基於空間位阻和酶相關信號放大的高特異性和高靈敏度檢測的製作方法

2023-10-18 03:31:34 1

專利名稱：基於空間位阻和酶相關信號放大的高特異性和高靈敏度檢測的製作方法
基於空間位阻和酶相關信號放大的高特異性和高靈敏度檢相關申請的交叉引用 本申請要求2007年5月31日提交的美國臨時專利申請號60/941，057的優先權， 其內容通過引用全文納入本文。在聯邦資助研發下作出發明的權利的聲明本發明本發明在NIH/NIDCR 基金號 UOlDE 017790、U01DE015018 和 R01DE017593 以及NASA/NSBRI基金號TD00406的政府資助下作出。政府對本發明享有一定權利。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及核酸探針和試驗方法。2.相關領域描述就地(point-of-care)檢測的要求之一是檢測混合物中的少量靶分子。由於任何 混合物的複雜性，檢測低數量靶需要高靈敏度以及高特異性。然而，現有技術檢測方法需要 在特異性和靈敏度之間作出妥協。開發了幾種技術以獲得信號擴增，從而有助於增加靈敏 度。在大多數檢測方法中，信號強度與檢測區域內靶的數量(與整個樣品體積相比通常極 少)相關。因此，無論是擴增整個樣品體積中的靶數量還是在小的檢測區域內累積靶均有 助於提高信號強度。第一種方法增加靶、探針和/或信號的總量，因而能獲得高強度檢測結果。例 如，PCR，引物原位標記(PCR，Primed in situ labeling) (PRINS)和基於核酸序列的擴 增(NASBA)技術應用於增加靴總量。參見Monis和Giglio，InfectionGenetics and Evolution, 2006. 6(1)第2_12頁。連接酶鏈式反應(LCR)和滾環擴增(RCA)能擴增探 針。支鏈DNA(bDNA)和酪胺信號擴增(TSA)能擴增信號。參見Andras等，Molecular Biotechnology, 2001. 19 (1)第 29-44 頁。與直接擴增靶/探針/信號相比，第二種方法致力於增加靶的局部濃度而不是產 生該靶的更多拷貝。例如，納米技術通過應用基於納米顆粒的技術將樣品內少數拷貝的靶 聚集到檢測區域中。同時增加靶的總量和局部濃度導致高靈敏度。然而，這樣也會產生較 高的背景水平和更多的假陽性結果，因為同時放大了特異性和非特異性信號。在另一方面，現已設計了高特異性探針來降低背景噪聲水平，例如分子信標 (molecular beacon)和具有約束性結構的其它探針。參見Wei等，Journal of theAmerican Chemical Society,2005. 127(15)第 5306-5307 頁；Broude, Trends inBiotechnology, 2002. 20(6)第 249-256 頁；Fan 等，Trends in Biotechnology, 2005. 23(4)第 186-192 頁；Tyagi 和 Kramer，Nature Biotechnology, 1996. 14(3)第 303-308 頁。這些方法通常 基於距離靈敏性信號轉導過程(distance sensitivesignal traducing process),例如 FRET，增補染料(Howell 等，Genome Research, 2002. 12(9)第 1401-1407 頁)和電化學方 法。在這些方法中，特異性靶的結合會導致探針的構象變化。構象變化將顯著轉換成信號 打開(ON)狀態。然而，通過改善特異性，那些探針的檢測極限降低，因為可檢測信號需要大量靶，因此會在檢測系統中引入更多假陽性結果。因此，仍需要能提供高特異性和高靈敏度檢測的試驗方法和試劑。發明概述本發明總體上涉及探針和試驗方法。在第一方面，本發明提供檢測靶核酸分子的探針。該探針包含兩部分，與靶核酸分 子序列特異性雜交的多核苷酸序列，和受體的配體。當沒有靶核酸分子與該探針結合時，該 探針具有第一三維結構，當靶核酸分子與該探針結合時，其具有第二三維結構。所述第一三 維結構抑制或阻止受體結合配體，而第二三維結構允許受體特異性結合配體。在一些實施 方式中，所述受體包含可檢測標記物，即，賦予可檢測信號的部分。在一些實施方式中，可檢 測信號被擴增，例如通過酶促反應。在一些實施方式中，所述第一三維結構在空間上阻礙受 體結合配體，在一些實施方式中，所述探針固定於基材或固體支持物上。在一些實施方式 中，所述第一三維結構將配體置於接近該基材的位置，從而抑制或阻止受體結合配體。在一 些實施方式中，所述受體是特異性結合配體的抗體。在一些實施方式中，所述可檢測標記物 是螢光素、鏈黴親和素或生物素等。在一些實施方式中，可通過由過氧化物酶、漆酶、葡萄糖 氧化酶、鹼性磷酸酶或脲酶等催化的酶促反應放大可檢測標記物的檢測信號。在一些實施 方式中，所述探針是髮夾探針或四重探針(quadruplex probe)。在第二方面，本發明提供檢驗樣品中靶核酸分子的方法。該方法包括在有受體存 在下使上述探針與樣品接觸，然後檢測是否存在配體與受體之間的複合物。本發明探針包 含多核苷酸序列(能特異性結合靶核酸分子的序列)和配體(能結合受體)，並且當沒有靶 核酸分子與該探針結合時，該探針具有第一三維結構，當靶核酸分子與該探針結合時，其具 有第二三維結構。所述第一三維結構抑制或阻止受體結合配體，而第二三維結構允許受體 特異性結合配體。因此配體和受體之間存在複合物表明樣品中存在靶核酸分子，而不存在 複合物表明樣品中不存在靶核酸分子。在一些實施方式中，受體是能賦予檢測信號的可檢 測標記物。在一些實施方式中，可檢測信號被擴增。在一些實施方式中，所述第一三維結構 在空間上阻礙受體結合配體。在一些實施方式中，所述探針固定於基材上。在一些實施方 式中，所述第一三維結構將配體置於接近該基材的位置，從而抑制或阻止受體結合配體。在 一些實施方式中，所述受體是特異性結合配體的抗體。在一些實施方式中，所述可檢測標記 物是螢光素、鏈黴親和素或生物素等。在一些實施方式中，可通過在酶促反應中利用過氧化 物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶或脲酶放大可檢測標記物的檢測信號。在一些實施 方式中，所述探針是髮夾探針或四重探針。在一些實施方式中，先除去未結合配體的任何受 體，再檢測該複合物。本發明提供在「髒」樣品(含高濃度的幹擾信號檢測的汙染物和分子)，例如唾液 中檢測極低濃度生物標記的方法。該方法可應用於高質量樣品製品無法獲得或太昂貴的情 況，例如就地檢測，以及與汙染物和幹擾性混合物(幹擾物)相比，生物標記濃度極低的情 況。低濃度檢測的可行性數據體現在口腔癌mRNA生物標記，IL8。在一些實施方式中，所述探針是「即用的」，例如，所述探針預先錨定在表面上，在 檢測期間無需其它處理。在一些實施方式中，所述探針是生物相容的寡核苷酸或適體。本發明探針可方便地應用於多種領域，無需昂貴的儀器和複雜的數據分析。讀出 信號可以是本領域已知的任何信號，例如電化學信號、螢光信號，等等。
與現有技術相比，本發明探針能減少或消除假陽性結果，因為現有技術方法對於 互補和非互補靶沒有選擇性，從而會導致假陽性結果。所述探針的空間位阻效應提高了特 異性。與現有技術相比，本發明探針還能減少或消除假陰性結果，因為具有高特異性的 現有技術方法降低了信號，從而會產生假陰性結果。應用特異性信號擴增來增強信號強度， 從而能改善靈敏度。本發明的探針和方法可用於臨床檢測血液、血清、尿液和唾液樣品中的生物標記， 例如原始唾液的唾液mRNA檢測和體內監測疾病的早期階段。本發明的探針和方法可用於多重檢測，例如包含多個本發明探針的微陣列，這些 探針對不同靶核酸分子具有特異性。本發明探針可以重複使用，因為探針的不同狀態之間的轉換是可逆的，從而使得 傳感器可重複使用。在一些實施方式中，可為空間位阻效應而優化受體和/或與其結合的 標記物的形狀和尺寸，例如與較小的受體和/或標記物相比，大受體和/或標記物對於空間 位阻更敏感。如本文所述，本發明涉及靶核酸分子的探針。該探針包含多核苷酸序列(特異性 雜交靶核酸分子的序列，例如，IL-8mRNA或DNA序列)和受體的配體。該探針在沒有靶核 酸分子與其結合時，具有第一三維結構，有靶核酸分子與其結合時，具有第二三維結構。所 述第一三維結構抑制或阻止受體結合配體，而第二三維結構允許受體特異性結合配體。在一些實施方式中，所述探針包含與靶序列互補或基本上互補的多核苷酸序列。 本文所用的「基本上互補」指在中等，優選嚴格雜交條件下與某序列特異性雜交的序列。一 些示範性的多核苷酸序列見表2-4。附圖簡述參考附圖可進一步理解本發明，其中

圖1是本發明試驗方法的一個實施方式的示意圖。圖2顯示具有本發明髮夾探針的探針結構的影響。圖3顯示用線形探針和髮夾探針檢測mRNA的界限。圖4是利用髮夾探針的電化學檢測中特異性信號放大的示意圖。當沒有靶結合於 髮夾探針時，髮夾關閉，HRP不能在表面上形成有效複合物，因此觀察不到信號。與靶雜交 後，髮夾打開，HRP複合物形成。然後TMB不停再生還原的HRP，從而放大現有信號。圖5顯示了應用髮夾探針交叉檢測兩組唾液RNA :IL-8和S100A8。IL-8的RNA靶 水平是5nM，S100A8的是7nM。空白信號是6XSSC和10mMMgCl2。顯示了 4次實驗的平均 值和標準偏差。圖6圖示比較了含不同接頭的IL-8髮夾探針進行的檢測。空白對照中髮夾是關閉 的，有RNA樣品時是打開的。IL-8RNA的濃度是50nM。空白對照是6XSSC和10mM MgCl2。 顯示了 4次實驗的平均值和標準偏差。示意性顯示了含不同長度接頭的髮夾探針的構型。圖7圖示比較了含不同莖-環結構的IL-8髮夾探針進行的檢測。空白對照中髮夾 是關閉的，有RNA樣品時是打開的。下劃線所示序列與靶RNA互補。斜體表示的序列是莖 部分。黑體表示的序列是環部分。HP1 :10bp在莖中，41bp在雙鏈體中。HP2:8bp在莖中， 34bp在雙鏈體中。HP3 :6bp在莖中，27bp在雙鏈體中。IL-8RNA的濃度是50nM。空白對照是6XSSC和10mMMgCl2。顯示了 4次實驗的平均值和標準偏差。圖8顯示了在線形和髮夾探針之間作比較的唾液RNA檢測。(a) :IL_8。線形探針 是IL-8CP和IL-8DP，髮夾探針是IL-8HP，如表2所列；(b) :S100A8。線形探針是S100A8CP 和S100A8DP，髮夾探針是S100A8HP，如表2所列。圖9顯示電化學檢測摻加IVT RNA的唾液。循環(a) IL8 ； (b) S100A8。唾液樣品 是未經處理的同一人同一批次的全唾液。圖10描述了標記分子與寡核苷酸之間連接鍵的結構。圖11 應用HP交叉檢測兩組IVT RNA :IL_8和S100A8。(a)8份樣品的電流計信 號。(1)-(4)對 HP 應用 S100A8，靶向 RNA 分別是(l)7nM S100A8, (2) 500nM IL-8，(3) 5nM IL-8，和(4)僅有緩衝液。(5)-(8)對 HP 利用 IL-8，靶向 RNA 分別是(5) 5nM IL-8, (6) 700nM S100A8, (7) 7nM S100A8和(8)僅有緩衝液。(b) (a)中相同8份樣品的柱狀圖。HP，例如 IL-8HP和S100A8HP的序列見表3。顯示了各4次實驗的平均值和標準偏差。圖12 藉助線形探針(LP)和HP檢測唾液IL-8RNA。LP是IL-8CP和IL-8DP，HP 是IL-8HP，如表3所列。從檢測信號中扣除空白對照信號。顯示了 4次實驗的平均值和標 準偏差。LP的4毫微微摩爾(fM)靶的數據點未顯示，因為其數值低於空白對照的數值。圖13 對於同一組臨床唾液樣品，利用HP的電流計信號與qPCR測定的IL_8mRNA 濃度之間的相關性。線性回歸的R2是0.99。發明詳述在以前的構象變化相關檢測中(參見Howell，W.M.，M. Jobs，和A.J.Brookes， iFRET :an improved fluorescence system for DNA-melting analysis (DNA_角軍鏈分析白勺 改進螢光系統).Genome Research, 2002. 12(9)第 1401-1407 頁；Xiao，Y.等，Single-st 印 electronic detection of femtomolar DNA by target-induced stranddisplacement in an electrode-bound duplex (通過電極結合雙鏈體中的靶誘導鏈置換來單步驟電檢測 毫微微摩爾 DNA) Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(美國國家科學院學報)，2006. 103(45)第 16677-16680 頁；Xiao， Y.等，Label-free electronic detection of thrombin inblood serum by using an aptamer-based sensor (利用基於適體的傳感器來無標記地電檢測血清中的凝血酶).AC 國際出版社(Angewandte Chemie-InternationalEdition)，2005. 44 (34)第 5456-5459 頁)，靶識別(特異性)和信號放大(靈敏度)是不相關的兩個步驟。只有識別過程是特異 性的，而放大是非特異性的，同時適用於信號和噪聲。在本發明中，放大和識別均是特異性 的。只有靶的特異性結合會導致信號放大。其它幹擾物(代檢驗樣品中的汙染物和其它分 子)的非特異性結合對檢測信號貢獻極低。因此，抑制了噪聲水平，並只擴增靶信號。本文所用的「靶」可與「靶核酸分子」互換使用。本文所用的「靶」核酸分子可以是 想要知道其存在和/或含量的任何核酸分子。在一些實施方式中，靶核酸分子的序列已知。 在一些實施方式中，例如突變檢測，靶核酸分子的序列可以是懷玉具有改變，即與參比核酸 序列不同的序列。在這些實施方式中，靶核酸分子的序列可已知或未知，「參比核酸序列」是 可與靶核酸分子的序列作比較的已知核酸序列。靶核酸分子中的改變可以在單核苷酸鹼基 或1個以上的核苷酸鹼基中。這種改變可以是已知的多態性改變，例如單核苷酸多態性。本文所用的「核酸分子」、「多核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用來指可以為單鏈
7或雙鏈的天然或合成來源的DNA和RNA分子，並代表有義或反義鏈。本發明的核酸分子可 含有已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接鍵，以及可由DNA或RNA聚合酶摻入聚 合物的任何物質。這些類似物的例子包括硫代磷酸酯、環磷醯胺、膦酸甲酯、手性_膦酸甲 酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)，等等。在優選的實施方式中，本發明的核酸分子是分離的。本文所用「分離的」指從其天 然環境中分離的核酸分子。「分離的」核酸分子可以是與獲得該核酸分子的物種的基因組 DNA基本上分離的或從中純化的。「分離的」多核苷酸所包括的核酸分子可與其正常或天然 在5』端、3』端或二者相連的其它DNA區段相分開。本發明的核酸分子可以是其天然形式或經合成修飾。本發明的核酸分子可以是單 鏈(編碼或反義)或雙鏈的，可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子 包括含有內含子並一一對應於DNA分子的mRNA分子，和不含內含子的mRNA分子。本發明 的核酸分子可連接於其它核酸分子、支持材料、報導分子、猝滅分子或它們的組合。其它核 酸分子包含啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制性內切酶位點、多克隆位點、其它編碼區 段等。因此，考慮了可利用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優選以製備便利性和在所需重 組DNA或PCR方法中應用為限。在本發明的一些實施方式中，考慮了包含本文所述核酸分 子的核酸序列。本發明的核酸分子不難通過本領域已知的方法製備，例如採用本領域已知的方法 和設備，如自動寡核苷酸合成儀、PCR技術、重組DNA技術等直接合成核酸序列。本發明的核酸分子可包含標記物。本領域技術人員已知各種標記物和偶連技術， 這些標記物和偶連技術可應用於利用本發明核酸分子的各種核酸和胺基酸試驗。本文所用 的「標記物」或「可檢測標記物」是產生信號的組合物或分子，所述信號可由本領域已知方 法檢測，例如放射照相術、螢光、化學發光、酶活性、吸光度等。可檢測標記物包括放射性同 位素、螢光團、生色團、酶、染料、金屬離子、配體，如生物素、親和素、鏈黴親和素和半抗原， 量子點(quantum dot)等。「標記的」核酸分子包含結合的標記物，從而可通過檢測與其結合的標記物是否存 在來檢測該核酸分子是否存在。標記物可通過共價鍵，例如化學鍵或非共價鍵，例如離子 鍵、範德華力、靜電作用或氫鍵與核酸分子結合。可採用本領域已知的方法產生標記的雜 交或PCR探針來檢測多核苷酸相關的序列，包括寡聚標記(oligolabeling)、缺口平移、末 端_標記或利用標記核苷酸的PCR擴增等，優選末端標記。看利用的合適標記物包括放射 性核苷酸、酶、螢光、化學發光或生色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。本文所用的「核酸探針」或「探針」指能結合靶核酸分子的核酸分子，所述靶核酸分 子的序列與該核酸探針的序列互補。探針可包含本領域已知的天然或修飾的鹼基。參見， 例如MPEP 2422，第8版。可通過除磷酸二酯鍵以外的連接鍵連接探針的核苷酸鹼基，只要 連接鍵不幹擾核酸分子結合互補核酸分子的能力。探針可結合與該探針序列的互補性低於 100%的靶序列，這種結合依賴於雜交條件的嚴格性。可檢測探針的存在與否來確定樣品中 靶序列或亞序列的存在與否。探針可含有可檢測標記物。本文所用的「檢驗」可與「檢測」、「測量」、「監測」和「分析」互換使用。除非另有明確表述，本文所用的「附於」、「附上」、「結合」、「偶連」、「連接」、「偶合」、 「固定」、「吸附」和「相連」可互換使用，包括直接以及間接連接、附上、相連或偶連，它們是可
8逆或不可逆的。本文提供的「配體」指結合另一分子，即「受體」的分子。例如，結合抗體的抗原、 與互補寡核苷酸雜交的寡核苷酸、結合受體的激素或神經遞質、或結合酶的底物或變構效 應物，包括天然和合成的生物分子，例如蛋白質、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、糖、脂質、 脂蛋白、小分子、天然和合成有機和無機物質、合成聚合物，等等。本文提供的「受體」是特 異性結合給定配體的分子。本文所用的兩分子之間的「特異性結合」或「特異性相互作用」表示某配體與其受 體彼此結合或相互作用的特異性足以區分與某給定樣品中其它組分或汙染物的結合或相 互作用。本文所用的短語「選擇性(或特異性)雜交」指在嚴格雜交到中等雜交條件下，某 核酸分子與特定核苷酸序列的結合、形成雙鏈體或雜交勝過其它核苷酸序列。對於選擇性 或特異性雜交，陽性信號至少是背景雜交的約2倍、優選約5倍、更優選約10倍。嚴格雜交 條件是比探針的熱解鏈溫度(TJ約低5°C到比Tm約低10°C。中等雜交條件是比探針的熱 解鏈溫度(Tm)低約10°C到比Tm約低20°C -約25°C。高靈敏度為提高靈敏度，應用基於夾心檢測的信號放大。夾心放大的基本概念 是為放大信號的目的而應用介導物形成三明治樣複合物。首先，靶與探針結合後，先在報導 分子標記的探針與介導物之間形成複合物，再進行檢測。然後除去過量的介導物並進行檢 測° 參見 Liao, J. C.等，Use of electrochemicalDNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urinespecimens (禾用電化學DNA生物傳 感器快速分子鑑定臨床尿液樣品中的尿路病原體).Journal of Clinical Microbiology, 2006. 44 (2)第 561-570 頁；Gau, V.等，Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification (核酸擴增的電化學分子分析).Methods，2005. 37 (1)第 73-83頁。在核酸的常規夾心檢測中，寡核苷酸探針是線性的。因此，不依賴於任何介導物 結合的非特異性和特異性靶會增加背景並導致假陽性結果。高特異性為提高特異性，在探針設計中引入空間位阻-轉換結構(例如莖環和適 體)。本發明探針具有至少一種雙狀態結構。沒有靶結合時，探針處於結構I。在結構I狀 態中，報導分子(或稱為「配體」)不能與介導物(或稱為特異性結合給定配體的「受體」) 形成有效的複合物，因為受體受到空間位阻、抑制或阻止從而不能接觸配體。與靶結合後， 探針轉變成結構II。在結構II狀態中，報導分子與導致信號放大的介導物形成有效複合 物。空間位阻設計簡單而有效，沒有會增加勞動和成本的任何其它化學反應步驟。物理作用力參數&描述了約束構象的探針分子內相互作用。Fa較高使得該探針在 結構I狀態中更穩定。另一物理作用力參數Fb描述了靶和探針之間的分子間相互作用。Fb 較高使得探針能穩定在結構II狀態。之間的競爭性決定了探針處於何種狀態。由 於Fb來自靶與探針之間的相互作用，特異性靶結合產生的Fb高於非特異性靶結合產生的。 因此，|Fa-Fb(特異性)|和|Fa-Fb(非特異性)|之間的差異決定了檢測的特異性。在大多 數情況中，靶，以及由此的靶和探針之間的相互作用，Fb，不能改變。然而，為實現高特異性， 可通過改變探針設計而將Fa設計成所需數值。低拷貝數應用此外，基於構象的傳統檢測通常是信號-關閉(signal-off) 方 法(Fan，C. H.，K. W. Plaxco, 禾口 A. J. Heeger，Electrochemical interrogationofconformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detectionof DNA(電化學分析構象改變作為序列特異性檢測DNA的無試劑方法).美國國 家科學院學報，2003. 100 (16)第9134-9137頁)，與之相比，本發明的檢測可以是信號_打 開(signal-on)方法。信號-打開方法在背景值低時檢測到信號增加，而信號-關閉方法在 背景值高時檢測到信號降低。在高數值時檢測的誤差通常大於在較低值時，因此，信號-打 開方法具有更穩定的背景噪聲水平。此外，信號-關閉方法中，信號降低的動態範圍受限於 原始背景值。因此，信號-打開方法的檢出限較高，測量誤差較小並且更易於商業使用，因 為其信號處理步驟少於信號_關閉方法。探針設計可單獨或集成設計探針的生物識別部分和約束-結構(或空間-轉換) 部分。圖1說明了探針設計的兩種方法。在單獨設計方法中(圖1A)，DNA髮夾結構用作探 針。環是靶的生物識別部分。莖設計成空間-轉換部分。當特定靶濃度低於檢出限時，探 針維持公布結構，產生阻止報導分子與介導物形成有效複合物的構象約束作用。因此，檢測 的信號水平低。與特定靶結合後，髮夾打開，報導分子與介導物自由形成有效複合物從而放 大信號，因此，檢測的信號水平高。在整合設計中，探針的組成本身可形成約束結構，探針設 計中無需額外部分。例如，可利用G-四重(探針)(圖1B)。圖2顯示不同水平的所設計空間位阻的作用。比較了各具有不同水平空間位阻的 含接頭(位於探針和底物之間)和不含接頭的兩種髮夾探針，所述空間位阻是報導分子接 近探針所結合的電極表面所致。在此設置中，與特定靶雜交形成造成報導分子進一步遠離 電極表面的DNA雙鏈體，因此檢測到信號輸出降低。應注意，在這種信號-關閉方法中，這 種信號造成高背景值降低不多，且難以檢測。對於含接頭的探針(較低的設計空間位阻)， 即使當髮夾關閉時，報導分子也遠離該表面，從而在報導分子和介導物之間依然可形成有 效的複合物。因此，在無靶和存在靶(IL-8)之間檢測的輸出值小，如「含接頭」標記的左側 數據集所示。當通過除去髮夾探針的接頭而設計較大的空間位阻時，沒有靶結合時報導分 子非常接近表面，從而阻止有效介導物_報導分子複合物的形成，因此檢測到的背景噪聲 極低。與靶雜交後，報導分子與表面之間的距離增加，從而能形成複合物並有效放大信號。 信號改變極大並具有高信噪比。這是信號_打開方法，其結果示於「無_接頭」標記的右側 數據集。雖然本文示例的探針是在基材表面上，但可利用溶液中的探針進行檢測。由於探 針設計的關鍵革新是空間位阻，可以應用導致空間位阻的所有類型的約束方法。例如，探針 可結合於納米顆粒、磁珠或大分子，例如蛋白質。信號讀出本發明的特徵在於信號讀出類型的多樣性。讀出信號不限於一種特定 類型的信號，例如以上例子所述的電輸出值，而是依賴於放大過程。如果放大與電子轉移過 程相關，則信號宜為電流/電壓。如果放大與光學過程相關，則信號宜為螢光/UV/IR等。如 果放大與精巧的分子結構修飾相關，則信號宜為精細的光譜。信號還可以是機械以及磁性 數據。本領域技術人員不難根據給定的放大過程而選擇合適的檢測方法。由於本發明的信號讀出與報導分子和介導物之間形成的複合物有關，所檢測的靶 可以不含標記物。無標記物檢測不僅降低了試劑使用的成本，還可能進行實時和高通量檢 測。其可應用於微陣列和自動原位檢測。實施例提供以下實施例只是為了說明，絕非限制。本領域技術人員不難知道可改變或改 進各種非關鍵性參數以獲得基本上相同或相似的結果。實施例1 採用髮夾探針設計監測低濃度mRNA唾液中的mRNA生物標記顯示唾液可用作口腔疾病，還可能用作其它全身性疾病 的診斷液體。然而，唾液中特異性mRNA生物標記的濃度低於毫微微摩爾/升。此外，同時 存在大量非特異性mRNA、rRNA和蛋白質。關鍵是如何檢測唾液中微量的mRNA或蛋白質而 不用純化和放大。本文公開的包括口腔癌的IL_8、mRNA生物標記的電化學陣列。示例了本發明探針 的應用。將探針設計成髮夾結構。報導分子是檢測探針(螢光素-綠色)。介導物是抗-熒 光素-HRP偶聯物。信號放大基於HRP氧化還原過程。信號讀出是電流。Fa是髮夾探針的 吉布斯自由能。Fb是探針和靶之間形成的雙鏈體的吉布斯自由能。通過應用無接頭的髮夾探針，IL-8的檢出限(L0D)是約10毫微微克/毫升(約1 毫微微摩爾/升)(圖3)。對於線形探針，L0D只有約100皮克/毫升(10皮摩爾/升)。 髮夾探針檢測的動態範圍是10毫微微克/毫升到100納克/毫升。唾液是體液的反映，現已證明其能反映身體的正常和患病狀態。參見，例如 I. D. Mandel，J. Am. Dent. Assoc.，124 :85_87 (1993) ； I. D. Mandel，J. OralPathol. Med.，19 119-125(1990) ；D. T. Wong, J. Am. Dent. Assoc.，137 :313_321 (2006)。近年來，Wong 的課 題組觀察到口腔癌患者的唾液中幾種唾液mRNA—致升高。參見D.T.Wong，J. Am. Dent. Assoc.，137 :313-321 (2006)。在這些 mRNA 中，4 種的組合(0AZ-1、SAT、IL8 禾口 IL1-3 )可 用作生物標記以區分口腔癌患者的唾液與對照對象的。參見Y. Li等，Clin. Cancer Res.， 10 =8442-8450 (2004)。鑑定mRNA生物標記使得唾液成為有價值的診斷液體。參見S. Hahn 等，Bioelectrochemistry,67 151-154 (2005)。然而，迄今為止，對於在未提取的唾液中直 接檢測RNA尚無一致而可靠的技術。與其它基於液體，例如血液和尿液的檢測相比，基於唾 液的診斷比目前的方法更易得、精確而廉價，同時對患者的危險更低。唾液作為診斷液體的主要問題是唾液中生物標記的含量通常低於血清中的量。由 於唾液生物標記的濃度低和唾液的複雜性，常規檢測方法不能符合高信噪比的臨床診斷要 求。開發了幾種技術以獲得有助於增加靈敏度的信號放大。在大多數檢測方法中，信 號強度與檢測區域內的靶數量相關，而該數量與整個樣品體積相比通常極低。因此，可增 大整個樣品體積內的靶數量或將靶累積在小的檢測區域內來確保高信號強度。第一種方 法增加靶、探針和/或信號的總量，因而產生高強度檢測輸出值。例如，PCR，引物原位標 記(raiNS)和基於核酸序列的擴增(NASBA)技術應用於增加靶總量。參見P.T.Monis和 S. Giglio, Infect. Genet. Evol.，6 :2_12(2006)。連接酶鏈式反應(LCR)和滾環擴增(RCA) 能擴增探針。參見 P.T.Monis 和 S. Giglio，Infect. Genet. Evol.，6 :2_12 (2006)。支鏈 DNA(bDNA)和酪胺信號擴增(TSA)能擴增信號。參見S. C. Andras等，Mol. Biotechnol.，19 29-44(2001)。與直接擴增靶/探針/信號相比，第二種方法致力於增加靶的局部濃度而 不是產生該靶的更多拷貝。例如，納米技術通過應用基於納米顆粒的技術將樣品內少數拷 貝的靴聚集到檢測區域中。參見A. N. Shipway和I. ffillner, Chem. Commun.，第2035-2045M (2001) ；A. Merkoci, Febs J. ,274 310-316 (2007) ;J. Wang, Anal. Chim. Acta, 500 247-257(2003) ；S. G. Penn 等，Curr. Opin. Chem. Biol.，7 :609_615 (2003)。同時增加靶的總
量和局部濃度導致高靈敏度。然而，這樣也會產生較高的背景水平和更多的假陽性結果，因 為同時放大了特異性和非特異性信號。在其它方面，現已開發可基於競爭的檢測方法來降低背景噪聲水平。檢測探針總 具有幾種準穩定狀態，各狀態顯示不同水平的信號強度。參見N. L. Goddard等，Phys. Rev. Lett.，85 :2400-2403 (2000) ；C. H. Fan 等，P Natl Acad SciUSA，100 :9134_9137 (2003)； S. Tyagi 禾口 F. R. Kramer， Nat. Biotechnol. ，14 :303_308 (1996) ；F. Wei 等，Biosens. Bioelectron. , 18 1149-1155 (2003) ；F. Wei 等，J. Am. Chem. Soc.，127 :5306_5307 (2005)。 互補靶和非互補靶之間的競爭將探針在這些狀態之間轉換，因此呈現不同水平的信號。 可通過分子內或分子間競爭實現轉換過程。對於分子內轉換，通常應用具有兩種或更多 種準穩定狀態構象的高特異性探針，例如分子信標和具有約束性結構的其它探針。參見 C. H. Fan 等，P Natl Acad Sci USA, 100 :9134_9137 (2003)，S. Tyagi 和 F. R. Kramer, Nat. Biotechnol.，14 :303_308 (1996)，F. Wei 等，J. Am. Chem. Soc.，127 :5306_5307 (2005)； Y.Xiao 等，P Natl Acad Sci USA, 103 16677-16680 (2006) ； A. A. Lub in 等，Anal. Chem.，78 : 5671-5677(2006) ；N. E. Broude, Trends Biotechnol.，20 :249_256 (2002)。特異性靶的結 合會導致探針的構象變化。構象變化通常會影響距離敏感性的信號水平，例如FRET、增補 染料和電化學方法。參見 T.J.Huang 等，Nucleic Acids Research，第 30 卷(2002) ； V. Gau 等，Methods，37:73-83 (2005)。非特異性靶不產生信號變化，並且背景水平低。然而，通過 改善特異性，那些探針的檢出限降低，因為可檢測信號需要大量靶，因此，會在檢測系統中 引入更多假陽性結果。在以前的構象變化相關檢測中，靶識別(特異性)和信號放大(靈敏度)是不相 關的兩個步驟。參見 C. H. Fan 等，P Natl Acad Sci USA, 100 9134-9137 (2003) ；S. Tyagi 和 F. R. Kramer, Nat. Biotechnol.，14 303-308 (1996) ；F. Wei 等，J. Am. Chem. Soc.，127 5306-5307(2005)。如本文披露的，藉助能進行選擇性放大的新型髮夾設計探針同時獲得高 靈敏度和高特異性。該髮夾探針由對靶具有高特異性的生物識別組分與活化信號報導過程 的約束結構組分構成。只有在生物識別組分確認了靶的特異性後，約束結構組分才除去內 在的空間位阻，從而發生信號放大，進而導致高靈敏度。當沒有特異性靶結合時，空間位阻 抑制信號放大。因此，即使在含有大量幹擾物的混合物中存在的拷貝數低，也只有特異性靶 能產生可檢測信號。這種選擇性放大的方法極大抑制了非特異性結合和背景水平，從而克 服了實施任何就地檢測體系的兩個關鍵障礙。材料所有試劑(表1)按購買狀態使用或用緩衝溶液稀釋，不作任何預處理。表1.電化學RNA檢測的材料名稱公司1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)畢埃可公司(Biacore)N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)畢埃可公司胺-PE02-生物素標記試劑(Ez-生物素)皮爾斯公司
12
(Pierce)乙醇胺-HCl，1.0M，pH 8. 5畢埃可公司氯化鎂(MgCl2)西格瑪公司(Sigma)鏈黴親和素VWR抗-螢光素-HRP羅氏公司(Roche)3,3' ,5,5'-四甲基聯苯胺底物低活性(TMB/H202)尼金公司(Neogen)IX磷酸緩衝鹽水，不含鈣或鎂英傑公司(Invitrogen)lXTris-HCL 緩衝液(Tris-HCl)英傑公司20X檸檬酸鈉緩衝液(SSC)英傑公司PBS溶液配製的封閉BSA含有10%牛血清白蛋白，pH 7. 4皮爾斯公司PBS溶液配製的封閉酪蛋白含有PBS配製的1 % (w/v)酪 皮爾斯公司蛋白，pH7.4所用的電化學傳感器是16-單位金陣列。參見V. Gau等，Methods, 37 73-83(2005)。電極陣列能同時多重檢測不同的樣品。每個單位有三_電極設置，包括工作 電極(WE)、對電極(CE)和參比電極(RE)。微小電極陣列的優點是可同時獲得16個電極的 信號讀出值，並且檢測只需要4 u L樣品溶液。如本文所示例的，電化學信號是報告酶_辣 根過氧化物酶(HRP)的氧化還原過程產生的電流。HRP和H202之間反應後，HRP轉變成氧化 狀態。然後，TMB通過2-電子步驟不停再生還原的HRP，從而放大電流信號。檢測方法金電化學傳感器的表面修飾包括下述3個步驟(V. Gau等，Methods, 37 73-83(2005) ;J. J. Gau 等，Biosens. Bioelectron.，16 :745_755 (2001))探針固定化對金電極預塗布用羧基封端的自裝配單層。用4 iiL 50%EDC和50% NHS活化金表面10分鐘。用DI水(18. 3MQ -cm)清洗傳感器後，用超純氮氣乾燥。然後將 4uL 5mg/mL Ez_生物素加載於金表面，然後用DI水清洗，並用氮氣乾燥。然後，將PBS緩 衝液配製含2. 5% BSA的0. 5mg/mL鏈黴親和素在電極上溫育10分鐘，最終獲得塗布有鏈黴 親和素的電極。然後通過表面上的鏈黴親和素與探針上的生物素標記物之間的相互作用將 Tris-HCl緩衝液配製的L生物素化和螢光素雙重標記的髮夾探針在電極上固定30分 鍾。用DI水徹底清洗來除去過量HP，用氮氣乾燥。靶雜交將該表面與在含有10mM MgCl2的6XSSC緩衝液中配製的靶樣品溫育60 分鐘。雜交後，用DI水清洗電極，氮氣乾燥。信號讀出電流與靶的表面濃度成比例。參見V. Gau等，Methods, 37 73-83 (2005)。首先，0. 5%酪蛋白封閉溶液配製的0. 5mU/mL抗-螢光素-HRP與HP上的熒 光素標記物結合。用DI水清洗和氮氣乾燥後，加入TMB/H202底物。通過給各電極單位施 加-200mV電壓，平衡60秒後平行讀出信號以進行電流分析檢測。電化學信號是報告酶-辣根過氧化物酶(HRP)的氧化還原過程產生的電流。HRP 和H202之間反應後，HRP轉變成氧化狀態。然後，TMB通過2-電子步驟不停再生還原的HRP，從而放大電流信號。首先，0. 5%酪蛋白封閉溶液配製的0. 5mU/mL抗-螢光素-HRP與HP上的螢光素標記物結合。用DI水清洗後，加入ΤΜΒ/Η202底物。通過給各電極單位施加_200mV 電壓，平衡60秒後同時讀出信號來進行電流分析檢測。電流與靶的表面濃度成比例。參見 V. Gau 等，Methods, 37 :73_83 (2005)。寡核苷酸探針和RNA樣品製備寡核苷酸從美國阿拉巴馬州的操縱子公司(Operon)定製。每個髮夾探針用生物 素在一端標記，用生物素TEG在另一端標記。生物素標記物可作為錨定物結合鏈黴親和素， 而螢光素標記物是信號報導分子。操縱子公司提供的生物素-TEG具有額外的16-原子間 隔臂來連接生物素和寡聚鏈。這種間隔設計使得生物素能更好地接近鏈黴親和素。選擇兩種mRNA靶作檢測。幹擾素8(IL-8)是口腔癌的唾液生物標記。健康人 的IL8濃度是2毫微微摩爾，口腔癌樣品中增加至約16毫微微摩爾。參見Y. Li等，Clin. Cancer Res.，10 =8442-8450(2004)。為標準化唾液樣品中的RNA水平，利用不顯示口腔癌 相關性的參比基因SlOO鈣-結合蛋白A8(S100A8)。對於唾液檢測，S100A8用作各電化學 傳感器上的參比對照。按照本領域已知的方法製備體外轉錄物(IVT) RNA。參見H. Ohyama等， Biotechniques, 29 :530_+(2000)。簡言之，用T7-寡聚_(dT) 24作為引物進行逆轉錄來合 成c-DNA的第一鏈。用美國德克薩斯州奧斯丁市安拜恩公司(Ambionlnc. ,Austin, TX,USA) 的T7RNA聚合酶進行體外轉錄。逆轉錄1 μ L細胞RNA以製備cDNA，1 μ 1 cDNA用作PCR模 板，T7序列用作引物。通過美國德拉瓦州的ND技術公司(NanoDrop Tech. ,Delaware,USA) 的光譜法測定cRNA的數量和質量。等分IVT RNA樣品，-20°C並存待用。為評估唾液的靈 敏度和特異性，將IVT RNA摻加入唾液。結果和討論在核酸的常規夾心檢測中，寡核苷酸探針是線形的。因此，不依賴於任何介導物結 合的非特異性和特異性靶會增加背景並導致假陽性結果。為提高特異性，在髮夾結構中引 入空間位阻效應。參見圖4。髮夾探針的特徵在於其打開或不打開的雙-狀態結構。沒有 靶結合時，髮夾探針處於關閉狀態，因此，報導分子因設計的空間位阻而不能與介導物形成 有效複合物。結合特異性靶後，探針轉換成打開狀態，報導分子與介導物形成有效複合物， 從而導致信號放大。空間位阻設計簡單而有效，沒有任何額外的化學反應步驟來增加實施 實驗的工作。由於該項操作中信號讀出只與報導分子和介導物之間形成的複合物有關，檢 測的靶不含標記物。無標記物的檢測不僅減少所用試劑的類型，還可能進行實時和高通量 檢測。其可應用於微陣列和自動原位檢測。本發明探針基於抑制HRP/TMB信號放大的表面空間位阻。因此，表面和報導分子 之間的距離是識別過程的主要因素。在這種設置中，與特異性靶雜交形成使得報導分子進 一步遠離電極表面的DNA雙鏈體，因此檢測到信號輸出降低。隨著報導分子從表面進入溶 液中，表面限制作用可降低，因此電流信號增加。此外，基於構象的傳統檢測通常是信號-關閉方法，與之相比，本發明的檢測可以 是信號_打開方法。信號_打開方法在背景值低時檢測到信號增加，而信號_關閉方法在 背景值高時檢測到信號降低。在較高數值時檢測的誤差通常大於在較低數值時，因此，信 號-打開方法具有更穩定的背景噪聲水平。此外，信號-關閉方法中，信號降低的動態範圍受限於原始背景值。因此，信號-打開方法的檢出限較高，測量誤差較小並且更易於商業使 用，因為其信號處理步驟少於信號-關閉方法。髮夾探針的空間位阻效應的概念 通過藉助HRP和ΤΜΒ/Η202的夾心樣信號放大與藉助夾心探針設計的信號選擇性的 組合來實現特異性信號放大。本發明方法的基礎思路是表面的空間位阻抑制HRP/TMB結合 無靶的探針。因此，表面和報導分子之間的距離是識別過程的主要因素。隨著報導分子從 表面進入溶液中，表面限制作用降低，因此電流信號增加。沒有空間位阻，與特異性靶雜交 形成隔開報導分子與電極表面的DNA雙鏈體，因此檢測到信號輸出降低。比較了含和不含接頭的4種髮夾探針，由於報導分子與探針結合的電極表面接 近，每種探針具有不同的空間位阻水平(表2)。通過5-生物素標記端的突出間隔臂和/ 或TEG調節接頭的長度。突出間隔臂是9胸苷(9T)。匪2計算得到生物素TEG的徑向尺 寸是約 3nm。參見 N. L. Allinger，J. Am. Chem. Soc.，99 :8127_8134 (1977)。對於 9T 接頭， 未施加作用力時單鏈DNA在電極上通常處於捲曲狀態。在特定作用力，例如負電勢下，卷 曲的鏈會伸直。由於在_200mV進行電化學檢測，9T接頭遠遠地伸長，而非具有彎曲或躺倒 的結構。參見 A.M. van Oi jen 等，Science，301 1235-1238 (2003) ；U. Rant 等，Biophys. J. ,90 :3666-3671(2006)。雖然9T接頭的實際長度不清楚，但如果雙鏈體DNA的數據取 9bpX0. 28nm/bp的話，其在負電勢下應該遠長於3nm。從晶體數據獲得的HRP尺寸是約 4X6. 7X11. 8nm。參見 G. I. Berglund 等，Nature，417 :463_468 (2002)。表2.具有不同接頭長度的IL-8髮夾探針的寡核苷酸序列* *通過M倍(Mfold)的免費網絡軟體計算髮夾探針設計。參見J. SantaLucia， P Natl Acad Sci USA，95 1460-1465(1998)和 Μ. Zuker，Nucleic Acids Research,31 3406-3415(2003)。圖6顯示了不同水平的所設計空間位阻的效應。對於具有最長接頭的TEG+9T探 針(空間位阻最低)，即使髮夾關閉時，報導分子依然遠離表面，從而報導分子和介導物之 間可形成有效的複合物。因此，無靶和靶(IL-8)結合之間檢測的輸出值(差異)小，如「HP L3」標記的數據集所示。當通過除去髮夾探針的接頭二而將空間位阻設計成較高時，沒有靶結合時報導分子非常接近表面，從而阻止有效介導物-報導分子複合物形成，因此檢測到的背景噪聲極低。與靶雜交後，報導分子與表面之間的距離增加，從而能形成複合物並有效 地再生信號。信號改變極大並具有良好的信噪比。測試了髮夾探針對2種靶的特異性，參見圖5。在互補和非互補RNA靶之間比較了 各探針。非互補靶得到的信號只是空白信號的2倍標準偏差(SDV)。互補靶的信號是空白 信號的20倍SDV。兩種探針均在RNA水平顯示良好的區分能力，IL-8是5nM，而S100A8是 7nM。SNR的控制與雜交效率RNA傳感器的主要問題是信噪比(SNR)。在本發明的髮夾探針中，SNR取決於髮夾 探針的打開與關閉之比。通過沒有靶結合時的充分關閉狀態和與靶雜交後的完全打開狀態 可獲得高SNR。對於分子內和分子間雜交，識別期間的這些關閉-或-打開狀態需要高效率。為增加雜交效率並優化本發明探針的SNR，通過改變莖長度和環長度來調節髮夾 結構。現已研究了莖_環長度不同的3種髮夾探針(序列見圖7的下部)。所有3種探針 具有與靶RNA互補的3-端莖部分，以及環部分。從圖7所示結果可知，具有最長莖和雙鏈 體的探針對於空白樣品的信號最低，對於靶樣品的信號最高。該結果表明沒有靶結合時更 好的關閉狀態和與靶雜交時更好的打開狀態導致高信噪比。具有短莖和雙鏈體的探針不具 有低背景和高信號。因此，利用髮夾探針不難獲得高SNR，因為高雜交效率不難促進靈敏度 和特異性。相比之下，用傳統線形探針難以找到優化的探針序列。長序列有助於雜交效率， 但產生高背景，從而導致的靈敏度_特異性問題的牴觸作用。用髮夾探針和線形探針檢測唾液RNA 摻加和未摻加的樣品利用髮夾探針可一致地檢測唾液RNA生物標記。圖8顯示了電流信號的濃度關 系。利用髮夾探針IL-8和S100A8顯示良好的SNR，但利用線形探針顯示SNR差。有趣的 是，信號強度既不與濃度呈線性，也不與濃度的對數呈線性。該現象通常來自複雜的表面化 學。在本發明中，複雜的總反應中整合了數個反應，包括髮夾探針的轉換、雜交、蛋白質識別 和酶促電化學反應。這不能以靶濃度的線性關係來簡單描述。IL-8的檢出限(LOD)約為1 毫微微摩爾/升。對於線形探針，LOD只有約10皮摩爾/升。髮夾探針對於S100A8的LOD 約為1毫微微摩爾/升，線形探針的為10皮摩爾/升。然後用髮夾探針檢測摻加唾液中的唾液RNA生物標記。數據示於圖9。將不同濃 度的RNA樣品摻加入整個唾液。類似於純化的IVT RNA樣品，摻加的唾液也具有低L0D。這 表明即使唾液中含有大量幹擾物，髮夾探針也可區分特異性靶RNA。LOD約為1毫微微摩爾， 能夠符合真正IL-8唾液診斷的要求。與圖8所示純RNA樣品結果相比，用唾液樣品觀察到明顯的信號增加，特別是背景 水平。摻加樣品的陰性對照的電流遠高於IVT RNA的。還觀察到，與純RNA的穩定信號水 平相比，即使來自同一人的信號水平也隨不同唾液樣品而變。陰性對照的電流從幾百nA到 幾千ηΑ不等。信號增加的可能反應是唾液中除靶RNA以外的幹擾性組分，例如高粘度的粘 蛋白，其可導致以下HRP的非特異性結合或增強的特異性結合。參見N. J.Park等，Clin. Chem. ,52 =988-994(2006)。由於唾液中這些幹擾物組分的濃度隨樣品而有所不同，電流強 度因此而改變。因此，在一些實施方式中，RNA檢測與溶解相組合以除去其它幹擾物。
1.髮夾探針的高信噪比的概念
在本發明中，高信噪比來自於夾心樣檢測與髮夾探針的組合。夾心樣檢測的概念 是應用介導物形成複合物，其目的是再生HRP以放大信號。首先，靶結合探針。然後，報導 分子(螢光素)標記的探針與介導物(抗-螢光素-HRP)之間先形成複合物再進行檢測。 通過洗滌除去過量的介導物，加入ΤΜΒ/Η202底物以再生HRP從而放大信號。參見V. Gau等， Methods, 37 :73_83 (2005) J. C. Liao 等，J. Clin. Microbiol.，44 :561_570 (2006)。信號水 平取決於複合物的數量和活性。由於金屬電極與複合物之間的相互作用強，該表面看用作 複合物形成的限制器以及報導分子活性的抑制物。能放大信號的這種複合物稱為「有效復 合物」。只有有效複合物能產生放大的信號。在核酸的常規夾心檢測中，利用兩種線形寡核苷酸探針一種是將靶固定在表面 上的捕捉探針，另一種是含有報導分子以產生信號的檢測探針。參見V. Gau等，Methods, 37:73-83(2005) ；Ε. Palecek 等，Anal. Chim. Acta，469 :73_83 (2002) ；H. Xie 等，Anal. Chem. ,76 1611-1617 (2004)。因此，無論是否有介導物結合，非特異性和特異性靶均會增加 背景並導致假陽性結果。為增加特異性，在髮夾結構內引入空間位阻效應。髮夾探針的特徵 在於其打開-或-未打開的兩狀態結構。當沒有靶結合時，髮夾探針處於關閉狀態，因此， 報導分子因為設計的空間位阻而不能與介導物形成有效複合物。結合特異性靶後，探針轉 化成打開狀態，報導分子與介導物形成有效的複合物，從而導致信號放大。空間位阻設計簡 單而有效，從初始的兩探針設計中除去了化學反應步驟，從而減少了進行實驗的工作。由於 該操作中信號讀出只與報導分子和介導物之間形成複合物有關，檢測的靶不含標記物。無 標記物的檢測不僅減少所用試劑的類型，還能進行實時和高通量檢測。其可應用於微陣列 和自動原位檢測。2.髮夾探針設計的原則髮夾探針檢測的基本概念是特異性放大信號的空間位阻設計。該設計有3個原 則1.穩定的髮夾結構，可通過穩定的莖部分，即，髮夾的長莖得以滿足(N. LGoddard等， Phys. Rev. Lett. ,85 =2400-2403(2000)) ；2.高雜交效率，可通過穩定的雙鏈體部分，即，用 於雜交的長序列得以滿足(N. L. Goddard 等，Phys. Rev. Lett. ,85 2400-2403 (2000)) ；3.報 道分子的高空間位阻效應，可通過改變接頭長度或引入更大的介導物來增加表面效應而得 以滿足。通過改變髮夾探針結構來優化空間位阻效應，從而實現高SNR。除髮夾探針設計外，有兩種其它方法增加表面空間位阻效應。一種是探針的表面 密度。稠密包裝的髮夾探針的擁擠效應高於鬆散包裝探針的。其增加了對HRP結合和HRP 活性的限制性。然而，探針的表面濃度高時，靶的雜交也受到限制。寡核苷酸的鬆散分布得 到高雜交效率。為得到最佳雜交，各探針和表面應具有最佳表面覆蓋。如本文公開的，髮夾 探針的固定濃度為1X10—6到IX IO-7M時獲得良好結果。其它因素是施加於電極的電勢。由於寡核苷酸帶大量負電荷，正電勢可提高雜交 並增加電極對鏈的吸引力。負電勢使得雙鏈體打開並將該鏈推離表面。在高正電勢下，寡 核苷酸會平躺在電極上，而在負電勢下會伸入溶液中。參見U. Rant等，Biophys. J. ,90 3666-3671(2006)。當探針在正電勢下平躺在電極上時，對關閉和打開狀態的探針的表面空 間位阻幾乎相同，因此，互補靶結合沒有差別。參見R.G. S0Sn0WSki，P Natl AcadSci USA, 94:1119-1123 (1997)。因此，就這點而言，應採用負電勢。然而，少許正電勢會將未結合的髮夾探針維持在關閉狀態並穩定含靶的雙鏈體。這有助於獲得高信噪比(數據未顯示)。同 時，負電勢會破壞鹼基對相互作用。如果施加太高的負電勢，沒有靶結合時髮夾探針也會打 開。參見？.1&等，1^叫11111化，22 :6280-6285(2006)。電流計檢測的最佳電勢非常重要並且 對於髮夾探針的序列組成具有高度敏感。參見F. Wei等，Langmuir, 22 =6280-6285 (2006)。 如本文所公開的，負電勢(_200mV)下的檢測得到良好的SNR。本領域技術人員不難為給定 應用優化電勢。3.信噪比的考慮 此外，基於構象的傳統檢測通常是信號-關閉方法，與之相比，本發明的檢測可以 是信號-打開方法。參見 C. H. Fan 等，P Natl Acad Sci USA，100 :9134_9137 (2003)。信 號_打開方法在背景值低時檢測到信號增加，而信號_關閉方法在背景值高時檢測到信號 降低。在高數值時檢測的誤差通常大於在較低值時，因此，信號-打開方法具有更穩定的背 景噪聲水平。此外，信號-關閉方法中，信號降低的動肽範圍受限於原始背景值。因此，信 號-打開方法的檢出限較高，測量誤差較小並且更易於商業使用，因為其信號處理步驟少 於信號-關閉方法。實施例2 利用髮夾探針(HP)的唾液mRNA電化學檢測根據空間位阻(SH)抑制非特異性信號並產生信號打開放大過程以供靶檢測的原 則設計探針。莖_環構象使探針末端的報導分子接近表面附近，並使其不能為介導物結合 所用。靶結合打開探針的髮夾結構，然後介導物可結合可接近的報導分子。利用辣根過氧 化物酶(HRP)產生電化學信號。這種信號打開方法的特徵在於基礎信號低、陽性讀出強以 及動態範圍大。通過髮夾設計和電場控制SH。通過將電場控制施加於髮夾探針，RNA的檢 出限約為0. 4毫微微摩爾，比常規線形探針靈敏10，000-倍。用HP檢測內源性IL-8mRNA， 採用qPCR技術獲得良好習慣性。所得的方法設置簡單，通過減少步驟數而適於就地檢測復 雜體液，例如唾液中的特異性核酸序列。引言體液的分子分析為早期癌症檢測和隨後療效的提高提供了可能性(Mandel， I.D. (1990)Journal of Oral Pathology & Medicine，19，119-125 ;Mandel，I. D. (1993) Journal of the American Dental Association,124,85-87 ；Wong, D. T. (2006)Journal of the American Dental Association，137，313-321)。腫瘤釋放的分子標記有其途徑 進入血液和/或其它體液，特異性檢測生物標記能以非侵入性和特異性的模式鑑定疾病 (Gormally 等.(2006)Cancer Research，66，6871-6876 ；Herr 等.(2007)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica(美國國家禾鬥學院 學報)，104，5268-5273)。不難以非侵入性方式得到唾液，與血液相比，收集唾液的患者不 適性較低。此外，幹擾性物質(細胞、DNA、RNA和蛋白質)和抑制性物質的水平較低，並且 唾液中的複雜性低於血液中的。最近，在口腔癌mRNA標記的全面研究中顯示了該優點(Li 等.(2004) ClinicalCancer Research，10，8442-8450)。通過微陣列鑑定 mRNA，按照已有的 指導通過PCR(qPCR)驗證(P印e等.(2001) Journal of the National Cancer Institute, 93，1054-1061)。檢測唾液mRNA生物標記為唾液作為有價值的診斷液體增加了新的因素。 在本項研究中，我們的目的在於開發原位檢驗唾液mRNA的獨特方法。電化學方法是RNA檢測的就地診斷方法的優秀候選對象(Hahn等，(2005)Bioelectrochemistry，67，151-154)，不僅因為其靈敏度高，還因為儀器簡單(Liao和 Cui (2007)Biosensors & Bioelectronics，23，218—224 ;Wei 等，(2005)Journal ofthe American Chemical Society，127，5306-5307 ；Wei等，(2006)Langmuir，22，6280-6285 ；Wei 等，(2003)Biosensors & Bioelectronics，18，1157-1163 ;Wei 等，(2003)Biosensors & Bioelectronics，18，1149-1155)。然而，由於唾液生物標記的濃度低(約毫微微摩爾)並且唾液的背景複雜，常規電化學電流計檢測方法不能符合在唾液中直接檢測RNA的高信噪 比(SBR)臨床診斷要求。最近，Plaxco課題組報導了應用氧化還原_標記的髮夾探針來檢測包括血清和尿 液在內的各種體液中的寡核苷酸的新型方法(Lubin等，(2006)AnalyticalChemiStry，78， 5671-5677 ;Xiao 等，(2006)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(美國國家科學院學報)，103，16677-16680)。該方法成功證明 髮夾探針(HP)可用作電化學反應期間關閉和打開狀態之間的開關。這些結果顯著改善了 靈敏度和特異性。就唾液診斷而言，唾液中RNA生物標記的拷貝數低要求高靈敏度的傳感 器來檢測背景噪聲之上的信號。在本文，我們提出了基於HP探針將酶促放大過程與靶誘導 構象變化偶連的方法。該HP包含環組分和莖組分，所述環組分具有與靶互補的序列，而所 述莖組分用報導分子在一端作了標記。沒有靶結合時，傳感器表面附近產生空間位阻(SH)， 從而通過阻止介導物接近探針報導分子標記而抑制了信號放大。生物識別組分驗證了靶特 異性後，該內在SH除去，使得報導分子標記接近介導物_過氧化物酶偶聯物並產生電流信 號。因此，只有特異性靶才能產生放大的電流，即使其拷貝數低並且存在於複雜的混合物 中。可通過優化探針設計和表面電場來控制這種基於HP的電化學傳感器的SH效應。我們 的選擇性放大方法抑制非特異性信號與背景水平，克服了開發就地核酸檢測體系的關鍵障 礙以供唾液RNA標記和其它普通應用。材料與方法寡核苷酸探針和RNA定製合成HPLC-純化的寡核苷酸(美國阿拉巴馬州的操縱子公司(Operonlnc.))。 探針序列可形成髮夾結構。環和髮夾莖的一半(3』端)含有靶識別序列，用生物素或生物素-TEG在 5』端，用螢光素在3』端標記HP(詳細結構見圖10)。生物素標記物作為晶片表面的錨定物 結合鏈黴親和素，螢光素標記物能結合信號介導物。本發明人研究了連接探針和晶片表面 的5』接頭的以下構象生物素接頭、生物素-TEG、生物素-9胸苷(T9)和生物素-TEG-T9。 生物素-TEG具有基於三乙二醇的混合極性的額外間隔臂，其含有連接生物素和寡聚鏈的 氧原子。不同間隔臂設計可使得生物素更好地接近鏈黴親和素，並可用作SH效應的長度可 調接頭。有人提出幹擾素8(IL-8)mRNA(NM_000584) (St John 等，(2004) Archivesof Otolaryngology-Head & Neck Surgery，130，929-935)可用作 口腔癌的唾液生物標記，並 選其用於檢測。出於確定該方法有效性的目的，體外轉錄(IVT)的IL-8RNA用作標準定量 檢測的靶。IVT RNA產生的細節描述於補充材料II部分。檢測臨床樣品中的內源性mRNA。 為檢測唾液樣品的內源性IL-8，通過在室溫下1 1地混合唾液與美國加利福尼亞州恰根 公司(QIAGEN，California, USA)的AVL病毒裂解緩衝液15分鐘來進行裂解過程。唾液收集和qPCR檢測的細節描述於補充材料III-IX。產生體外轉錄的RNA用作RNA標記選擇兩種mRNA靶以供檢測。有人提出幹擾素8 (IL_8) (mRNA, NM_000584) (St John 等，(2004)Archives of Otolaryngology-Head & NeckSurgery，130，929-935)可用作口腔 癌的候選生物標記。在唾液中高度表達的SlOO鈣-結合蛋白A8 (S100A8) (mRNA, NM_002964) 在各電化學傳感器上用作參比物，其不顯示口腔癌相關性。出於方法確定的目的，IL-8和S100A8的體外轉錄(IVT)RNA在本項研究中用作檢 測靶。採用兩步驟產生IVT RNA 第一步是採用常規RT-PCR產生體外轉錄的模板，其中引物 在正向引物的5 』端具有20鹼基核心T7啟動子序列。對於IL-8，正向引物是5 『 -CTAATACG ACTCACTATAGGGaaggaaaactgggtgcagag-3『，反向引物是5' _attgcatctggcaaccctac_3『。 對於 S100A8，正向引物是 5' CTAATACGACTCACTATAGGGatcatgttgaccgagctgga-3'，反向引 物是5' -gtctgcaccctttttcctga-3 『。產物分別是177bp和159bp的雙鏈DNA。用總的 口腔鱗狀細胞癌(OSCC)細胞系RNA作為模板進行常規RT-PCR，在含有50UMuLV逆轉錄酶 (應用生物系統公司(Applied Biosystems)),20U RNA酶抑制劑(應用生物系統公司)、 IOmM dNTP和5納摩爾隨機六聚體的20 μ 1逆轉錄反應混合物中合成cDNA。該混合物首先 在25°C溫育10分鐘，然後在42°C逆轉錄45分鐘，再於95°C進行最終滅活5分鐘並於4°C 冷卻5分鐘。1微升cDNA用於含400nM引物的20μ1 PCR反應中。PCR反應按照以下方 案進行95°C，3分鐘，然後進行40輪的95°C、30秒，60°C、30秒，72°C、30秒，和72°C、最終 延伸7分鐘。在溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上檢測RT-PCR產物。第二步是產生IVT RNA。按照生產商的使用說明書，利用英傑公司的T7MEGA簡易轉錄試劑盒(T7 MEGAshort transcribe kit)進行體外轉錄。簡言之，37°C，體外轉錄第一步的8 μ 1 PCR產物3小時， 然後用2 μ 1 rDNA酶1 (英傑公司)額外處理20分鐘。用加利福尼亞州芒廷維尤市大角星 公司的清理設備(Arcturus,Mountain View, CA)純化得到的單鏈RNA轉錄物。用Nanodrop 分光光度法定量測定重組RNA的質量和A260/A280之比。將得到的RNA溶解於含麵包酵母 tRNA(30yg/ml，羅氏公司)作為運載體的無RNA酶蒸餾水(英傑公司)中。唾液收集按照我們公布的方案(Li，Yang 2004)收集未刺激的全唾液。簡言之，收集所有唾 液樣品，同時維持在冰上。收集後，室溫下將加利福尼亞州瓦倫西亞市恰根公司(QIAGEN， Valencia, CA)的RNAlater以1 1 (體積)比加入唾液樣品並通過渦流混合。將RNAlater 以1 1與全唾液混合併將樣品保存在-80°C能迅速而充分地抑制唾液RNA降解。-80°C保 存樣品試樣以待隨後使用。提取唾液總RNA按照以下方法提取總RNA 在冰上融化保存在RNAlater中的冷凍唾液，除了以下 例外之處，按照生產商的使用說明用恰根公司的病毒迷你試劑盒提取總RNA 為與以前報 道的方法(Li，Yang，2004)相當，利用兩倍起始體積的唾液RNAlater混合物(2X560ul)以 彌補RNAlater所致的唾液稀釋作用。用40 μ 1洗脫緩衝液洗脫得到 的總RNA，37°C，用美國 德克薩斯州奧斯丁市安拜恩公司的rDNA酶1在含有40 μ 1 RNA,4. 5 μ 1 10 X DNA酶I緩衝 液、0. 5 μ 1 rDNA酶I的溶液中處理30分鐘以除去任何基因組DNA汙染。用DNA酶滅活物 清理後，回收最多35 μ 1總RNA，-80°C冷凍待用。
引物設計利用引物3程序設計解鏈溫度約為60°C的IL8的跨內含子引物對。OF和OR是 RT-PCR的引物，IF和IR為qPCR設計。IL8_IF IL8 IF CCAAGGAAAACTGGGTGCAGIL8_IR IL8 OR CTTGGATACCACAGAGAATGAATTTTTIL8_0F IL8 OF TTTCTGATGGAAGAGAGCTCTGTCTIL8_0R IL8 IR ATCTTCACTGATTCTTGGATACCACART-PCR 預放大在20-40 μ 1反應體系中，用加利福尼亞州卡爾斯巴德市英傑公司的SuperScript III 鉬一步 qRT-PCR 系統(superscript III Platinum One-StepqRT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CA)進行一步RT和PCR預放大，所有靶的引物濃度為300nM。利用 BioMek 3000液體操控平臺，在PCR平板冷卻儀的96孔板內建立該反應體系，然後按照以 下程序進行60°C、1分鐘，50°C、15分鐘，95°C、2分鐘，和15輪的95°C、15秒，50°C、30秒和 600C UO秒以及72°C、10秒，72°C最終延伸5分鐘並冷卻至4°C。預放大反應的清理RT-PCR後，37°C，立即用2μ 1俄亥俄州克裡夫蘭市USB公司的Exo-SAP-.IT 處理 5μ 1反應液15分鐘以除去過量引物和dNTP，然後加熱至80°C，15分鐘以滅活酶混合物。除 非另有報導，用無核酸酶的水將反應液稀釋40倍。稀釋因子值Exo-SAP-IT處理前預放大 物的體積。定量實時PCR利用BioMek 3000液體操控平臺，在96孔板內自動建立所有反應體系。用300nM 的一對半巢式試驗擴增4μ 1預放大稀釋液試樣。在冰上配製含有加利福尼亞州福斯特城 應用生物系統公司的SYBR綠色強力反應混合物(SYBRGreen Power reaction mix,Applied Biosystems (AB), Foster City, CA)的 10 μ 1 反應體系，在 SDS 7500 快速儀器(AB)中運 行。95°C活化聚合酶10分鐘後，進行40輪的95°C、15秒和60°C、60秒，然後進行解鏈曲線 分析。qPCR 分析利用7500快速系統1. 3. 1版本軟體(AB)的自動基線設置進行qPCR分析。表面處理如下所示進行金電化學傳感器的表面處理(Gau等，(2001) Biosensors &Bioelectronics,16,745-755 ；Gau 等，(2005)Methods，37，73-83)探針固定化金電極用羧基封端的巰基十一烷酸(MUDA)自裝配單層(18)預塗布。用50% 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，畢埃可公司，新澤西州，美 國)和50% N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(畢埃可公司)的4 μ L混合物活化金表面10分鐘。 用DI水(18. 3ΜΩ · cm)清洗傳感器，用氮氣乾燥。將總共4 μ L的5mg/mL胺-PE02-生物 素標記試劑(Ez-生物素)(美國伊利諾斯州皮爾斯公司)加載於金表面，然後清洗和乾燥。 加載乙醇胺-HCl (1. 0Μ，ρΗ 8. 5，畢埃可公司)以使未反應的EDC/NHS活化表面滅活。然後， 將PBS(pH 7. 2，英傑公司，加利福尼亞州，美國)配製的0. 5mg/mL鏈黴親和素(VWR公司，力口 利福尼亞州，美國)在電極上溫育10分鐘以產生塗布有鏈黴親和素的電極。然後通過表面上的鏈黴親和素與探針上的生物素標記物之間的相互作用將Tris-HCl緩衝液(pH 7. 5，英 傑公司，加利福尼亞州，美國)配製的4yL 5'-生物素化和3'-螢光素雙重標記的HP在 電極上固定30分鐘。據報導，採用該固定化方法獲得的寡聚探針的表面密度約為3. 4X1012 分子/cm2 (Su等，(2005) Langmuir，21，348-353)。用DI水徹底清洗除去過量HP，用氮氣乾燥。
靶雜交將該表面與在含有IOmM MgCl2(西格瑪公司，密蘇裡州，美國)的6X鹽 水-檸檬酸鈉緩衝液(6xSSC，0. 09M檸檬酸鈉，含0. 9M NaCl，pH 7. 0，英傑公司，加利福尼 亞州，美國)中配製的含靶樣品溫育5分鐘。雜交期間，施加30輪循環方波電場+200mV、 1秒和-300mV、90秒。雜交後，用DI水清洗電極，氮氣乾燥。電化學檢測按照生產商的使用說明書，利用電化學工作站進行電化學讀出。簡言之，將用含 0.5%酪蛋白封閉緩衝液(PBS配製的封閉劑酪蛋白，皮爾斯公司，pH7.4)的PBS稀釋的 抗_螢光素-HRP(羅氏公司，印第安納州，美國)加入HP或檢測探針上的螢光素標記物。 然後，加載3，3' ,5,5'四甲基聯苯胺低活性(ΤΜΒ/Η202，尼金公司，肯塔基州，美國)底物， 通過給各金電極單位施加_200mV電壓，平衡60秒後平行讀出信號以進行電流分析檢測 (Gau 等，(2001) Biosensors & Bioelectronics，16，745-755 ;Gau 等，(2005)Methods，37， 73-83)。電化學傳感器是16-單位金陣列。每個單位有三個電極，包括工作電極 (WE)、對電極(CE)和參比電極(RE) (Gau 等，(2005)Methods, 37，73-83)。通過檢測 0. ImM[Fe (CN)6] "4I勺循環伏安曲線(cyclic voltammetric curve)確定參比電極對SCE為 +218mV。該報導所述的所有電勢是以金參比電極為參照的(+218mV對SCE)。該小電極陣列 的優點是可同時獲得16個電極的信號讀出值，並且檢測只需要4μ L樣品溶液。在我們的 實驗中，電化學信號是HRP報導酶氧化還原所產生的電流。TMB通過2-電子步驟不停再生 還原的HRP，從而放大電流信號。電流與雜交靶的表面濃度成比例(Gau等，(2005)Methods, 37，73-83)。所有實驗在室溫下進行。結果與討論1.髮夾-誘導的特異性放大通過藉助HRP和ΤΜΒ/Η202的夾心樣信號放大與藉助HP設計的選擇性雜交的組合 來實現利用電流方法檢測特異性靶。該方法基於SH效應接近HP的表面抑制HRP偶聯物 結合不含靶的探針。因此，表面和探針上報導標記物之間的距離是檢測方法的關鍵因素。靶 結合後，HP打開，報導分子遠離表面，導致表面的限制作用降低。偶連的HRP結合於螢光素 並產生電流，從而構成信號打開過程。比較了顯示SH水平不同的含和不含接頭的4種IL-8特異性HP，所述SH水平不同 是因為報導分子與電極表面之間的距離不同所致(表3)。通過5』-生物素標記端的突出間 隔臂(T9)或TEG的長度調節接頭的長度和靈活性。分子力學計算(MM2)得到生物素-TEG W@(n|X\^^^3nm(Allinger,N. L. (1977) Journal of the American Chemical Society, 99,8127-8134)。未施加作用力時單鏈DNA在電極上處於捲曲狀態。當在負電勢下進行電 化學檢測時，捲曲(的DNA)可能會伸直，從而能結合偶聯物(Rant等，(2006)Biophysical Journal, 90, 3666-3671 ；van Oijen 等，(2003) Science，301，1235-1238)。雖然 T9 接頭的實際長度不清楚，但如果雙鏈體DNA是9bp X 0. 28nm/bp，其在負電勢下應該長於3nm。按照蛋白質晶體數據，HRP 尺寸是約 4X6. 7X11. 8nm(Berglund 等，(2002)Nature,417,463-468)。圖6顯示了不同HP設計的SH效應。對於具有最長接頭的探針(TEG-T9),即使發 夾關閉時，螢光素依然遠離表面。介導物複合物形成，SH效應非常低。與靶雜交只增加了 HRP複合物與電極的距離。因此，結合後信號降低，識別導致非常弱的信號關閉過程(圖6)。 4種探針的靶結合信號水平相似，空白信號隨接頭長度減少而降低。對於不含接頭的HP，報 道分子以關閉狀態非常接近表面。因此，SH效應非常強，觀察到最低的背景(SBR = 8. 1)。2.特異性檢驗了不含接頭的HP與2種靶交叉反應的特異性，結果示於圖11。我們利用 在唾液中高度表達而且沒有口腔癌相關性的SlOO鈣結合蛋白A的mRNA(S100A8mRNA， NM_002964)作為參比對照。對於各探針，在互補和非互補IVT RNA靶之間進行比較，IL-8 的濃度是5nM和500nM，S100A8的濃度為7nM和700nM。對於IL-8-和S100A8-特異性探 針，即使非互補靶過表達100倍，信號增加也不多。互補靶信號是空白對照的20倍標準偏 差(SDV)以上。兩種探針均顯示良好的RNA區分能力，IL-8是5nM，而S100A8是7nM。3.控制SBR以及雜交效率RNA傳感器的主要問題是SBR。在目前的HP設計中，SBR取決於打開或關閉HP的 數量之比。沒有特異性靶結合時背景水平與關閉狀態有關，靶雜交後從打開狀態產生信號。 識別期間這些關閉或打開的狀態要求高效率的分子內和分子間雜交。為增加雜交效率並優化該傳感器的SBR，我們通過改變莖和環長度修飾了髮夾結 構。研究了莖環長度不同的三種HP (序列見表4)。在所有三種探針中，3』 -端莖組分連同 環與靶RNA互補。具有短莖(6bp)和雙鏈體(21+6bp)的探針的背景高而信號低(圖7中 的HPS3)。具有最長莖(IObp)和雙鏈體(10+31bp)的探針的空白信號最低而靶信號最高 (HPSl)，表明沒有靶結合時更好的關閉狀態，與靶雜交時更好的打開狀態。互補HP序列包 含完整的環和莖的一半，從而在靶雜交後提供較低自由能。因此，一旦靶與環結合，即使非 常長的莖也能因其序列與靶互補而打開。由於高雜交效率同時有益於靈敏度和特異性，從 而能實現良好的SBR。相比之下，用傳統線形探針(LP)難以確定優化的探針序列(Liao等， (2006) Journal of Clinical Microbiology, 44，561-570)。長序列有助於雜交效率，但產 生高背景。4.檢測唾液中摻加的RNA通過合適的HP設計和SH效應的協助，可在靶濃度的各種動態範圍上檢測唾液RNA 生物標記序列。圖12顯示緩衝液中濃度與電流信號之間的關係。為進行比較，還採用以前 公布的方法(Liao 等，(2006) Journal of ClinicalMicrobiology，44，561-570)檢測了含各 靶的兩種LP的原始系統。簡言之，將兩種探針設計成與靶序列的毗鄰延伸段互補。將「捕 捉探針」固定在電極上，並含有5』端生物素標記。「檢測探針」具有3』螢光素標記以結合 抗_螢光素-HRP。我們的結果顯示用HP檢測IL-8得到良好的SBR，但用LP觀察到性能不 佳。檢出限(LOD)定義為信號為背景水平之上至少2SDV的濃度。根據該標準，HP的 LOD約為0. 4毫微微摩爾。對於LP，IL-8的LOD約為400皮摩爾，比HP約高10，000倍(圖 12)。
5.檢測唾液中的內源性mRNA然後我們檢測了唾液樣品中的內源性IL-8mRNA。觀察到不同唾液樣品之間有信號水平改變。採用本發明的優化HP設計檢測7種臨床唾液樣品中的IL-8mRNA。由於唾液中 的內源性mRNA混合了會遮蔽檢測的其它大分子，先進行裂解過程在進行電化學試驗以釋 放遮蔽的RNA。在唾液樣品的電化學信號與qPCR結果之間觀察到良好相關性，如圖13所 示。如qPCR檢測所測定的，在含有較高水平的IL-SmRNA的唾液樣品中觀察到較高電化學 信號。除了 PCR檢測，這些結果支持了唾液中存在mRNA。這些結果還說明無需PCR擴增可 通過電化學方法檢測唾液中的內源性mRNA，這滿足就地唾液診斷的靈敏度要求。採用各種電化學相關方法檢測DNA寡核苷酸達到fM範圍的L0D。這些方法包括 納米顆粒連接的二級探針(Park等，(2002) Science，295，1503-1506)、採用多步還原方法 沉積的銀納米顆粒的陽極剝離伏安法(Hwang和Kwak(2005) Anal Chem, 77, 579-584)和基 於靶誘導鏈置換機制的電子DNA傳感器(Xiao等，(2006) Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America(美國國家禾鬥學院學報)，103, 16677-16680)。與寡聚物相比，mRNA具有更長的序列和更複雜的二級結構。為捕捉特異性 mRNA靶，必須小心選擇mRNA的特徵性片段。二級mRNA結構可減弱捕捉探針與靶之間的雜 交作用。在本項研究中，本發明人選擇通過M倍(Mfold)網絡伺服器計算得到的二級結構 最低的 mRNA 片段(Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Research，31，3406-3415)。探針設計 還要求充分考慮環序列、莖長度和探針二級結構。考慮到RNA的內在2-D或3-D結構，以下 原理適用於線形和髮夾探針設計(1)應考慮探針對靶mRNA:mRNA 二級結構的親和力和與靶RNA互補的探針序列的 二級結構，包括四重和髮夾(探針)。根據四重和M-倍(M-fold)計算值選擇沒有穩定二級 結構的序列。還要根據熱力學計算值考慮自-二聚體的形成和雜交穩定性。(2)對於最佳髮夾探針性能，將莖的一半(3』端)連同環設計成與靶RNA互補。由 於本項研究中所有HP的莖的5』端通過生物素-鏈黴親和素固定在表面上，雜交過程中只 有3』莖是自由的。對於雙鏈體形成，共享莖的3』端與環導致雜交效率較高而SH效應變化 更大。總之，本發明人開發了以高靈敏度、高特異性和大動態範圍(緩衝液體系和摻加 唾液中fM-nM)地利用HP的電化學檢測mRNA的有效方法。本發明人還證明該技術對於直 接檢測內源性mRNA而無需PCR擴增能良好起作用。表3. IL-8和S100A8的寡核苷酸序列
L0198」 *通過M倍(Mfold)免費網絡伺服器計算髮夾探針設計(27，28)。t靶識別序列見斜體字。髮夾的莖部分由下劃線標出。t IL-8CP是雙探針檢測中含生物素標記的捕捉探針。IL-8DP是雙探針檢測中含熒 光素標記的檢測探針。表4.具有不同莖-環結構的IL-8HP的寡核苷酸序列 *所有探針用5'-生物素和3' _螢光素作雙重標記。1"通過M倍(Mfold)免費網絡伺服器計算髮夾探針設計(27，28)。 靶識別序列見斜體字。髮夾的莖部分由下劃線標出。本申請引用的所有專利、專利申請和其它出版物，包括公布的胺基酸或多核苷酸 序列出於所有目的通過弓I用全文納入本文。
權利要求
一種用於靶核酸分子的探針，該探針包含與靶核酸分子的序列特異性雜交的多核苷酸序列和受體的配體，當沒有靶核酸分子與其結合時，所述探針具有第一三維結構，當有靶核酸分子與其結合時，所述探針具有第二三維結構，其中所述第一三維結構抑制或阻止該受體結合該配體，而所述第二三維結構允許該受體特異性結合該配體。
2.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述受體包含可檢測標記物。
3.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，來自可檢測標記物的檢測信號被放大。
4.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述第一三維結構對所述受體結合所述配 體具有空間位阻作用。
5.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述探針固定在基材上。
6.如權利要求5所述的探針，其特徵在於，所述第一三維結構將所述配體置於接近所 述基材的位置，從而抑制或阻止所述受體結合所述配體。
7.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述受體是特異性結合所述配體的抗體。
8.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述可檢測標記物是螢光素、鏈黴親和素或 生物素。
9.如權利要求3所述的探針，其特徵在於，通過過氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、鹼性 磷酸酶或脲酶放大檢測信號。
10.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述探針是髮夾探針或四重探針。
11.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述靶核酸分子是IL-8核酸。
12.如權利要求1所述的探針，其特徵在於，所述多核苷酸序列選自表2-4。
13.—種檢驗樣品中靶核酸分子的方法，所述方法包括將權利要求1所述探針與所述樣品和受體接觸，和檢測所述配體和所述受體之間的複合物存在與否，其中存在所述複合物表明所述樣品中存在所述靶核酸分子，不存在複合物表明所述樣 品中不存在所述靶核酸分子。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述受體包含可檢測標記物。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，還包括放大來自可檢測標記物的檢測信號。
16.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述第一三維結構對所述受體結合所述 配體具有空間位阻作用。
17.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述探針固定在基材上。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述第一三維結構將所述配體置於接近 所述基材的位置，從而抑制或阻止所述受體結合所述配體。
19.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述受體是特異性結合所述配體的抗體。
20.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記物是螢光素、鏈黴親和素 或生物素。
21.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，通過過氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、鹼 性磷酸酶或脲酶放大來自可檢測標記物的檢測信號。
22.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述探針是髮夾探針或四重探針。
23.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，還包括先除去未與所述配體結合的任何受體，再檢測所述複合物。
24.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述靶核酸分子是IL-8核酸。
25.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸序列選自表2-4。
全文摘要
本發明涉及能高靈敏度和高特異性地檢測樣品中的靶核酸的分子探針。還公布了利用該探針的檢測方法。
文檔編號G01N33/00GK101849185SQ200880101316
公開日2010年9月29日 申請日期2008年5月30日 優先權日2007年5月31日
發明者B·G·齊默爾曼, D·T·W·王, 魏芳 申請人:加利福尼亞大學董事會