一種硫酸銨促進EupergitC250固定化草酸脫羧酶的方法
2023-10-17 13:04:34 1
專利名稱:一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物化工技術領域：
，特別是提供了一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法。
背景技術：
草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化轉化草酸為甲酸和C02，是生物體內催化降解草酸及草酸鹽的三種酶之一，對底物草酸具有較強的專一性。草酸脫羧酶已被應用於高草酸尿、尿石症等臨床醫療檢測，其在食品、工業等領域也具有廣闊的應用前景。將草酸脫羧酶應用於啤酒工業中可控制和降解富含草酸鹽的啤酒石；用於氧化鋁冶煉工業中可以高效處理生產過程的草酸廢棄物；用於造紙製漿過程可降低在流程管路、過濾器或換熱器等設備上草酸鹽的結垢風險(曹茂新等，草酸脫羧酶及其應用，中國生物工程雜誌， 2005(增)170-175)。草酸脫羧酶主要存在於木材腐敗真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金針 (Flammulina velutipes)、黑麴黴(Aspergillus niger)、雙抱蘑 (Agaricus bisporus)等，細菌中枯草桿菌(Bacillus subtil is)的草酸脫羧酶研究報導較多。目前草酸脫羧酶的製備有兩種方法一是對高產的野生菌進行酸誘導發酵，產酶水平約在 20U/L 左右 Oiu CX 等，Induction of an Oxalate decarboxylase in the Filamentous Fungus Trametes versicolor by Addition of Inorganic Acids, Appl Biochem Biotechnol, 2010,160 (2) :655-664) ；二是構建草酸脫羧酶的轉基因工程菌進行高效誘導合成，產酶水平約為820U/g(wet weight)。總體看，目前草酸脫羧酶的生產製備成本比較高，這直接限制了其在各種工業過程的應用。
酶固定化是降低酶催化成本、提高酶穩定性的有效方法。目前已有結晶交聯固定化草酸脫羧酶的方法(結晶化的草酸脫羧酶和使用方法，中國專利公開號CN 101583375A)，但存在固定化過程必須首先實現酶的結晶、固定化酶粒度難以控制等問題， 獲得的結晶交聯固定化草酸脫羧酶操作性能差，僅適合於製作口服酶製劑而不適用於工業降解草酸的操作條件。通過共價連接將酶固定於樹脂等載體上可以有效地改善固定化酶的的操作性能；合理控制固定化反應條件，實現酶與載體間的多點共價連接，還可以有效穩定多聚體酶的四級結構，這對於維持草酸脫羧酶六聚體結構的穩定性與活性非常重要。聚丙烯酸載體C(Eupergit C)，直徑約100-250 μ m，具有化學、機械性能穩定；可長期存放；具有較高的反應活性，可以和蛋白質上的氨基、巰基、羥基等基團反應形成穩定多點共價鍵；固定化後未反應的環氧基團易於使用巰基乙醇或二硫蘇糖醇進行封閉等優點，是酶固定化常用的商品化載體(Ephraim KK 等 Eupergit C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential, Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 10,2000. 157-176)，目前已成功應用於青黴素醯胺酶、環狀糊精葡萄糖基轉移酶、磷酸二酯酶、脂肪酶等多種工業酶的固定化。使用Eupergit C固定化酶反應歷程需經過吸附和共價反應兩步。由於Eupergit C表面具有較強的疏水性，而酶的親水性一般較強，因此需通過提高緩衝液的濃度促進載體對酶的吸附，加快固定化的反應歷程以減少固定化造成的酶活損失。而一些緩衝對價格比較高，提高緩衝液濃度的方法必將大幅增加固定化反應的成本。 此外，利用Eupergit C固定化草酸脫羧酶用於流體中草酸及草酸鹽降解迄今未見報導。
發明內容
本發明目的是提供一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，該方法操作簡單，製備所得固定化草酸脫羧酶酶活可達410U/g，酶活回收達84%以上。製備所得固定化草酸脫羧酶可用於工業或食品中草酸及草酸鹽的降解。
本發明的技術方案一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法。 包括草酸脫羧酶的誘導表達，親和層析分離純化草酸脫羧酶，草酸脫羧酶固定化三部分。工藝步驟如下
(1)重組草酸脫羧酶的誘導表達
將產草酸脫羧酶基因工程菌E. coli BL21(DE;3)/pET32a/YVrK進行發酵培養。當細菌生長至0D600為0. 4時，42°C熱衝擊5min，加人MnCl2及IPTG誘導草酸脫羧酶表達，離心收集菌體，磷酸鹽緩衝液重懸菌體後進行超聲破碎細菌，離心收集上清為粗酶液。
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶
使用AKTA-FPLC系統進行酶純化。粗酶液過0. 2um孔徑膜後上柱(5mL HisTrap HP)，調節洗脫液中咪唑濃度進行洗脫，將草酸脫羧酶與其他雜質分離。分級酶液利用 SDS-PAGE進行分析鑑定。有活性的純化酶液經超濾濃縮、PD-10柱脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。
(3)草酸脫羧酶固定化
Eupergit C 250首先使用50mmol/L磷酸鹽緩衝液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達0. l-2mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉速振蕩固定化反應4-72h。離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩餘環氧基團，反應1 後過濾，用緩衝液洗滌，衝洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無酶活性，即得固定化草酸脫羧酶，4°C用緩衝液保存待用。
游離草酸脫羧酶活性測定草酸脫羧酶活力測定採用終止反應法。反應液含 0. 115mol/L草酸鉀，80μπκ)1/1 MnCl2, 50mmol/L pH4. 0檸檬酸緩衝液，加入草酸脫羧酶液開始反應，IOmin後加入等體積的0. 2mol/L磷酸氫二鉀使體系pH上升至7. 2終止反應。 過0.20 μ m微孔膜除去酶蛋白，採用液相色譜法(HPLC)檢測反應生成的甲酸。色譜柱為 Aminex resin-based 87H 柱，柱溫 65°C ；流動相為 0. 004mol/LH2S04，流速 0. 6mL/min ；紫外檢測器210nm檢測；進樣量20 μ L。酶活單位定義為每分鐘催化轉化草酸產生1 μ mol 甲酸的酶量。
固定化草酸脫羧酶活性測定方法同游離草酸脫羧酶酶活測定方法，反應在120rpm 震蕩條件下進行。
固定化酶活回收率回收的固定化酶的酶活力與用於固定化的酶的總活力之比。
本發明的優點在於
①利用成熟的固定化載體Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶，利於草酸脫羧酶的回收及重複使用，提高酶對溫度等影響因子的穩定性，克服了草酸脫羧酶應用中成本較高的問題，同時改善了固定化草酸脫羧酶應用中的操作性能；
②應用添加中性鹽硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶，提高了酶的固定化效率，操作簡單，成本低。
具體實施方式
為了更好的理解本發明，下面結合實施例子對本發明做進一步的描述。
實例1
(1)重組草酸脫羧酶的誘導表達
將基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET32a/YvrK接於含氨苄青黴素(0. lmg/ml)的 LB培養基中37°C，200r/min進行培養。細菌生長至0D600為0. 4時，42°C熱衝擊5min，將溫度降回37°C，加人MnCl2至終濃度為5mmol/L，IPTG終濃度至0. 4mmol/L,誘導表達4h後， 離心收集細菌沉澱，按每克溼重菌體加IOmL磷酸鹽緩衝液(50mmol/L，pH8. 0)重懸菌體，超聲破碎細菌後，離心收集上清為粗酶液。
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶
使用AKTA-FPLC系統進行酶純化。先以5倍柱床體積A緩衝液(含20mmol/L咪唑，0. 5mol/L NaCl,50mmol/L的pH8. 0磷酸鹽緩衝液)平衡柱床。粗酶液過0. 2um孔徑膜後上柱，按以下程序洗脫含0%的B緩衝液(含20mmol/L咪唑，0. 5mol/L NaCl, 500mmol/L 的pH8. 0磷酸鹽緩衝液)衝洗15個柱體積，含10%的B緩衝液衝洗8個柱體積，B液10% 至100%線性梯度洗脫10個柱體積。洗脫流速為lmL/min。合併有活性的分級液，經超濾濃縮、PD-10柱脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。
(3)草酸脫羧酶固定化
Eupergit C 250首先使用磷酸鹽緩衝液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達1.5mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉速振蕩固定化反應 4-72h，離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩餘環氧基團，反應1 後過濾，用緩衝液洗滌，衝洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無酶活性，即得固定化草酸脫羧酶。
測定該固定化酶活力為410U/g，酶活回收率為84. 2%
實例2
(1)重組草酸脫羧酶的誘導表達同實例1
(2)親和層析分離純化草酸脫羧酶同實例1
(3)草酸脫羧酶固定化
EupergitC首先使用磷酸鹽緩衝液浸泡溶脹，加入純化草酸脫羧酶，加入硫酸銨使之濃度達0. l-2mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的轉速振蕩固定化反應4_72h， 離心棄去上清，加入5%巰基乙醇封閉剩餘環氧基團，反應1 後過濾，用緩衝液洗滌，衝洗巰基乙醇及未固定上的游離酶，直至洗出液中無酶活性，即得固定化草酸脫羧酶。
固定化過程蛋白質回收率、固定化酶活回收率以及固定化酶的表觀比活見表1。
表1添加硫酸銨對Eupergit C固定化草酸脫羧酶的影響
5
權利要求
1.一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，包括重組草酸脫羧酶的誘導表達，草酸脫羧酶的純化，以及固定化草酸脫羧酶的步驟；其特徵在於使用含活性環氧基的Eupergit C 250為固定化酶載體。
2.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於使用含活性環氧基的EupergitC 250為固定化酶載體，固定化操作過程添加硫酸銨。
3.如權利要求
1或2所述的方法，其特徵在於使用含活性環氧基的EupergitC 250 為固定化酶載體，固定化操作過程添加的硫酸銨是一種中性鹽，濃度為0. l-2mol/L。
專利摘要
本發明提供了一種硫酸銨促進Eupergit C 250固定化草酸脫羧酶的方法，屬於生物化工技術領域：
。本發明包括重組草酸脫羧酶的誘導表達，親和層析分離純化草酸脫羧酶及草酸脫羧酶固定化三部分。其特徵在於使用含活性環氧基的Eupergit C 250為固定化載體，在固定化過程中添加0.1-2mol/L的中性鹽硫酸銨，促進載體對草酸脫羧酶的吸附和共價連接反應。本發明操作簡單，酶活回收達到84％以上；使用載體材料價格適中，物化性能穩定，製備的固定化酶具有較好的操作性能、易於回收重複使用，可應用於食品或造紙等工業過程中草酸的降解。
文檔編號C12N11/08GKCN102174502SQ201110028096
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月26日
發明者林日輝 申請人:廣西民族大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan