三突變型低氧誘導因子1α經其輔助激活因子誘導的血管新生及其運用的製作方法

2023-10-30 07:44:42

專利名稱：三突變型低氧誘導因子1α經其輔助激活因子誘導的血管新生及其運用的製作方法
技術領域：
本發明涉及三突變型低氧誘導因子Id基因治療領域。更具體地，本發明提供一 種利用三突變型低氧誘導因子Ia基因促進血管新生的方法，包括三突變型低氧誘導因 子Ia基因的構建，含有三突變型低氧誘導因子Ia基因的載體的構建，特別是重組腺病 毒載體的構建；該三突變型HIF-I α蛋白質，能夠與CREB結合蛋白/腺病毒ElA相關蛋白 P300(CBP/p300)以及組蛋白去乙醯酶(HDAC)等輔助激活因子結合促進血管內皮生長因子 (VEGF)等HIF-I α下遊靶基因的表達，以及它們作為冠心病、外周動脈缺血性血管疾病以 及間歇性跛行等的治療劑應用。
背景技術：
缺血性血管疾病(冠心病、缺血性腦血管病以及外周血管病)已成為威脅人類健 康的重大疾病。我國缺血性血管疾病發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。目前，對其主要治 療措施包括常規藥物治療、血運重建等，已經取得了重大成就。然而，相當一部分患者目前 的藥物治療難以見效，也不適於常規血運重建術處理，因此必須開闢新的治療途徑。近年來，促血管新生已成為缺血性血管疾病的治療新方向，是當前國際上最熱 點研究領域之一。先前曾報導了許多促血管新生因子，如血管內皮生長因子(VEGF)、 Fltl(VEGF-rec印tor)、成纖維生成因子(FGF)、血小板衍化生長因子(PDGF)、Endogl in、 轉化生成因子β (TGF-β)和血管生成素(angiopoietin)等。有些因子曾試用於臨床， 比如VEGF，但結果顯示VEGF可導致新生血管不成熟、組織水腫及血管滲漏，因而其臨床試 驗已停止(Lee, Springer et al. 2000 ；Schwarz, Speakman et al. 2000 ；Grines, Watkins et al. 2002 ；Losordo, Vale et al. 2002 ；Masaki, Yonemitsu et al. 2002 ；Fam, Verma et al. 2003；Lee, Rentz et al. 2003 ；Semenza 2003)。血管新生是組織對缺氧的適應性反應，廣泛存在於從胚胎發育、傷口癒合到腫瘤 生長等生理/病理過程中；同時，它是一個複雜的生物學過程，需要多種因子參與，依靠單 一的促血管新生因子很難完成。近10年研究顯示低氧誘導因子1 (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一個非常重要的核轉錄因子，能直接或間接調控100多種下遊靶基 因(review in(ffenger, Stiehl et al. 2005 ；Ke and Costa 2006))，這些下遊靴基因包 括血管生長、血管張力、糖代謝、紅細胞生成、幹細胞誘導分化等(Kaluz，Kaluz0va et al.2008)。到目前為止，已查明經HIF-I α直接調控參與血管新生的基因有30多種，是血 管新生的上遊核心調控因子(Thurston, Suri et al. 1999 ；Bruick and McKnight 2001 ； Semenza 2002 ；Hirota and Semenza 2005)。〈〈Science〉〉曾經發表評述"Discovery of these could open up new therapeutic possibilitiesfor the many diseases such as ischemic heart disease and stroke" (http://www. sciences ignaling.org/cgi/ content/abstract/sigtrans ；2001/108/tw418)，因此，HIF-I α 是一個十分有應用前景的 治療血管新生的功能基因。
HIF-I是由α和β兩個亞基組成的異二聚體(Wang，Jiang et al. 1995)，α 亞基為其功能活性發揮的關鍵性調節亞基，組織中HIF-I α的量與活性受氧濃度的調節。 HIF-I α g豐勾_中Lfi 1 ! P華角軍g (OxygenDependent Degradation Domain, ODDD), % HIF-I α的穩定性有關(Pugh，0' Rourke et al. 1997)。同時HIF-1 α的C末端含有2個相 對獨立的轉錄激活區(Transactivation Domains, TAD) :N_TAD 和 C-TAD (Ruas，Poellinger et al. 2002)，其中N-TAD與ODDD有部分重疊，參與HIF-I α穩定性的調節；C-TAD則與共 激活因子CBP/P300結合啟動下遊靶基因的轉錄(Lando，Peet et al. 2002)。HIF-I α穩定性調節主要與ODDD區上ft~o402以及Pro5642個脯氨酸殘基羥基 化有關(Ivan，Kondo et al. 2001)。常氧情況下，ftx)402和/或ft~o564被脯氨酸羥化酶 (prolyl hydroxylase domain, PHD)羥化後，HIF-I α與ρVHL泛素Ε3連接酶結合經泛素 途徑降解，故HIF-I α在常氧下的半衰期很短，約l-2min，5min即可全部降解(Salceda and Caro 1997)；低氧時，PHD功能受到抑制，HIF-I α不被降解因而變得穩定，穩定的HIF-I α 與HIF-Ιβ結合後，從胞漿轉位到核內。機體對HIF-I α的氧依賴的調節是雙重調節(Pugh and Ratcliffe 2003)，除了前述穩定性調節以外，更穩重要的是HIF-I α轉錄活性調節。常 氧情況下，C-TAD結構域內803位點上的天門冬醯胺(Asn8tl3)在HIF-I α抑制因子(factor InhibitingHIF, FIH)作用下羥化，故即使穩定的HIF(半衰期內，< 2-5min)轉位到核內 後，因HIF-I α的C-TAD不能與轉錄共激活因子CBP/P300結合，轉錄活性由此受到抑制； 低氧時，FIH功能受到抑制，不能有效的催化結構域內Asn8tl3羥基反應，從而使CBP/300與 非羥化的C-TAD結合激活下遊靶基2因轉錄(Hewitson，McNei 11 et al. 2002 ；Masson and Ratcliffe2003)。目前報導的 HIF-I α 的亞型有 HIF-I α WT，HIF-1 α FL, HIF-1 α 736, HIF-1 α 557， HIF-I α 516, HIF-I α 785 (Lee, Bae et al. 2004 ；Gaber, Dziurla etal. 2005)以及 HIF-I α 390 (Vincent, Shyu et al. 2000)等。突變型 HIF-1 α 缺乏部分或者全部 ODDD 或 /和C-TAD，故穩定性和/或轉錄活性明顯降低。Chun等先後實驗證實(Chun，Choi et al. 2000 ；Chun, Choi et al. 2001 ；Chun, Choi et al. 2002)因 HIF-1 α 736、HIF_1 α 557 以及 HIF-I α 三種缺陷型缺乏C-TAD結構域，突變型HIF-I α雖能與HIF-Ιβ結合從胞漿轉 位到核內，但是其轉錄活性明顯低於HIF-I α ffT,HIF-I α FL,VEGF的表達不足HIF-1 α WT以及 HIF-I α FL的1/3。突變型HIF-1 α 785含有C-TAD結構域，故其雖保留了轉錄活性；但是其 ODDD結構域缺陷(ΑΑ512_554)，並不能增加其在常氧下的穩定性(Je0ng，Bae et al. 2002)。另 一方面，HIF-I α作為一個核轉錄因子能調控如此眾多的下遊靶基因參與血管新生過程取 決於HIF-I α的TAD區與轉錄輔助激活因子的共同作用(Herzig，Long et al. 2001 ；Yoon, Puigserver et al. 2001 ；Hermanson, Glasset al. 2002 ；Kasper, Boussouar et al. 2002 ； Liu, Auboeuf et al. 2002 ；ffu, Qin et al. 2002)。目前已明確與 HIF-1 α TAD 區的轉錄活 性絕對的需要輔助激活因子有CREB結合蛋白/腺病毒ElA相關蛋白P300(CREB binding protein/p300,CBP/p300)的輔助(Kasper，Boussouar et al. 2005)。此外，組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylase, HDAC)亦在該過程起重要作用(Kasper, Boussouar et al. 2005)， 說明基因序列的完整性是其功能正常發揮的基礎。我們力圖在保留HIF-I α基因結構完整性的基礎上，通過基因工程技術獲得在常 氧條件下能成組表達且具有高效的轉錄活性HIF-I α，從而使HIF-I α常氧條件下具有促血管新生潛能，進一步開發出安全、穩定、高效的促血管新生的基因治療藥物。

發明內容
本項發明是以野生型HIF-I α在低氧條件下具有穩定性和高轉錄活性的特點為 基礎。HIF-2ci以及HIF-3ci與HIF-I α具有相似的基因和蛋白結構以及生物學功能，故在 本發明中主要闡述HIF-I α。一方面，本發明是以野生型HIF-I α蛋白質的結構以及功能為基礎。本發明提供 的野生型HIF-I α蛋白質是人HIF-I α蛋白質，是由SEQ ID NQ :2所編碼的蛋白質。在一 個實施例中，在野生型HIF-I α蛋白質胺基酸序列中，第402位上的胺基酸殘基是脯氨酸殘 基(Pro 402)、第564位上的胺基酸殘基是脯氨酸殘基(Pro 564)、第803位上的胺基酸殘 基是天門冬醯胺殘基(Asn 803)；野生型HIF-I α蛋白質可以是天然存在的HIF-I α蛋白 質(例如SEQ ID NQ :2所編碼的蛋白質)，也可以是與天然存在的HIF-I α蛋白質具有相 似結構且具有HIF-I α生物學功能的通過生物工程技術人工合成的相關蛋白質。本發明所述三突變型HIF-I α蛋白質與野生型HIF-I α蛋白質相比，該三突變型 HIF-I α蛋白質胺基酸序列上第402位上的脯氨酸殘基(Pro 402)，第564位上的脯氨酸殘 基(Pro 564)以及第803位上的天門冬醯胺殘基(Asn 803)均發生突變。所述突變可以是 替代或者缺失，優選是替代。在優選的實施例中，三突變型HIF-I α蛋白質是由SEQ ID NQ: 1所編碼的蛋白質。在三突變型HIF-I α蛋白質胺基酸序列中，第402位上的脯氨酸殘基 (Pro 402)被替代為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)；第564位上的脯氨酸殘基(Pro 564)被替代為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)；第803位上的天門冬醯胺殘基(Asn 803)被替代為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)；在優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-I α蛋白質在常氧條件下能明顯促 進下遊靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF, PAI-I、PDGF, Ang-I以及Ang_2等)表 達，與低氧條件下野生型HIF-I α蛋白質轉錄活性相比，該三突變型HIF-I α蛋白質在常氧 條件下具有高效的轉錄活性。在另一個優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-I α蛋 白質，與野生型HIF-I α蛋白質相比，其通過與輔助激活因子CBP/p300或/和HDAC結合， 來促進促進下遊靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF、PAI-I、PDGF，Ang-I以及Ang-2 等)表達。在另一個優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-Ια蛋白質，與野生型 HIF-I α蛋白質相比，能明顯增加下遊靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF、PAI-I以 及PDGF等)的在常氧條件下的穩定性。在另一個優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-Ια蛋白質，與野生型 HIF-I α蛋白質相比，能明顯促進形成成熟的具有功能的新生血管(例如促進內皮細胞增 殖、黏附、遷移以及降低新生血管滲漏)。另一方面，本發明提供編碼本發明中所述野生型HIF-Ια蛋白質以及三突變型 HIF-I α蛋白質的核酸序列。在一個實施例中，本發明所述野生型HIF-I α核苷酸序列編碼由擬6胺基酸殘基 組成的野生型HIF-I α蛋白質。在野生型HIF-I α核苷酸序列SEQ ID NQ :2中，與編碼第 402位上的脯氨酸殘基相對應的密碼子是CCk,與編碼第564位上的脯氨酸殘基相對應的密碼子是CCC，與編碼第803位上的天門冬醯胺殘基相對應的密碼子是AAT。在優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-I α核苷酸序列編碼由擬6胺基酸 殘基組成的三突變型HIF-I α蛋白質。在三突變型HIF-I α核苷酸序列SEQ ID NQ :1中， 編碼第402位上的脯氨酸殘基的密碼子由CCA替代為其他密碼子(例如GCA)，編碼第564 位上的脯氨酸殘基的密碼子由CCC替代為其他密碼子(例如GCC)，編碼第803位上的天門 冬醯胺殘基的密碼子由AAT替代為其他密碼子(例如GCT)。在其他實施例中，本發明指向至少中等度嚴緊條件下與本文提供的核苷酸、或其 片段、或其互補序列能夠雜交的核苷酸。在核酸雜交反應時，根據核酸的性質，長度，高度的 互補性，核苷酸序列組成來確定其嚴緊程度。典型地，「雜交條件」根據測量雜交時所用的 「嚴緊性」程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合複合物或者探針的解鏈溫度(Tm) 為依據。例如，「最大嚴緊性」典型地發生在約Tm-5°C (低於探針Tm 5°C )；「高等嚴緊性」 發生在約Tm以下約5 10°C;「中等嚴緊性」發生在約Tm以下約10 20°C;「低等嚴緊性」 發生在約Tm以下約20 25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或者離 子強度條件和/或依次或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6XSSC=極低嚴緊性；3XSSC =低至中嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性；0.5XSSC=高等嚴緊性。從功能上說，可以採用最 大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而採用高等嚴緊性條件 確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對於要求高的選擇性應用，典型地期望採用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如 選擇相對低的鹽和/或高溫條件。Sambrook等(Sambrook，J等《分子克隆——實驗室手 冊》，Cold Spring Harbor Press, Plain-view, N. Y.)提供了中等嚴緊性和高等嚴緊性在內 的雜交條件。本發明中所涉及的核酸與其他核酸分子雜交的高等嚴緊性實驗條件為在 2XSSC.0. 1% SDSUmM EDTA(pH = 8. 0)以及室溫條件下雜交，繼而分別在低嚴緊條件 (2XSSC.0. 1% SDS以及室溫)、中嚴緊條件(0. 2XSSC、0. 1% SDS以及42°C )、高嚴緊條 件(0. 2X SSC以及68°C )條件下洗滌10 15分鐘。本領域技術人員應當理解，然而，如上 所述，最佳條件會有所不同，依具體的雜交反應根據相關實驗經驗來確定。在優選的實施例中，本發明所述三突變型HIF-I α核苷酸序列編碼的三突變型 HIF-I α蛋白質，與野生型HIF-I α核苷酸序列編碼的野生型HIF-I α蛋白質相比，三突 變型HIF-I α核苷酸序列能更穩定、更高水平的表達HIF-I α蛋白質，而這種三突變型 HIF-I α蛋白質與野生型HIF-I α相比具有更高的促進下遊靶基因轉錄的活性。在另一方面，本發明提供包含本發明的核酸分子載體，優選是病毒載體，更優選是 腺病毒載體，特別是5型腺病毒載體。本發明還提供包含野生型HIF-I α編碼核酸的腺病 毒載體，特別是5型腺病毒載體。在一個實施例中，本發明所述載體是能夠表達三突變型HIF-I α核酸序列的表 達載體，與含有野生型HIF-I α核酸序列的表達載體相比，能夠更穩定，更高水平的表達 HIF-I α蛋白質，而這種三突變型HIF-I α蛋白質與野生型HIF-I α相比具有更高的促進下 遊靶基因轉錄的活性。在另一方面，本發明提供含有本發明核酸分子或者本發明的宿主細胞。宿主細胞 可以是動物細胞、植物細胞和微生物(包括真菌以及細菌等)等。
在另一方面，本發明提供含有本發明三突變型HIF-I α蛋白質、或本發明三突變 型HIF-I α核苷酸序列、或本發明載體的組合物。本發明組合物優選是藥物組合物，優選還 含有藥用助劑。如賦形劑。更優選的，所述組合物是用於治療缺血性疾病的藥物組合物， 該藥物組合物優選可以被配置成注射液或者凍乾粉針。或者，該組合物可以是促進血管新 生或改善缺血的藥物組合物，所述藥物組合物是用於提高常氧條件下HIF-I α蛋白質表達 水平，或延長HIF-I α蛋白質半衰期，以及增強HIF-I α蛋白質轉錄的組合物。在另一方面，本發明提供含有本發明三突變型HIF-I α蛋白質、或本發明三突變 型HIF-I α核苷酸序列、或本發明載體在製備用於治療缺血性疾病以及可以是促進血管新 生或改善缺血的藥物用途。在另一方面，本發明提供含有本發明三突變型HIF-I α蛋白質、或本發明三突變 型HIF-I α核苷酸序列、或本發明載體在製備用於提高常氧條件下HIF-I α蛋白質表達水 平，或延長HIF-Ια蛋白質半衰期，以及增強HIF-I α蛋白質轉錄的藥物中的用途。本發明構建了表達人HIF-I α基因的重組腺病毒載體，為採用HIF_1 α轉基因治 療缺血性疾病(冠心病、外周血管疾病以及間歇性跛行)奠定了基礎。本發明構建的重組人 HIF-I α基因腺病毒載體是El區複製缺陷型腺病毒El區基因是腺病毒複製所必需的基因， 該區編碼的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的轉錄，對有關細胞基因的轉錄也有明顯的 調控作用，El區的功能由輔助細胞反式提供，最常用的輔助細胞是293細胞，是由人胚胎腎 細胞經Ad5DNA片斷轉染後發生轉化而形成的，其基因組中整合了含有腺病毒El區的片段， 可持續表達El區蛋白，用於增殖El區缺失的腺病毒載體。因此這就決定了複製缺陷型腺 病毒在靶細胞中只有一次感染機會而無複製能力，從而完成腺病毒載體的功能，避免腺病 毒本身對靶細胞的損害，達到安全轉移基因之目的。


為了讓上述發明的特徵、優勢、目的以及其他方面的闡述更加的明晰，上述發明簡 述包含的詳細內容有可能在附圖/表中得到有關說明。這些附圖/表成為發明詳細內容的 一部分。需要值得注意的是，這些附圖/表僅是對本發明內容的進一步解釋說明，因此對本 發明的範圍不構成任何限制。圖1、pcDNA3. l/V5_HisA結構示意圖及其多克隆位點。圖2、pcDNA3. 1(+)結構示意圖及其多克隆位點。圖3、穿梭質粒pamttle2結構示意圖及其多克隆位點。圖4、腺病毒骨架質粒pAdeno-X Viral DNA結構示意圖及其酶切位點。圖 5、腺病毒表達系統 Adeno-X Adenoviral Expression System 1 構建流程圖。圖6、重組 pcDNA3. 1(+)-HIF-Ianative 質粒以 Kpn I、Xba I 作單、雙酶切鑑定圖。 1 :pcDNA3. l/V5-HisA-HIF-l α 經 Xba I 單酶切；2 :pcDNA3. l/V5-HisA-HIF_l α 經 Kpn I、Xba I 雙酶切；M :DL15000 Marker。圖 7、pcDNA3. 1 (+)酶切圖。1 :pcDNA3. 1 (+)；2 :pcDNA3. 1(+)Kpn I、Xba I 雙酶切。
M :DL15000 Marker ；圖8、重組 pShuttle2-HIF_lanative 質粒作 Nhe I、Apa I 單、雙酶切鑑定圖。1 :pcDNA 3. 1 (+) -HIF-I α native ；2 :pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α native 經 Apa I, Nhe I 雙酶切；3 :pShuttle2 經 Apa I、Nhe I 雙酶切。M :DL15000 Marker ；圖9、重組穿梭質粒pShuttle2-HIF-l α native測序結果。圖9A 402位點；圖9B :564位點；圖9C :803位點；圖10、重組穿梭質粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 BspT104I、Age I單、雙酶切鑑定圖。1 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 BspT104I 單酶切；2-3 :pShuttle2HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 BspT104I、Age I 雙酶切；4 :DL2000 Marker ；5 :DL15000 Marker。圖11、重組穿梭質粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 測序結果。圖IlA 402 位點；圖 IlB :564 位點；圖 IlC :803 位點；圖12、重組穿梭質粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 Pl-SceI、I-CeuI 雙酶切。M:DL15000Marker ；1 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 ΡΙ—Sce I、I-CeuI 雙酶切。圖13、pAdeno-HIF-1 α native 經 Xho I 酶切鑑定。1 :pAdeno-HIF-l α native.2 :pAdeno-HIF-l α nativediges ted by Xho I.M λ -Hind III digest.圖14、pAdeno-HIF-1 α native 經突變區引物 PCR 鑑定。1 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 產物(引物 l、2，380bp)；2 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 產物(引物 3、4，460bp)；3 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 產物(引物 5、6，214bp)；圖15、pAdeno-HIF-1 α native 經 BD. Clontech 所提供引物 PCR 鑑定(引物 A、B)。圖 16、pAdeno-HIF-1 α -Ala402-Ala564-Ala803 經 Xho I 酶切鑑定。1 :pAdeno-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 ；2 :pAdeno-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 經 Xho I 切；3 :Marker λ -Hind III ；圖17、pAdeno-HIF-1 α -Ala402-Ala564-Ala803 經突變區引物 PCR 鑑定。M :Marker I ；1 :PShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803PCR 產物(引物 A、B, 287bp)；2 :pShuttle2-HIF-l α -Ala4ci2-Ala564-Ala8ci3PCR 產物(引物 l、2，380bp)；3 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803PCR 產物(引物 3、4，460bp)；4 :pShuttle2-HIF-l α -Ala4ci2-Ala564-Ala8ci3PCR 產物(引物 5、6，214bp)；
圖18、三突變HIF-I α在常氧條件下的表達以及其對下遊促血管新生基因的轉錄 活性。圖18Α =HIF-I α的mRNA的表達水平；圖18B
VEGF的mRNA的表達水平；圖18C =PLGF的mRNA的表達水平；圖18D =PAI-I的mRNA的 表達水平；圖18E =PDGF的mRNA的表達水平；圖19、三突變HIF-I α常氧條件下的穩定性以及其對下遊促血管新生基因的穩定 性的影響。圖19Α =HIF-I α的半衰期；圖19Β =VEGF的半衰期；圖19C =PLGF的半衰期；圖 19D =PAI-I的半衰期；圖19Ε =PDGF的半衰期；圖20、三突變HIF-I α基因在常氧條件下的促血管新生作用。圖20Α 三突變型 HIF-I α對HMVEC-L細胞增殖的影響；圖20Β 三突變型HIF-I α對HMVEC-L遷移的影響； 圖20C 三突變型HIF-I α對HMVEC-L管樣形成能力的影響；圖20D-E 三突變型HIF-I α對 HMVEC-L血管滲漏的影響。圖21、輔助激活因子08 / 300在!1正-1(1誘導的促血管新生基因轉錄中的作用。圖2IA =VEGF的mRNA的表達水平；圖21B =PLGF的mRNA的表達水平；圖21C =PAI-I 的mRNA的表達水平；圖21D =PDGF的mRNA的表達水平；圖22、輔助激活因子HDAC在HIF-I α誘導的促血管新生基因轉錄中的作用。圖22Α =VEGF的mRNA的表達水平；圖22B =PLGF的mRNA的表達水平；圖22C =PAI-I 的mRNA的表達水平；圖22D =PDGF的mRNA的表達水平；圖23、輔助激活因子CBP/p300和HDAC在HIF-1 α誘導的促血管新生基因轉錄中 的作用。圖23Α =VEGF的mRNA的表達水平；圖2!3B =PLGF的mRNA的表達水平；圖23C =PAI-I 的mRNA的表達水平；圖23D =PDGF的mRNA的表達水平；
圖24、病毒滴度測定(終點稀釋實驗法)示意具體實施例實施例1三突變型HIF-I α重組腺病毒載體的構建1、重組 pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native 的構建(1)、以 Kpn I、Xba I 酶切 pcDNA3. l/V5-HisA-HIF_l α native,用 Omega 凝膠回收 試劑盒(具體步驟參照試劑盒使用說明)膠回收目的基因片段(HIF-1 α nativecDNA片段)， 約2500bp大小，回收後取適量進行瓊脂糖凝膠(1% )電泳，其結果見圖6。酶切反應體系如下
pcDNA3. l/V5-HisA-HIF-l α native約 μ g
Kpn I1 μ L
Xba I1 μ L
IOXM酶切緩衝液2μ L
加滅菌去離子水至總體積為20 μ L
(2)、同以上方法以Kpn I、Xba I雙酶切pcDNA3. 1 (+)，膠回收線性化pcDNA3. 1 (+)
片段(方法同HIF-I α nativecDNA片段的回收)，約MOObp大小，回收後取適量進行瓊脂糖凝 膠(1%)電泳，其結果見圖7。 (3)、將獲得的HIF-I α nativecDNA片段以及pcDNA3. 1⑴片段在T4DNA連接酶的作用下連接重組為pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α
連接反應體系
native° HIF-I α
native
cDNA片段
6 μ LpcDNA3. 1 (+)片段IOXligase BufferT4 DNA ligase (5ffeiss u/μ L)總體積16 °C
2μ L 1 μ L 0. 5μ L 10. 0μ L 10-12h(4)、將連接產物轉化感受態DH5 α，塗布到氨苄青黴素抗性固體培養基平皿。轉化 的具體步驟①、取200 μ L貯存於_70°C感受態DH5 α，冰浴融化。②、加入上述連接產物10 μ L，輕輕混勻，冰浴20_30min。③、於42°C水浴中熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-aiiin。④、加入LB液體培養基200 μ L，於37°C緩慢振搖培養45min (約100轉/min)。⑤、將培養物適量塗於氨苄青黴素抗性瓊脂LB平板(約50 100 μ L/平板)，待 平板表面沒有液體流動時，37°C孵箱倒置培養12-1他。(5)、重組子篩選及質粒提取，具體步驟如下①無菌接種環挑取平板上生長的中等大小的單菌落約3 5個，分別接種於約5ml 左右的氨苄抗性LB液體培養基，37°C振搖培養(約200轉/分)過夜後，各取菌液IOyL 行菌液PCR鑑定，餘則暫置於4°C保存。②引物為HIF-I α突變1區或/和突變2區或/和突變3區片段引物，PCR反應 體系及程序如下PCR反應體系菌液10. OyL引物1 或 3 或 5(10D/500yL)2. 0 μ L引物2 或 4 或 6(10D/500y L)2. 0 μ LdNTP4. 0μ L
TaqDNA 聚合酶 0· 25 μ L10 X PCR 緩衝液5. OyL加滅菌去離子水至總體積為50. OyLPCR 反應程序94°C 2min — 94°C 30s — 52°C 30s 72°C Imin — 94°C 30s共30個循環。附引物序列如下①突變1區(Pro402)片段引物上遊引物(Primer1) 5' -AGCACGACTTGATTTTCTCCC-3『下遊引物(Primer2) 5' -TTCTTGATTGAGTGCAGGGT-3『PCR產物片段長380bp②突變2區(Pro564)片段引物上遊引物(Primer3) 5' -GACACAGAAGCAAAGAACCC-3『下遊引物(Primer4) 5' -TCAAAGCGACAGATAACACG-3『
720C Imin — 72°C 5min，其中
PCR產物片段長460bp③突變3區(Asn803)片段引物上遊引物(Primer5) 5' -CCAGACGATCATGCAGCTAC-3『下遊引物(Primer6) 5' -GGTTTCTGCTGCCTTGTATAG-3『PCR產物片段長214bp備註上述所有引物均按照說明書配製成終濃度lOpmol/μ L。③將PCR反應產物各取5 μ L進行瓊脂糖凝膠(1.5 2%)電泳，紫外燈下觀察電 泳結果正確後(不保存該電泳結果)，取PCR鑑定正確的菌液Iml接種於100 200ml左右 的氨苄青黴素抗性LB液體培養基，37°C振搖培養過夜。④用Omega質粒提取試劑盒提取重組pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α質粒質粒(具體步驟 參照試劑盒使用說明)。(6)、重組 pcDNA3. 1 (+)-HIF-I α native 質粒酶切鑑定。以 Kpn I、XbaI 對所提重組 質粒作單、雙酶切鑑定(酶切方法同前)2、重組穿梭質粒 pShuttle2-HIF_l α native 的構建(1)、以 Nhe I, Apa I 雙酶切 pcDNA3. 1 ⑴-HIF-l α native，具體步驟如下①先以Apa I單酶切獲得線性化的pcDNA3. 1 (+)-HIF-I α native，Apa I單酶切反應 體系如下Apa I單酶切反應體系pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α native 約 1· O μ gApa Il.OyL10XL酶切緩衝液2. OyL加滅菌去離子水至總體積為20. OyL酶切約2_3h②、乙醇沉澱法獲得Apa I單酶切產物，方法如下a.在酶切產物中加入TE 80 μ L，再加入無水乙醇200 μ L、3Μ 醋酸鈉 10yL、糖原 lyL。b.充分搖動混勻，4°C下14000rpm離心5min。c.小心棄去上清，此時可見有少量白色沉澱物。d.小心加入300 μ L 75%乙醇，室溫下14000rpm離心2min。e.小心吸棄上清，室溫約IOmin自然風乾(可置超淨臺內)，避免過度乾燥。f.以 15 μ L TE 重新溶解 DNA,即已線性化的 pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α。③、再Nhe I單酶切線性化的pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native, Nhe I單酶切反應體系 如下Nhe I單酶切反應體系線性化pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native 約 1· 0 μ gNhe Il.OyLIOXM酶切緩衝液2. OyL加滅菌去離子水至總體積為20. OyL酶切約2_3h
④、酶切產物行瓊脂糖凝膠(1%)電泳，膠回收HIF-I CinativeCDNA片段，方法同前， 其結果見圖8。O)、以Nhe I、Apa I先後酶切pShuttle2質粒，方法同上，對線性化pShuttle2作 膠回收，以完全去除pShuttle2質粒雙酶切後的多克隆位點內小片段DNA，其結果見圖8。(3)、連接重組pShuttle2-HIF-lanative，連接產物轉化感受態DH5a，重組子篩選 及重組pShuttle2-HIF-l a native質粒提取。方法同前，只是在抗性篩選時改用卡那黴素，終 濃度為50μ g/mL。(4)、重組pShuttle2-HIF-l α native質粒作Nhe I和Apa I單、雙酶切鑑定，將酶切 產物進行瓊脂糖凝膠(1. 5 2% )電泳，紫外燈下觀察電泳結果正確後(不保存該電泳結 果)，取0. 5-1 μ L質粒用HIF-I α突變區片段引物作PCR鑑定，並將PCR產物送基因測序公 司(博亞)測序，測序結果見圖9。 3、在pShUttle2-HIF-lanative基因序列的基礎上運用 定點突變技術構建 pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564_Ala803(1)、將HIF-I α native基因序列上編碼HIF-I α native蛋白質第402位脯氨酸殘基 (Pro)的密碼子CCA突變為丙氨酸(Ala)密碼子GCA，反應體系如下
權利要求
1.三突變型HIF-Ια蛋白質是由1-擬6個胺基酸殘基組成[SEQID NO. 1編碼的蛋 白質]，包含氧依賴降解結構域(ODDD)以及轉錄激活區(TAD)這兩個重要的功能區，其中 ODDD區內第402位上的脯氨酸(ftx))殘基突變為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)，和 第564位上的脯氨酸(ftx))殘基突變為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)，以及TAD區內 第803位上的天冬醯胺(Asn)殘基突變為其他任何胺基酸殘基(例如丙氨酸)。
2.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質在常氧條件下的穩定性不再受脯氨酸羥化 酶(PHD)的調控，從而使其在常氧條件下的穩定性不低於野生型HIF-I α蛋白質[SEQ ID NO. 2編碼的蛋白質]在低氧條件下的穩定性。
3.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質在常氧條件下的轉錄活性不再受HIF-I抑制 因子(FIH-I)的調控，從而其在常氧條件下也具有高效的轉錄活。
4.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質，能夠與CREB結合蛋白/腺病毒ElA相關 蛋白P300(CBP/p300)以及組蛋白去乙醯酶(HDAC)等輔助激活因子結合促進血管內皮生長 因子(VEGF)、胎盤生長因子(PLGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、纖溶酶原激活物抑制因 子-I(PAI-I)等HIF-I α下遊靶基因的表達。
5.編碼權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質是三突變型HIF-I α核酸分子[SEQ ID NO. 1中的核酸分子序列]。
6.權利要求5的三突變型HIF-Iα核酸分子，與野生型HIF-I α核酸分子[SEQ ID NO. 2中的核酸分子序列]相比，其編碼的三突變型HIF-I α蛋白質在常氧條件下更穩定且 更高的表達水平，該HIF-I α蛋白質與野生型HIF-la蛋白質相比在常氧條件下具有更高 的轉錄活性。
7.含有權利要求1所述的三突變型HIF-Iα核酸分子的表達載體，優選是病毒載體， 更優選是腺病毒載體，特別是5型腺病毒載體。
8.權利要求7的載體，其是能夠表達權利要求6-7的三突變型HIF-Iα核酸分子的表 達載體；優選地，該表達載體與含有野生型HIF-I α蛋白質編碼核酸分子的相同載體相比， 能夠更穩定、更高水平表達HIF-I α蛋白質；該HIF-la蛋白質優選與野生型HIF-I α蛋白 質相比具有提高的轉錄因子活性。
9.含有權利要求2中載體的宿主細胞，可以是原核細胞，也可以是真核細胞。
10.提高HIF-Iα蛋白質在常氧條件下的穩定性或者表達水平、和/或提高HIF-I α 蛋白質的轉錄活性的體外方法，包括同時將野生型HIF-I α蛋白質(優選人HIF-la蛋白 質)分子序列中第402位點、第564位點上的脯氨酸(ftx))殘基突變為其他任何胺基酸殘 基(例如丙氨酸)，以及第803位上的天冬醯胺(Asn)殘基突變為其他任何胺基酸殘基(例 如丙氨酸)，其與野生型HIF-I α蛋白質相比，該三突變型HIF-I α蛋白質第402位、第564 位和第803位點上的胺基酸發生了突變，使得該三突變型HIF-I α蛋白質在常氧條件下的 穩定性或者表達水平與野生型HIF-I α蛋白質相比提高了，以及該三突變型HIF-I α蛋白 質的轉錄活性與野生型HIF-I α蛋白質相比也提高了。
11.提供HIF-Iα核酸分子呈成組型表達的體外方法在允許權利要求1所述三突變 型HIF-I α核酸分子表達的條件下，用該核酸分子轉染細胞，從而使核酸分子呈成組型表 達。
12.提高HIF-Iα核酸分子表達的體外方法，在允許權利要求7中載體所攜帶的核酸分子表達的條件下，通過該載體介導權利要求1的三突變型HIF-I α核酸分子轉染細胞，從而 增加HIF-I α核酸分子在該細胞中的表達。
13.提供一個減輕低氧或缺血所導致組織損傷的方法在機體的低氧或缺血部位給 予有效劑量的權利要求1所提供的三突變型HIF-I α核酸分子，該核酸分子由藥學上可接 受的載體所介導，從而減輕低氧或缺血所導致的組織損傷。
14.權利要求13所述的低氧或缺血所導致組織損傷與心、腦，或周圍循環障礙密切相關。
15.提供一種在哺乳動物體內促進血管新生的方法給予哺乳動物有效劑量權利要求 1的三突變型HIF-I α蛋白質，或權利要求5的三突變型HIF-I α核酸分子，或者權利要求 7或8的載體的組合物；或/和給予CBP/p300以及CBP/p300的激動劑；或/和給予HDAC 以及HDAC的激動劑。
16.權利要求15中的哺乳動物，優選是人。
17.含有權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質、權利要求5的三突變型HIF-I α核酸 分子、或者權利要求7或8的載體的組合物，特別是藥物組合物，優選還含有可藥用助劑，如 賦形劑；特別是用於治療缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周動脈缺血性血 管疾病以及間歇性跛行)的藥物組合物，該藥物組合物優選可以被配置成注射液或凍乾粉 針。
18.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質、權利要求5的三突變型HIF-I α核酸分 子、或者權利要求7或8的載體在製備用於治療缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病 如外周動脈缺血性血管疾病以及間歇性跛行)的藥物中的用途。
19.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質、權利要求5的三突變型HIF-I α核酸分 子、或者權利要求7或8的載體在製備用於促進血管新生或者改善缺血的藥物中的用途。
20.權利要求1的三突變型HIF-Iα蛋白質、權利要求5的三突變型HIF-I α核酸分 子、或者權利要求7或8的載體在製備用於提高HIF-I α蛋白質在常氧條件下的穩定性或 者表達水平、和/或提高HIF-I α蛋白質的轉錄因子活性的藥物中的用途。
全文摘要
本發明的發明名稱是三突變型低氧誘導因子1α經其輔助激活因子誘導的血管新生及其運用。本發明涉及三突變型低氧誘導因子1α，其編碼核酸，含有三突變型低氧誘導因子1α編碼核酸的載體，特別是重組腺病毒載體，以及含有它們的藥物組合物。三突變型HIF-1α蛋白質，能夠與CREB結合蛋白/腺病毒E1A相關蛋白P300(CBP/p300)以及組蛋白去乙醯酶(HDAC)等輔助激活因子結合促進血管內皮生長因子(VEGF)等HIF-1α下遊靶基因的表達。本發明的三突變蛋白質、核酸、載體和藥物組合物可用於治療缺血性疾病的促血管新生治療，例如冠心病、外周動脈缺血性血管疾病以及間歇性跛行等。
文檔編號A61K38/17GK102120764SQ20101001930
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月11日 優先權日2010年1月11日
發明者傅銳斌, 劉城, 吳平生, 賓建平, 王月剛, 童鍇, 胡英芳, 謝宜軍, 賴豔嫻, 郭壽貴 申請人:劉城, 吳平生, 王月剛