一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法

2023-10-18 03:11:04 3

專利名稱：：一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及酶催化/酶抑制生物
技術領域：
，具體為一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法。
背景技術：
：植物果實(如冬瓜子等)中所含有的短鏈生物鹼具有胰蛋白酶抑制劑活性。有報導稱，從冬瓜子中提取出來的這些特殊的生物鹼成分，在生理條件下可表現出減肥功效。此外，冬瓜子還具有多種其它藥用功能，如用冬瓜子提取物治療血吸蟲病等。故冬瓜子及其提取物被廣泛接受為一種保健佳品。但是，在測定冬瓜子提取物的胰蛋白酶抑制劑活性時，卻缺乏靈敏、簡便的方法。現有測定方法是用牛血清白蛋白作為胰蛋白酶的作用底物，然後加入抑制劑成分，根據抑制劑加入前後牛血清白蛋白量的變化來確定胰蛋白酶抑制劑的活性。現有技術的缺點是牛血清白蛋白中胰蛋白酶的作用位點是醯氨鍵，作用不徹底，反應靈敏度差。BAPNA(苯甲醯-L-精氨醯對硝基苯胺鹽酸鹽)檢測法是以BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，已應用到胰蛋白酶活性檢驗過程中。採用BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，來測定胰蛋白酶抑制劑活性，使各類胰蛋白酶抑制劑活性的測定更為簡單、方便、靈敏。
發明內容本發明的目的是提供一種簡易、靈敏、高效的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法。為實現上述目的，本發明所採用的技術方案為胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法胰蛋白酶反應體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應10-15分鐘後，加入反應終止液，而後測定反應終溶液在410nm波長下的吸光度值，根據抑制劑的加入量與吸光度值繪製出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性;其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應體系中0.5—1.0ml。所述反應溫度為36-38°C。所述的反應終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1-0.2ml。所述BAPNA溶液為稱取40mgBAPNA溶於1.0mL二甲基亞碸中，而後用37。C的tris-CaCl2溶液稀釋至100mL。本發明所具有的優點本發明釆用BAPNA為胰蛋白酶的作用底物，保持適合的溫度和酸鹼度，再加入用胰蛋白酶標準品配製的胰蛋白酶溶液，根據所加胰蛋白酶抑制劑提取液量的差異而得到的不同吸光度值，繪製抑制劑活性曲線，確定抑制劑活性。本發明以BAPM為胰蛋白酶的作用底物，胰蛋白酶作用於BAPNA中的脂鍵，且因為BAPNA是一小分子物質，所以反應徹底，可獲得較高的檢測靈敏度。並且可使胰蛋白酶抑制劑的微量檢測成為可能。本發明儀器簡單、操作方便、反應靈敏度高，適用於各類胰蛋白酶抑制劑活性的測定。本發明根據胰蛋白酶抑制劑樣品液加入量及其相應對照管與測定管吸光度值的差值U,-A2)繪製曲線，其中配置對照管的目的是為了消除反應體系中非BAPNA胰蛋白酶分解產物對終反應液吸光度值的影響。反應體系中胰蛋白酶溶液最後加入，由於醋酸溶液的存在，反應體系pH值處在5.0~5.5範圍內，在此pH範圍內胰蛋白酶自身分解，而對BAPNA不起分解作用，所以反應體系中並沒有BAPNA胰蛋白酶分解產物的存在，反應終溶液的吸光度值完全由非BAPNA胰蛋白酶分解產物因素決定。因而，對照管吸光度值與測定管所得吸光度值的差異，便是BAPNA胰蛋白酶分解產物在410nm波長下的吸光度值。根據胰蛋白酶抑制劑樣品液加入量及其相應對照管與測定管吸光度值的差值繪製曲線，由斜率進而計算出所測定樣品的胰蛋白酶抑制劑活性。圖l為胰蛋白酶抑制劑活性測定坐標曲線圖。具體實施例方式1)pH:8.1、0.05mol/Ltris-CaCl2溶液配製(三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液)用900mL蒸餾水中溶解6.05g三羥甲基氨基甲烷及2.94gCaCl2.H20於約，調節至pH為8.1並用蒸餾水稀釋至1.0L。2)BAPNA溶液的配製稱取40mgBAPNA溶於1.0mL二甲基亞碸中，並用已預熱到37。C的tris-CaClr溶液稀釋至100mL。配製BAPNA溶液的燒杯必須保證完全乾燥，並且須將BAPNA完全溶於二甲基亞碸後，再加入tris-CaCh溶液。3)胰蛋白酶溶液的配製稱取4.Omg胰蛋白酶(不含鹽)溶於200mL0.001mol/L的HC1溶液；冬瓜子提取物溶於10mL0.001mol/L的HC1溶液4)醋酸溶液的配製取30mL濃度為36%的醋酸溶液稀釋至100mL。測定方法首先，吸取不同量的胰蛋白酶抑制劑提取液加入事先準備好的試管中(參見表1),以蒸餾水稀釋至2.0mL,順序加入5.0mL預熱至37。C的BAPNA溶液，2.0mL胰蛋白酶溶液，並嚴格於IO分鐘後加入1.0mL醋酸溶液終止反應，將反應液搖勻，於410nra波長下測定其吸光度值A,(參見表3)。表l測定管中反應物的加入組分和含量tableseeoriginaldocumentpage4tableseeoriginaldocumentpage5注表格橫列代表試管序號；表格縱列代表試管內所加的溶液A.蒸餾水B.胰蛋白酶抑制劑樣品液C.預熱至37'C的BAPNA溶液D.胰蛋白酶溶液E.醋酸溶液，體積單位(mL)。其次，配製對照樣品液，取相應胰蛋白酶抑制劑樣品液和蒸餾水共2.0mL(參見表2)，加入5.0mLBAPNA溶液並在水洛鍋中37。C恆溫反應10分鐘，再順序加入l.OmL醋酸溶液，2.0mL胰蛋白酶液，於410nm波長下測定其吸光度值A,(參見表3)。表_2對照管中反應物的加入組分和含量tableseeoriginaldocumentpage5由曲線斜率計算樣品的胰蛋白酶抑制劑活性值，因樣品吸光度值隨樣品加入量的增大而減小，故胰蛋白酶抑制劑活性值取斜率絕對值為0.0826。實施例2與實施例l不同之處在於胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法胰蛋白酶反應體系反應時間為12分鐘後，反應溫度為38'C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應體系中1.0ml。所述的反應終止液為醋酸溶液，其加入量為0.2ml。實施例3與實施例1不同之處在於胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法胰蛋白酶反應體系反應時間為15分鐘後，反應溫度為38"C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應體系中G.8ml。所述的反應終止液為醋酸溶液，其加入量為0.15ral。實施例3與實施例l不同之處在於胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法胰蛋白酶反應體系反應時間為14分鐘後，反應溫度為36'C，其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每亳升胰蛋白酶反應體系中0.6ml。所述的反應終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1ml。權利要求1.一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，其特徵在於胰蛋白酶反應體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應10-15分鐘後，加入反應終止液，而後測定反應終溶液在410nm波長下的吸光度值，根據抑制劑的加入量與吸光度值繪製出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性；其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應體系中0.5-1.0ml。2.按權利要求1所述的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，其特徵在於所述反應溫度為36-38°C。3.按權利要求1所述的的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，其特徵在於所述的反應終止液為醋酸溶液，其加入量為0.1-0.2ml。4.按權利要求1所述的的胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，其特徵在於所述BAPNA溶液為稱取40mgBAPNA溶於1.0mL二甲基亞碸中，而後用37。C的tris-CaCh溶液稀釋至100mL。全文摘要本發明涉及酶催化/酶抑制生物
技術領域：
，具體為一種胰蛋白酶抑制劑活性的檢測方法。檢測具體過程主要為在胰蛋白酶反應體系中分別加入胰蛋白酶抑制劑提取物和胰蛋白酶作用底物，待反應10-15分鐘後，加入反應終止液，而後測定反應終溶液在410nm波長下的吸光度值，根據抑制劑的加入量與吸光度值繪製出曲線，確定胰蛋白酶抑制劑的活性；其中胰蛋白酶作用底物為BAPNA溶液，加入量為每毫升胰蛋白酶反應體系中0.5-1.0ml。本發明使用儀器簡單、操作方便、反應靈敏度高，適用於各類胰蛋白酶抑制劑活性的測定。文檔編號C12Q1/37GK101191142SQ20071015911公開日2008年6月4日申請日期2007年12月21日優先權日2007年12月21日發明者史榮久,穎張,張忠澤,慧徐,慧李,李啟平,楊偉超,韓斯琴申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所