等，EMBOJ.11:3237-3244，1992)。尤其是，人IL-4中Tyr^突變為Asp可產生拮抗劑，其與IL-4Ra結合但不與IL-2Ra結合，因此不能產生信號(Kruse等，同上，1992)。4螺旋束的細胞因子還通過其組成螺旋的長度分組。"長螺旋"形式的細胞因子一般由24-30個殘基的螺旋組成，包括IL-6、睫狀神經營養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生長激素(hGH)。貨螺旋"形式的細胞因子一般由18-21個殘基的螺旋組成，包括IL-2、IL-4和GM-CSF。使用CNTF和IL-6進行的研究證實，可以將CNTF螺旋替換為IL-6中的等同螺旋，從而使該嵌合體具有CTNF結合性質。因此，似乎可以基於結構同源性，而不管序列的同一性如何，確定4螺旋細胞因子的功能域，而且這些功能域能夠在嵌合體中保持功能的完整性(Kallen等，J.Biol.Chem.274:11859-11867，1999)。因此，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋域對於合特異性是有用的。尤其有意義的是將來自幹擾素和細胞因子如IFN-a、IL-10、人生長激素的螺旋和環區域組合在一起的融合蛋白。已經證實zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以和稱為zcytorl9的孤兒受體形成複合物。Zcytorl9描述在共同轉讓的專利申請PCT/US01/44808中。已經證實Zcyto22、zcyto21和zcyto24也和zcytorl9結合或通過其傳導信號，這進一步支持zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25是同一細胞因子家族的成員。Zcytorl9受體是II類細胞因子受體。II類細胞因子受體通常與4螺旋束細胞因子結合。例如，白細胞介素10和幹擾素與該類型中的受體(例如千擾素y受體的a和p鏈、幹擾素a/p受體的a和p鏈)結合。II類細胞因子受體的特徵在於在其細胞外域中存在一個或多個細胞因子受體組件(CRM)。其它II類細胞因子受體包括zcytorll(共同擁有的美國專利5，965，704)、CRF2-4(Genbank登錄號Z17227)、IL-10R(Genbank登錄號畫672和NM—001558)、DIRS1、zcytor7(共同擁有的美國專利5，945，511)和組織因子。Zcytorl9與除了幹擾素a/p受體a鏈外的所有已知II類受體一樣，在其細胞外域中僅具有單個II類CRM。對編碼zcytorl9的人cDNA克隆(SEQIDNO:26)的分析顯示編碼520個胺基酸(SEQIDNO:27)的開放閱讀框，其中包含分泌信號序列(SEQIDNO:27第1位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟zcytorl9細胞因子受體多肽(SEQIDNO:27第21位殘基(Arg)至第520位殘基(Arg)),其中細胞外配體結合域大約206個胺基酸殘基(SEQIDNO:27第21位殘基(Arg)至第226位殘基(Asn))，跨膜域大約23個胺基酸殘基(SEQIDNO:27第227位殘基(Trp)至第249位殘基(Trp))，以及細胞內域大約271個胺基酸殘基(SEQIDNO:27第250位殘基(Lys)至第520位殘基(Arg))。在細胞外配體結合域內，有兩個III型纖連蛋白域和一個接頭區。第一個III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:27的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:27的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:27的第125位(Pro)至223位(Pro)殘基。因此，包含SEQIDNO:27第21位(Arg)至第223位(Pro)胺基酸的多肽被認為是配體結合片斷。此外，如II類受體中一般是保守的一樣，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:27所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp))和位於SEQIDNO:27第74、82、195、217位的保守半胱氨酸殘基。此外，還鑑定到編碼其中缺失了30個胺基酸殘基的zcytorl9變體的人cDNA克隆。該zcytorl9變體(顯示在SEQIDNO:23)包含編碼491個胺基酸(SEQIDN0:24)的開放式閱讀框，其中包含分泌信號序列(SEQIDNO:24第l位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟的zcytorl9細胞因子受體多肽(SEQIDNO:24第21位殘基(Arg)至第491位殘基(Arg))，其中細胞外配體結合域大約206個胺基酸殘基(SEQIDNO:24第21位殘基(Arg)至第226位殘基(Asn))，跨膜域大約23個胺基酸殘基(SEQIDNO:24第227位殘基(Trp)至第249位殘基(Trp))，而細胞內域大約242個胺基酸殘基(SEQIDNO:24第250位殘基(Lys)至第491位殘基(Arg))。在細胞外配體結合域內，有兩個III型纖連蛋白域和一個接頭區。第一個III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:24的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:24的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個III型纖連蛋白域較短，包含SEQIDNO:24的第125位(Pro)至223位(Pro)殘基。因此，包含SEQIDNO:24第21位(Arg)至第223位(Pro)胺基酸的多肽被認為是配體結合片斷。此外，正如在II類受體中一般是保守的，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:24所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp))和位於SEQIDNO:24第74、82、195、217位的保守半胱氨酸殘基。似乎可天然表達產生Zcytorl9受體的一種截短可溶性形式的mRNA。對編碼該截短的可溶zcytorl9的人c腿克隆(SEQIDNO:28)的分析顯示編碼211個胺基酸(SEQIDNO:29)的開放式閱讀框，其包含分泌信號序列(SEQIDNO:29第l位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟的截短可溶性zcytorl9受體多肽(SEQIDNO:29第21位殘基(Arg)至第211位殘基(Ser)),其中截短的細胞外配體結合域大約143個胺基酸殘基(SEQIDNO:29第21位殘基(Arg)至第163位殘基(Trp))，無跨膜域，但有一個大約48個胺基酸殘基的額外域(SEQIDNO:29第164位殘基(Lys)至第211位殘基(Ser))。在截短的細胞外配體結合域內，有兩個III型纖連蛋白域和一個接頭區。第一個III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:29的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:29的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:29的第125位(Pro)至163位(Trp)殘基。因此，包含SEQIDNO:29第21位(Arg)至第163位(Trp)胺基酸的多肽被認為是配體結合片斷。此外，正如在II類受體中一般是保守的，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:29所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp)),而且在該截短可溶性形式的zcytorl9受體中的保守半胱氨酸殘基位於SEQIDNO:29第74和82位。Zcytorl9受體是與II類細胞因子受體相同的受體亞家族的成員，該亞家族的受體可以結合形成轉導信號的同二聚體。亞家族的幾個成員(例如結合幹擾素、IL-10、IL-19和IL-TIF的受體)與第二亞基(稱作p-亞基)組合以結合配體和轉導信號。然而，在許多情況下，特定的p-亞基與許多特定的細胞因子受體亞基結合。例如，II類細胞因子受體，如zcytorll(美國專利5，965，704)和CRF2-4受體異二聚體化以結合細胞因子IL-TIF(見，WIPO公開文本WO00/24758;Dumontier等，J.Immunol.164:1814-1819,2000;Spencer，SD等，J.Exp.Med.187:57卜578，1998;Gibbs，VC和Pennica，Gene186:97-101，1997(CRF2-4c纖)；Xie，MH等，J.Biol.Chem.275:31335-31339，2000)。IL-10p受體被認為與CRF2-4同義(Du畫tier，L等，Proc.Natl.Acad.Sci.97:10144-10149，2000;LiuY等，J.Immunol.152:1821-1829，1994(IL-10RcDNA)。因此，可以預期，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25將和單體、同二聚體、異二聚體和多聚體的zcytor19受體結合。試驗證據已將CRF2-4(SEQIDNOS:40和41)確定為zcytorl9的推測的結合夥伴，這再次支持了zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在免疫調節系統中有重要作用，影響諸如天然免疫系統和炎症應答系統等生理機能。定位受體/配體對中受體的表達可能對於筌定配體作用的把細胞或組織有重要意義。當受體/配體複合物涉及異二聚體受體且受體的一個亞基廣泛表達而另一亞基以局限方式(空間或時間上有限)表達時，這尤其有用。使用原位雜交已經在皮膚癌樣品中鑑定到zcytorl9的表達，其中癌性顆粒狀上皮為強陽性，而在正常皮膚中未觀察到陽性信號。鑑定到表達zcytor19的其它組織包括胎肝，其中在竇狀隙的單個核細胞的混合群體中觀察到信號；在肺中觀察到II型肺泡上皮內有表達；並在間充質組織的巨噬細胞樣單個核細胞中觀察到有表達。Zcytorl9的Northen分析鑑定到一個大約4.5kb轉錄本的表達，該轉錄本表達量在心臟、骨骼肌、胰腺和前列腺組織中，以及在伯基特氏淋巴瘤(RAJI)細胞系和SW-480結腸直腸癌細胞系中最大。本發明提供編碼本文公開的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本領域技術人員容易明了，鑑於遺傳密碼子的簡併性，這些多核苷酸分子中可能有相當大量的序列變異。SEQIDN0:3是簡併DNA序列，其包含了編碼SEQIDNO:2的zcyto20多肽的所有DNA。本領域技術人員將明了，通過用U替代T,SEQIDNO:3的筒並序列還提供了編碼SEQIDNO:2的所有RNA序列。因此，包含SEQIDNO:3的第1或64位至第615位核苷酸的編碼zcyto20多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本發明所考慮的。表3列出SEQIDN0:3中用以指示筒並核苷酸位置的單字母代碼。僻釋(resolutions)"是代碼字母所表示的核苷酸。"互補物"是指互補核苷酸的代碼。例如，代碼Y表示C或T，其互補物R表示A或G,其中A與T互補而G與C互補。SEQIDNO:46是簡併DNA序列，其包含了編碼SEQIDNO:7的zcyto22多肽的所有DNA。本領域技術人員將明了，通過用U替代T，SEQIDNO:46的簡併序列還提供了編碼SEQIDNO:7的所有RNA序列。因此，包含SEQIDNO:46的第1或64位至第615位核苷酸的編碼zcyto22多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本發明所考慮的。表3列出SEQIDNO:46中用以指示筒並核苷酸位置的單字母代碼。僻釋"是代碼字母所表示的核苷酸。"互補物"是指互補核普酸的代碼。例如，代碼Y表示C或T，其互補物R表示A或G,其中A與T互補而G與C互補。表3核苷酸解釋互補物解釋AATTCCGGGGCCTTAARA|GYC|TYC|TRA|GMA|CKG|TKG|TMA|C.SC|GSC|GwA|TWA|THA|C|TDA|G|TBC|G|TVA|C|GVA|C|GBC|G|TDA|G|THA|C|TNA|C|G|TNA|C|G|T表4中給出了SEQIDNO:3中使用的簡併密碼子，包括了給定胺基酸的所有可能密碼子。22tableseeoriginaldocumentpage23本領域技術人員將明了，在確定代表編碼每個胺基酸的所有可能密碼子的簡併密碼子時引入了某種不確定性。例如，絲氨酸的簡併密碼子(WSN)可以在某些情況下編碼精氨酸(AGR)，而精氨酸的筒並密碼子(MGN)可以在某些情況下編碼絲氨酸(AGY)。類似的關係也存在於編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼子間。因此，簡併序列包括的某些多核苷酸可以編碼變體胺基酸序列，但本領域技術人員通過參考SEQIDNO:2和SEQIDN0:7的胺基酸序列可以容易地鑑定出這些變體序列。變體序列的功能性可以容易地按照本文所述來測試。本領域技術人員也將理解，不同物種可以表現出貨先密碼子使用"。一般參見Grantham等，Nuc.AcidsRes.8:1893-912，1980;Haas等，Curr.BioL6:315-24，1996;Wain-Hobson等，Gene13:355-64，1981;Grosjean和Fiers，Gene18:199-209，1982;Holm,Nuc.AcidsRes.14:3075-87，1986;Ikemura，J.Mol.Biol.158:573-97，1982。本文中，術語"優先密碼子使用"或"優先密碼子"是本領域的一個術語，指某個物種的細胞中最為頻繁使用的蛋白質翻譯密碼子，因此在編碼各種胺基酸的可能密碼子中會偏向一種或幾種代表性的密碼子(見表3)。例如，蘇氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT編碼，但在哺乳動物細胞中ACC是最常用的密碼子；在其它物種中，例如，昆蟲細胞、酵母、病毒或細菌中，不同的Thr密碼子可能是優先的。通過本領域已知的多種方法，可以將一個特定物種的優先密碼子引入本發明多核苷酸中。將優先密碼子序列引入重組DNA中可以例如通過使蛋白質在特定細胞類型或物種中的翻譯更為有效來增強蛋白質的產生。因此，SEQIDNO:3和46公開的簡併密碼子序列可以作為模板以優化多核苷酸在本領域常用的和本文公開的不同細胞類型和物種中的表達。可以按本文的公開對含有優先密碼子的序列在不同物種中的表達進行測試和優化，並測試這些序列的功能性。正如前面提及的，本發明的分離多核普酸包括DNA和RNA。製備DNA和RNA的方法是本領域熟知的。一般地，從產生大量zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25RNA的組織或細胞中分離腿。這些組織和細胞可以通過Northern印跡(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201，1980)或通過根據對耙細胞或組織的活性篩選來自不同細胞類型的條件培養液來鑑定。一旦鑑定到產生該活性或RNA的細胞或組織後，就可以使用異硫氰酸胍抽提，之後在CsCl梯度中離心分離，製備總賺(Chirgwin等，Biochemistry18:52-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-12，1972)從總RNA製備poly(A)+RNA。可以使用已知方法從poly(A)+RM製備互補DNA。在另一可供選擇的方案中，可以分離基因組DNA。然後通過例如雜交或PCR筌定並分離編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸。可以通過常規克隆方法獲得編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的全長克隆。優選互補DNA(cDNA)克隆，但對於一些應用(例如在轉基因動物中表達)可能優選使用基因組克隆，或對cDNA克隆進行l務飾以包括至少一個基因組內含子。製備cDNA和基因組克隆的方法是熟知的並屬於本領域普通技術人員的水平，它們包括使用本文公開的序列或其部分來作為探針篩選文庫或作為引物來擴增文庫。表達文庫可以使用zcytorl9受體的片斷或其它特異性結合夥伴來探查。本發明還提供來自其它物種的對應多肽和多核普酸(定向進化同源物)。這些物種包括但不限於哺乳動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物、魚類、昆蟲和其它脊推動物和無脊推動物物種。尤其有意義的是來自其它哺乳動物物種的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽，包括鼠、豬、綿羊、牛、犬、貓、馬和其它靈長類動物多肽。可以使用本發明提供的信息和組合物以及常規克隆技術複製人zcyto20、zcyto21和zcyto22的定向進化同源物。例如，可以使用從表達本文7>開的zcyto20、zcyto21和zcyto22的組織或細胞類型獲得的mRNA克隆cDNA。mRNA的適宜來源可以通過用根據本文公開的序列設計的探針探查Northern印跡來鑑定。然後從陽性組織或細胞系的mRNA製備文庫。之後可以通過多種方法，例如用完整的或部分的人cDNA或用一組或多組基於公開的序列的簡併探針進行探查，分離編碼zcyto20、zcyto21和zcyto22的cDNA。還可以使用聚合酶鏈式反應或PCR(Mullis，美國專利4,683,202),使用根據本文公開的代表性人zcyto20序列設計的引物，克隆cDNA。在另一方法中，可以使用cDNA文庫轉化或轉染宿主細胞，然後可以用zcyto20多肽的抗體、結合研究或活性測試方法檢測目的cDNA的表達。類似的技術也可以應用於基因組克隆的分離。本領域技術人員將意識到，SEQIDNOS:1、4和6中7>開的序列分另'〗代表人zcyto20、zcyto21和zcyto22帶的一種等位基因，而且預期可以出現等位變異和可變拼接。該序列的等位變體可以通過利用標準方法探查來自不同個體的cDNA或基因組文庫進行克隆。SEQIDNO:1、4和6所示DNA序列的等位變體，包括含有沉默突變的那些和其中的突變導致胺基酸序列改變的那些，均屬於本發明的範圍，作為SEQIDNO:2、5和7的等位變體的蛋白質同樣也屬於本發明的範圍。由可變拼接產生的mRNA製備的、仍保留了zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽性質的cDNA包括在本發明範圍內，同樣這些cDNA和mRNA編碼的多肽也包括在本發明範圍內。這些序列的等位變體和拼接變體可以通過使用本領域已知的標準方法探查來自不同個體或組織的cDNA或基因組文庫進行克隆。本發明還提供在診斷應用中有用的試劑。例如，zcyto20、zcyto21和zcyto22基因、包含zcyto20、zcyto21和zcyto22DNA或■或其亞序列的探針可以用於確定zcyto20、zcyto21和zcyto22基因是否存在於人染色體上，如19號染色體上，或是否有基因突變發生。Zcyto20、zcyto21和zcyto21定位在19號染色體的q13.13區。zcyto20、zcyto21和zcyto22基因座位上可檢測的染色體畸變包括，但不限於，非整倍性、基因拷貝數改變、異質性喪失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位點改變和重排。可以通過使用分子遺傳學技術，例如限制性片斷長度多態性(RFLP)分析、利用PCR技術進行的短串聯重複(STR)分析，和本領域已知的其它遺傳學連鎖分析技術(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian,Chest108:255-65，1995)，使用本發明多核苷酸來檢測這些畸變。基因位置的精確信息對於許多目的可能是有用的，包括1)確定序列是否是現有重疊群的一部分並以多種形式例如YAC、BAC或cDNA克隆獲得其它的周圍遺傳序列；2)為表現出與相同染色體區域連鎖的遺傳疾病提供可能的候選基因；和3)與模式生物(例如小鼠)相互參照，這可以幫助確定特定基因可能具有的功能。例如，Delague等(Am.J.Hum.Genet.67:236-243，2000)鑑定到Charcot-Marie-Tooth疾病定位在19ql3.1-13.3(Delague等，Am.J.Hum.Genet.67:236-243,2000)。診斷可以幫助醫師確定疾病類型和適當的相關治療，或幫助遺傳諮詢。同樣地，^^吏用本領域已知的和本文描述的方法，按本文所述，本發明的抗zcyto20抗體、多核苷酸和多肽可以用於檢測zcyto20多肽、mRNA或抗zcyto20抗體，由此充當標記，並可以直接用於檢測遺傳疾病或癌症。而且，可以使用zcyto20、zcyto21和zcyto22多核苷酸探針檢測與如下情況相關的異常或基因型染色體19ql3.13中的人類疾病相關性缺失及易位、或涉及胂瘤的惡性發展的其它易位、或預期涉及惡性腫瘤或其它癌症中的染色體重排的其它19ql3.13突變。類似地，可以使用zcyto20多核苷酸探針檢測與如下情況有關的異常或基因型與人類疾病或自然流產相關的染色體19ql3.13三體性和染色體丟失。因此，zcyto20、zcyto21和zcyto22多核普酸探針可以用於檢測與這些缺陷有關的異常或基因型。一般地，用於遺傳連鎖分析以檢測患者的遺傳畸變或異常的診斷方法是本領域已知的。分析性探針一般長至少20nt，但有時可以使用更短的探針(例如14-17nt)。PCR引物長至少5nt,優選15nt或更大，更優選20-30nt。對於基因或染色體DNA的總體分析，zcyto20多核普酸探針可以包含完整的外顯子或更多。本領域技術人員通過比較zcyto20、zcyto21、和zcyto22序列(分別是SEQIDN0S:1、4和6)與zcyto20、zcyto21、和zcyto22的基因組腿，可以容易地確定夕卜顯子。一般地，用於遺傳連鎖分析以檢測患者的遺傳畸變或異常的診斷方法是本領域已知的。大多數診斷方法包括步驟(a)從可能患病的患者、患病的患者或隱性疾病等位基因的可能非患病攜帶者獲得遺傳樣品；(b)通過在例如RFLP分析中將遺傳樣品與zcyto20多核苷酸探針一起孵育(其中所述多核苷酸與互補多核苷酸序列雜交)或通過將遺傳樣品和有義及反義引物在PCR反應中在適當的PCR反應條件下一起孵育，產生第一反應產物；(c)通過凝膠電泳和/或其它已知方法顯現第一反應產物，例如使用zcyto20多核苷酸探針(其中所述多核苷酸將與第一反應物中的互補多核苷酸序列雜交)顯現第一反應產物；和(d)將顯現到的第一反應產物和來自野生型患者的遺傳樣品的第二對照反應產物進行比較。第一反應產物和對照反應產物之間的差異將指示該患病的或可能患病的患者中的遺傳異常，或非患病患者存在雜合隱性攜帶者表型、或病患者的肺瘤中存在遺傳缺陷、或胎兒或植入前胚胎中存在遺傳異常。例如，zcyto20遺傳座位在限制性片斷圖、PCR產物長度、重複序列長度方面的差異將指示與正常野生型對照相比存在遺傳異常、遺傳畸變或等位差異。對照可以來自未受影響的家族成員或無關個體，這取決於所作試驗及樣品的可獲得性。用於本發明的遺傳樣品包括從患者的任何組織或其它生物學樣品(例如，但不限於，血液、唾液、精液、胚胎細胞、羊水等)分離的基因組DNA、mRNA和cDNA。多核普酸探針或引物可以是RNA或DNA，並將包含SEQIDNO:1的部分、SEQIDN0:1的互補分子、或其RNA等同物。進行人類疾病表型的遺傳連鎖分析的這些方法是本領域熟知的。對於基於PCR的診斷方法，一般參見Mathew(編)，ProtocolsinHumanMolecularGenetics(HumanaPress,Inc.1991)、White(編)，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications(HumanaPress,Inc.1993)、Cotter(編)，MolecularDiagnosisofCancer(HumanaPress,Inc.1996)、Hanausek和Walaszek(編)，TumorMarkerProtocols(HumanaPressInc.1998)、Lo(編)，ClinicalApplicationsofPCR(HumanaPress,Inc.1998)和Meltzer(編),PCRinBioanalysis(HumanaPress,Inc.1998))。可以使用本發明核酸分子通過用於直接突變分析的標準方法，如限制性片斷長度多態性分析、基於PCR技術的短串聯重複分析、擴增不應哭變系統分析(amplification-refractorymutationsystemanalysis)、單鏈構象多態性檢測、RNase切割方法、變性梯度凝膠電泳、藉助螢光的錯配分析和其它本領域已知的遺傳分析技術(見，例如，Mathew(編)，ProtocolsinHumanMolecularGenetics(HumanaPress,Inc.1991)，Marian,Chest108:255(1995);Cole隨和Tsongalis，MolecularDiagnosis(HumanaPress,Inc.1996);Elles(編)MolecularDiagnosisofGeneticDiseases(HumanaPress,Inc.1996);Landegren(編)LaboratoryProtocolsforMutationDetection(OxfordUniversityPress1996);Birren等(編),GenomeAnalysis,第2巻檢測基因(ColdSpringHarborLaboratoryPress1998);Dracopoli等(編)，CurrentProtocolsinHumanGenetics(JohnWiley&Sons1998);和Richards和Ward,"分子診斷檢測，，，《PrinciplesofMolecularMedicine》第83-88頁(HumanaPress,Inc.1998)),檢測與zcyto20、zcyto21和zcyto22座位有關的突變。對Zcyto20基因的突變的直接分析可以使用受試對象的基因組DNA來進行。擴增從例如外周血淋巴細胞獲得的基因組DNA的方法是本領域技術人員熟知的(見，例如，Dracopoli等(編)，CurrentProtocolsinHumanGenetics,第7丄6-7.1.7頁(JohnWiley&Sons1998))。在本發明實施方案中，分離的zcyto20編碼核酸分子可以在嚴緊條件下與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子雜交，與具有SEQIDNO:1核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子雜交，或與具有與SEQIDNO:1互補的核苷酸序列的核酸分子雜交。一般地，選擇的嚴緊條件為對於特定的序列在規定的離子強度和pH下比熱熔解溫度(Tm)低大約5t:。Tm是50。/。靶序列與完全匹配的探針發生雜交時的溫度(在規定的離子強度和pH下)。在本發明實施方案中，分離的zcyto22編碼核酸分子可以在嚴緊條件下與具有SEQIDNO:6的核苷酸序列的核酸分子雜交，與具有SEQIDNO:6核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子雜交，或與具有與SEQIDNO:6互補的核苷酸序列的核酸分子雜交。如果一對核苷酸序列具有一定程度的互補性，則該核酸分子對，例如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA可以雜交。雜交體可以在雙螺旋中耐受錯配鹼基對，但雜交體的穩定性受到錯配程度的影響。錯配的雜交體的Tm每1-1.596鹼基對錯配降低rC。改變雜交條件的嚴緊性使得可以控制雜交體中存在的錯配程度。當雜交溫度增加而雜交緩衝液的離子強度減少時，嚴緊程度增加。使這些條件適用於具體的多核苦酸雜交體屬於本領域技術人員的能力範圍。特定靶序列的Tm是50%該靶序列與完全匹配的探針序列發生雜交時的溫度(在規定的條件下)。影響Tm的那些條件包括多核苷酸探針的大小和鹼基對量、雜交溶液的離子強度和雜交溶液中去穩定劑的存在。用於計算Tm的許多等式是本領域已知的，它們對於DNA、RNA和DNA-RNA雜交體及不同長度的多核苷酸探針序列是特異的(見例如，Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(ColdSpringHarborPress1989);A畫bel等(編)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWileyandSons,Inc.1987);Berger和Kimmel(編),GuidetoMolecularCloningTechniques,(AcademicPress,Inc.1987);和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227(1990))。序歹'分析軟體如OLIGO6.0(LSR;LongLake,MN)和PrimerPremier4.0(PremierBiosoftInternational;PaloAlto,CA)以及英特網上的站點，是公眾可得到的工具，可基於用戶定義的標準用於分析給定序列和計算Tm。這些程序也可以在規定的條件下分析給定的序列並確定適宜的探針序列。典型地，較長多核苷酸序列(〉50個鹼基對)的雜交在低於計算的Tm大約20-25"的溫度下進行。對於較小的探針(〈50個鹼基對)，雜交典型地在Tm或低於計算的Tm5-l(TC的溫度下進行。這允許DNA-DNA和DNA-RNA雜交體以最大速率雜交。雜交後，可以在嚴緊條件或在高度嚴緊條件下洗滌核酸分子以除去未雜交的核酸分子。典型的嚴緊洗滌條件包括在O.5x-2xSSC加0.W十二烷基碌u酸鈉(SDS)的溶液中55-65t:洗滌。也就是說，編碼zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽變體的核酸分子可以在嚴緊洗滌條件下分別與具有SEQIDN0S:1、4和6的核苷酸序列的核酸分子(或其互補分子)雜交，其中所述洗滌嚴緊性相當於0.5x-2xSSC加0.1%SDS在55-65匸下，包括0.5xSSC加0.1%SDS在55"C下或2xSSC加0.1%SDS在65"C下。本領域技術人員可以通過例如用SSPE代替洗滌溶液中的SSC，容易地設計出等同的條件。典型的高度嚴緊洗滌條件包括在0.lx-0.2xSSC加0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的溶液中50-65X:洗滌。也就是說，編碼zcyto20多肽變體的核酸分子可以在高度嚴緊洗滌條件下與具有SEQIDNO:1的核普酸序列的核酸分子(或其互補分子)雜交，其中所述洗滌嚴緊性相當於0.lx_0.2xSSC加0.1%SDS在50_65X:下，包括0.lxSSC加0.1%SDS在50"C下或0.2xSSC加0.1%SDS在65"C下。本發明還提供分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、ll的多肽或它們的定向進化同源物具有基本上相似的序列一致性的分離的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。術語"基本上相似的序列一致性"在本文中用於指分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、11所示序列或它們的定向進化同源物有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大於95%的序列一致性的多肽。本發明還包括含有與SEQIDNO:2或SEQIDNO:7胺基酸殘基第1至205位或第21至205位的序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大於95%、96°/。、97%、98%、99%的序列一致性的胺基酸序列的多肽。本發明還包括編碼這些多肽的核酸分子。確定一致性百分數的方法見如下描述。本發明還考慮可以使用兩個標準確定的zcyto20、zcyto21和zcyto22核酸分子變體對所編碼多肽分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、11的胺基酸序列的相似性的確定，和/或如上所述的雜交分析。這些zcyto20變體包括(1)分別與具有SEQIDNOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互補分子)在嚴緊洗滌條件下雜交的核酸分子，其中該洗滌嚴緊性相當於0.5x-2xSSC加0.1%SDS在55-65t:下；或(2)編碼與SEQIDNO:2的胺基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大於95%的序列一致性的多肽的核酸分子。或者，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25變體可以表徵為(1)分別與具有SEQIDNOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互補分子)在高度嚴緊洗滌條件下雜交的核酸分子，其中該洗滌嚴緊性相當於0.lx-0.2xSSC加0.1%SDS在50-65。C下；和(2)編碼分別與SEQIDNOS:2、5、7、9、11的胺基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大於95%的序列一致性的多肽的核酸分子。序列一致性百分數可通過常規方法確定。見例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48:603(1986)，和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1992)。簡而言之，l吏用10的缺口(gap)開放罰分、1的缺口延伸罰分和Henikoff和Henikoff(同上)的BL0SUM62"評分矩陣(見表4，胺基酸用標準單字母代碼表示)，將兩個胺基酸序列對齊以優化比對分數。一致匹配的總數n數目]tableseeoriginaldocumentpage33本領域技術人員明了，已有許多成熟的算法可以比對兩個胺基酸序列。Pearson和Lipman的"FASTA"相似性檢索算法是一個適宜的蛋白質比對方法，可用於檢測本文公開的胺基酸序列和推測的zcyto20變體的胺基酸序列之間的一致性水平。FASTA算法描述在Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.眼85:2444(1988)及Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)。簡而言之，FASTA首先通過確定查詢序列(例如SEQIDNO:2)和測試序列共有的區域，即在不考慮保守胺基酸替代、插入或缺失的情況下具有最大的一致性密度(如果kt叩變量為l)或具有成對的一致性(如果kt叩二2)的區域，以表徵序列相似性。然後使用胺基酸替代矩陣比較所有配對的胺基酸的相似性，對具有最大的一致性密度的10個區域進行重新評分，並，務剪"這些區域的末端以便僅包括對此最高分數有貢獻的那些殘基。如果有分數大於識斷值"(通過預先確定的公式基於序列長度和ktup值計算的)的幾個區域，則檢驗這些經修剪的最初區域以確定這些區域是否可以結合缺口以形成近似對齊。最後，使用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:444(1970);Sellers,SIAMJ.Appl.Math.26:787(1974))(該算法允許胺基酸插入和缺失)，對這兩個胺基酸序列的最大得分區域進行比對。FASTA分析的優選參數是kt叩二l、缺口開放罰分=10、缺口延伸罰分二l和替代矩陣二BL0SUM62。這些參數可以通過修飾評分矩陣文件("SMATRIX")引入FASTA程序中，對此的解釋參見Pearson,Meth.Enzymol.183;63(1990)的附錄2。使用上面公開的比例，FASTA還可以用於確定核酸分子的序列一致性。對於核苷酸序列比較，kt叩值可以在1至6的範圍內，優選3至6，最優選3，而其它參數設置為默認值。zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽變體或具有實質上相似的序列一致性的多肽的特徵在於具有一個或多個胺基酸替代、缺失或插入。這些改變優選在性質上較小，即保守胺基酸替代(見表5)和不顯著影響多肽的摺疊或活性的其它替代；小的缺失，典型地一個至約30個胺基酸的缺失；氨基或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸殘基，不超過約20-25個殘基的小的接頭肽或親和標籤。本發明因此提供包含與SEQIDNO:2的相應區域有至少70%、優選至少90%、更優選95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的序列的具有約154-235個胺基酸殘基的多狀。包含親和標籤的多肽還可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽與親和標籤之間含有蛋白酶剪切位點。優選的這些位點包括凝血酶切割位點和因子Xa切割位點。表6保守胺基酸替代tableseeoriginaldocumentpage35可以確定包含對於維持結構完整性關鍵的區域或域的胺基酸殘基。可以確定在這些區域中或多或少耐受改變而保持分子的整個三級結構的特定殘基。分析序列結構的方法包括，但不限於具有高胺基酸或核苷酸一致性的多個序列的比對、二級結構傾向(propensity),二元圖(binarypatterns)、互補堆積(complementarypacking)和隱蔽的極性相互作用(Barton,CurrentOpin.Struct.Biol.5:372-376，1995;和Cordes等，CurrentOpin.Struct.Biol.6:3-10,1996)。一般地，當設計分子修飾或鑑定特定片斷時，將在確定結構的同時評價修飾的分子的活性。可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽中進行胺基酸序列改變以便最少破壞對於生物學活性必需的高級結構。例如，當zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽包含一個或多個螺旋時，將改變胺基酸殘基以便不破壞螺旋的幾何學和其中的構象改變將使一些關鍵功能(例如分子與其結合夥伴的結合)減弱的其它分子成分。胺基酸序列改變的效果可以通過例如以上公開的計算機模擬進行預測，或通過晶體結構分析進行測定(見例如L鄰thorn等，Nat.Struct.Biol.2:266-268，1995)。本領域熟知的其它技術對變體蛋白和標準分子(例如天然蛋白)的摺疊進行比較。例如，可以比較變體和標準分子中的半胱氨酸分布情況。質譜和使用還原和烷基化的化學修飾為測定與二疏鍵相關的或未形成這些鍵的半胱氨酸殘基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201:216-266，1992;Gray,ProteinSci.2:1732-1748，1993;和Patterson等，Anal.Chem.66:3727-3732，1994)。一般認為如果〗務飾的分子與標準分子具有不相同的半胱氨酸分布情況，則摺疊受到影響。另一個用於測量摺疊的被接受的熟知方法是園二色性(CD)。測量和比較修飾分子和標準分子產生的CD譜是常規的(Johnson,Proteins7;205-214，1990)。晶體學是另一個分析摺疊和結構的熟知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作圖和表位作圖也是分析摺疊及蛋白質和多肽之間的結構相似性的已知方法(Sch繊an等，Science257:96卜964，1992)。可以製備SEQIDNO:2所示Zcyto20蛋白質序列的Hopp/Woods親水性分布圖(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828,1981;Hopp，J.I咖un.Meth.88:1-18,1986和Triquier等,ProteinEngineering11:153-169，1998)。該分布圖以滑動的六殘基窗為基礎。忽略隱蔽的G、S和T殘基及暴露的H、Y和W殘基。例如，在zcyto20中，親水區域包括SEQIDNO:2的第169(Glu)至174(Glu)位胺基酸殘基、SEQIDNO:2的第54(Lys)至第59(Ala)位胺基酸殘基、SEQIDNO:2的第53(Phe)至第58(Asp)位胺基酸殘基、SEQIDNO:2的第168(Gln)至173(Lys)位胺基酸殘基、以及SEQIDNO:2的第154(Pro)至第159(Arg)位胺基酸殘基。可以製備SEQIDNO:7所示Zcyto22蛋白質序列的Hopp/Woods親水性分布圖(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828，1981;Hopp，J.Immun.Meth.88:1-18，1986和Triquier等，ProteinEngineering11:153-169,1998)。該分布圖以滑動的六殘基窗為基礎。忽略隱蔽的G、S和T殘基及暴露的H、Y和W殘基。例如，在zcyto22中，親水區域包括SEQIDNO:7的第169(Glu)至174(Glu)位胺基酸殘基、SEQIDNO:7的第54(Lys)至第59(Ala)位胺基酸殘基、SEQIDNO:7的第53(Phe)至第58(Asp)位胺基酸殘基、SEQIDNO:7的第168(Gln)至173(Lys)位胺基酸殘基、以及SEQIDNO:7的第154(Pro)至第159(Arg)位胺基酸殘基。本領域技術人員將明了，當在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的胺基酸序列中設計修飾時應考慮親水性或疏水性，以便不破壞整體的結構和生物學情況。對於替代尤其有意義的是選自Val、Leu和lie組成的組或選自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp組成的組的疏水'l"生殘基。從IFN-a與zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25家族的成員之間的序列相似性分析(顯示在表1和2)，也可以推斷出哪些是必需胺基酸。使用如前述"FASTA"分析等方法，可以在蛋白質家族中鑑定高相似性區域，這些區域可以用於分析保守區域的胺基酸序列。基於結構鑑定變體多核苷酸的另一可選擇的方法是按上述確定編碼潛在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因變體的核酸分子是否可以和具有SEQIDNOS:1、4、6、8或10的核苷酸序列的核酸分子雜交。可筌定本發明多肽中的必需胺基酸的其它方法是本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，Science244:1081(1989)，Bass等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4498(1991),Coombs和Corey,"定點誘變和蛋白質工程，，，《Proteins:AnalysisandDesign》，Angeletti(編),第259-311頁(AcademicPress,Inc.1998))。在後一技術中，在分子的每個殘基位置引入單丙氨酸突變，並按下面的公開方法測試所獲突變分子的生物學或生物化學活性以確定對於該分子的活性關鍵的胺基酸殘基。也參見Hilton等，J.Biol.Chem.271:4699(1996)。本發明還包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的功能性片斷和編碼這些功能性片斷的核酸分子。在本文中，^能性"zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或其片斷的特徵在於其增殖或分化活性、誘導或抑制特化細胞功能的能力或特異結合抗zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗體或zcytorl9受體(可溶的或固定的)的能力。如本文前述，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的特徵在於6螺旋束。因此，本發明還提供如下融合蛋白，其包括(a)包含上述一個或多個螺旋的多肽分子；和(b)包含這些螺旋中的一個或多個螺旋的功能性片斷。融合蛋白的另一多肽部分可以由另一螺旋束細胞因子或幹擾素(如IFN-a)提供或由促進融合蛋白分泌的非天然的和/或無關的分泌信號肽提供。本發明zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽，包括全長多肽、生物學活性片斷和融合多肽，可以根據常規技術使用其中導入了編碼該多肽的表達載體的細胞來製備。本文中，嚷中導入了表達載體的細胞"包括直接接受操作引入了外源DNA分子的細胞和其含有該引入的DNA的後代。適宜的宿主細胞是可以用外源DNA轉化或轉染且可以培養生長的那些細胞類型，包括細菌、真菌細胞和培養的高等真核細胞。操作克隆的DNA分子和將外源DNA引入多種宿主細胞的技術公開在Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989;和Ausubel等，編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.NY，1987。一般地，編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的DNA序列與對於其表達必需的其它遺傳元件，一般包括轉錄啟動子和終止子，在表達載體中可操作地連接。載體通常還含有一個或多個選擇標記和一個或多個複製起點，但本領域技術人員將明了在某些系統中選擇標記可以在分開的不同載體上提供，而且外源DNA的複製可以通過整合至宿主細胞基因組中來實現。啟動子、終止子、選擇標記、載體和其它元件的選擇是屬於本領域普通技術人員水平內的常規設計。這些元件中的許多在文獻中已有描述，並可通過供應商獲得。為了引導zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣進入宿主細胞的分泌途徑，可以在表達載體中提供分泌信號序列(又稱作前導序列，前原序列(pr印rosequence)或前序歹1(presequence))。該分泌信號序歹'j可以是zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的分泌信號序列，或可以來源於另一分泌蛋白(例如t-PA;見美國專利5，641，655)或從頭合成。將分泌信號序列與zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的DNA序列可操作地連接，即將兩個序列在正確的閱讀框中連接並放置在一定位置以指導新合成的多肽進入宿主細胞的分泌途徑。分泌信號序列通常位於編碼目的多肽的DNA序列的5，，但某些信號序列可以位於目的DNA序列的其它地方(見例如Welch等，美國專利5,037,743;Holland等，美國專禾'J5，143，830)。本發明中可以使用培養的哺乳動物細胞作為宿主。將外源DNA引入哺乳動物宿主細胞中的方法包括磷酸鈣介導的轉染(Wigler等，Cell14:725，1978;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7:603，1981;Graham和VanderEb，Virology52:456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBOJ.1:841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介導的轉染(Ausubel等，同上)和脂質體介導的轉染(Hawley-Nelson等，Focus15:73，1993;Cicca雨e等，Focus15:80，1993)。在培養的哺乳動物細胞中生產重組多肽/>開在例如Levinson等，美國專利4,713,339;Hagen等，美國專利4，784，950;Palmiter等，美國專利4,579,821;和Ringold,美國專利4，656，134。適宜的培養的哺乳動物細胞包括COS-1(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCNo.CRL1651)、B服(ATCCNo.CRL1632)、BHK570(ATCCNo.CRL10314)、293(ATCCNo.CRL1573;Graham等，J.Gen.Virol.36:59-72，1977)和中國倉鼠卵巢細胞系(例如CH0-Kl，ATCCNo.CCL61;或CHODG44，Chasin等，Som.CellMolec.Genet.12:555，1986)。其它適宜的細胞系是本領域已知的，並可以通過公共保藏單位(如美國典型培養物保藏中心，Manassas,VA)獲得。一般地，優選強轉錄啟動子，如來自SV40或巨細胞病毒的啟動子。見例如美國專利4,956,288。其它適宜的啟動子包括來自金屬硫蛋白基因的啟動子(美國專利4,579,821和4，601，978)和腺病毒主要晚期啟動子。用於哺乳動物細胞的表達載體包括pZP-1和pZP-9(它們保藏在美國典型培養物保藏中心(Manassas,VA，USA)，保藏號分別是98669和98668)及其衍生物。一般使用藥物篩選以選擇其中插入了外源DNA的培養的哺乳動物細胞。這些細胞通常被稱作,染子"。在選擇劑存在下培養並能夠將目的基因傳遞給其後代的細胞被稱作^!定轉染子"。優選的選擇標記是編碼抗生素新黴素抗性的基因。選擇在存在新黴素類藥物，如G-418等時進行。還可以使用選擇系統以增加目的基因的表達水平，該過程被稱作"擴增"。擴增的實施方式是在有低水平選擇劑時培養轉染子然後增加選擇劑的量以選擇產生高水平的引入基因之產物的細胞。優選的可擴增選擇標記是二氫葉酸還原酶，該酶賦予對氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其它藥物抗性基因(例如潮黴素抗性、多重抗藥性、嘌呤黴素乙醯轉移酶)。也可以將腺病毒系統用於體外蛋白質生產。通過在細胞不會快速分裂的條件下培養腺病毒感染的非293細胞，該細胞可以長時期產生蛋白質。例如，在細胞工廠中將BHK細胞培養至匯合，然後將其暴露於編碼目的分泌蛋白的腺病毒載體。然後在無血清條件下培養細胞，在該條件下允許感染的細胞存活幾周而不發生顯箸的細胞分裂。在另一可選擇的方法中，可以將腺病毒感染的293細胞以貼壁細胞的形式或以懸浮培養物的形式培養至相對高的細胞密度以產生顯著大量的蛋白質(見Garnier等，Cytotechnol.15:145—55，1994)。使用任一種方案，可以根振表達蛋白在細胞中的分布重複從細胞培養物上清液、裂解物或膜碎片中分離表達的分泌異源蛋白質。在使用感染的293細胞的生產方案中，還可以有效地獲得非分泌的蛋白質。可以用通常來源於苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)的重組杆狀病毒根據本領域已知的方法感染昆蟲細胞。在優選方法中，通過使用基於轉座子的系統(描述在Luckow等，J.Virol.67:4566-4579，1993)產生重組杆狀病毒。該系統利用轉移載體，並可以以試劑盒的形式購買得到(Bac-to-Bac試劑盒；LifeTechnologies,Rockville,MD)。所述轉移載體(例如pFastBacl;LifeTechnologies)含有Tn7轉座子以便可以將編碼目的蛋白質的DNA移入在大腸桿菌中作為所謂"杆粒"的大質粒維持的杆狀病毒基因組中。見，Hill-Perkins和Possee,J.Gen.Virol.71:971-976，1990;Borming等，J.Gen.Virol.75:1551-1556，1994;和ChazenbalkRapoport，了.Biol.Chem.270:1543-1549，1995。此外，轉移載體可以包括與編碼上文公開的多肽延伸段或親和標籤的DNA的框內融合物。使用本領域已知技術，可以將含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25編碼序列的轉移載體轉化至大腸桿菌宿主細胞中，篩選帶有含中斷的lacZ基因(指示重組杆狀病毒)的杆粒的細胞。使用常規技術分離含有重組杆狀病毒基因組的杆粒DNA,並用其轉染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞，如Sf9細胞。隨後產生表達zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的重組病毒。通過本領域常用方法頁製備重組病毒原液。為了產生蛋白質，可以使用該重組病毒感染宿主細胞，典型地來源於秋粘蟲，草地貪夜蛾(如Sf9或Sf21細胞)或粉紋夜蛾(Trichoplusiani)(如HighFive細胞；Invitrogen，Carlsbad,CA)的細胞系。見例如美國專利5,300,435。使用無血清培養基培養和維持細胞。適宜的培養基配方是本領域已知的，可以從供應商處獲得。從大約2-5xl05個細胞的接種密度將細胞培養至1-2xl6個細胞的密度，此時加入感染複數(MOI)為0.1-10，更典型地近3的重組病毒原液。所用方法是本領域一般已知的。還可以使用其它高等真核細胞作為宿主，包括植物細胞和鳥類細胞。關於毛根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為載體用於植物細胞中表達基因的綜述見Sinkar等，J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987。在本發明中還可以使用真菌細胞，包括酵母細胞。在此方面特別有意義的酵母種包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和Pichiamethanolica。用夕卜源DNA轉化釀酒酵母細胞和從其中製備重組多肽的方法公開在例如Kawassaki，美國專利4，599，311;Kawasaki等，美國專利4，931，373;Brake,美國專利4，870，008;Welch等，美國專利5，037，743;和Murray等，美國專利4,845,075。通過選擇標記所確定的表型，通常是藥物抗性或在缺少特定養分(例如亮氨酸)時的生長能力，選擇轉化細胞。用於釀酒酵母的優選載體系統是Kawasaki等(美國專利4，931，373)公開的POTI載體系統，該系統允許通過在含有葡萄糖的培養基中的生長選擇轉化細胞。用於酵母的適宜啟動子和終止子包括來自糖酵解酶基因(見例如Kawasaki,美國專利4,599,311;Kingsman等，美國專利4,615,974;和Bitter,美國專利4，977，092)和醇脫氫酶的那些。也參見美國專利4,990,446;5，063;154;53139,936和4,661,454。用於其它酵母，包括多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、Schizosaccharomycespombe、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyvero邁ycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago邁aydis)、巴斯德畢赤酵母、Pichiamethanolica、季也蒙氏畢赤酵母(Pichiaguillermondii)和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的轉化系統也是本領域已知的。見例如Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132:3459—3465，1986;Cregg,美國專利4,882,279;和Raymond等，Yeast14，11-23，1998。可以根據McKnight等，美國專利4,935,349的方法使用麴黴屬細胞。轉化Acremoniumchrysogenum的方法公開在Sumino等，美國專利5,126,228。轉化鏈孢黴的方法公開在Lambowitz，美國專利4,486,533。在Pichiamethanolica中製備重組蛋白公開在美國專利5，716，808、5，736，383、5，854，039和5，888，768。原核宿主細胞，包括細菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和其它屬的菌抹，也是本發明中有用的宿主細胞。轉化這些宿主和表達克隆在其中的外源DNA序列的技術是本領域熟知的(見例如Sambrook等，同上)。當在細菌如大腸桿菌中表達zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽時，可以將多肽保留在細胞質中，典型地以不溶性顆粒的形式，或可以通過細菌分泌序列將其引導至周質間隙。在前面的情況下，裂解細胞，回收該顆粒並使用例如異硫氰酸胍或尿素進行變性。之後通過稀釋該變性劑，例如通過對尿素溶液和還原及氧化穀胱甘肽的組合進行透析，隨後對緩衝鹽溶液進行透析，使該變性的多肽重摺疊並二聚化。在後一情況下，可以從周質間隙中以可溶性功能形式回收該多肽，方式是破碎細胞(通過如超聲或滲壓震擾)釋放周質間隙內容物並回收該蛋白質，這由此省去變性和重摺疊的需要。成分的培養基中培養轉化的或轉染的宿主細胞。多種適宜的培養基，包括已知成分培養基和複雜培養基，是本領域已知的，一般包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素和礦物質。如果需要，培養基還可以含有諸如生長因子或血清這樣的成分。生長培養基一般通過例如藥物篩選或缺少可由表達載體攜帶的或共轉染至宿主細胞中的選擇標記補充的必需養分來選擇含有外源添加DNA的細胞。通過常規方式，如振搖小三角瓶或發酵罐噴氣給液體培養物提供充足的空氣。優選純化本發明多肽和蛋白質達到>80%純度，更優選>90%純度，甚至更優選>95%純度，尤其優選藥物純狀態，即相對於汙染的大分子，尤其是其它蛋白質和核酸而言大於99.9%的純度，而且不含感染劑和致熱劑。優選地，純化的多肽或蛋白質基本上不含有其它多肽或蛋白質，尤其是動物來源的那些。可以通過常規蛋白質純化方法，典型地通過層析技術的組合，純化表達的重組zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(包括嵌合多肽和多體蛋白)。一般參見親和層析原則和方法(AffinityChromatography:Principles&Methods)，PharmaciaLKBBiotechnology,Uppsala,瑞典，1988;和Scopes,蛋白質純化原貝'J和實踐(ProteinPurification:PrinciplesandPractice),Springer-Verlag，紐約，1994。包含多聚組氨酸親和標籤(典型地約6個組氨酸殘基)的蛋白質可以通過在鎳螯合樹脂上親和層析進行純化。見例如Houchuli等，Bio/Technol.6:1321-1325，1988。包含glu-glu標籤的蛋白質可以根據常規方法通過免疫親和層析純化。見例如Grussenmeyer等，同上。麥芽糖結合蛋白融合物根據本領域已知的方法在直鏈澱粉柱上純化。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽還可以根據本領域已知的方法通過化學合成製備，包括完全固相合成、部分固相合成方法、片斷縮合或經典的溶液合成。見例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149，1963;Stewart等，SolidPhasePeptideSynthesis(第2版)，PierceChemicalCo.，Rockford，IL，1984;B，r和Rapp，Chem.Pept.Prot.3:3，1986;和Atherton等，SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,1989。體外合成對於製備較小的多肽是尤其有利的。使用本領域已知方法，可以製備單體或多體；糖基化或未糖基化；PEG化(pegylated)或未PEG化(議-pegylated)形式的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質，這些蛋白質可以包括或可以不包括起始甲錄u氨酸殘基。用於zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性分析的耙細胞包括，但不限於，血管細胞(尤其是內皮細胞和平滑肌細胞)、造血(髓樣和淋巴樣)細胞、肝臟細胞(包括肝細胞、有窗內皮細胞、枯否氏細胞和Ito細胞)、成纖維細胞(包括人皮膚成纖維細胞和肺成纖維細胞)、胎肺細胞、關節滑膜細胞、周細胞、軟骨細胞、成骨細胞和前列腺上皮細胞。內皮細胞和造血細胞來源於共同的祖先細胞，即成血管細胞(h醒ngioblast)(Choi等，Development125:725-732，1998)。本發明的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質可以通過其活性，即調節應答細胞類型的增殖、分化、遷移、粘著或代謝，進行表徵。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質的生物學活性可以使用設計以檢測細胞增殖、分化、遷移或粘外或體內試驗來測試。許多適宜的試驗是本領域已知的，本文中公開了代表性試驗。對於篩選，例如對於確定胺基酸替代、缺失或插入的效果，使用培養細胞進行的試驗是最方便的。然而，筌於發育過程(例如血管發生、傷口癒合)的複雜性，一般使用體內試驗驗證和進一步表徵生物學活性。某些體外模型，例如P印per等的三維膠原凝膠基質模型(Biochem.Biophys.Res.Comm.189:824—831，1992)足夠複雜以致可測試組織學效果。可以使用外源產生的蛋白質進行試驗，或可以使用表達目的多肽的細胞在體外或體內進行試驗。可以使用單獨的或與其它生長因子(例如VEGF家族成員)或造血細胞因子(如EPO、TPO、G-CSF、幹細胞因子)結合的zcyto20蛋白質進行試驗。代表性的試驗公開如下。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的活性可以使用培養細胞體外測量，或通過將本發明分子施用於適當的動物模45型來體內測量。測量細胞增殖或分化的試驗是本領域熟知的。例如，測量增殖的試驗包括例如對中性紅染料的化學敏感性(Cavanaugh等，InvestigationalNewDrugs8:347-354，1990)、在增殖細胞的腿中摻入放射性標記的核苷酸(公開在例如Rains和Ross,MethodsEnzymol.109:749-773，1985;Wahl等，Mol.CellBiol.8:5016-5025，1988;和Cook等，AnalyticalBiochem.179:1-7,1989)、在增殖細胞的腿中摻入5_溴-2，-脫氧尿苷(BrdU)(Porstmann等，J.Immunol.Methods82:169-179，1985)、和使用四氮唑鹽(Mosmann，J.Immunol.Methods65:55-63，1983;Alley等，CancerRes.48:589-601,1988;Marshall等，GrowthReg.5:69-84，1995;和Scudiero等，C塞erRes.48:4872-4833，1988)。分化可以使用能被誘導分化出更成熟表型的適宜前體細胞來測試。測量分化的試驗包括例如測量與組織的階段特異性表達有關的細胞表面標記、酶活性、功能活性或形態學改變(Watt，FASEB，5:281-284，1991;Francis,Differentiation57:63-75，1994;Res，Adv.Anim.CellBiol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989;所有文獻均併入本文作為參考)。還可以使用設計以檢效'Jzcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24驗來檢測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性。優選的該類試驗包括確定肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子a(TGFa)、白細胞介素-6(IL-6)、VEGF、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、血管生成素和肝臟產生的其它大分子是否存在的那些試驗。適宜的試驗包括使用應答目的大分子的靶細胞進行的有絲分裂試驗、受體結合試驗、竟爭結合試驗、免疫學試驗(例如ELISA)和本領域已知的其它形式。可以從經處理的原代人皮膚成纖維細胞、滑膜細胞和軟骨細胞測量金屬蛋白酶分泌。響應在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質存在下培養而產生的膠原酶、明膠酶和基質溶解酶(stromalysin)的相對水平可以使用酶譜凝膠(Loita和Stetler-Ste薦son，CancerBiology1:96-106，1990)測量。皮膚成纖維細胞和軟骨細胞應答測試蛋白質而進行的原膠原/膠原合成可以使用3H-脯氨酸在新生的分泌膠原中的摻入來測量。3H-標記的膠原可以通過SDS-PAGE之後放射自顯影進行觀察(Unemori和Amento，J.Biol.Chem.265:10681-10685，1990)。從皮膚成纖維細胞和軟骨細胞分泌的糖胺聚糖(GAG)可以使用1,9-二甲基亞甲藍染料結合試驗(Farndale等，Biochem.Biophys.Acta883:173-177，1986)測量。膠原和GAG試驗還可以在存在IL-la或TGF-a時進行以檢測zcyto20蛋白質修飾針對這些細胞因子建立的應答的能力。包含zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的蛋白質家族的某些成員已被證實可以增加體內循環的單核細胞數量。活化單核細胞對於天然免疫和獲得性免疫均是重要的。例如，已證實單核細胞的活化可以通過幾種機制刺激抗原呈遞。抗原呈遞則促進T細胞(細胞毒性和輔助T細胞)的活化和增殖。樹突細胞的成熟和活化也促進T細胞的激活和天然及獲得性免疫。而且已證實活化的單核細胞和巨噬細胞的增加可以增加細胞裂解活性。因此，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用作抗感染劑，以增強天然的、細胞介導的和體液免疫應答。在CD14+單核細胞中觀察到ICAM染色增強，提示zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在單核細胞的活化中有重要作用。儘管數據顯示該家族成員可以促進對病毒的抗病毒應答，但也可以影響細菌和寄生蟲。可進行單核細胞活化試驗以(1)探測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質進一步刺激單核細胞激活的能力，和(2)檢測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質調節由附著誘導的或由外毒素誘導的單核細胞活化的能力(Fuhlbrigge等，J.Immunol.138:3799-3802，1987)。響應活化產生的IL-la和TNFa的水平可以通過ELISA(Biosource，Inc.Camarillo，CA)測量。單核細胞/巨噬細胞藉助CD14(LPS受體)對外毒素極為靈敏，具有適當水平的外毒素樣活性的蛋白質可以活化這些細胞。單核細胞水平的增加提示，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以對骨髓中的髓樣祖先細胞直接產生作用。髓樣祖先細胞向單核細胞分化的增加是例如化療後恢復免疫能力所必需的。因此，給接受化療的患者施用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以促進患者的恢復和提高他們抵抗通常與化療相關的感染的能力。因此，本發明提供通過如下方式擴增單核細胞或單核細胞祖先細胞的數量的方法用本發明分子培養骨髓或外周血細胞以便體外或離體地實現單核細胞或單核細胞祖先細胞數量的增加。本發明還提供了給需要增加單核細胞或單核細胞祖先細胞的哺乳動物體內施用本發明分子的方法。單核細胞和單核細胞祖先細胞的增加可以使用臨床醫師、醫師和本領域其它技術人員熟知的方法測量。單核細胞屬於髓樣造血細胞譜系，因此對該譜系中的其它細胞的影響並不是不尋常的。例如，當一種因子利於髓樣或淋巴樣譜系中的一類細胞的分化或增殖時，這也可以影響具有共同的祖先細胞或幹細胞的其它細胞的產生。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質的造血活性可以在培養的多種造血細胞上進行測試。優選的測試方法包括原代骨髓集落分析和晚期譜系限制性集落分析，它們是本領域已知的(例如Holly等，WIPO公開文本W095/21920)。將接種在適宜半固體培養基(例如含有15%胎牛血清、10%牛血清白蛋白和0.6%PSN抗生素混合物的50%甲基纖維素)上的髓細胞在存在測試多肽的情況下培養，然後顯微鏡檢測集落形成。已知的造血因子用作對照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽對造血細胞系的促有絲分裂活性可以按以上公開測量。細胞遷移基本上按Kahler等(Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology17:932-939,1997)/>開的方法測定。如果一個蛋白質誘導細胞從低蛋白濃度的區域向高蛋白濃度的區域遷移，則該蛋白被認為具有趨化性。典型的試驗使用修飾的Boyden室(用聚笨乙烯膜分開兩室)(Transwell;CorningCostarCorp.)進行。將稀釋在含有1%BSA的培養基中的測試樣品加入含Transwell的24孔板的下部室中。然後，將細胞放在預先用0.2%明膠處理的Transwell插入物上。37i:孵育4小時後測量細胞遷移。除去Transwell膜頂部的非遷移細胞，並固定附著在膜下表面上的細胞，用O.1%結晶紫染色。然後用10%乙酸提取染色的細胞，並於600nm測量吸光度。然後從標準標定曲線計算遷移。還可以使用Grant等("血管發生是上皮-間充質相互作用的一個成分"，Goldberg和Rosen,Epithelial—MesenchymalInteractioninCancer,BirkhauserVerlag，1995，235-248;Baatout，AnticancerResearch17:451-4561997)的matrigel方法測量細胞遷移。細胞祐著活性基本上按照LaFleur等(J.Biol.Chem.272:32798-32803，1997)公開的方法測定。筒而言之，用測試蛋白質包被微量滴定板，用BSA封閉非特異位點，並以大約104-105個細胞/孔的密度接種細胞(如平滑肌細胞、白細胞或內皮細胞)。在37。C孵育這些孔(典型地大約60分鐘)，然後通過溫和洗滌除去未貼壁的細胞。通過常規方法(例如用結晶紫染色、裂解細胞並測定裂解物的光密度)定量貼壁細胞的數量。對照孔用已知的粘著蛋白，如纖連蛋白或玻連蛋白包被。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質的活性可以用珪基生物傳感顯微生理計(microphysiometer)(其測量與受體結合及隨後的細胞生理反應有關的細胞外酸化速率或質子排出)測量。此類裝置的一個例子是MolecularDevices(Sunnyvale,CA)製造的Cytosensor顯微生理計。多種細胞應答，如細胞增殖、離子運輸、能量產生、炎症應答、調節和受體激活等均可以通過此方法測量。見，例如，McCo騰ll等，Science257:1906-1912，1992;Pitchford等，Meth.Enzymol.228:84-108，1997;Arimilli等，J.Immunol.Meth.212:49-59，1998;和VanLiefde等，Eur.J\Pharmacol.346:87-95，1998。顯微生理計可以用於分析粘著或非粘著真核細胞或原核細胞。通過測量細胞培養基中細胞外酸化隨時間推移的改變，顯微生49理i十可以直接測量出細胞對多種刺激(包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白、它們的激動劑和拮抗劑)的應答。優選使用顯微生理計測量相對於不應答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的對照真核細胞，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應答性真核細胞的反應。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應答性真核細胞包括通過轉染Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體而產生的應答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細胞、以及天然應答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細胞。通過細胞外酸化的改變(如增加或減少)測量到的暴露於Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細胞與對照(未暴露於Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)在反應方面的差異，是對Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25調節的細胞應答的直接測量。而且，由Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25調節的此類應答還可以在多種刺激物下進行測定。因此，本發明提供養定Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的激動劑和拮抗劑的方法，包括提供應答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的細胞，將這些細胞的第一部分在無測試化合物時進行培養，將這些細胞的第二部分在有測試化合物時進行培養，和檢測第二部分細胞相對於第一部分細胞在細胞應答方面的改變，如增加或減少。細胞應答的改變表現為可測量的細胞外酸化速率的改變。將上述細胞的第三部分在有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白但無測試化合物的情況下進行培養，這為Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應答性細胞提供了陽性對照,並為比較測試化合物的激動劑活性與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的活性提供了對照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗劑可以通過使細胞在有和無觀〗試化合物的情況下暴露於Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白進行鑑定，籍此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激活性的降低指示測試化合物具有拮抗劑活性。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核普酸在動物中的表達為進一步研究體內過量產生或抑制蛋白質的生物學效應提供了模型。可以使用病毒載體或棵DNA將Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼多核苷酸和反義多核苷酸引入測試動物，如小鼠中，或可以製備轉基因動物。測試本發明蛋白質的一個體內方法利用了病毒遞送系統。用於此目的的實例病毒包括腺病毒、皰瘮病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒和腺相關病毒(AAV)。腺病毒，一種雙鏈DNA病毒，是目前研究得最好的遞送異源核酸的基因轉移載體。綜述見Becker等，Meth.CellBiol.43:161-89，1994;和Douglas和Curiel，Science&Medicine4:44-531997。腺病毒系統有幾個優點。腺病毒可以(i)容納相當大的插入DNA;(ii)生長至高滴度；(iii)感染廣譜的哺乳動物細胞類型；和(iv)與許多不同的啟動子，包括遍在的、組織特異性的和可調節的啟動子一起使用。由於腺病毒在血流中是穩定的，故它們可以通過靜脈注射給藥。通過缺失部分腺病毒基因組，可以容納更大的異源DNA插入片斷(多達7kb)。可以通過直接連接或通過和共轉染的質粒同源重組，將這些插入片斷整合在病毒DNA中。在一個示例性系統中，從病毒載體中缺失必需的El基因，這樣除非宿主細胞(如人293細胞系)提供El基因，否則該病毒將不能複製。當通過靜脈內方式施用給完整動物時，腺病毒主要把向肝。如果腺病毒遞送系統具有E1基因缺失，則該病毒不能在宿主細胞中複製。然而，宿主組織(例如肝)將表達和加工(並且，如果存在信號序列，分泌)該異源蛋白質。分泌的蛋白質將在高度血管化的肝中進入循環系統，並可以測定它對感染動物的作用。基因遞送的另一備選方法包括採取機體的細胞並以棵DNA質粒的形式將載體引入該細胞中。然後將轉化的細胞重新植入機體。將棵DNA載體引入宿主細胞的方法是本領域已知的，包括轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、使用基因槍或使用DNA載體轉運者。見，Wu等，J.Biol.Chem.263:14621-14624，1988Wu等，J.Biol.Chem.267:963-967，1992;和Johnston和Tang,Meth.CellBiol.43:353_365,1994。還可以製備(Lowell等，Nature366:740--742，1993)經工程化表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因的轉基因小鼠、和表現出完全缺失Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因功能的小鼠，後者被稱作效除小鼠(knockoutmice)"(Snouwaert等，Science257:1083，1992)。可以利用這些小鼠在體內系統中研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因和由此編碼的蛋白質。轉基因小鼠對於研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白在早期發育中的作用尤其有用，因斷。也參見Maiso叩ierre等，Science277:55-60，1997和Hanahan，Science277:48-50，1997。轉基因表達的優選啟動子包括來自金屬硫蛋白和白蛋白基因的啟動子。對肌肉收縮的正常抑制性控制的喪失與選擇的分泌Y氨基丁酸的神經元的損傷或紊亂有關。例如，僵人症候群表現出顯著的肌肉系統僵硬，這被i^為是通過幹擾產生y氨基丁酸(gaba)的神經元的功能來介導的。其它相關的神經肌肉疾病包括肌強直、代謝性肌病、艾薩克症候群、肌張力障礙和強直性痙攣(Valldeoriola，J.Neurol.246:423-431，1999)。類似地，可以在經歷腫瘤進展的組織或細胞中對Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、或它們在組織中的表達喪失進行直接測量。與正常組織相比，癌前或癌性情況下細胞侵入性和運動性的增加、或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表達的獲得或喪失可以用於診斷腫瘤進程中的轉化、侵入和轉移。就這一點而論，有關肺瘤進展或轉移階段的信息將幫助醫師針對給定的獨特癌症患者選擇最適當的治療或治療侵襲性。用於測量(mRNA或蛋白質的)表達獲得和喪失的方法是本領域熟知的並描述在本文中，可以將它們應用於Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表達。例如，可以使用調節細胞運動性的多肽的出現或消失來幫助診斷前歹'J腺癌和進4亍預後(Banyard，J.和Zetter,B.R.，CancerandMetast.Rev.17:449-458，1999)。作為細胞運動性的效應子或作為肝特異性標誌，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表達獲得或喪失可以用於診斷腦癌和其它癌症。而且，類似於前列腺特異性抗原(PSA)，相對於正常對照，患者中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣的水平增加或抗zcyto20、抗zcyto21、抗zcyto22、抗zcyto24和抗zcyto25抗體可以指示腦癌和其它癌症(見例如Mulders,TMT等，Eur.J.SurgicalOncol.16:37-41，1990)。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在正常發現不表達這些多核苷酸的組織中的強表達可以用於診斷細胞或組織類型中的異常、癌性肝組織向非肝組織的侵入或轉移，並可以幫助醫師指導進一步的測試或研究或幫助醫師指導治療。此夕卜，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核*酸探針、抗Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗體、及對組織中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25存在的檢測也可以用於評價是否存在正常表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的腦或其它組織，例如，在涉及切除患病的或癌性肝或神經組織的手術後進行評價。在這點上，本發明的多核普酸、多肽和抗體可以用於幫助確定手術後(例如，腦和其它癌的手術後)是否所有的組織都被切除。在這些情況中，尤其重要的是除去所有潛在的患病組織以便在癌症後實現最大的恢復和最小的復發。優選的實施方案包括可以組織學或原位使用的螢光的、放射性標記的或量熱方式標記的抗zcyto20抗體和Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多狀結合夥伴。而且，可以體內測量Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性和對腫瘤進展及轉移的影響。幾個同基因小鼠模型已被開發用於研究多肽、化合物或其它治療對腫瘤進展的影響。在這些胞植入與腫瘤供體相同品系的小鼠中。細胞將在受體小鼠中發育成具有相似特徵的腫瘤，而且在某些模型中會發生轉移。對於我們的研究，適當的腫瘤模型包括尤其是Lewis肺癌(ATCCNo.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCCNo.CRL-6323)。這兩個均是常用的腫瘤系，與C57BL6小鼠同基因，易於在體外培養和操作。由植入其中任一個細胞系引起的腫瘤能夠在C57BL6小鼠中向肺轉移。Lewis肺癌模型近來被用於小鼠中鑑定血管生成抑制劑(O'ReillyMS等，Cell79:315-328，1994)。通過每日注射重組蛋白、激動劑或拮抗劑或一次性注射重組腺病毒用試驗劑處理C57BL6/J小鼠。此處理後3天，將105至106個細胞移植在背部皮膚之下。或者，可以在移植前用重組腺病毒(例如表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的重組腺病毒)感染細胞本身，以便在腫瘤位置或在細胞內而不是在全身合成該蛋白質。該小鼠正常在5日內長出可見的腫瘤。允許該肺瘤生長多達3個星期，在此期間它們在對照處理組中可以達到1500-1800mi^大小。在整個實驗過程中仔細監測胂瘤的尺寸和體重。處死時，與肺和肝一起取出胂瘤並稱重。肺重顯示出與轉移的胂瘤負荷十分相關。作為另一種測量方法，計數肺表面轉移瘤。使用本領域已知的和本文中描述的方法處理切下的肺瘤、肺和肝以便進行組織病理學檢查、免疫組織化學分析和原位雜交。由此可以評價表達的目的多肽，例如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25對腫瘤募集血管系統和進行轉移的能力的影響。此外，除了使用腺病毒夕卜，還可以用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25瞬時轉染植入的細胞。應用穩定的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25轉染子以及應用誘導型啟動子體內激活Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表達是本領域已知的，而且可以將它們用於該系統中以評價zcyto20對轉移的誘導。而且，可以直接將純化的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養基注射至該小鼠模型中，並由此用於該系統。一般地參見，O'ReillyMS等，Cell79:315-328，1994;和RuscianoD等，肝轉移的鼠模型，InvasionMetastasis14:349—361，1995。可以使用反義方法學抑制zcyto20基因轉錄以檢測該抑制的體內效應。設計與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼多核苷酸(例如SEQIDN0:1中所示多核苷酸)的區段互補的多核苷酸，以便其與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼mRNA結合併抑制該mRNA翻譯。這些反義寡核苷酸還可以用於細胞培養物中抑制Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的編碼基因的表達。大多數細胞因子以及活化淋巴細胞產生的其它蛋白質對於整個身體的細胞分化、激活、募集和細胞穩態有重要的生物學作用。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及其活性的抑制劑預期具有多種治療用途。這些治療用途包括治療需要免疫調節的疾病，包括自身免疫病如類風溼性關節炎、多發性硬化、重症肌無力、系統性紅斑狼痴和糖尿病。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25對於炎症調節可能是重要的，因此可以用於治療類風溼性關節炎、哮喘和敗血症。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可能在介導胂瘤發生中有作用，由此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25拮抗劑可以用於治療癌症。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用於調節免疫系統，由此，可以使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗劑降低移植排斥、預防移植物抗宿主疾病、增強對感染性疾病的免疫、治療無免疫應答的患者(例如HIW患者)或改善疫苗。本發明蛋白質家族的成員已證實具有與幹擾素a相似的抗病毒作用。在美國，幹擾素已被批准用於治療自身免疫病、尖銳溼疣、慢性C型肝炎、膀胱癌、宮頸癌、喉乳頭狀瘤病、蕈樣肉芽肺病、慢性B型肝炎、感染人免疫缺陷病毒的患者中的卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、毛細胞白血病和多發性硬化。此外，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通過抑制細胞增殖用於治療各種形式的動脈硬化，如動脈粥樣硬化。因此，本發明考慮具有zcyto20活性的蛋白質、多肽和肽在治療這些疾病以及治療視網膜病中的用途。本發明還考慮具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白質、多肽和肽在治療淋巴增生性疾病(包括B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性髓細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病)中的用途。千擾素還被證實可以誘導培養細胞表達抗原(見例如，Auth等，H印atology18:546(1993)，Guadagni等，Int.J.Biol.Markers9:53(1994)，Girolomoni等，Eur.J.Immunol.25:2163(1995)，和Maciejewski等，Blood85:3183(1995))。此活性增強了體外筌定新胂瘤相關抗原的能力。而且，幹擾素提高人腫瘤抗原的表達水平的能力說明幹擾素能夠作為佐劑用於免疫治療中或增強使用抗腫瘤抗原抗體進行的免疫閃爍照相術(immunoscintigmphy)(Guadagni等，CancerImmunol.Immunother.26:222(1988);Guadagni等，Int.J.Biol.Markers9:53(1994))。因此，本發明包括具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白質、多肽和肽作為佐劑用於免疫治療或用於改善使用抗腫瘤抗原抗體進行的免疫閃爍照相術的用途。檢測和診斷病毒感染的方法是本領域技術人員熟知的。用於測量響應本發明分子的施用引起的病毒下降的確切方法將取決於患者、病毒感染類型等。例如，方法包括，但不限於，測量CD4細胞數量的改變、血清學試驗、通過常規實時定量聚合酶鏈式反應試驗測量病毒DNA和病毒RNA、病毒誘導的抗體水平、免疫螢光和酶聯免疫吸附試驗、致細胞病毒效應和組織學。而且，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以結合CD4或另外的白細胞受體，並表現出抗病毒作用，例如抗人免疫缺陷病毒(HIV)或人T細胞嗜淋巴細胞病毒(HumanT-celllymphotropicvirus,HTLV)。或者，zcyto20多肽可以和病毒竟爭病毒受體或共同受體56以阻斷病毒感染。Zcyto20可以胃腸外給藥以預防病毒感染或降低正在進行的病毒複製和再感染(Gayowski，T.等，Transplantation64:422-4261997)。因此，zcyto20可以用作抗病毒治療劑，例如治療病毒性白血病(HTLV)、AIDS(HIV)，或由如輪狀病毒、杯狀病毒(例如，NorwalkAgent)和某些致病性腺病毒抹引起的胃腸道病毒感染、B型肝炎和C型肝炎。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25還可以用於治療心肌炎，一種當心臟涉及炎症過程時引起的疾病。淋巴細胞浸潤和肌細胞裂解被認為是病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染後的結果(見例如，Brodison等，J.Infection37:99(1998))。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通過靜脈內或皮下途徑注射以治療與心肌炎有關的感染。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25還可以通過靜脈內途徑作為免疫調節性細胞因子給藥以治療自身免疫性心肌炎。幹擾素的劑量可以使用A/J小鼠心肌炎自身免疫模型來推斷(Do畫eyer等，J.Exp.Med.182:1291(1995))。給綿羊外源性施用幹擾素t可以增加妊娠率(Aggarwal，HumanCytokinesIII，(BlackwellScience1997))。正如本文所述，zcyto20mRNA在胎盤中表達。因此，本發明包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25，如本文公開的人Zcyto20、zcyto21和zcyto22，在促進和保護胎兒生長方面的用途。作為舉例說明，可以使用Zcyto20、zcyto21和zcyto22保護髮育的胎兒免受病毒(例如人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒等)感染。此夕卜，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用於促進體夕卜受精。近來的報導提示，I型幹擾素可以在病毒感染早期通過在胰腺p細胞中誘導強抗病毒狀態起到預防病毒誘導的糖尿病的作用(Flodstroem等，NatureImmunology3,373-382(2002))。這可以防止由於病毒誘導的細胞死亡以及伴隨發生的自身免疫引起的p細胞喪失。Zcyto20、21和22還可以在,表達它們的受體zcytorl9的細胞中誘導抗病毒狀態。Zcytorl9在胰腺組織中高表達，因此，zcyto20-22可以起到預防因P細胞死亡引起的病毒誘導性糖尿病的作用。此外，還可以將I型幹擾素在預防病毒誘導性糖尿病中的作用擴展至其它病毒誘導的自身免疫疾病，因此，zcyto20-22也可能起到預防其它疾病(如肌硬化(muscularsclerosis)、狼掩和在表達zcyto20-22受體zcytorl9的組織中病毒誘導的自身免疫病)的作用。I型幹擾素的慢性系統性表達還與I型糖尿病的病理有關。由於I型幹擾素和zcyto20-22在生物學活性和基因誘導方面的相似性，zyto20、21或22的慢性系統性表達也可能在I型糖尿病的病理中有作用。因此，zcyto20-22活性的抑制劑在胰腺中可能對於預防I型糖尿病是有益的。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽可以單獨或聯合其它脈管生成劑或血管生成劑(包括VEGF)—起給藥。當與其它藥劑聯合使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25時，對於所治療的具體疾病，可以適當地同時或相繼施用這兩種化合物。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25對於治療肺瘤發生是有用的，因此可以用於治療癌症。zcyto20可以抑制抗IgM剌激的正常B細胞，在B細胞腫瘤系中觀察到類似效果，這提示使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治療患者以資導B細胞肺瘤細胞進入增殖較不活躍的狀態可以具有治療益處。可以將該配體和其它已應用的藥劑(包括常規化療藥劑以及免疫調節劑如幹擾物疾病模型，而且對於B細胞胂瘤來源的細胞系，幹擾素a和zcyto20的生長抑制作用可以相加。本發明提供降低贅生性B或T細胞增殖的方法，包括給具有B或T細胞贅生物的哺乳動物施用給藥量足以降低贅生性B或T細胞增殖的zcyto20組合物。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以剌激來自骨髓祖先細胞的裂解性NK細胞並在抗原受體活化後刺激T細胞增殖，這將增強對接受同種異型骨髓移植的患者的治療，因此，在輸注或不輸注供體淋巴細胞的情況下，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25均可以增強抗肺瘤應答的產生。另一方面，本發明提供降低贅生性B或T細胞增殖的方法，包括給具有B或T細胞贅生物的哺乳動物施用給藥量足以降低贅生性B或T細胞增殖的zcyto20拮抗劑組合物。而且，該zcyto20拮抗劑可以是配體/毒素融合蛋白。可以使用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與皂草素的融合毒素對抗一組類似的白血病和淋巴瘤，從而擴大了可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治療的白血病範圍。融合毒素介導的zcyto20受體激活為抑制靶細胞生長提供了兩個獨立方式，第一個方式與單獨使用配體時觀察到的效應一樣，而第二個方式是由於通過受體內化遞送毒素。對於藥物應用，可以根據常規方法對zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質進行配製以便局部或胃腸外，尤其是靜脈內或皮下給藥。一般，藥物製劑包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和可藥用載體，如鹽水、緩沖鹽水、5%葡聚糖水溶液等。製劑還可以包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、防止蛋白質丟失在瓶表面上的白蛋白等。配製方法是本領域熟知的,公開在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro編，MackPublishingCo.，Eastern,PA，第19版，1995。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25優選以大約10至lOOjig/ml總體積的濃度使用，但也可以使用lng/ml至lOOOpg/ml的濃度。對於局部使用，例如為了促進傷口癒合，可以按0.l-10jig/cm2傷口面積使用該蛋白質，確切的劑量由臨床醫師根據接受的標準，考慮待治療疾病的性質和嚴重性、患者的特性等來確定。劑量的確定屬於本領域普通技術人員的水平。可以在治療期間每日或間歇地給藥。可以在一至幾個小時的典型時間期限內通過快速注射或灌注進行靜脈給藥。還可以使用緩釋製劑。一般，zcyto20的治療有效量是指足以造成所治療疾病出現臨床上顯著改變(例如造血或免疫功能方面的臨床顯著改變、發病率的顯著降低或組織學評分的顯著增加)的量。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質、激動劑和拮抗劑可以用於調節應答性細胞類型的擴增、增殖、激活、分化、遷移或代謝，這些細胞類型包括原代細胞和培養的細胞系。在這方面尤其有意義的是造血細胞、間充質細胞(包括幹細胞和成熟髓樣細胞和淋巴樣細胞)、內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、肝細胞、神經細胞和胚胎幹細胞。將zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽加入這些細胞類型的組織培養基中，濃度為約10pg/ml至約100ng/ml。本領域技術人員將明了，可以在培養基中有利地聯合使用zcyto20蛋白質和其它生長因子。在實驗室研究領域，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白還可以用作分子量標準或在測定該蛋白質的循環水平的分析中用作試劑，如用於診斷以過量或低量產生zcyto20蛋白質為特徵的疾病或分析細胞表型。還可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質筌定它們活性的抑制劑。將測試化合物加入上述試驗中以鑑定抑制zcyto20蛋白質活性的化合物。除了上述試驗外，還可以在多種設計用來測量受體結合或zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25依賴性細胞應答的刺激/抑制的試驗中測試樣品對zcyto20活性的抑制。例如，可以用響應zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25所刺激的細JJ包途徑的才艮道基因結構轉染zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應答性細胞系。該類報導基因結構是本領域已知的，一般包括可操作地與編碼可檢測蛋白質(如螢光素酶)的基因連接的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25激活的血清效應元件(SRE)。在靶細胞上測試候選化合物、溶液、混合物或提取物抑制zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的能力，這可以通過zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激的報導基因表達的減少來證實。此類試驗可以檢測直接阻斷zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與細胞表面受體結合的化合物以及阻斷髮生在受體-配體結合後的細胞途徑中的過程的化合物。在備選方法中，可以使用連接有可檢測標記(例如"51、生物素、辣根過氧化物酶、FITC等)的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25,測試直接阻斷zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與受體結合的化合物或其它樣品。在此類試驗中，測試樣品抑制標記的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與受體結合的能力指示了抑制活性，這可以通過別的試驗進行驗證。用於結合試驗中的受體可以是細胞受體或分離的固定化受體。本文中，術語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、其抗原結合片斷如F(ab，)2和Fab片斷、單鏈抗體等，其中包括遺傳工程化抗體。非人抗體可以通過在人構架和恆定區上嫁接非人CDR、或通過整合完整的非人可變區(任選地通過替換暴露的殘基用人樣表面踅蔽"它們，其結果是嘴飾"抗體)實現人源化。在一些情況中，人源化抗體可以在人可變區構架域中保留非人殘基以增加正確的結合特徵。通過使抗體人源化可以增加生物學半衰期，並減少在施用於人後出現不良免疫Ig亞型)製備人源化抗體以促進或抑制與特定抗體恆定區有關的不同免疫功能。如果抗體與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽或蛋白質的結合親和力比抗體與對照(非Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)多欣或蛋白質的結合親和力高至少10倍，則該抗體被定義為發生特異結合。本領域普通技術人員可以容易地測定單克隆抗體的親和力(見，例如Scatchard，Ann.NYAcad.Sci.51:660-627,1949)。製備單克隆和多克隆抗體的方法是本領域熟知的(見例如HurrellJ.G.R.編,MonoclonalHybridomaAntibodies:TechniquesandApplications,CRCPress,Inc.，BocaRaton，FL，1982，併入本文作為參考)。尤其有意義的是製備針對親水性抗原性位點的抗體，所述抗原性位點包括例如SEQIDN0:2第169(Glu)至174(Glu)位胺基酸殘基，SEQIDNO:2第54(Lys)至59(Ala)位胺基酸殘基，SEQIDNO:2第53(Phe)至58(Asp)位胺基酸殘基，SEQIDN0:2第168(Gln)至173(Lys)位胺基酸殘基，及SEQIDN0:2第154(Pro)至159(Arg)位胺基酸殘基。例如，zcyto22中，親水區域包括SEQIDNO:7第169(Glu)至174(Glu)位胺基酸殘基，SEQIDNO:7第54(Lys)至59(Ala)位胺基酸殘基、SEQIDNO:7第53(Phe)至58(Asp)位胺基酸殘基，SEQIDNO:7第168(Gin)至173(Lys)位胺基酸殘基，及SEQIDNO:7第154(Pro)至159(Arg)位胺基酸殘基，它們將是有用的。本領域普通技術人員將明了，多克隆抗體可以從多種溫血動物如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠製備。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的免疫原性可以通過使用佐劑如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑來加強。用於免疫的多肽還包括融合多肽，如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肷或其部分與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全長分子或其部分。如果多肽部分是"半抗原樣的"，則該部分可以有利地與大分子載體(如匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風類毒素)結合或連接用於免疫。製備或篩選抗體的備選技術包括體外使淋巴細胞暴露於Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、和在嗜菌體或類似載體中篩選抗體展示文庫(例如通過使用固定化的或標記的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽)。人抗體可以在已經通過工程化而含有人免疫球蛋白基因的轉基因非人動物中製備，見WIPO公開文本W098/24893中的公開。優選通過例如同源重組的方式失活或清除這些動物中的內源性免疫球蛋白基因。本領域技術人員已知的多種試驗均可以用於檢測特異結合Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的抗體。示例性試驗詳細描述在Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow和Lane(編)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988。此類試驗的代表性例子包括並行免疫電泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉澱、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、斑點印跡分析、Western印跡分析、抑制或竟爭試驗和三明治試驗。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗體可以用於親和純化這些蛋白質，在診斷試驗中用於確定這些蛋白質的循環水平；用於檢測或定量作為潛在病理學或疾病的標誌的可溶性Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽.，用於在整體動物或組織切片中免疫定位，包括免疫診斷應用；用於免疫組織化學；和用作拮抗劑以體內和體外阻斷蛋白質活性。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗體還可以用於標記表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細胞；用於親和純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和蛋白質；用於使用FACS的分析方法中；用於篩選表達文庫;和用於製備抗獨特型抗體。可以使用已知方法使抗體和其它化合物，包括治療性和診斷性藥劑連接，以使這些化合物可以耙向表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體的細胞。對於某些應用，包括體外和體內診斷應用，有利的是使用標記的抗體。適宜的直接標籤或標記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光標記、化學發光標記、磁性顆粒等；間接標籤或標記可以類似使用生物素-親和素或其它互補物/反互補物對作為中間體。本發明抗體還可以直接或間接地與藥物、毒素、放射性核素等偶連，而且這些偶連物可以用於體內診斷或治療應用(例如抑制細胞增殖)。一般見R畫krish腿等，CancerRes.56:1324-13301996。本發明多肽和蛋白質可以用於鑑定和分離受體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體可能參與肝臟中的生長調節、血管形成和其它發育過程。例如，可以將Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質和多肽固定在柱子上，然後^f吏膜製品過柱(一般見ImmbolizedAffinityLigandTechniques,Hermanson等編，AcademicPress,SanDiego,CA，1992，第195-202頁)。還可以對蛋白質和多肽進行放射性標記(MethodsEnzymol.第182巻，,白質純化指南"，M.Deutscher編，AcademicPress,SanDiego,1990，721-737)或光親和標記(B進證等，Ann.Rev.Biochem.62:483-514，1993和Fedan等，BiochemPh翻謡l-33:1167-1180，1984)，並可以將其用於標記特異的細胞表面蛋白質。類似地，可以在結合試驗中使用cDNA表達文庫轉染的細胞，利用放射性標記的zcyto20蛋白質和多肽克隆同源受體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣還可以用於教導分析技術，例如質譜、園二色性以確定尤其是四a螺旋的構象，x射線晶體學以在原子細節上確定三維結構，核磁共振光譜分析以揭示蛋白質在溶液中的結構。例如，可以給學生含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的試劑盒用於分析。由於胺基酸序列是教導者已知的，因此可以給予學生該蛋白質作為確定或發展學生技能的試驗，然後教導者將知道學生是否正確地分析了該多肽。由於每個多肽都是獨特的，因此教學利用zcyto20本身將具有獨特性。與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25特異結合的抗體可以用作教學輔助工具以教導學生如何製備親和層析柱以純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25，以及克隆和測序編碼該抗體的多核苷酸並由此作為實踐課用於教導學生如何設計人源化抗體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因、多肽或抗體可以由試劑公司包裝並出售給教學機構以便學生掌握分子生物學領域的技能。由於每個基因和蛋白質都是獨特的，因此在實驗課中每個基因和蛋白質對於學生來說都構成了獨特的挑戰和學習經驗。這些含有ZCYT020基因、多肽或抗體的教學試劑盒被認為屬於本發明範圍。總之，本發明提供與選自下組的多肽具有至少80%或95%或100%—致性的分離的多肽(a)包含SEQIDN0:2第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDN0:7第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDN0:11第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。另一實施方案中，該分離的多肽結合SEQIDNOS:24、27或29所示的單體或同二聚體受體形式的受體或SEQIDNOS:24、27或29與SEQIDNO:41組合的異二聚體受體。在另一方面，本發明包括含有SEQIDN0:2第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示的胺基酸序列的分離多肽。另一方面，本發明包括含有SEQIDN0:7第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基所示的胺基酸序列的分離多肽。另一方面，本發明包括含有SEQIDN0:9第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示或SEQIDN0:9第1位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示的胺基酸序列的分離多肽。另一方面，本發明包括含有SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示或SEQIDNO:11第1位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基所示的胺基酸序列的分離多肽。另一方面，本發明包括具有SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基中或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基中的至少14個連續胺基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答(antigenicresponse)。另一方面，本發明包括具有SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基中或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基至第205位胺基酸殘基中的至少14個連續胺基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。另一方面，本發明包括具有SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基中或SEQIDNO:9第1位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基中的至少14個連續胺基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。另一方面，本發明包括具有SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基中或SEQIDNO:11第1位胺基酸殘基至第202位胺基酸殘基中所示至少14個連續胺基酸的分離多肽，其中所述多肽剌激哺乳動物的抗原性應答。本發明包括在可藥用載體中含有本文所迷多肽的藥物組合物。本發明還包括含有本文所述多肽的融合蛋白。在其它方面，本發明包括編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)含有SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴緊洗滌條件後仍與由SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。另一實施方案中，本發明包括編碼多肽的分離多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)含有SEQIDNO:36的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴緊洗滌條件後仍與由SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補序列組成的多核香酸雜交的多核香酸。另一方面，本發明包括包含SEQIDNO:1第64位核香酸至第618位核普酸所示或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示核普酸序列的分離多核苷酸。在另一實施方案中，本發明包括包含SEQIDNO:6第64位核苷酸至第618位核苷酸所示或SEQIDNO:6第1位核苷酸至第618位核普酸所示的核普酸序列的分離多核苷酸。在另一實施方案中，本發明包括包含SEQIDNO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分離多核苷酸。在另一實施方案中，本發明包括包含SEQIDNO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQIDNO:10第1位核香酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分離多核苷酸。本發明提供包含本文所述分離的核酸分子和轉錄啟動子及轉錄終止子的表達栽體，其中該啟動子與該核酸分子可操作地連接，且該核酸分子與該轉錄終止子可操作地連接。本發明提供包含本文所述表達載體的重組宿主細胞，其中該宿主細胞選自細菌、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞。另一方面，本發明提供製備多肽的方法，包括步驟培養包含本文所述表達載體並產生該多肽的重組宿主細胞。本發明提供特異性地與本文所述多肽結合的抗體或抗體片斷。另一方面，本發明提供擴增單核細胞或單核細胞祖先細胞的方法，包括用包含本文所述多肽的組合物培養骨髓或外周血細胞，其中本文所述多肽的量足以造成骨髓或外周血細胞中單核細胞或單核細胞祖先細胞數量相對於在未施用多肽時培養的骨髓或外周血細胞而言發生增加。本發明還提供刺激暴露於抗原或病原體的哺乳動物的免疫應答的方法，包括(l)測定抗原或病原體特異性抗體的水平；(2)施用在可藥用載體中包含有本文所述多肽的組合物；(3)測定施用後抗原或病原體特異性抗體的水平；(4)比較步驟(1)中的抗體水平和步驟(3)中的抗體水平，其中抗體水平增加指示剌激了免疫應答。其它方面，本發明提供在哺乳動物中產生抗病毒應答的方法，包括給感染病毒的哺乳動物施用用量足以引起病毒減少的本文所述多肽的組合物。由此對本發明作了一般性的描述，而參考如下實施例可以更容易理解本發明，這些實施例以舉例說明的方式提供並不旨在限制本發明。實施例實施例1哺乳動物表達質粒含有編碼Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的多核苷酸的表達質粒可以通過同源重組構建。使用5，和3，末端側翼區相應於包圍zcyto20插入位點的載體序列的SEQIDN0:1多核苷酸序列，67通過PCR分離cDNA片斷，如zcyto20cDNA。引物ZC40923和ZC40927分別顯示在SEQIDNO:12和13中。在1%瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應混合物，並使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)凝膠提取相應於插入片斷大小的條帶。質粒pZMP21是哺乳動物表達載體，其包含具有MPSV啟動子、用於插入編碼序列的多個限制性位點、終止密碼子、大腸桿菌(E.coli)複製起點的表達盒；包含SV40啟動子、增強子和複製起點、DHFR基因及SV40終止子的哺乳動物選擇標記表達單位；和在釀酒酵母(S.cerevisiae)中進行選擇和複製所必需的URA3和CEN-ARS序列。該質粒是使用取自pRS316(保藏在美國典型培養物保藏中心，10801Universityboulevard,M醒ssas，VA20110-2209，保藏號77145)的酵母遺傳元件、來自脊髓灰質炎病毒的內部核糖體進入位點(IRES)元件、和在跨膜域C末端發生截短的CD8細胞外域從pZP9(保藏在美國典型培養物保藏中心，10801Universityboulevard,Manassas,VA20110-2209，保藏號98668)構建的。用BglII消化質粒pZMP21,將其用於和PCR插入片斷重組。將100^1酵母(釀酒酵母)感受態細胞分別與10^1以上的各種DNA混合物混合，並轉移至0.2cm電穿孔杯中。使用電源(BioRadLaboratories,Hercules,CA)設定O.75kV(5kV/cm)、00歐姆、25^iF，電衝擊酵母/DNA混合物。每個杯中加入600^11.2M山梨糖醇，將酵母以兩個300nl等分試樣接種在兩個URA-D平板上，並在30"C孵育。約48小時後，將來自單個平板的Ura+酵母轉化體重懸在lmlH20中，短暫旋轉以沉澱酵母細胞。將細胞沉澱重懸在lml裂解緩衝液(2%TritonX-100、1%SDS、100mMNaCl、10mMTris，pH8.0、1mMEDTA)中。將500jil裂解混合物加入含有300nl酸洗滌的玻璃珠和200^1酚-氯仿的Eppendorf管中，渦旋1分鐘，2或3次，然後以最大速率在Eppendorf離心機中離心5分鐘。將300^1水相轉移至新管中，用600nl乙醇(Et0H)沉澱DNA,之後4C離心10分鐘。將DNA沉澱重懸在lO^ilH20中。使用0.5-2ml酵母DNA製備物和40pl細胞轉化電感受態的大腸桿菌宿主細胞(ElectromaxDH10B細胞；獲自LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD)。以1.7kV、25^F和400歐姆對細胞進行電脈衝。電穿孔後，將lmlSOC(2%BatoTM胰蛋白腖(Difco，Detroit,MI)、0.5%酵母提取物(Difco)、lOmMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04、20mM葡萄糖)加入250^il等分試樣中，然後接種在4個LBAMP平板(LB'液體培養基(Lennox)、1.8%BactoJ京月旨(Difco)、100mg/L氨苄青黴素)上。通過限制性消化鑑定包含正確的zcyto20表達結構的各個克隆，以便驗證zcyto20插入片斷的存在和證實各個DNA序列均已正確地彼此連接。對陽性克隆的插入片斷進行序列分析。使用商業試劑盒(QIAGENPlasmidMaxi試劑盒，Qiagen，Valencia,CA)根據廠商說明書更大規模地分離質粒DNA。正確的構建體命名為zcyto20_CEE/pZMP21。含有zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的質粒使用核菩酸特異性引物以相似方式製備。實施例2在中國倉鼠卵巢細胞中表達—將CH0DG44細胞(Chasin等，Som.CellMolec.Genet.12:555-666，1986)接種在10cm組織培養皿中，使之在及5%C02下於Ham氏F12/FBS培養基(Ham氏F12培養基(LifeTechnology)、5W胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)、1%L-穀氨酖胺(JRHBioscience,Lenexa，KS)、1%丙酮酸鈉(LifeTechnologies))中過夜生長至大約50%至70%匯合。然後通過脂質體介導的轉染，用3:1(w/w)聚陽離子脂2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙亞胺錯三氟乙酸鹽和中性脂二油醯基磷脂醯乙醇胺在膜過濾水中的脂質體製劑(LipofectamineReagent,LifeTechnologies),在無血清(SF)培養基製劑(Ham氏F12、10mg/ml轉鐵蛋白、5mg/ml胰島素、-穀氨跣胺和1%丙酮酸鈉)中，用含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的質粒，如zcyto20/pZMP6，轉染細胞。用SF培養基將zcyto20/pZMP6稀釋在15ml管中至640pl的總最終體積。使35fi1LipofectamineT"和605^1SF培養基混合。將所獲混合物加入DNA混合物中，使之在室溫孵育約30分鐘。向DNA:Lipofectamine化混合物中加入5mlSF培養基。用5mlSF培養基洗滌細胞一次，將之吸出，之後加入DNA:Lipofectamine混合物。37"C孵育細胞5小時，然後向每個平板加入6.4mlHam氏F12/10。/。FBS、1%PSN培養基。平板在37"C孵育過夜，第二天用新鮮的5%FBS/Ham氏F12更換DNA:LipofectamineTM混合物。在轉染後第三天，將細胞分開，放入T-175搖瓶的生長培養基中。在轉染後第7天，用FITC-抗CD8單克隆抗體(PharmingenBiotec,Auburn,CA)，之後用抗FITC偶連的磁珠(MiltenyiBiotec，Auburn,CA)染色細胞。使用商品柱(mini-MACS柱;MiltenyiBiotec)根據廠商指導分離CD8陽性細胞，將其放入無核苷但有50nM氨甲蝶呤的DMEM/Ham氏F12/5%FBS(選擇培養基)中。以每孔0.5、1和5個細胞的密度將細胞接種在96孔平皿的選擇培養基中以便進行亞克隆，使細胞生長大約2周。檢查孔中培養基的蒸發，在該過程中如果必要可以使每孔恢復到200nl。當平板上大多數集落接近匯合時，從每個孔收集lOOjil培養基用於點印跡分析，並給細胞添加新鮮選擇培養基。在點印跡裝置中將上清液加載在硝酸纖維素濾膜上，然後真空爐中ioox:處理該濾膜以變性蛋白質。濾膜在625mMTris-甘氨酸(pH9.1)、5mMp-巰基乙醇中65i:孵育10分鐘，然後在2.5%脫脂幹奶粉的WesternA緩衝液(O.25%明膠、50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、5mMEDTA、0.05%Ig印alCA-630)中於旋轉搖床上4"孵育過夜。室溫下於旋轉搖床上在2.5%脫脂幹奶粉的WesternA緩衝液中用抗體-服P綴合物孵育濾膜l小時。然後室溫下在添加有0.01%Tween20的PBS中洗滌濾膜三次，每次15分鐘。用化學發光試劑ECL,AmershamCorp.)曝光約5分鐘。用胰蛋白酶處理96孔皿中的陽性克隆，將之轉移至6孔m的選擇培養基中以便放大和用於Western印跡分析。實施例3在幼倉鼠腎細胞中表達在BHK細胞中產生全長zcyto24和zcyto25蛋白質。例如，用zcyto24-CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21(實施例l)轉染BHK細胞。將BHK570細胞(ATCCCRL-10314)接種在T75組織培養瓶中，使之在37。C和5%C02下於生長培養基(SL7V4，5%胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1%青黴素/鏈黴素)中過夜生長至大約50%至70%匯合。然後通過脂質體介導的轉染(使用Lipofectamine;LifeTechnologies)在無血清(SF)培養基中用zcyto24—CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21轉染細胞。用SF培養基將質粒稀釋在1.5ml管中至640nl的總最終體積。將35^1脂混合物和605piSF培養基混合，室溫孵育所獲混合物大約30分鐘。然後將6mlSF培養基加入DNA/脂混合物中。用5mlSF培養基洗滌細胞一次，將之吸出，然後加入DNA/脂混合物。細胞在37。C孵育5小時，然後向每個平板加入15ml生長培養基。37i:孵育平板過夜，第二天用選擇培養基(SL7V4，5%胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)、1%青黴素/鏈黴素、ljiMMTX)更換DNA/脂混合物。轉染後大約7-10天，胰蛋白酶處理抗氨甲蝶呤的集落，將細胞重新接種在T-162搖瓶中然後轉移至大規模培養。實施例4腺病毒載體的構建為了構建腺病毒載體，使用分別在5，和3'末端添加了Pmel和Ascl限制性位點的引物通過PCR擴增Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的蛋白質編碼區。使用全長cDNA模板按如下在PCR反應中進行擴增95"C5分鐘進行一個循環；之後95^1分鐘、61t:l分鐘、721C1.5分鐘進行15個循環；之後72^7分鐘；之後4C保溫。將PCR反應產物加載至TAE緩衝液(O.04MTris乙酸，0.001MEDTA)中的1.2%低熔點瓊脂糖凝膠上。從凝膠上切下PCR產物，並用包含矽膠膜離心柱的商業試劑盒(QIAquick⑧PCR純化試劑盒和凝膠提純試劑盒；Qiagen，Inc.)按照試劑盒說明進行純化。然後用Pmel和Ascl消化、酚/氯仿抽提、EtOH沉澱PCR產物，之後重新在20mMTE(Tris/EDTApH8.0)中水合。然後將zcyto20片斷連接至轉基因載體pTG12-8的Pmel-Ascl位點中，並通過電穿孔轉化大腸桿菌DH10Btm感受態細胞。載體pTG12-8通過在NruI位點插入大鼠胰烏素II內含子(大約200bp)和多接頭(FseI/PmeI/AscI)來源於p2999B4(Palmiter等，Mol.CellBiol.13:5266-5275，1993)。該載體包含被10kbMT-l5，側翼序列和7kbMT-13'側翼序列包圍的小鼠金屬硫蛋白(MT-1)啟動子(大約750bp)和人生長激素(hGH)非翻譯區及聚腺苷酸化信號(大約650bp)。將cDNA插在胰島素II和hGH序列之間。含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25cDNA的克隆通過質粒DNA小量製備，之後用Pmel和Ascl消化進行鑑定。測序陽性克隆以確保構建體中無缺失或其它異常。使用商業試劑盒(Maxi試劑盒，Qiagen，Inc.)製備DNA,並使用Pmel和Ascl酶從pTG12-8載體中釋放cDNA。在1%低熔點瓊脂糖凝膠上分離該cDNA並從凝膠上將之切下。切下的膠條在70t:溶化，用等體積Tris緩衝的酚抽提DNA兩次，用Et0H沉澱，然後將之重懸在腳lH20中。將該cDNA克隆至修飾的pAdTrack-CMV(He,T-C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:2509-2514，1998)的EcoRV-Ascl位點中。該構建體含有綠色螢光蛋白(GFP)標記基因。將驅動GFP表達的CMV啟動子替換成SV40啟動子，並用人生長激素聚腺苷酸化信號替代SV40的聚,腺苷酸化信號。此夕卜，用FseL.EcoRV和Ascl位點替換原來的多接頭。該修飾形式的pAdTrack-CMV被命名為pZyTrack。使用商業DNA連接和篩選試劑盒(Fast—Link試劑盒；EpicentreTechnologies,Madison,WI)進行連接。通過用Fsel和Ascl消化小量製備的DNA，鑑定含有zcyto20的克隆。為了線性化該質粒，用Pmel消化約5pg的所獲pZyTrackzcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25質粒。大約ljig線性化質粒和200ng超螺旋pAdEasy(He等，同上)共轉化大腸桿菌BJ5183細胞(He等，同上)。使用Bio-Rad基因脈衝儀在2.5kV、200歐姆和25pFa時進行共轉化。將所有的共轉化混合物鋪在4個含有25pg/ml卡那黴素的LB平板上。挑取最小的菌落並在LB/卡那黴素中擴增，通過標準DNA小量製備方法鑑定重組腺病毒DNA。用小量製備的重組腺病毒DNA轉化大腸桿菌DH10B化感受態細胞中，並使用Maxi試劑盒(Qiagen，Inc.)根據試劑盒說明製備DNA。用Pacl酶(NewEnglandBiolabs)37C消化約5pg重組腺病毒DNA3小時，其中反應體積為100nl，含有20-30UPacl。消化的DNA用等體積酚/氯仿抽提兩次，並用乙醇沉澱。將DNA沉澱重懸在lOjil蒸餾水中。用Pacl消化的DNA對前一天接種並生長至60%-70%匯合的T25搖瓶中的QBI-293A細胞(QuantumBiotechnologies,Inc.,Montreal,Qc.加拿大)進行轉染。用無菌HBS(150mMNaCl，20mM服PES)將Pacl消化的DNA稀釋至50nl總體積。在單獨的管中，用HBS將20^1lmg/mlN-[卜(2，3-二油醯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨鹽(D0TAP)(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)稀釋至lOO^il總體積。在D0TAP中加入DNA，通過上下抽吸溫和地混勻，然後置室溫下15分鐘。從293A細胞中除去培養基，並用5ml含有ImM丙酮酸鈉、0.ImMMEM非必需胺基酸和25mMHEPES緩衝液(從LifeTechnologies,Gaithersburg，MD獲得的試劑)的無血清極限必需培養基(MEM)a洗滌。在293A細胞中加入5ml無血清MEM,並置於37t:。向T25搖瓶中的293A細胞滴加DNA/脂混合物，溫和混合，並37"C孵育4小時。4小時後，吸出含有DNA/脂混合物的培養基，並更換為含有5/。胎牛血清的5ml完全MEM。監測轉染細胞的GFP表達和轉化灶(病毒斑)的形成。用重組腺病毒DNA轉染293A細胞後7天，細胞表達GFP蛋白並開73始形成病灶(病毒貨")。使用細胞刮棒收集粗病毒裂解物以便收集所有的293A細胞。將裂解物轉移至50ml錐形管中。為了將大多數病毒顆粒從細胞中釋放出來，在幹水/乙醇浴和37t:水浴中進行3個凍/融循環。擴增(初次(1。)擴增)粗裂解物以獲得zcyto20rAdV裂解物的工作"原液"。預先培養20小時以得到其中293A細胞接近匯合(80%-90%)的10個10cm平板，向每個10cm平板加入200ml粗rAdV裂解物，然後在白光顯微鏡下監測細胞的CPE(致細胞病變效應)48至72小時，並在螢光顯微鏡下監測GFP的表達。當所有的293A細胞表現出CPE時，收集此原液裂解物並按上述進行凍融循環。然後二次(2。)擴增zcyto20rAdV。預備20個15cm組織培養皿的293A細胞以便細胞達到80-90%匯合。僅留下20ml5%MEM培養基，並用300-500ml初次擴增的rAdV裂解物接種每個平板。48小時後，由於病毒生產，293A細胞裂解，將裂解物收集在250ml聚丙烯離心瓶中，純化rAdV。向粗裂解物的瓶中加入NP-40去汙劑，達到O.5%的終濃度，以便裂解所有細胞。將瓶子放置在旋轉平臺上IO分鐘，在不翻轉瓶子的情況下儘可能快地進行搖動。20，000xG離心15分鐘以沉澱碎片。將上清液轉移至250ml聚碳酸酯離心瓶中，然後加入0.5體積的20%PEG8000/2.5MNaCl溶液。在冰上振搖瓶子過夜。20,OOOxG離心瓶子15分鐘，然後將上清液丟棄至漂白溶液中。使用無菌細胞刮棒，將2個瓶子的白色病毒/PEG沉澱重懸在2.5mlPBS中。將所獲病毒溶液置於2ml微量離心管中，在微量離心機中14，OOOxG離心10分鐘以除去所有的其它細胞碎片。將來自2ml微量離心管的上清液轉移至一個15ml聚丙烯具有保護帽蓋的管中並用CsCl調節至1.34g/ml密度。將該溶液轉移至3.2ml聚碳酸酯薄壁離心管，在25t:以348，OOOxG離心3-4小時。病毒形成白色條帶。使用寬孔吸頭收集病毒帶。使用商業離子交換柱(例如預先填充了SephadexG-25M的PD-10柱；PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)對病毒製品進行脫鹽處理。該柱用20mlPBS平衡。加載病毒然後使之過柱。將5mlPBS加入柱中，然後按8-10滴收集餾分。在分光光度計上測定每個餾分的1:50稀釋物在260nm的光密度。匯集峰值餾分，測定1:25稀釋物的光密度(OD)。使用公式(260nm的OD)(25)(1.lx1012)二毒粒/ml,將OD轉化成病毒濃度。為了儲存病毒，向純化的病毒中加入甘油達到15%終濃度，溫和但有效地混合，並等分後儲存在-80pC。按照QuantumBiotechnologies,Inc.(Montreal,加拿大)發展的實驗方案測量重組病毒感染性。簡而言之，對於每個待測重組病毒，按每孔lxl04個293A細胞將細胞接種在兩個96孔組織培養板的MEM(含有2。/。胎牛血清)中。24小時後在含有2%胎牛血清的MEM中製得每個病毒的10倍稀釋物(從lxl(T至1x1014)。在20個孔的每個孔中各加入一種稀釋物(100nl)。37"C孵育5天後，觀察孔的CPE是陽性或陰性，並計算噬斑形成單位/ml"(PFU)的值。實施例5zcyto20、zcyto22、zcyto24和zcyto25的克隆A:zcyto20和zcyto22在預測的編碼序列中設計zcyto20和zcyto22共有的PCR引物。它們被命名為ZC39339(SEQIDNO:47)和ZC39393(SEQIDNO:48)。在一組來自不同組織的人cDNA文庫上進行PCR。在腦、胰島(胰腺)、前列腺、胎盤、睪丸、HPVS(前列腺上皮)和CD3+文庫中觀察到產物。然後根據zcyto20的起始甲硫氨酸5，基因組序列和終止密碼子3，基因組序列(與zcyto22高度相似)設計PCR引物。將它們命名為ZC39340(SEQIDNO:49)和ZC39341(SEQIDNO:50)。在以上文庫上進行PCR。4個文庫含有全長克隆。對來自這些克隆的PCR產物進行測序，結果3個文庫含有zcyto22(前列腺、睪丸和CD3+),—個文庫含有zcyto20(HPVS(前列腺上皮))。還使用特異針對zcyto22的預測編碼序列的引物進行PCR。這些引物稱為ZC39295(SEQIDN0:51)和ZC39298(SEQIDNO:52)。該PCR的陽性文庫是腦、前列腺、CD3+和睪丸。測序證實了Bzcyto20序列。B:zcyto24和zcyto25在預測的編碼序列中設計zcyto24和zcyto25共有的PCR引物。這些命名為ZC39687(SEQIDNO:53)和ZC39741(SEQIDNO:54)。在一組來自不同組織的小鼠cDNA文庫上進行PCR。在如下文庫中觀察到產物心臟、肺、胎盤、Torres前列腺、皮膚、小腸、睪丸和胸腺。然後設計起始甲硫氨酸5'和終止密碼子位置的PCR引物。5'引物命名為ZC39732(SEQIDN0:55),其與zcyto24和zcyto25序列均匹配。Zcyto243，引物命名為ZC39701(SEQIDNO:56)。Zcyto253，引物命名為ZC39688(SEQIDN0:57)。在上述陽性文庫上進行PCR。對於zcyto24,除了心臟和Torres前列腺外所有的文庫均是陽性。測序證實了來自胎盤、睪丸和小腸文庫的zcyto24序列。對於zcyto25,除了心臟和Torres前列腺外所有的文庫均是陽性。測序證實了來自肺文庫的zcyto25序列。實施例6在杆狀病毒中表達A:用於表達zcyto20的構建體製備表達載體pzBV37L:zCyto20以在昆蟲細胞中表達zcyto20多肽。使用引物ZC41932(SEQIDNO:14)及ZC41933(SEQIDNO:15)和ExpandHighFidelityPCR系統(BoerhingerMannheim)按照廠商說明書從質粒zcyto20PCR擴增含有zcyto20的序列並在5，和3'末端分別編碼BspEl和Xbal限制性位點的536bp片斷。PCR條件如下94°C4分鐘進行1個循環；94"C30秒、50"C30秒和72"C1分鐘進行30個循環；74X:4分鐘進行1個循環；之後4"C保溫。通過凝膠電泳(1%NuSieve瓊脂糖)觀察小量PCR產物，證實片斷長度大約550bp。剩餘反應混合物通過QiagenPCR純化試劑盒按照廠商說明純化，並將之稀釋在30fil水中。在36^1體積中使用Bspel和Xbal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)在適當的緩衝液條件下37"C消化該cDNA。通過1%瓊脂糖TAE凝膠電泳分離消化的PCR產物帶，將之切下並用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取，然後稀釋在30^ilEB緩衝液中。將消化的zcyto20PCR產物連接在載體pZBV37L多克隆位點的Bspel和Xbal位點處。pZBV37L載體是〗務飾的pFastBacl(LifeTechnologies)表達載體，其中已經除去多角體啟動子並在MCS上遊替換為晚期活化鹼性蛋白啟動子和EGT前導信號序列。將5^1限制性酶消化的zcyto20PCR片斷和4^1相應的pZBV37L載體在20pl體積中適當的緩衝液條件下15€連接72小時。通過在400歐姆、2.00kV和25pF下2mm間隔電穿孑L杯(BTX，ModelNo.620)中進行電穿孔，用5^1連接混合物轉化33^1ElectoMAXDH12sTM細胞(LifeTechnologies,Cat.No.18312-017)。將轉4匕的細J包稀釋在500nlLB培養基，在37。C生長1小時，將lOpl和20jil稀釋物鋪在含有100ng/ml氨苄青黴素的LB平板上。PCR分析克隆，並選擇陽性克隆，接種並進行測序。然後驗證序列。B.帶標籤的zcyto20的構建和表達製備表達載體pZBV32L:zCyto20cee以在昆蟲細胞表達zcyto20cee多肽。設計pZBV32L:zCyto20cee以表達帶有C端GLU-GLU標籤(SEQIDN0:16)的zcyto20多肽。可以使用該構建體以確定切除信號肽後zcyto20的N端胺基酸序列。1.pZBV32L:zCyto20cee的構建使用引物zc40240和zc40241(分別為SEQIDNOS:17和18)從含有zcyto20cDNA的質粒PCR擴增產生5，和3'末端分別含有BainHI和Xbal限制性位點的625bpzcyto20片斷。PCR條件如下在含有5%DMSO的lOOfil體積反應物中利用ExpandHighFidelityPCR系統(BoehringerMannheim),94"C4分鐘進行1個循環；94"C30秒、50€30秒和72"C60秒進行30個循環；4分鐘進行1循環；之後4"C保溫。凝膠電泳(196NuSieve瓊脂糖)觀察5plPCR片斷。剩餘的反應混合物通過QiagenPCR純化試劑盒按照廠商說明書純化，並稀釋在7730nl水中。使用BamHI和Xbal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)在適當緩衝液條件下35^il體積中37"C消化該cDNA2小時。通過1%瓊脂糖TAE凝膠電泳分離消化的PCR產物帶，將之切下並使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取，然後稀釋在30nl水中。將純化的消化zCyto20ceePCR產物連接在預先製備並限制性酶消化(BamHI和Xbal)的栽體pZBV32L的多克隆位點中。載體pZBV32L是修飾的pFastBacl(LifeTechnologies)表達載體，其中已經除去多角體啟動子並替換為晚期活化鹼性蛋白啟動子，並將Glu-Glu標籤(SEQIDNO:IO)及終止信號的編碼序列插在多克隆區域的3'末端。在20pl體積中16。C過夜連接5ji1限制性消化的zCyto20插入片斷和40ng相應的pZBV32L載體。以400歐姆、2.OOkV和25pF在2mm間隔電穿孔杯中通過電穿孔，用5ji1連接混合物轉化50filElectoMAXDH12sTM細胞(LifeTechnologies).將轉化的細胞稀釋在500^1SOC培養基(296Bacto胰蛋白腖、0.5%Bacto酵母提取物、10ml1MNaCl、1.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04和20mM葡萄糖)中，將50^1稀釋物鋪在含有100ng/ml氨千青黴素的LB平板上。通過PCR和限制性消化分析克隆。選擇陽性克隆並接種用於測序。一旦證實了正確的序列，通過在42。C加熱塊中熱休克45秒用25ng陽性克隆DNA轉化66^1DHlOBacMAXEfficiency⑧感受態細胞(GIBCO-BRL)。將轉化的DB10BacTM細胞稀釋在600nlSOC培養基(296Bacto胰蛋白腖、0.5%Bacto酵母提取物、10ml1MNaCl、1.5mMKC1、lOmMMgCl2、10mMMgS04和20mM葡萄糖)中並37。C生長1小時，然後將100^1鋪在含有50pg/ml卡那黴素、7pg/ml慶大黴素、l(Wml四環素、40fig/mlIPTG和200pg/inlBluoGal的Luria瓊脂平板上。37X:孵育平板48小時。使用顏色選擇以鑑定具有轉座的病毒DNA(稱作軒粒")的那些細胞。挑取白色菌落進行分析。PCR分析菌落並選擇陽性菌落(含有期望的杆粒)進行培養，隨後純化杆粒DNA。使用針對杆粒中轉座元件的引物ZC447(SEQIDN0:19)和ZC976(SEQIDNO:20),通過PCR擴增DNA篩選具有正確分子量插入片斷的克隆。PCR反應條件如下94X:4分鐘進行1個循環；94"C30秒、30秒和72"2.5分鐘進行25個循環；72X34分鐘進行1個循環；之後4X:保溫。在1。/。瓊脂糖凝膠上電泳PCR產物以驗證插入片斷的大小。具有正確大小的插入片斷的那些用於轉染草地貪夜蛾(SpodopteraFrugiperda)(Sf9)細胞。2.轉染以每孔1xi6個細胞將Sf9細胞接種在6孔板中，並使之在27"C貼壁1小時。用Sf-900IISFM(LifeTechnologies)將大約5pg杆粒腿稀釋至100nl。用Sf-900IISFM將20plLipofectamine"試劑(LifeTechnologies)稀釋至lOOjil。溫和地混合杆粒DNA和脂溶液，然後室溫孵育45分鐘。將800^1Sf-900IISFM加入脂-DNA混合物中。吸出孔中培養基並在細胞中加入lmlDNA-脂混合物。27。C孵育細胞過夜。吸出每個孔中的DNA-脂混合物，並替換為2mlSf-900II培養基。271C、90%溼度下孵育平板大約7天，之後收穫病毒。3.擴增按每孔1xi(f個細胞將Sf9細胞接種在6孔板上。將來自轉染平板的500nl病毒加入孔中，然後27X:、90%溼度下孵育平板96小時，之後收穫病毒(初次擴增)。將100nl來自上述初次擴增平板的病毒轉移至含有^106個細胞/孔的孔中，從而進行第二輪擴增。收穫前孵育平板96小時。進行再一輪擴增(第三次擴增)。在250ml搖瓶的50mlSf-900IISFM中使Sf9細胞生長至大約lxl06個細胞/ml的密度。然後用來自上述平板的lml病毒原液感染之，然後27"C孵育6天，此後收穫病毒。通過生長抑制曲線滴定病毒原液，允許指示1的感染複數(MOI)的滴定培養進行總共48小時。使用特異針對Glu-Glu標籤的單克隆一抗，隨後使用HRP-偶聯的山羊抗鼠二抗，通過還原Western分析上清液。結果顯示大約20kDa的一條帶。上清液還被用於活性分析。然後通過如下方法製備大量病毒原液在2800ml搖瓶的1LSf-900IISFM中將Sf9細胞培養至大約lxl(f個細胞/ml的密度。然後用來自上述搖瓶的5ffil病毒原液感染之，27X:孵育4天，此後收穫病毒。完成更大規模的感染以為下遊純化提供材料。類似地，在杆狀病毒中表達了zcyto21和zcyto22。實施例7蛋白質純化對於本文所述的任何一種蛋白質而言，均可以製備重組蛋白質。A.zcyto20的純化從重組杆狀病毒感染的昆蟲細胞、穩定或瞬時的B服細胞系製備羧基端帶有Glu-Glu標籤的重組zcyto20。收穫培養物，並使用0.2nm濾器無菌過濾培養基。通過聯合使用抗Glu-Glu(抗-EE)肽抗體親和層析和Superdex75凝膠排阻層析，從條件培養液純化蛋白質。將來自BV的培養基(pH6.0，導電率7mS)調節至pH6.7。然後向BV和BHK培養基中均加入NaCl至300mM，之後以2-5ml/分鐘的流速將其加載在10><70mm(5-ml柱體積)Poros蛋白A抗-EE抗體親和柱上。然後用5倍柱體積(CV)的5xPBS(pH7.2)洗滌柱子。用0.5M乙酸、0.5MNaCl(pH3，0)洗脫結合的蛋白質。按2ml收集餾分，加入2MTris以中和洗脫物。從抗-EE抗體親和柱得到的樣品通過SDS-PAGE用銀染和western印跡分析zcyto20蛋白質的存在。將含有zcyto20蛋白質的餾分匯合，並使用Biotnax-5濃縮器(Millipore)濃縮至大約2ml，然後加載至16x600mmS卯erdexx75凝股過濾柱(AmershamPharmaciaBiotech)上。將含有純化的zcyto20蛋白質的餾分匯合，通過O.2jim濾器過濾，等分成100^1小份，然後冰凍在-80"C。通過BCA試驗(Pierce，Rockford，IL)和HPLC-胺基酸分析測定最終純化的蛋白質的濃度。B.SDS-PAGE和Western印跡分析zcyto20蛋白質通過SDS-PAGE(N叩age4-12%Bis-Tris，Invitrogen，Calsbad,CA)以銀染方法(FastSilver,G簡Technology,Inc.,St.Louis，M0)及用抗EE抗體進行的Western印跡分析重組zcyto20蛋白質。使用XcellIIMINI-CELL(Invitrogen，Calsbad,CA)電泳條件培養液或純化的蛋白質，室溫下在攪拌同時使用Xcell11化印跡組件(Invitrogen)按照儀器手冊提供的指導將之轉移至硝酸纖維素(O.2一m;Bio-RadLaboratories,Hercules，CA)上。轉移在含有25mMTris鹼、200mM甘氨酸和20%甲醇的緩衝液中500mA進行45分鐘。然後用10%脫脂幹奶粉的PBS溶液室溫封閉濾膜10分鐘。快速洗滌該硝酸纖維素膜，然後加入在含有2.5%脫脂幹奶粉的PBS中的一抗。溫和搖動下，該印跡在室溫孵育2小時或4t:孵育過夜。孵育後，PBS中洗滌印跡三次，每次10分鐘。加入1:2000稀釋在含有2.5%脫脂幹奶粉的PBS中的二抗(偶聯辣根過氧化物酶的兔抗小鼠IgG;獲自PierceChemicalCo.,Rockford，IL),然後，溫和搖動下，室溫孵育印跡兩小時。之後在PBS中洗條印跡三次，每次10分鐘，然後在&0中快速洗滌。使用商業化學發光底物試劑(S叩erSigna1⑧ULTRA試劑1和2的1:1混合物；試劑獲自PierceChemicalCo.)顯色印跡，使用Lumi-Imager，sLumiAnalyst3.0軟體(BoehringerMannheimGmbH,德國)經10秒至5分鐘或按需要的時間捕獲信號。C.對蛋白質純化和分析的總結來自BV培養基的純化的zcyto20-CEE蛋白質在4-12%Bis-Tris凝膠上遷移為一21kDa的單體，然而還觀察到微弱的36kDa二體帶。二體蛋白質在使用還原劑還原時變成單體，提示zcyto20-CEE通過二疏鍵二聚體化，而且這與半胱氨酸殘基的奇數數目(總共7個)是一致的，從而導致鏈間二硫鍵。以相似方式純化了zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。實施例8zcyto20的幹擾素樣轉錄調節區對已表徵的IFN-a、IFN-p、IFN，啟動子及許多其它細胞因子的,總動子與zcyto20、zcyto21牙口zcyto24的上遊區域進4亍局部序歹'M:對，以鑑定這些基因是否是共調節的。假說是基因調節的共同性質應反映在基因上遊區域的序列相似性上。由於TF的低結合特異性，各結合位點的預測具有高比例的假陽性。因此，為了筌定在體內具有功能作用的結合位點，孤立的位點預測是沒有用的。然而，可能具有序列特異性功能的預測的結合位點可以通過基於保守性的過濾進行選擇物種之間調節區通常比其它非編碼區要保守許多，可以對這一生物學觀察結果進行量化以揭示稱作系統發生足跡(phylogeneticfootprints)的保守模式(Fickett等，Curr.Opin.Biotechnol.11:19-24，2000)。尤其是，人-嚙齒類動物的比較證實對於鑑定功能性調節元件是一個有價值的資源(Wasserman等，Nat.Genet.26:225-228，2000)。比對主要在不同的IFN-a基因的啟動子之間揭示出顯著的匹配，而基於該分析幾乎沒有zcyto20-22和其它細胞因子的啟動子之間具有相似性的證據。用DBA(Jareborg等，Ge讓eRes.9:815-824，1999)進行成對序列比對。用標準位置權重矩陣(Fickett，Mol.CellBiol.16;437-441，1996)(來自TRANSFAC資料庫(3.0版，Wingender等，NucleicAcidsRes.28:316-319，2000))對各轉錄因子結合位點進行檢索，並用S歸匪(3.ltl2版，Pearson,Genomics11:635-固，1991)計算區域1-4的比對情況。基於公開的關於其它TF組的研究，可以預期小鼠和人之間充分保守的大多數天然結合位點可以在所用的評分範圍內檢測到(Fickett，Mol.CellBiol.16;437-441，1996;Wasserman等，J.Mol.Biol.278:167-181，1998)。計算的結果提示，通過序列相似性反映出的zcyto20家族和其它細胞因子在調節上所共有的特徵將預期出現在單個的結合位點水平上，而非大範圍的匹配。基於一組(32個)TF的結合位點的檢索，鑑定公知參與幹擾素轉錄調節的有限數量的因子的推測位點。比較的結果證實在IFN-卩[NF-kB5ISRE(結合IRF的元件)]和IFN-y(AP-1，CREB，GATA，NF-kB，NF-AT)的轉錄調節中有重要作用的TF的推測結合位點也存在於保守的非編碼區中。例如，區域l中一對相鄰的AP-1/NF-AT位點是出現在許多細胞因子啟動子中的一個得到很好闡明的協同結合的例子(Holloway等，Mol.Immunol.38;567-580，2000)。TF的結合位點已經被確定對於細胞因子的調節是關鍵的，提示zcyto20啟動子區域中的轉錄因子結合位點簇是候選的功能區域。區域2與該組已知細胞因子的比對的結果是在AK155啟動子中，在相對於AK155的轉錄起始位點(Knapper等給出，J.Virol.74:3881-3887，2000)的-415位有匹配。Zcyto20啟動子在該位置上有推測的NF-kb結合位點的這一事實說明AK155啟動子中可能存在NF-kB位點。實施例9轉基因動物使用成年能育雄性(種鼠)(B6C3fl，2-8月齡(TaconicFarms,Germantown，NY))、切除輸精管的雄性(去勢鼠)(CD1，2-8月齡(TaconicFarms))、性成熟前的能育雌性(供體)(B6C3fl，4-5周齡(TaconicFarms))和成年能育雌性(受體)(CD1，2-4月齡(TaconicFarms))，製備表達zcyto21基因的轉基因動物。使供體適應環境1周，然後每隻小鼠腹膜內(I.P.)注射大約8IU妊娠母馬的血清促性腺激素(Sigma，St.Louis，M0),46-47小時後每隻小鼠腹膜內(I.P.)注射大約8IU人絨毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))以誘導超排卵。使供體和種鼠交配，隨後注射激素。排卵一般發生在注射hCG後13小時內。通過交配後早上陰道栓的存在證實交配發生。在手術顯微鏡(LeicaMZ12StereoMicrospcope，Leica，Wetzlar，DE)下收集受精卵。收集輸卵管並將卵釋放至含有透明質酸鰷(Sig邁a)的尿分析(urinanalysis)玻片上。卵在透明質酸酶中洗滌一次，在Whitten氏W640培養基(表7)(已經在5%0)2、5%02和9(T/。N2中37"C孵育過)洗滌兩次。然後在顯微注射前將卵儲存在37IV5。/。C02孵箱中。將10-20pg含有zcyto21基因的cDNA的質粒DNA線性化，凝膠純化並重懸在10mMTrispH7.4、0.25mMEDTApH8.0中，終濃度83為每微升5-10ng用於顯微注射。將質粒DNA顯微注射至包含於一滴W640培養基中的收穫的卵中，之上覆蓋COz平衡的溫暖石蠟油。將DNA吸入注射針(從O.75mmID,lmmOD硼矽酸鹽玻璃毛細管牽拉)，然後注射入各卵中。對於所有的卯，注射針均穿刺入一個或兩個單倍體原核中。將皮升DNA注射至原核中，撤出注射針並且不接觸核仁。重複該過程直到所有卵都已完成注射。將成功顯微注射的卵轉移至含有預先放氣(pregassed)的W640培養基的器官組織培養皿中，在37匸/5%C02孵箱中保存過夜。第二天，將來自前一天注射的12-17個健康2細胞胚胎植入受體。定位壺腹，固定住壺腹和粘液嚢(bursa)之間的輸卵管，用28G針頭在靠近粘液嚢的位置在輸卵管上造成一個切口，同時確保不戳破壺腹或粘液嚢。通過此切口植入胚胎，然後通過固定在腹膜壁上，引導生殖器官回到腹腔內。將受體成對放回籠中，允許其妊娠19-21天。注射了zcyto21cDNA的動物在出生前死亡。表7tableseeoriginaldocumentpage84所有試劑均可獲自Sigma。實施例10抗體製備A:zcytorl9多克隆抗體用純化的重組蛋白質huzcytorl9/MBP-6H免疫2隻雌性紐西蘭白兔，以製備多克隆抗體。每隻兔最初腹膜內(ip)注射200pg完全弗氏佐劑中的純化蛋白質，隨後每3周腹膜內加強注射lOOpg不完全弗氏佐劑中的肽。第二次加強注射後7-10天(總共注射3次)，採取動物血液並收集血清。然後每3周加強動物並採血一次。使用CNBr-SEP證0SE4B蛋白柱(Pha鹿ciaLKB，Pe鄰ack，N.J.)使huzcytor19/MBP-6H特異性兔血清預先與抗MBP抗體吸附，所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg純化的重組MBP製備的。使用CNBr-SEPHAR0SE4B蛋白柱(使用10mg純化的重組蛋白質特異性抗原huzcytorl9/MBP-6H，隨後在PBS中20x透析過夜製備的)從兔血清中親和純化huzcytorl9-特異性多克隆抗體。使用500ng/ml純化的重組蛋白質huzcytorl9/MBP-6H或huzcytor19-Fc4作為抗體把標在ELISA中表徵huzcytor19特異性抗體。測定兔抗huzcytorl9/MBP-6H親和純化的抗體對其特異性純化的重組抗原huzcytorl9/MBP-6H及對純化的重組huzcytor19-Fc4的檢測下限(LLD)。B:Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多克隆抗體用純化的重組蛋白質zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H和zcyto22/MBP-6H以及小鼠zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H，通過免疫雌性紐西蘭白兔製備多克隆抗體。每隻兔最初腹膜內(ip)注射200jig完全弗氏佐劑中的純化蛋白質，隨後每3周腹膜內加強注射100pg不完全弗氏佐劑中的肽。第二次加強注射後7-10天(總共注射3次)，採取動物血液並收集血清。然後每3周加強動物並採血一次。可以使用CNBr-SEPHAR0SE4B蛋白柱(PharmaciaLKB,Peapack，N.J.)使zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H、zcyto22/MBP-6H、zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H特異性兔血清預先與抗MBP抗體吸附，所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg純化的重組MBP製備的。使用CNBr-SEPHAROSE4B蛋白柱(使用10mg純化的重組蛋白質特異性抗原，隨後在PBS中20x透析過夜製備的)從兔血清中親和純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的特異性多克隆抗體。使用500ng/ml純化的重組蛋白質作為抗體靶標在ELISA中表徵抗體。測定純化的抗體對其純化的特異性重組抗原的檢測下限(LLD)。使用類似的方法通過用CEE標籤的zcyto21蛋白質免疫兔製備zcyto21的多克隆抗體，並純化該抗體。實施例11聚肌苷酸-聚胞苷酸誘導的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因表達A:各種細胞類型在存在聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C;100fig/ml)(SIGMA;St.Louis胞、正常人皮膚成纖維細胞、人臍靜脈內皮細胞、人微血管內皮細胞和人平滑肌細胞-,C固ETICS公司；Walkersville，MD)和人絨毛膜癌細胞系(Jar，BeWo，和3A-SubE細胞；ATCC，Manassas,VA)的培養物。在一些情況下，還檢測了10ng/mlhTNFa或10ng/mlhILlb。孵育4小時後，分離細胞的總RNA，用無RNase的DNase處理。使用AdvantageRT-for-PCR試劑盒按廠商建議(Clontech，PaloAlto，CA)，使用lpg總RNA合成第一鏈cDNA。使用如下引物對zcyto20，ZC40134(SEQIDNO:30)和ZC40214(SEQIDNO:31);zcyto21，ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22,ZC39295(SEQIDNO:34)和ZC39298(SEQIDNO:35),按廠商建議(Clontech)使用5%cDNA反應物進行聚合酶鏈式反應。針對G3PDH的引物用作對照。在所有測試細胞類型中均檢測到低水平的zcyto20mRNA。在用聚I:C刺激的,E、麗EC、JAR、3-ASubE和BeWo細胞中觀察到zcyto20mRNA水平增加。在所有測試細胞類型中均檢測到低水平的zcyto22mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、JAR、3-ASubE和BeWo細胞中觀察到zcyto22mRNA水平增加。這些結果說明，已知千擾素誘導劑聚I:C可以刺激zcyto20和zcyto22固A合成。在所有測試細胞類型中均檢測到低水平的zcyto21mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、HUVEC、NHDF、SMC、HMVEC、JAR、3—ASubE和BeWo細胞中觀察到zcyto21mRNA水平增加。在ILlb處理的3-ASubE胎盤細胞中也觀察到zcyto21mRNA水平增加。這些結果說明，已知幹擾素誘導劑聚I:C可以刺激zcyto21mRNA合成，並且在某些細胞類型中細胞因子ILlb也可以刺激其合成。B:外周血單個核細胞使用FicollHypaque從人血液中分離全外周血單個核細胞。從外周血單個核細胞利用VarioMacs陽性篩選柱按照廠商說明書(MiltenyiBiotecInc.，Auburn,CA)純化T細胞。對來自各群體的樣品進行染色，並通過螢光抗體細胞分揀(FACS)(BectinDickinson,Sanjose，CA)分析法分析以確定富集百分數。CD3+丁細胞為大約95%純度。在聚I:C(100pg/ml)或在單純的培養基中培養全外周血白細胞或CD3+T細胞。孵育4小時後，分離細胞的總RNA，用無RNase的DNase處理。使用Superscript—步RT-PCR和Plati誦Taq試劑盒(Invitrogen，Frederick,MD)以100ng總RNA作為模板進行RT-PCR以合成cDNA。所用引物對如下zcyto20:ZC40134(SEQIDNO:30)和ZC40214(SEQIDNO:31);zcyto21:ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22:ZC39295(SEQIDNO:34)和ZC39298(SEQIDNO:35)。對每一種RNA的等分試樣，還以特異於I類MHC的引物對(Clontech)作為對照進行了檢測。在聚I:C剌激的全外周血單個核細胞中檢測到zcyto20mRNA。此結果表明已知的幹擾素刺激劑聚I:C可以刺激外周血單個核細胞合成zcyto20mRNA。在聚I:C刺激的全外周血單個核細胞和CD3+T細胞中檢測到zcyto21mRNA。此結果表明已知幹擾素刺激劑聚I:C可以刺激外周血單個核細胞(包括CD3+T細胞)合成zcyto21m謹。在聚I:C刺激的全外周血單個核細胞和CD3+T細胞中檢測到zcyto22mRNA。此結果表明已知幹擾素剌激劑聚I:C可以刺激外周血單個核細胞(包括CD3+T細胞)合成zcyto22m腿。這些結果表明聚I:C對zcyto24和zcyto25以及其它家族成員都將有作用。實施例12使用RT-PCR對人原代免疫細胞和免疫細胞系進行的表達分析使用RT-PCR篩選一組原代人免疫細胞群和人免疫細胞系的RNA，以篩查zcyto21、zcyto21和zcyto22的表達。該組腿是自製的，包含來自下述16種不同的靜息和活化細胞的RNA。所有的原代免疫細胞群是從幾個匿名供體的血液中分離得到的。然後使用標記的Microbeads和磁性細胞分離系統(MiltenyiBiotec)分離各種免疫細胞亞型(CD3+、CD14+、CD19+和CD56+)。使用RNeaseyMidiprep試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)按廠商說明書製備RNA。CD56+NK細胞RNA分離自靜息態的這些細胞。聯合使用500ng/ml離子黴素和5.0ng/mlPMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波酯)活化一個CD3+群體。另一個CD3+群體使用來自ConconavalinA剌激的大鼠脾細胞的上清液(已知富含細胞因子和生長因子的介質)進行刺激。在0、4和16小時的活化時間收集CD3+細胞用於RNA分離。從人扁挑體分離CD19+樣品並用0.5pg/ml離子黴素和10ng/mlPMA活化。然後在0、4和24小時收集細胞並分離RNA。用0.1ng/ml脂多糖(LPS)或1.0ng/inlLPS活化人CD14+單核細胞20小時。然後收集靜息和活化的細胞，並分離RNA。此外，從靜息和活化的人單核細胞系HL-60、THP-1和U93788分離RNA。HL-60細胞用10ng/mlPMA活化過夜。THP-1細胞用1.Ong/mlLPS+10ng/mlIFNy活化過夜。最後U937細胞用10ng/mlPMA活化過夜。用Superscript—步RT-PCR和Plati誦Taq試劑盒(Invitrogen),並使用1OOng總RNA作為模板進行RT-PCR以合成cDNA。所用PCR引物對如下zcyto20:ZC40632(SEQIDNO:36)和ZC40633(SEQIDNO:37);zcyto21:ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22:ZC40638(SEQIDNO:38)和ZC40639(SEQIDNO:39)。對每一種RNA的等分試樣，還以特異於I類MHC的引物對(Clontech)作為對照進行了檢測。在LPS和幹擾素y處理的THP-1細胞中檢測到zcyto20mRNA。在PMA處理4'J、時的CD3+細胞中也檢淡'J至!]zcyto20mRNA。在靜,lU937細胞和靜息THP-1細胞中檢測到^氐水平的zcyto21mRNA。用LPS和幹擾素y處理THP-1細胞時zcyto21mRNA水平增加。在PMA處理4小時的CD3+細胞中也檢測到zcyto21mRNA。用LPS和幹擾素y處理的THP—1細胞中檢測至'Jzcyto22mRNA。在PMA處理4小時和16小時的CD3+細胞中以及在用ConconavalinA處理4小時和16小時的CD3+細胞中也檢測到zcyto22mRNA。這些結果表明，活化單核細胞系和原代CD3+免疫細胞可以刺激zcyto20、zcyto21和zcyto22mRNA的合成。這些結果說明，聚I:C將會對zcyto24和zcyto25以及其它家族成員產生影響。實施例13抗病毒活性:在Hela和L929細胞中的致細胞病變效應對抗病毒活性的最初功能性試驗是使用來自瞬時轉染的人胚胎腎(服K)細胞的條件培養基進行的。該條件培養基的製備如下。使用標準方法將zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的全長cDNA克隆至pzp7Z載體中。用此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25構建體轉染293HEK細胞。簡而言之，對於每個構建體，在轉染前約18小時將700,000個細胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+1096胎牛血清中。對每個孔，向總共lOOfilDMEM中的6^1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中添加1.5pgZcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25DNA和0.5pgpIRES2-EGFP腿(Clontech)。單獨的2jigpIRES2-EGFPDNA用作陰性對照。30分鐘後將這些轉染混合物加入預先接種的293細胞中。24小時後，除去細胞培養基並加入DMEM+0.1%牛血清白蛋白。48小時後收集條件培養基，通過O.45微米濾器過濾，然後用於抗病毒和報導試驗。使用人宮頸癌細胞(HeLa)和小鼠成纖維細胞(L929)實施抗病毒試驗。在第一天，稀釋含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的條件培養基(見實施例10)並與50,000個細胞一起接種在96孔平底微量滴定板中。37。C孵育24小時後，除去培養基並更換為含有感染複數O.1的腦心肌炎病毒的培養基。再次於37'C孵育細胞24小時。然後在4分等級上通過觀察對培養細胞中致細胞病變效應的存在評分，然後將之轉化成y。CPE，見表8所示。將來自僅轉染了GFP和純化的人幹擾素a-2a或鼠幹擾素a的細胞的條件培養基包括在內作為對照。表8:致細胞病變效應的測定tableseeoriginaldocumentpage90表9顯示，含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養基以劑量依賴性方式抑制了病毒對HeLa細胞的感染(%CPE),而對照GFP條件培養基沒有顯著阻斷致細胞病變效應的出現。如表10所示，含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養基並不抑制病毒對L929細胞的感染。純化的幹擾素在兩個試驗中都顯示出陽性抗病毒活性。襲9:使用條件培養基(CM)時HeLa細胞中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的致細胞病變效應百分數相對CM濃度對照zcyto20zcyto21zcyto22zcyto24zcyto25hIFN-hlFN-a-2aGFP(CM)(CM)(CM)(CM)(CM)a墨2a濃度tableseeoriginaldocumentpage91tableseeoriginaldocumentpage91作為進一步研究，將來自感染了表達Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的杆狀病毒的Sf9細胞的條件培養基用於抗病毒試驗。使用來自野生型杆狀病毒感染的Sf9細胞的條件培養基作為對照。使用來自杆狀病毒的條件培養基進行的抗病毒試驗的結果與使用瞬時轉染的293的條件培養基時的結果類似。表11顯示，杆狀病毒來源的含有zcyto21的條件培養基以劑量依賴方式抑制病毒對HeLa細胞的感染，而對照杆狀病毒條件培養基不能阻斷致細胞病變效應的出現。表11:使用來源於杆狀病毒的ZCyto21條件培養基(CM)時HeLa細胞中的致細胞病變效應百分數tableseeoriginaldocumentpage92桿狀病毒構建體和條件培養基的製備如上述。實施例14抗人幹擾素a受體2B鏈抗體不能阻斷抗病毒活性使用人宮頸癌細胞(HeLa)進行了另一些抗病毒試驗。在第一天，將抗人IFN受體,(ResearchDiagnosticsInc.)和同種型匹配的陰性對照MAb稀釋在96孔平底微量滴定板中。加入來自表達ZCyto20、zcyto21或zcyto22的杆狀病毒感染的Sf9細胞的條件培養基，得到0.0MSxCM的終濃度，然後每孔接種50,000HeLa細胞。37t!孵育24小時後，除去培養基並更換為含有感染複數0.1的腦心肌炎病毒的培養基。再次wx:孵育細胞24小時。然後按表8所示，通過觀察對培養細胞中致細胞病變效應(CPE)的存在進行評分。濃度0.01ng/ml的純化人幹擾素-a-2a被包括在內作為陽性對照。表12顯示，含有zcyto20、zcyto21和zcyto22的條件培養基在有或無抗人幹擾素a受體2P鏈的中和抗體存在時在HeLa細胞中都具有抗病毒活性(由0%CPE所證實)。相反，在抗人幹擾素a受體2p鏈的中和抗體存在時，幹擾素-a-2a的抗病毒活性以劑量依賴性方式特異地受到抑制。這些數據表明，zcyto20、zcyto21和zcyto22與不同於人幹擾素a受體的受體相互作用，或者它與人幹擾素a受體以不同於人千擾素-a-2a與人幹擾素a受體相互作用的機制相互作用。表12:使用zcyto20、zcyto21或zcyto22條件培養基(CM)及抗人幹擾素a受體2p鏈的中和抗體時HeLa細胞中的致細胞病變效應百分數Anti-zcyto20zcyto20zcyto21zcyto21zcyto22zcyto22hIFN-a-hIFN-a-hIFNRCM+CM+CM+CM+CM'+CM+2a+2a+MAbAnti-對照Anti-對照Anti-對照Anti-對照濃度ihIFNRMAbhEFNRMAbhEFNRMAbhIFNRMAbMAbMAbMAbMabOug/ml0000007.5100.0010000007.510ug/ml0.010000001010ug/ml0.100000027.510ug/ml1ug/ml0000004010100000008710ug/ml實施例15使用BAF3細胞系進行抗增殖試驗使用BaF3以確定zcyto20是否具有抗增殖性質。用在ZCyto20cDNA或稱作Za30的無關cDNA上遊含有CMV啟動子及內含子A的表達載體，通過BRLlipofectamine穩定轉染幼倉鼠腎(B服)細胞。將穩定轉染的細胞接種在細胞工廠的無血清培養基中，培養3天後收穫條件培養基，然後在5K濾器中將其濃縮10倍。將濃縮的條件培養基樣品儲存在4x:。使用如下試驗在BaF3上測試抗增殖活性。在96孔板上，用單純的生長培養基(RPMI1640，10%胎牛血清，lmM丙酮酸鈉，2邁ML-穀氨醯胺)或鼠IL-3(生長培養基中起始50pg/ml)配製成終體積100jU的8個1:2系列稀釋物。將如下50微升物質加入單純的生長培養基或mlL-3稀釋的道中人幹擾素a(100ng/ml,10ng/ml或lng/邁l，稀釋在生長培養基中)、人幹擾素p(100ng/ml，10ng/ml或lng/ml，稀釋在生長培養基中)、鼠幹擾素a(100ng/ml，10ng/ml或lng/ml,稀釋在生長培養基中)、鼠幹擾素p(100ng/邁l，10ng/ml或lng/ml,稀釋在生長培養基中)、zcyto20(2.5x，0.5x或0.lx)和鼠Za20(2.5x，0.5x或0.lx)。在生長培養基中洗滌BaF3細胞系三次，沉澱重懸在生長培養基中，計數細胞並將之稀釋在生長培養基中至5，000個細胞/50nl。然後向每個樣品稀釋物中加入50nl稀釋的細胞。試驗板在37X:孵箱中孵育3至4天。然後每孔加入20^1Alomar藍，平板37t:孵育過夜。在螢光平板讀數器上以544激發波長和590發射波長對平板進行讀數。實施例16通過千擾素應答途徑的信號傳導1型幹擾素和其特異性受體相互作用將對許多負責抗病毒/抗增殖活性的基因產生誘導。這些基因包括2'-5，寡腺苷酸合成酶(2-5A合成酶)、雙鏈RNA依賴性Pkr激酶(Pkr)、磷脂scra邁blase和細胞間粘著分子-1(ICAM-1)。還誘導目前仍未知功能的基因，如幹擾素剌激的56kDa基因產物(ISG-56k)。為了確定zcyto20處理細胞時是否會誘導其中一些或所有的基因，用來自表達zcyto20的杆狀病毒感染的Sf9細胞的條件培養基處理人DaudiB淋巴樣細胞72小時。使用來自野生型杆狀病毒感染的Sf9細胞的條件培養基作為陰性對照。處理後，收集細胞並裂解以分離總RNA。使用逆轉錄酶將ljig總RNA轉化成cDNA，並將其作為模板並使用特異針對上述人幹擾素刺激的基因的寡核苷酸引物進行聚合酶鏈式反應。針對人甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的寡核苷酸引物被用作非幹擾素刺激的基因對照。結果顯示，用zcyto20處理細胞後明顯誘導了ISG-56k、Pkr、2-5A合成酶和磷脂scramblase。沒有觀察到對ICAM-1或非千擾素刺激的基因對照G3PDH的誘導。實施例17:作為zcyto21受體的zcytorl9的鑑定A:COS細胞轉染和分泌誘捕測試生物素化的zcyto21與已知的或^^兒細胞因子受體的結合。用含有細胞因子受體(包括人IFNaRl,IFN(5R2，IFNaRl，IFNpR2，IL-10R，CRF2-4，zcytoR7，DIRS1，zcytorl9和組織因子)的cDM的pZP7表達栽體轉染COS細胞，並使用下述分泌誘捕試驗測試生物素化的zcyto20與轉染的COS細胞的結合。在該試驗中陽性結合顯示了受體-配體對。COS細胞轉染按如下轉染COS細胞將COS細胞接種(lxl5個細胞/孔)在纖連蛋白包被的12孑L組織培養板(BectonDickinson,Bedford,MA)上，並37"孵育過夜。將細胞因子受體DNA(O.75pg)與50jil無血清DMEM培養基(500mlDMEM中55mg丙酮酸鈉，146mgL-穀氨醯胺，5mg轉鐵蛋白，2.5mg胰烏素，lfig硒和5mg胎球蛋白)混合，然後與45jil無血清廳M培養基中的5jilLipofectamine(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合，並室溫孵育30分鐘。再加入400ji1無血清DMEM培養基。用無血清DMEM洗滌細胞，並加入500jilDNA混合物。37匸孵育細胞5小時，在此期間再加入500fi120%FBSDMEM培養基(500mlDMEM中100mlFBS，55mg丙酮酸鈉和146mgL-穀氨醯胺)，然後孵育細胞過夜。分泌誘捕試驗95按如下進行分泌捕獲吸出培養基，用PBS中的1。/。BSA洗滌細胞。用水中的TNB(O.1MTris-HCl,0.15MNaCl和0.596封閉劑(NENRenaissanceTSA-Direct試劑盒,NENLifeScienceProducts,Boston,MA))封閉細胞1小時。細胞與TNB中的3jig/ml生物素化的zcyto21蛋白質(實施例27)—起孵育1小時。然後用PBS中的1%BSA洗滌細胞3次，然後與TNB中的1:300稀釋的鏈黴親和素-HRP(NEN試劑盒)一起再孵育l小時。再次用PBS中的196BSA洗滌細胞3次，然後用PBS中的1.8%甲醛固定15分鐘。然後用TNT(水中0.1MTris-HCl，0.15MNaCl和0.05%Tween-20)洗滌細胞3次。用1:50稀釋在稀釋緩衝液(NEN試劑盒)中的螢光素tyramide試劑檢測陽性結合，孵育4.5分鐘後用TNT洗滌。用1:5稀釋在TNT中的VectashieldMounting介質(VectorLabsBurlingame，CA)保存細胞。使用FITC濾光片在螢光顯微鏡下觀察細胞。在轉染了人zcytorl9cDNA並與生物素化的zcyto21—起孵育過的細胞上檢測到陽性結合。其它轉染的受體沒有一個與zcyto21結合，而且zcytorl9不與對照生物素化的蛋白質結合。這些數據表明zcytorl9是zcyto21的受體。其它實驗表明人和鼠zcytorl9與生物素化的zcyto21均有陽性結合。在轉染了人zcytorl9c畫並與生物素化的zcyto20和zcyto24一起孵育的細胞上也檢測到陽性結合。實施例18信號轉導報導試驗可以使用信號轉導報導試驗確定zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與zcytorl9的功能性相互作用。在有或無含有II類細胞因子受體(包括人DIRS1、IFNaRl、IFNaR2和zcytorl9(SEQIDN0S:2S和加))的cDNA的pZP7表達載體存在時，用含有幹擾素刺激應答元件(ISRE)的報導質粒轉染人胚胎腎(HEK)細胞，所述ISRE驅動安光素酶報導基因轉錄。在用II類配體(包括zcyto20(SEQIDN0:1)、zcyto21(SEQIDN0:4)、zcyto22(SEQIDN0:6)、zcyto10、人IL10和人IFNa-2a)刺激轉染細胞後的螢光素酶活性反映了配體與細胞表面上轉染的和天然的細胞因子受體的相互作用。結果和方法如下。細胞轉染如下轉染293HEK細胞轉染前約18小時將700,00個293細胞/孔(6孔板)接種在2邁1DMEM+1096胎牛血清中。對於每個孔，向總共lOOjtl,M中的％1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入ljigpISRE-螢光素酶DM(Stratagene)、lfig細胞因子受體DM和ljigpIRES2-EGFPDNA(Clontech)。當不包括細胞因子受體DNA在內時，使用2pgpIRES2-EGFPDNA。30分鐘後將該轉染混合物加入預先接種的293細胞中。24小時後，使用胰蛋白酶-EDTA從平板上剝離轉染細胞，然後按約25，000個細胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時，將培養基改變為DMEM+0.5%FBS。信號轉導報導試驗按如下進行信號轉導報導試驗在DMEM+0.5%FBS中37C孵育18小時後，用如下II類配體的稀釋物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激轉染細胞zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto10、人IL10(huIU0)和人IFN-a-2a(huIFNa-2a)。37C孵育4小時後，裂解細胞，並在加入螢光素酶底物後在光度計上測量相對光單位(RLU)。所獲結果顯示為實驗樣品的RLU相對於單純培養基對照的RLU的誘導倍數(實驗樣品的RLU/單純培養基的RLl^誘導倍數)。表14顯示，在ISRE-螢光素酶轉染的293細胞中zcyto20、zcyto21和zcyto22誘導了ISRE信號轉導，與單純培養基相比產生15-17倍的螢光素酶活性誘導。向轉染混合物中加入zcytorl9腿導致zcyto20、zcyto21和zcyto22豫導的ISRE信號轉導再提高6-8倍，從而總共產生104至125倍誘導。所有的其它轉染的II類細胞西子受體DNA均未導致ISRE信號轉導增加。這些結果說明，zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9細胞因子受體發生功能性相互作用。表13還顯示，人IFNa-2a可以在ISRE-螢光素酶轉染的293細胞中誘導ISRE信號轉導，與單純培養基相比產生205倍螢光素酶活性誘導。然而，向轉染物中加入zcytorl9DNA導致ISRE信號轉導降低11倍(與單純的ISRE-螢光素酶DNA相比)，提示zcytorl9的過量表達會負面影響千擾素信號轉導，相反，zcytorl9的過量表達會對zcyto20、zcyto21和zcyto22信號轉導產生正面影響。表13:n類細胞因子刺激後轉染的293細胞的幹擾素刺激應答元件(ISRE)信號轉導(誘導倍數)配體ISRE-螢光素酶ISRE-螢光素錄/Zcytor19Zcyto20(125ns/ml)15125Zcyto21(125ng/m)17108Zcyto22(125ng/ml)17104HuIFNa-2a(100ng/ml)20518ZcytolO(125ng/ml)1.31HuILlOClOOng/ml)10.5實施例19:鑑定作為zcytorl9的受體亞基的IL10Rb(CRF2-4)A:IL10Rb中和抗體抑制ISRE信號轉導使用信號轉導報導實驗測定zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。用含有幹擾素刺激應答元件(ISRE)的報導質粒轉染人胚胎腎(HEK)細胞或穩定過量表達人zcytorl9的人胚胎腎(HEK)細胞，該ISRE將驅動螢光素酶報導分子轉錄。用II類配體(包括zcyto20、zcyto21、zcyto22和人IFNa-2a)在有或無IL10Rb(CRF2-4)的中和抗體時刺激轉染細胞後的螢光素酶活性反映了配體與細胞表面上細胞因子受體的相互作用。結果和方法如下。細胞轉染為了製備穩定過量表達人zcytorl9的293HEK細胞，按如下轉染293細胞在轉染前約6小時將300,000個293細胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+10%胎牛血清。對於每個孔，向總共lOOjilDMEM中的6^1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入2pg含有人zcytorl998的cDNA(SEQIDN0:23)的pZP7表達載體。30分鐘後將該轉染混合物加入預先接種的293細胞中。48小時後，將轉染細胞置於2jxg/ml嘌呤黴素選擇之下。嘌呤黴素抗性細胞表現為細胞群。按如下轉染293HEK細胞(野生型或過量表達人zcytorl9):在轉染前約18小時將700,000個293細胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+10%胎牛血清中。對於每個孔，在總共100filDMEM內的6nlFugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入ljigpISRE-螢光素酶DNA(Stratagene)和ljigpIRES2-EGFP腿(Clontech)。30分鐘後將該轉染混合物加入預先接種的293細胞中。24小時後使用胰蛋白酶-EDTA將轉染細胞從平板上剝離下來，然後按約25,000個細胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時，將培養基改變為DMEM+0.5%FBS。信號轉導報導試驗按如下進行信號轉導報導試驗在DMEM+0.5%FBS中37'C孵育18小時後，用IL10Rb的中和多克隆山羊抗體(對於zcytor21，2.5jig/ml;對於zcyto20和zcyto22,8jig/ml，R&DSystems)或PBS37匸預先處理轉染細胞1小時。對於涉及zcyto20和zcyto22的實驗，還用IFNAR1的非中和多克隆山羊抗體(8ng/ml，R&DSystems)作為抗體對照預先處理穩定過量表達人zcytoR19的人胚胎腎(HEK)細胞。用如下II類配體的稀釋物(在DMEM+0.596FBS中)剌激預先處理的細胞zcyto20、zcyto21或zcyto22。每個實驗中使用人IFNa-2a作為對照。371C孵育4小時後，裂解細胞，並在加入螢光素酶底物後在光度計上測量相對光單位(RLU)。所獲結果顯示為與單純培養基對照相比實驗樣品的RLU的誘導倍數(實驗樣品的RLU/單純培養基的RLU=誘導倍數)。表14和15顯示，用IL10Rb的中和抗體預先處理野生型293細胞或過量表達人zcytoR19的293細胞可以抑制zcyto20對ISRE信號轉導的誘導。幾乎或完全觀察不到對人IFNa-2a誘導的ISRE信號轉導的抑制。這些結果說明，對於ISRE信號轉導的最大誘導，zcyto20需要與IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto20的受體是zcytoR19和tableseeoriginaldocumentpage100表16:II類細胞因子刺激後轉染的野生型293細胞的ISRE信號轉導的IL10Rb抑制(誘導倍數)細胞因子濃度!Zeyto21Zcyto21+HuEFNa-2aHuIFNa-2a+IL10RbIL10Rb(ng/ml)中和抗體中和抗體1004.11.83130103.21.4323i11.51.316.3150.11.11.31.420.011.21.3i.l1.20.0011.21.30.92.101111表17:II類細胞因子剌激後過量表達zcytoR19的轉染293細胞的ISRE信號轉導的IL10Rb抑制(誘導倍數)細胞因子濃度Zcyto21Zcyto21+Hu顧a-2aHuIFNa-2a+IL10RbBL10Rb(ng/ml)中和抗體中和抗體100453197.710482898.51355.84.34.30.13.511.41.30.011.51.10.91.20.0011.111.2i01111表l8和19顯示，用IL10Rb的中和抗體預先處理野生型293細胞或過量表達人zcytoR19的293細胞可以抑制zcyto22引起的ISRE信號轉導。對於人IFNa-^誘導的ISRE信號轉導，沒有或幾乎沒有觀察到抑制。這些結果說明，為了最大誘導ISRE信號轉導，zcyto22需要與IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto21的受體是zcytoR19和101IL10Rb(CRF2-4)的異二聚體組合。表18:II類細胞因子刺激後轉染的野生型293細胞的ISRE信號轉導的IL10Rb抑制(誘導倍數)tableseeoriginaldocumentpage102B:抗IL10Rb抗體阻斷抗病毒活性進行抗病毒試驗以確定抗IL10Rb抗體阻斷zcyto20的抗病毒活性的能力。該試驗使用293HEK細胞(野生型或過量表達人zcyto!U9)進行。第一天，按5jig/ml將抗體(抗人IL10Rp、抗人L印tin受體，R&DSystems)稀釋在細胞培養基中，然後與50，000個細胞/孔一起接種在96孔板中。37X:孵育1小時後，將zcyto20-CEE(來自實施例3)(200ng/ml用於野生型293細胞、0.5ng/ml用於過量表達人zcytoR19的293細胞)或人幹擾素a-2a(lng/ml用於野生型293細胞、100ng/ml用於過量表達人zcytorl9的293細胞)加入孔中，並37t:孵育過夜。第二天，除去培養基並更換為含有感染複數O.1的腦心肌炎病毒(EMCV)的培養基。然後371C將細胞孵育過夜。隨後，每孔中加入25jil5mg/ml甲基噻唑四唑鏘(MTT)(Sigma),37t:孵育2小時，然後用lOOjil抽提緩衝液(12.5%SDS，4596DMF)抽提各孔。37C孵育過夜後，在Spect薦ax平板讀數器(MolecularDevices,CA)上測量570nM的光密度。光密度(570nm)降低表明細胞存活減少(抗病毒活性喪失)。對於不同的試驗條件，光密度(570nm)顯示在下表20中。結果顯示，封閉人IL10受體P特異地抑制了zcyto20的抗病毒活性，但不影響幹擾素-a-2a的活性。這說明，人IL10受體(i是參與zcyto20抗病毒活性的受體複合物(包括人zcytorl9)的一部分。表20:ECMV感染的經細胞因子處理的細胞的光密度(570mn)tableseeoriginaldocumentpage103C:zcytoR19和IL10Rb的共表達可增加zcyto20、zcyto21和zcyto22的信號轉導使用信號轉導報導試驗測定zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。在有或無含有II類細胞因子受體zcytorl9和IL10Rb(CRF2-4)的cDNA的pZP7表達載體時，用含有用幹擾素剌激應答元件(ISRE)的報導質粒轉染倉鼠腎(BHK)細胞，該ISRE將驅動螢光素酶報導基因轉錄。用II類配體(包括zcyto20、zcyto21和zcyto22)刺激轉染細胞後的螢光素酶活性反映了配體與細胞表面上轉染的和天然的細胞因子受體的相互作用。結果和方法如下。細胞轉染按如下轉染BHK-570細胞在轉染前約5小時將200,000個B服細胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+5%胎牛血清中。對於每個孔，在總共lOOjil匿M內的9jilFugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入lpgpISRE-螢光素酶DNA(Stratagene)、ljig細胞因子受體DNA和lfigpIRES2-EGFPDNA(Clontech)。當不包含細胞因子受體DNA時使用2pgpIRES2-EGFPDNA。30分鐘後將該轉染混合物加入預先接種的BHK細胞中。24小時後使用胰蛋白酶-EDTA將轉染細胞從平板上剝離下來，然後按約25,000個細胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時，將培養基改變為DMEM+0.5%FBS。信號轉導報導試驗按如下進行信號轉導報導試驗在DMEM+0.5%FBS中37"C孵育18小時後，用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25配體的稀釋物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激轉染細胞。37t:孵育4小時後，裂解細胞，並在加入螢光素酶底物後在光度計上測量相對光單位(RLU)。所獲結果顯示為與單純培養基對照相比實驗樣品的RLU的誘導倍數(實驗樣品的^11/單純培養基的既11=誘導倍數)。表21顯示，zcyto20、zcyto21和zcyto22在ISRE-螢光素酶和zcytorl9轉染的BHK細胞中以劑量依賴性方式誘導ISRE信號轉導。向轉染混合物中加入IL10Rb(CRF2-4)DNA導致以低10-100倍的細胞因子劑量得到信號轉導最大誘導量的一半。單純使用ISRE轉染時未觀察到反應。這些結果說明，zcyto20、zcyto21和zcyto22通過幹擾素刺激應答元件傳導信號的能力可以被zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的共表達加強，表明zcyto20、zcyto21和zcyto22的受體是zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的異二聚體組合。104表21:II類細胞因子刺激後轉染的BHK細胞的幹擾素刺激應答元件(ISRE)信號轉導(誘導倍數)tableseeoriginaldocumentpage105實施例20構建表達zcytorl9可溶性受體zcytorl9CEE、zcytorl9CFLG、zcytorl9CHIS和zcytorl9-Fc4的哺乳動物表達載體為了表達zcytor19多肽的可溶性細胞外域，製備表達載體pC4zcytorl9CEE，其中對該構建體進行設計以便表達包含預測的起始甲硫氨酸且在預測的跨膜域處附近截短的帶有C端Glu-Glu標籤(SEQIDN0:16)的zcytorl9多肽。使用PCR構建包含本文所述zcytorl9細胞外域或zcytorl9的細胞因子結合域的zcytorl9DNA片斷，並用標準方法純化。將切下的DNA亞克隆至質粒表達載體中，該載體具有信號肽(如天然zcytorl9信號肽)並將Glu-Glu標籤(SEQIDNO:16)加至zcytorl9多肽C端的編碼核苷酸序列上。該哺乳動物表達載體含有帶哺乳動物啟動子、用於插入編碼序列的多克隆位點、終止密碼子和哺乳動物終止子的表達盒。該質粒還可以具有大腸桿菌的複製起點、哺乳動物選擇標記表達單位(具有SV40啟動子、增強子和複製起點、D服F基因和SV40終止子)。限制性消化的zcytorl9插入片斷與預先消化的載體使用標準分子生物學技術進行連接，然後按照廠商說明書電穿孔至感受態細胞如DH10B感受態細胞(GIBCOBRL，Gaithersburg,MD)中，之後接種在含有50mg/ml氨苄青黴素的LB平板上並孵育過夜。通過限制性分析從各個菌落製備出的DNA,篩選菌落。陽性克隆的插入序列通過序列分析驗證。使用QIAGEf大量製備試劑盒(Qiagen)根據廠商說明大規模製備質粒。使用相同方法製備帶有C端his標籤(由一排6個His殘基組成)的zcytorl9可溶性受體；和帶有C端FLAG⑧標籤(SEQIDN0:42)的zcytorl9CFLAG。為了構建這些構建體，將前述載體中的glu-glu標籤(SEQIDN0:16)替換為C-HIS或FLAG⑧標籤。製備表達載體zcytorl9/Fc4/pzmp20以在BHK細胞中表達C端帶有Fc4標籤的可溶性zcytorl9版本(人zcytorl9-Fc4)。將包括zcyotrl9受體細胞外域的多核苷酸序列的zcytorl9cDNA片斷與Fc4多核苷酸序列(SEQIDN0:43)在閱讀框中融合以產生zcytorl9-Fc4融合物。pzmp20載體是哺乳動物表達栽體，含有Fc4多核苷酸序列和允許使用標準分子生物學技術快速構建C端Fc4融合物的克隆位點。通過PCR產生含有人zctorl9細胞外域以及在5，和3，末端分別編碼有BamHI和Bgl2位點的一段630鹼基對片斷。該PCR片斷使用引物ZC37967(SEQIDN0:44)和ZC37972(SEQIDN0:45)通過擴增人腦cDNA文庫來製備。該PCR反應條件如下94X:20秒和2分鐘進行30個循環；68X:4分鐘進行1個循環；之後IOX]保溫。用BamHI和Bgl2限制性內切酶消化該片斷，隨後通過1%凝膠電泳純化，並使106用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行條帶純化。所獲純化DM室溫下與預先用Bgl2消化的pz見p20載體(其在Bgl2位點3，含有Fc4)連接5小時。在37jilDH10B電感受態大腸桿菌(Gibco)中根據廠商指導用連接混合物進行電穿孔。將轉化的細胞稀釋在400jilLB培養基中，並鋪在含有lOOpg/ml氨,青黴素的LB平板上。通過限制性消化分析克隆，陽性克隆進行DNA測序以驗證融合構建體的序列。實施例21哺享L動物表達人zcytorl9可溶性受體zcytorl9/Fc4將BHK570細胞(ATCCNO:CRL-10314)接種在T-75組織培養瓶中，使之37X:和5%(:02下在DMEM/FBS培養基(DMEM,Giboco/BRL高葡萄糖(GibcoBRL,Gaithersburg，MD)，5%胎牛血清，lmML-穀氨醯胺(JRHBiosciences,Lenea,KS)，lmM丙酮酸鈉(GibcoBRL))中生長至大約50%至70%匯合。然後用質粒zcytorl9/Fc4/pzmp20(實施例4B)和Lipofectamine(GibcoBRL),在無血清(SF)培養基製品(DMEM,10mg/ml轉鐵蛋白，5mg/ml胰島素，2mg/ml胎》求蛋白，1%L-穀氨醯胺和1%丙酮酸鈉)中轉染細胞。用SF培養基將10pg質粒DNAzcytorl9/Fc4/pmzp20(實施例4B)稀釋在15ml管中至500jU終體積。使50jilLipofectamine與450filSF培養基混合。向DNA混合物中加入該Lipofectamine混合物，然後在室溫下孵育約30分鐘。將4mlSF培養基加入該DNA:Lipofectamine混合物中。用5mlSF培養基洗滌細胞一次，吸出然後加入該DNA:Lipofectamine混合物。37"C粹育細胞5小時，然後加入5mlDMEM/10%FBS培養基。搖瓶在37"孵育過夜，之後將細胞分開按1:2、1:10和1:50加入150mm平板的選擇培養基(上述DMEM/FBS培養基加上ljiM氨甲蝶呤(SigmaChemicalCo.St.Louis,M0.))中。轉染後大約10天，將1個150mm平板中的ljiM氨甲蝶呤抗性集落用胰蛋白酶處理，匯合細胞，然後將其中一半細胞重新接種在10jiM氨甲蝶呤中；以便進一步擴大zcytorl9/Fc4蛋白質的表達。使用SDS-PAGE和Western分析測試從該匯合的擴增細胞得到的條件培養基樣品，以確定表達水平。還可以使用標準技術分離、篩選表達該可溶性受體的單個克隆，並將之培養在細胞培養基中，然後進行純化。此外，對於這些目的，CHO細胞也是適宜的細胞。實施例22使用ORIGEN試驗評價zcytorl9受體異二聚化根據廠商搡作方案通過與5倍摩爾過量的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,Inc.,Rockford，lU反應對可溶性zcytorl9受體進行生物素化。可溶性zcytorl9受體和另一可溶性受體亞基(例如可溶性II類細胞因子受體，如CRF2-4(SEQIDN0:40))根據廠商操作方案用5倍摩爾過量的Ru-BPY-NHS(Igen，Inc.,Gaithersburg，MD)標記。該生物素化的和Ru-BPY-NHS標記形式的可溶性zcytorl9受體可以分別命名為Bio-zcytorl9受體和Ru-zcytorl9;另一可溶性受體亞基的該生物素化形式和Ru-BPY-NHS標記形式可以類似地命名。^吏用條件培養基或使用純化的配體進行試驗。對於最初對可溶性受體結合的表徵，測試上述細胞因子或條件培養基以確定它們是否可以介導zcytorl9受體的同二聚體化以及它們是否能介導zcytorl9與上述可溶性受體亞基的異二聚體化。為了達到此目的，將50jil條件培養基或含有純化細胞因子的TBS-B與含有如400ng/mlRu-zcytorl9受體和Bio-zcytor19、或400ng/mlRu-zcytor19和如Bio-CRF2-4、或400ng/ml如Ru-CRF-4和Bio-zcytor19的50jilTBS-B(20mMTris,150邁MNaCl,lmg/mlBSA，pH7.2)混合。室溫孵育l小時後，加入30ng鏈黴親和素包被的2.8mm磁珠(Dynal,Inc.,Oslo,Norway),並室溫再將育該反應物1小時。然後加入200ji1ORIGEN試驗緩衝液(Igen，Inc.Gaithersburg,MD)，並使用M8ORIGEN分析儀(Igen，Inc.)測量受體結合的程度。實施例23用於製備zcytorl9受體異二聚體的構建體表達分泌的人zcytorl9異二聚體的載體是通過將zcytorl9的細胞外細胞因子結合域與IgGyl重鏈融合，並將異聚(heteromeric)細胞因子受體亞基(例如II類細胞因子受體，如CRF2-4)的細胞外部分與人k輕鏈融合來構建的。a.構建IgGyl和人k輕鏈融合載體將IgGyl重鏈克隆在Zem229R哺乳動物表達載體(ATCC保藏號69447)中以便可以在其中克隆具有5，EcoRI和3，Nhel位點的任何期望的細胞因子受體細胞外域，導致形成N端細胞外域-C端IgGyl融合物。用於該構建體中的IgGyl片斷是通過PCR從作為模板的Clontech人胎肝cDNA文庫中分離出IgGyl序列而製備的。使用本文所述方法純化PCR產物，並用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化，乙醇沉接頭的寡聚物一起連接至預先用EcoRI消化的Zem229R中。將人k輕鏈克隆在Zera228R哺乳動物表達栽體(ATCC保藏號69446)中以^更可以在其中克隆具有5，EcoRI和3，Kpnl位點的任何期望的細胞因子受體細胞外域，導致形成N端細胞因子細胞外域-C端人k輕鏈融合物。由於有一個KpnI位點位於人k輕鏈序列中，故設計特異引物以將期望的細胞因子受體細胞外域的3，端克隆至該Kpnl位點中對該引物進行設計以便所獲PCR產物含有期望的細胞因子細胞外域和到該Kpnl位點之前的一段人k輕鏈。該引物優選包含與人k輕鏈5，端在閱讀框中融合的期望細胞因子細胞外域3，末端的至少10個核苷酸的部分。用於該構建體中的人k輕鏈片斷是通過PCR從用於上面的同樣Clontech人胎肝cDNA文庫中分離出人k輕鏈序列而製備的。使用本文所述方法純化PCR產物，並用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化，乙醇沉澱，並使用本文公開的標準分子生物學技術將其與MluI/EcoRI接頭一起連接至預先用EcoRI消化的Zem228R中。b.將zcytorl9受體或異二聚化的亞基細胞外域插入融合載體構建體中使用上述構建栽體，製備zcytorl9與IgGyl融合的構建體。通過標準方法使用提供EcoRI和NheI限制性位點的寡聚物經PCR從前列腺cDNA文庫(Clontech)或活化的淋巴細胞cDNA文庫擴增本文所述zcytorl9受體的細胞外域或細胞因子結合域，從而實現此構建。按本文所述，所獲PCR產物用EcoRI和NheI消化，凝膠純化，並連接至預先用EcoRI和Nhel消化並經帶純化的上述Zem229R/IgGYl中。對所獲載體測序以驗證該zcytorl9/IgGyl融合物(zcytorl9/ChlIgG)是正確的。按上述還構建了另一獨立結構，該結構具有與k輕鏈融合的異二聚體化的細胞因子受體亞基(即CRF2-4)的細胞外域。按上述通過PCR用標準方法和提供EcoRI和Kpnl限制性位點的寡聚物從例如淋巴細胞cDNA文庫(Clontech)擴增，進行細胞因子受體/人k輕鏈的構建。用EcoRI和Kpnl消化所獲PCR產物，然後將該產物連接至預先EcoRI和Kpnl消化並經帶純化的上述Zem228R/人k輕鏈載體中。測序所獲載體以證實細胞因子受體亞基/人K輕鏈融合物是正確的。c.zcytorl9和異二聚體化細胞因子受體亞基細胞外域的共表達利用LipofectaminePlusTM試劑(Gibco/BRL)，按製造商的i兌明，用上述每個載體大約15fig共轉染哺乳動物細胞，如BHK-570細胞(ATCCNo.CRL-10314)。在含有ljiM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma,St.Louis,MO)和0.5mg/mlG418(Gibco/BRL)的DMEM+596FBS(Gibco/BRL)中選才奪轉染細胞10天。所獲轉染子庫在10jiMMTX和0.5mg/mlG418中再次選糹奪10天。使用所獲二次選擇的細胞庫製備蛋白質。利用該庫的3個工廠(Nunc.丹麥)製備10L無血清條件培養基。使該條件培養基通過lml蛋白A柱，然後洗脫在約10,750nl餾分中。將具有最高蛋白質濃度的餾分匯合，並對PBS透析(10kDMW截斷值)。最後，使用常規方法對該透析物進行胺基酸分析(AAA)。d.體夕卜重建zcytorl9受體110為了鑑定參與zcytorl9信號轉導複合物的成分，按如下進行受體的重建研究。例如，使用本文所述標準方法轉染了螢光素酶報導哺乳動物表達載體質粒的BHK570細胞(ATCCNo.CRL-10314)可以用作生物分析細胞系以測量在zcytorl9配體存在時從轉染的zcytorl9受體複合物到螢光素酶報導分子的信號轉導應答。因為BHK細胞不內源性表達zcytorl9受體，故可以使用BHK細胞。也可以使用其它細胞系。一個示例性螢光素酶報導哺乳動物表達載體是KZ134質粒，該質粒是使用含有來自4個基因的STAT轉錄因子結合元件的互補寡核苷酸構建的。修飾的c-fosSis誘導型元件(m67SIE或hSIE)(Sadowski，H等，Science261:1739-1744，1993)、來自p21WAF1基因的p21SIEl(ChinY.等，Science261:1739-1744,1996)、p-酪蛋白基因的乳腺應答元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.CellBiol.11:3745-3755，1991)和FcgRI基因的STAT誘導型元件(Seidel，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.92:3041-3045,1995)。這些寡核苷酸含有Asp718-Xhol相容性末端，使用標準方法將其連接入用相同酶消化過的、具有c-Fos啟動子並含有新黴素選擇標記的受體螢火蟲螢光素酶報導載體(Poulsen:L.K.等，J.Biol.Chem.273:6229—6232，1998)。通過標準轉染和選擇方法，使用KZ134質粒穩定轉染BHK或BaF3細胞，以分別製備BHK/KZ134或BaF3/KZ134細胞系。用單獨的zcytorl9受體轉染該生物分析細胞系，或用zcytorl9和多種其它已知受體亞基中的一種一起共轉染該細胞系。受體複合物包括但不限於單純的zcytorl9受體、zcytorl9與II類細胞因子受體(如幹擾素Y、a和P鏈和幹擾素ot/p受體a和p鏈、zcytorll(共同擁有的美國專利5,965,704)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(共同擁有的美國專利5，945，511)受體)的各種組合。然後在存在細胞因子條件培養基或純化的細胞因子時分析每種獨立的受體複合物細胞系，並使用常規方法測量螢光素酶活性。未轉染的生物分析細胞系作為對照以得到背景螢光素酶活性，由此用作基線以便於比較不同的受體複合物組合的信號轉導。在正確受體複合物存在時與zcytorl9受體結合的條件m培養基或細胞因子預期將給出相對於背景大約5倍或更多的螢光素酶讀數。作為備選方案，可以進行類似試驗，其中按本文所述共轉染Baf3/'/cytor19細胞系並使用諸如標準AlamarBlue增殖試驗等已知試驗測量增殖。實施例24配體與可溶性受體的結合可以使用塽珠標記方法測試配體(Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)與可溶性受體的結合。例如，1251標記的zcyto21-CEE是標記的(1.2xl07CPM/ml;1.5ng/fU;和8.6xl06CPM/ng)。將50ng1251標記的zcyto21-CEE(見實施例3)(399,600CPM)與1000ng冷zcytorl9/Fc4同二聚體受體、1000ng冷zcytorl9/CRF2-4異二聚體受體或1000ng對照II類細胞因子受體/Fc4受體以及作為竟爭者的約10，000ng冷zcyto21混合。將樣品在4t!孵育2小時，之後向每個樣品中加入30plG蛋白(ZymedSanFrancisco.CA)。4'C孵育樣品1小時，然後用PBS洗滌3次。使用y計數器(PackardInstruments,DownersGrove,lU測量洗滌後G蛋白的放射活性。實施例25用zcyto20和zcyto21-生物素流式細胞術染色人單核細胞用FicollHypaque(Amersham，瑞典)分離方法從肝素化人血中分離外周血白細胞(PBL)。37t!在標準培養基中以1xioe6個細胞/ml的密度在6孔組織培養板中培養PBL。過夜孵育後，收穫PBL並用濃度lOpg/ml的生物素化zcyto20-cee和zcyto2卜cee(見實施例18)染色。用按1:1000稀釋製備的藻紅蛋白標記的鏈黴親和素(Pharmingen，CA，USA)檢測染色。染色後將PBL在2%多聚甲搭中固定，在Facscaliber(BectonDickinson,SanDiego，CA)上讀數。使用Cellquest軟體(BectonDickinson)分析數據。結果顯示，生物素化的zcyto20-cee和zcyto21-cee均染色處於外周血白細胞的骨髓門(myeloidgate)中的細胞淋巴門(lymphoidgate)中的細胞不與zcyto20-cee和zcyto21-cee結合。實施例26zcyto21-CEE對PBL上活化標記的表達的影響通過FicollHypaque分離方法從肝素化人血液中分離外周血白細胞(PBL)。然後用來自如下的純化蛋白或培養基對照剌激PBL:1)zcyto21-CEE(2jig/ml);2)zcyto21-cee(ljig/ml);3)單純培養基；4)A141F陰性對照蛋白(2ng/ml);或5)IFNa-A(lng/ml)(PBLBiomedicalNJ,USA)。經過剌激的PBL在37°C及5%C02下按1xi0e6個細胞/ml細胞密度培養。24小時和48小時收穫培養物，並對活化標記進行染色。用PBS洗滌PBL,然後用Facs緩衝液(HBSS+296正常山羊血清、2%BSA、0.2%NaN3)中的正常小鼠IgG封閉，之後用針對如下標記的抗體進行染色CD19、CD14、CD3、HLA-DR、CD54、HLA-ABC(Pharmingen,CA，USA和Immunotech，法國)。洗滌細胞，然後在2%多聚甲醛中固定，然後在Facscaliber(BectonDickinson,CA，USA)上分析。所獲數據4吏用Cellquest軟體(BectonDickinson,CA，USA)分析。結果說明，與單純培養基對照相比，用zcyto21-cee刺激的單核細胞上表面CD54(ICAM)表達在24和48小時增加。用zcyto21-cee刺激也導致在第24小時B細胞上主要組織相容性複合體I的表達增加和在第48小時B細胞和單核細胞上MHCI的表達增加。實施例27配體的生物素化按如下PierceChemical公司提出的^務飾方案用Sulfo-NHS-LC-生物素對zcyto21CEE進行生物素化。將250pgzcyto21CEE(在0.5mlPBS中)加入8.4^ilS-NHS-生物素原液(84pg)中，搖動下室溫孵育2小時。孵育步驟後，加入20jil2MTrisHCl(pH8),搖動下室溫孵育混合物20分鐘。然後將此生物素化的配體混合物儲存在4x:。按基本上相同的方法製備zcyto20CEE、zcyto22CEE和zcyto24CEE。實施例28Northern分析zcytorl9的表達探測Northern印跡以確定zcytorl9的組織分布。使用PCR和基因特異性引物，即5，ZC40285(顯示在SEQIDNO:21)和3，ZC40286(顯示在SEQIDNO:22)，獲得人zcytorl9cDNA片斷。模板是克隆的人zcytorl9cDNA(SEQIDNO:23)。凝膠純化PCR片斷，用P32a-dCTP和Prime—ItRmT隨機引物才示i己試劑盒(Stratagene,Lajolla，CA)標記大約25ng。探溯'j如下Northern印跡(Clontech,PalAlto，CA)以檢測zcytorl9mRNA的表達(1)人癌細胞系印跡C，其含有來自如下各癌細胞系的RNA樣品早幼粒細胞白血病HL-60、HELAS3、慢性骨髓性白血病k-562、淋巴母細胞白血病M0LT-4、伯基特氏淋巴瘤RAJI、結腸直腸腺癌SW480、肺癌A549和黑素瘤G-361;(2)人MINH印跡，其含有來自如下組織的mRNA:心臟、全腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺；(3)人MTNH3，其含有來自如下組織的mRNA:胃、甲狀腺、脊髓、淋巴結、氣管、腎上腺和骨髓；和(4)人MTNH4，其含有來自如下組織的mRNA:脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、子宮、小腸、結腸和外周血白細胞。除了將額外的0.2mg/ml鮭精DNA加入雜交和預雜交緩衝液中以減低非特異性雜交外，雜交均在ULTRAhybTM超靈敏雜交緩衝液(Ambion，Austin,TX)中根據廠家推薦進行。雜交後，通過用0.lxSSC/0.5%SDS在50X:處理，除去非特異性放射信號。使用BioMaxMR膠片和增感屏(EastmanKodak,Rochester,NY)按廠家推薦曝光印跡3天。一個~4.5kb轉錄本在心臟、骨骼肌、胰腺和前列腺組織，以及伯基特淋巴瘤(RAJI)細胞系中表達量最大。在多種其它組織中觀察到較低水平。此外，還有一個2kb轉錄本，其一般比上述該較大轉錄114本豐度小，但也存在於許多組織和細胞系中。除了具有該2和4.5kb轉錄本外，睪丸組織中還可能具有約4kb和1.4kb轉錄本。腎上腺表現出該4.5kb和2kb轉錄本的表達水平相等。實施例29原位分析zcytorl9的表達分離特定人組織並原位雜交篩查zcytorl9的表達。製備多種人組織，切片並進行原位雜交，這些組織包括正常和癌性結腸、宮頸癌、子宮內膜癌、正常和癌性卵巢、正常和贅生性皮膚、胎肝、肺、心臟和MFH(肌肉肉瘤)。使用標準技術在10%緩衝的甲醛中固定組織，並石蠟包埋。將組織切成4至8微米切片。使用標準方案製備組織。筒而言之,用Histo—Clear(NationalDiagnostics,Atlanta,GA)給組織切片脫石蠟，然後用乙醇脫水。接著，用蛋白酶K(50ng/ml)(BoehringerDiagnostics,Indi謹polis，IN)37"C消化切片2至7分鐘。該步驟後對組織進行乙醯化和重現水化。使用標準方法針對人zcytorl9(變體><i)序列(INC7128744,見SEQIDNO:25)(含有zcytorl9的3，UTR)設計了一個原位探針。使用T7聚合酶產生反義探針。使用體外轉錄系統(Rib叩robe⑧體外轉錄系統，Promega，Madison,WI),除了使用地高配基辛探針代替放射標記的rCTP以及調節水以適應rNTP的減少體積外，按照廠家說明標記探針。使用地高辛配基標記的zcytorl9探針(上述)進行原位雜交。以1至5pmol/ml將探針加至載玻片上，12至16小時。隨後在2xSSC和0.lxSSC中55X:洗滌載玻片。使用TSA(TyramideSignalAmplification;PerkinElmerLifeSciencesInc.,Boston,MA)擴大信號，並用VECTOR紅底物試劑盒(VectorLaboratories,Burlingame,CA)按廠家指導進行顯色。然後用蘇木精復染載玻片。在幾種測試的組織中觀察到信號結腸癌組織中，在癌細胞和幾個免疫浸潤區觀察到弱信號。然而，在正常結腸和小腸中，包括固有層、上皮、免疫節中的細胞和外周神經節神經細胞，沒有觀察到陽性信號。在宮頸癌組織中，在癌細胞及免疫節的一些細胞中有弱信號。在子宮內膜癌組織中，在癌細胞中有弱信號。在正常子宮組織中，沒有觀察到陽性信號。在卵巢癌樣品中，一些癌細胞為弱陽性。在正常卵巢樣品中，一些毛細血管內皮和大濾泡的上皮可能是弱陽性的。在皮膚癌樣品中，癌性顆粒上皮(granularepithelium)為強陽性，而正常皮膚中沒有觀察到陽性信號。在胎肝中，在竇狀隙內的單個核細胞混合群體中觀察到信號。在肺中，zcytorl9在II型肺泡上皮中似乎為陽性。偶爾支氣管上皮也可以是弱陽性。間質組織中的巨噬細胞樣單個核細胞也是陽性。心臟中，肌細胞是陰性，而一些循環單個核細胞是zcytor19陽性。在其中一個樣品中，血管內皮可能是弱陽性。測試的其它組織，包括MFH(肌肉肉瘤)樣品和卡波西肉瘤皮膚樣品。這些組織中沒有明確的陽性信號。實施例30基於RT-PCR分析剌激的細胞相對未刺激的細胞中人zcytorl9的表達使用RT-PCR分析如下細胞類型以檢測zcytorl9的基因表達Hela、293、Daudi、CD14+、U937和HL-60。使用用於RT-PCR的商業第一鏈合成系統(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)從總RNA合成第一鏈cDNA。使用分別產生806bp和892bp產物的zcytorl9x1(SEQIDNO:23)和zcytorl9x2(SEQIDNO:28)及特異寡聚引物ZC40288(SEQIDNO:58)和ZC40291(SEQIDN0:59)、QiagenHotStarTaqDNA聚合酶和緩沖液(Qiagen，Inc.，Valencia,CA)、GeneAmpdNTP(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)、RediLoadTM染料(ResearchGenetics,Inc.,Huntville，AL)和2pl來自各細胞類型的第一鏈cDNA(10%第一鏈反應物)，設置隨後的PCR反應。PCR循環條件如下初始l個循環95X:變性15分鐘；35個循環94X:變性45秒、63"C退火1分鐘和72C延伸15秒；隨後最後1個循環72t:延伸7分鐘。在2%瓊脂糖凝膠(EMScience,Gibbstown，NJ)上電泳分離反應物，並通過溴化乙錠染色進行顯色。在Hela±IFN—p(僅892bp帶)、293+親代Adv、Daudi±IFN-P、Daudi±IFN-a、活化的CD14+、活化的HL-60中觀察到正確大小的條帶。在靜息CD14+、靜息和活化的U937和靜息HL-60中沒有觀察到條帶。這些結果顯示，當單核細胞或單核細胞系活化或分化時誘導zcytorl9表達。實施例31RAW細胞中NFKB才艮道分子的刺激使用小鼠單核細胞/巨噬細胞報導細胞系測試Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25通過NFkP信號轉導途徑傳遞信號的能力。該細胞系是通過用含有驅動螢光素酶報導基因轉錄的NFkP應答元件的KZ170逆轉錄病毒報導分子轉導RAW264.7細胞製備的。起初溯'J試Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的報導試驗是使用描述用於抗病毒分析的瞬時轉染293的條件培養基進行的。收穫RAW264.7/KZ170細胞，並按50，000個細胞/孔的密度接種在96孔平板中。37。C下在RPMI+10%FBS中孵育細胞過夜。第二天，從貼壁細胞中除去培養基，然後向細胞中加入未稀釋的zcyto20-25條件培養基或zcyto20-25條件培養基的稀釋物(稀釋在RPMI+0.1%BSA中)。37。C孵育5小時後，裂解細胞，加入螢光素酶底物後在光度計上進行讀數。通過將zcyto20-25條件培養基的相對光單位(RLU)與未轉染細胞的條件培養基的相對光單位進行比較，分析結果。與未稀釋的未轉染細胞的條件培養基相比，未稀釋的zcyto20-25條件培養基誘導的螢光素酶表達高4-9倍。這些結果表明，在小鼠單核細胞/巨噬細胞細胞系中zcyto20-25能夠通過NFicp信號轉導途徑傳遞信號。作為進一步研究，在該報導試驗中使用來自感染了表達zcyto20、zcyto21或zcyto22的杆狀病毒的Sf9細胞的條件培養基。野生型杆狀病毒用作陰性對照。杆狀病毒構建體和條件培養基的製備如上述。117使用杆狀病毒來源的條件培養基進行的RAW264.7NFkb-受體試驗的結果與使用瞬時轉染293條件培養基時得到的結果相似。含有zcyto20-22的杆狀病毒來源的條件培養基以劑量依賴方式誘導螢光素酶表達，而相應對照條件培養基無此現象。實施例32體內結果將zcyto24的毒性和生物學活性與另一II類細胞因子、親代腺病毒載體以及未注射的小鼠比較。按如下注射4組(每組8隻)C57B16小鼠(雌性，9周齡)組1:每隻小鼠注射lx1011個Adzcyto24顆粒；組2:按lxlH個顆粒注射II類細胞因子(Adzcyto);組3:按lxlU個顆粒注射親代腺病毒載體(Adzpar);和組4:未處理的。在-l天將溫度發送器放置在小鼠身上，在第0天注射病毒。籠子方便食物攝取，每5天檢測一次體重，第10天採血(最大0.25ml)用於試驗，包括CBC和Abbot血液分析。在第20天處死所有小鼠。在第10天採取Adzcyto24(組1)處理的小鼠的血液，測試血清以檢測是否存在zcyto24生物活性。病毒試驗證實對於Adzcyto24組的每隻小鼠在1:500最大稀釋下有顯著抗病毒活性。這相應於大約160ng/ml純化的zcyto24CEE。用於檢測小鼠千擾素的抗病毒試驗在Adzcyto24組中未檢測到活性。使用具有IRSE的報導分子進行的生物分析也在Adzcyto24注射的小鼠的血清中檢測到顯著的zcyto24活性，而在其它組中則沒有檢測到。溫度探頭顯示，組2的平均體溫到第10天降低了5"C以上，而Adzcyto24(組l)組的平均體溫減低了2X:以上。對照組的體溫在整個實驗過程中表現出不到it:的改變。Adzcyto24(組1)小鼠在20天的實驗中體重表現出輕微增加，與對照組(組3和4)相同。組2小鼠體重下降到第10天組2的平均體重降低約8%。對第10天和第20天採取的血液進行的Abbot血液分析儀分析揭示，組1和2中白細胞計數顯著改變。圖1顯示了Adzcyto24處理的小鼠相對於其它組而言單核細胞計數明顯增加。Adzcyto24注射的小鼠與親代載體(Adzpar)注射的小鼠相比，單核細胞計數高2,77倍。到第20天,單核細胞計數稍微下降，但仍顯著高於親代載體注射的小鼠的單核細胞計數。圖2顯示，用編碼II類細胞因子的腺病毒(Adzcyto)而非用編碼zcyto24的腺病毒注射時，導致在第10天嗜中性粒細胞計數增加。為了驗證Abbot血液分析儀檢測到的細胞類型的性質,使用譜系特異性Mab(單克隆抗體)對實驗第20天採取的血液實施流式細胞術分析。圖3顯示了每隻小鼠外周血中CDllb陽性細胞，即單核細胞的百分數。將每組的平均值作圖，圖4顯示，用帶zcyto24的腺病毒注射的組與親代載體感染的組相比，單核細胞百分數顯著增加(p=0.05)。這與之前使用Abbot血液分析儀觀察到的改變是相符的。用針對粒細胞(GR-1)的特異性MAb對同樣血液樣品進行的分析顯示，Adzcyto24注射的小鼠中粒細胞(即，主要是嗜中性粒細胞)百分數沒有顯著增加。PBL還用B細胞(B220)特異的Mabs進行了染色，相對於其它組，Adzcyto24注射小鼠沒有觀察顯著不同。值得注意的是，使用Adzcyto24時，與Adzcyto注射相關的寒戰和重量減輕並不明顯。在第10天和20天通過Abbot血液分析儀檢測到的單核細胞明顯增加，得到用譜系特異的MAbs對第20天的血液進行的流式細胞分析的證實。注射了Adzcyto24的小鼠的PBL中單核細胞百分數的明顯增加好象是腺病毒感染情況下zcyto24直接或間接介導的獨特活性。注射了Adzcyto24的小鼠中顯著水平表達的zcyto24可能通過從周圍組織募集和動員單核細胞或通過刺激從骨髓或肝來源的祖先細胞產生單核細胞而促進抗病毒反應。該證據提示，單核細胞/巨嚆細胞被zcyto24和zcyto21激活。根據以上的描述應當理解，儘管為了舉例說明的目的這裡描述了本發明的具體實施方案，仍可以進行各種修改而不偏離本發明的精神和範圍。因此，本發明只受所附權利要求書的限制。本申請還公開了如下內容1.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少80%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到笫205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到笫205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到笫202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。2.項目1的分離的多肽，其中所述多肽特異地結合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯合SEQIDNO:41的異二聚體受體。3.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少95%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氛基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。4，項目3的分離的多肽，其中所述多肽特異地結合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯合SEQIDNO:41的異二聚體受體。5.分離的多肽，包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基到笫205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。6.分離的多肽，包含SEQIDNO:7列第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。7.分離的多肽，包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:9列第1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序。8.分離的多肽，包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:11第1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列。9.分離的多肽，其是SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。10.分離的多肽，其是SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。11.分離的多肽，其是SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:9第1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。12.分離的多肽，其是SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:11第1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。13.藥物組合物，其在可藥用栽體中包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。14.藥物組合物，其在可藥用載體中包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:7第l位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。15.包含至少兩個多肽的融合蛋白，其中至少一個多肽包含選自如下組的多肽(a)包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。16.編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴緊洗滌條件後仍與由SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補分子組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。17.編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)包含SEQIDNO:36的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴緊洗滌條件後仍與由SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補分子組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。18.編碼選自如下組的多肽的分離的多核苷酸(a)包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。19.項目18的分離的多核苷酸，其中所述核酸分子編碼的胺基酸序列和相應的胺基酸序列之間的任何差異均是由於保守胺基酸替代引起的。20.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:1第64位核苷酸至第618位核普酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列。21.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:6第64位核苷酸至笫618位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:6第1位核苷酸至笫618位核苷酸所示的核苷酸序列。22.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:1第1位核苷酸至笫606位核苷酸所示的核苷酸序列。23.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:10第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苦酸序列。24.表達載體，其包含項目20、項目21、項目22或項目23的分離的核酸分子、轉錄啟動子和轉錄終止子，其中所述啟動子與所述核酸分子可操作地連接，並且所述核酸分子與所述轉錄終止子可操作地連接。25.重組宿主細胞，其包含項目24的表達載體，其中所述宿主細胞選自細菌、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞。26.製備多肽的方法，該方法包括步驟培養包含項目24的表達栽體並產生所述多肽的重組宿主細胞，和從所培養的宿主細胞中分離該多肽。12327.與項目9、項目10、項目ll或項目12的多肽特異結合的抗體或抗體片斷。28.檢測生物樣品中基因表達是否存在的方法，包括步驟(a)在雜交條件下使核酸探針和(l)分離自該生物樣品的測試RNA或(2)從該分離的RNA分子合成的核酸分子接觸，其中該探針由包含SEQIDNO:l核苷酸序列、SEQIDNO:1核苷酸序列的互補分子的一部分；SEQIDNO:6核苷酸序列、SEQIDNO:6核普酸序列的互補分子的一部分的核苷酸序列組成，和(b)檢測核酸探針和測試RNA分子或合成的核酸分子形成的雜交體，其中該雜交體的存在指示了生物樣品中存在該RNA,或(a，)使該生物樣品與項目27的抗體或抗體片斷接觸，其中所述接觸在允許該抗體或抗體片斷與該生物樣品結合的條件下進行，和(b)檢測所有結合的抗體或結合的抗體片斷。29.擴增單核細胞或單核細胞的祖先細胞的方法，包括用包含項目9、項目10、項目ll和項目12的多肽的組合物培養骨髓或外周血細胞，其中所述多肽在組合物中的量足以造成所述骨髓或外周血細胞與在未給予多肽的情況下培養的骨髓或外周血細胞相比其中的單核細胞或單核細胞的祖先細胞數量增加。30.在暴露於抗原或病原體的哺乳動物中刺激免疫應答的方法，包括(1)確定抗原或病原體特異的抗體的水平；(2)給予在可藥用栽體中含有項目9、項目10、項目11或項目12的多肽的組合物；(3)確定給藥後抗原或病原體特異的抗體的水平；(4)將步驟(1)中的抗體水平和步驟(3)中的抗體水平進行比較，其中抗體水平增加表明刺激了免疫應答。序列表ZymoGenet"ics,Inc.細胞因子蛋白質ZCYT02001-17PCUS60/285,4082001魯20US60/286.4822001-04-25US60/341,0502001-10-22US60/341,1052001-10-22US09/895.834.2001-06-29US60/285.4242001-04-2059FastSEQforWindowsVers化n4.01618DMA<213〉人(Homosapiens)CDS(1)...(618)1atgactMetThr1gggGlygacAsptgcCys5acgTh廣CCdProgtgValctgLeugtgctgValLeu10atgMetgccAlagcaAlagtgVal15ctg48accgtgThrValactThrgga20gcaAlagttValcctProgtcValgccAla25aggetcArgLeuC3CHisgggGlygetAla30etcLeuccgPro96gatgcaAspAlaaggArg35ggcGlytgcCysC3CHisataliegccAla40cagGinttcaagPheLystecSe廣ctgLeu45tctSe廣CC3Proc的Gin144gagctgGluLeu50c的GingccAlatttPheaag柳Arg55gccAla333LysgatgccAspAlatta匕eu60gaaGlug的GlutegSercttLeu192ctgctgl_eul_eu65aaggacAsptgcCysaggArg70tgcQysC3CHistecSercgcetcArgLeu75ttcPhecccProaggArg3CCThrtggTrp80240gacctgaggcagctgcaggtgagggagcgccccatggetttggagget288AspLeuArgGinLeuGinValArgGluArgProMetAlaLeuGluAla85卯95gagctgGluLeugccAlactgLeu100acgThrctgLeuaaggttValctgLeu105gaggccGluAla3CCThrgetAlagacAsp110actThrgacAsp336ccagccProAlactgLeu115gtgValgacAspgtcValttgLeugacAsp120cagGinccccttProl_euC3CHis3CCThr125ctgLeuC3CHiscatHis384ateetcteccagttcegggcctgtgtgagtcgtcagggcctgggcseclieLeuSerGinPheArgAlaCysValSerArgGinGlyLeuGlyThr130135140432cagateGinlie145cagGincctProcagGincccPro150acgThrgcaAlagggcccaggProArg1553CCThreggArgggcGlycgcArgetct_eu160480caccattggctgtaceggetccaggaggccccaaaaaaggagteccct528HisHisTrpLeuTyrArgLeuGinGluAlaProL_ysUysGluSerPro165170175doctgcetcgaggcctctgtcaccttcaacetcttccgcetcetcacg576CysLeuGluAlaSerValThrPheAsnLeuPheArgLeuLeuThr180185l卯cgagacctgaattgtgttgccagtggggacctgtgtgtctga618ArgAspLeuAsnCysValAlaSerGlyAspLeuCysVal*1952002052205PRT<213〉人<400〉2MetTh「GlyAspCysThrProValLeuValLeuMetAlaAlaValLeu15.1015ThrValThrGlyAlaValProValAlaArgLeuHisGlyAlaLeuPro202530.AspAlaArgG，yCysHislieAlaGinPheLysSerLeuSerProGin354045..GluLeuGinAlaPheU/sArgAlaLysAspAlaLeuGluGluSerLeu'505560LeuLeuLysAspCysArgQysHisSerArgLeuPheProArgThrTrp65707580AspLeuA「gGinLeuGinValArgGluArgProMetAlaLeuGluAla85卯95GluLeuAlaLeuThrLeuLysValLeuGluAlaThrAlaAspThrAsp100105110ProAlaLeuValAspValLeuAspGinProLeuHisThrLeuHisHis115120125lieLeuSe「GinPheA「gAlaCysValSerArgGinGlyLeuGlyThr130135140GinlieGinProGinProThrAlaGlyProArgTh「ArgGlyA「gLeu145150155160HisHisTrpLeuTyrArgLeuGinGluAlaProLysLysGluSerPro165170175GlyCysLeuGluAlaSerValTh廣PheAsnLeuPheArgLeuLeuThr180185190ArgAspLeuAsnQysValAlaSerGlyAspLeuQysVal1952002053615DNA人工序列<223〉簡併序列<221〉misc—feature<222〉(1)...(615)<223〉n=A,T,C或G3atgacnggngaytgyacnccngtnytngtngcngtnccngtngcrrnignytncayggngcncarttyaarwsnytnwsnccncargarytngargarwsnytnytnytnaargaytgymgngayytnmgncarytncargtnmgnganngnacnytnaargtnytngargcnacngcngaycarccnytncayacnytncaycayathytnggnytnggnacncarathcarccncarccncaycaytggytntaymgnytnca廠gargcngcnwsngtnacnttyaayytntt，gnytnggngayytntgygtn4603DNA<213〉人CDS<222〉(1)...(603)4ytnatggcngcngtnytnacngtnacnggn60ytnccngaygcnmgnggntgycayathgcn120cargcnttyaarmgngcnaargaygcnytn180tgycaywsnmgnytnttyccnmgnacntgg240ccnatggcnytngargcngarytngcnytn300acngayccngcnytngtngaygtnytngay360wsncarttymgngcritgygtnwsnmgnca廣420acngcnggncc闊nac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所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。2.權利要求1的分離的多肽，其中所述多肽特異地結合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯合SEQIDNO:41的異二聚體受體。3.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少95%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列的多肽。4.權利要求3的分離的多肽，其中所述多肽特異地結合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯合SEQIDNO:41的異二聚體受體。5.分離的多肽，包含SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。6.分離的多肽，包含SEQIDNO:7列第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列。7.分離的多肽，包含SEQIDNO:9第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:9列笫1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序。8.分離的多肽，包含SEQIDNO:11第29位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:11第1位胺基酸殘基到第202位胺基酸殘基所示胺基酸序列。9.分離的多肽，其是SEQIDNO:2第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:2第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。10.分離的多肽，其是SEQIDNO:7第22位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列或SEQIDNO:7第1位胺基酸殘基到第205位胺基酸殘基所示胺基酸序列中的至少14個連續胺基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應答。全文摘要本發明涉及與幹擾素α在胺基酸序列水平上極為緊密相關的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的多核苷酸和多肽分子。該蛋白質家族的受體是II類細胞因子受體。本發明包括降低病毒感染和增強單核細胞數量的方法。本發明還包括zcyto20多肽的抗體，和製備這些多核苷酸和多肽的方法。文檔編號C07K14/52GK101531715SQ200910126508公開日2009年9月16日申請日期2002年4月19日優先權日2001年4月20日發明者B·A·弗克斯,D·W·塔伏特,K·M·克魯施爾,P·O·舍帕德,W·R·金德斯沃格申請人:津莫吉尼蒂克斯公司