一種低分子量肝素的製備方法與流程
2023-10-17 08:08:14
本發明涉及一種低分子量肝素的製備方法,特別涉及一種利用超聲輔助氧化方法綠色、快速製備低分子量肝素的方法,屬於多糖降解領域。
背景技術:
肝素是一種由艾杜糖醛酸和葡萄糖胺組成的,具有雙糖重複單元的長鏈粘多糖,屬糖胺聚糖,且分子量在3-30kda之間,重均分子量約15kda左右。肝素首先發現於肝臟,也因此得名,廣泛分布於在哺乳動物的組織中,如肝臟、肺、腸黏膜、心、脾臟、腎、胸腺等,其在醫藥方面作為抗凝血和抗血栓藥物的應用備受關注。隨著對其研究的不斷深入,科學家還發現肝素具有抗炎、抗病毒、抗癌、調節血脂等諸多生物學功能。
低分子量肝素是通過對普通肝素降解得到的分子量較小的片段,具有生物利用率高、血漿半衰期長、口服易吸收、致出血傾向大大降低等諸多優點。目前常用的低分子量肝素製備方法包括肝素鈉酶降解法、亞硝酸降解法、β-消除法、過氧化物降解法和過碘酸降解法,但由於酶法降解生產成本較高而缺乏競爭力,因此,市場上低分子量肝素製備多採用化學降解方法,易引起化學汙染,且生產周期較長,如亞硝酸降解法在ph2.3-3.0,需約3.5h的反應。該方法利用超聲和抗化血酸催化fe2+和過氧化氫的氧化反應,從而達到快速製備低分子量肝素的目的。
技術實現要素:
本發明的目的在於改進目前低分子量肝素製備技術,提供了一種安全、快速的一種低分子量肝素的製備方法。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種低分子量肝素的製備方法,包括以下步驟:
(1)取一定量的蒸餾水,加入適量hcl溶液調整ph在3-5之間,加入fecl2·4h2o或feso4·7h2o和抗壞血酸,配置成含有1.0-5.0mmol/lfe2+和0.5-2.0mmol/l抗壞血酸的溶液a。
(2)取肝素溶於溶液a,使得肝素的濃度為4-20mg/ml,攪拌溶液至肝素完全溶解;
(3)將步驟2配置的肝素溶液轉移至10-40℃環境中進行超聲處理,超聲強度為3-15w/ml,同時在溶液中加入8mol/lh2o2溶液,使金屬離子與過氧化氫的摩爾比為1:10-1:25;
(4)超聲處理後,加入亞硫酸氫鈉,終止反應,然後通過陽離子交換樹脂置換溶液中的金屬離子;
(5)對步驟4處理後的溶液進行過濾,取濾液調整ph至5-8;
(6)將步驟5處理後的溶液轉移至500da的透析袋中,流水透析24h,純水透析24h,透析後液體0.22μm的水膜,凍幹,得到低分子量肝素。
進一步地,所述步驟1中,ph為3,fe2+濃度為2mm,抗壞血酸濃度為1.0mmol/l。
進一步地,所述步驟3中,金屬離子與過氧化氫的摩爾比為1:20。
進一步地,所述步驟5中,ph為6。
本發明所具備的優點:
1.本發明為肝素降解提供一種綠色、安全、快速降解方法,得率可達到75%以上,所得產品純度較高、質量穩定、成本低。
2.降解工藝簡單,反應時間短,所用樹脂可重複利用,工藝條件環保無汙染。
3.本發明所得的產品的重均分子量在4000-5500da,抗xa因子活性為85-105u/mg。
具體實施方式
本發明通過超聲、抗壞血酸和fenton氧化反應聯用,達到快速降解肝素的目的。超聲能夠強化fenton反應中fe3+的還原,還原生成的fe2+可進一步與過氧化氫發生反應,產生羥基自由基;同時抗壞血酸亦可強化降解體系,促進肝素的降解。羥基自由基造成肝素的氧化斷裂,作用位點主要集中於未硫酸化的己糖醛酸,形成低分子量肝素。所得到的的肝素重均分子量在4000-5500da,產物抗凝血保留,且副作用減小。
fe2++h2o2→fe3++·oh+oh-(1)
下面結合具體事例對本產品做進一步闡述。
實施例1:
(1)取30ml蒸餾水,加入3mol/lhcl溶液,調整ph至3,加入fecl2·4h2o和抗壞血酸,配置成含有1mmol/lfe2+和0.5mmol/l抗壞血酸的溶液a;
(2)取120mg/ml肝素溶解於30ml溶液中,攪拌充分溶解後,轉移至超聲管(內徑3.4cm)中;
(3)將超聲管置於10℃恆溫槽中,並開啟超聲設備,同時加入8mol/lh2o2溶液,使金屬離子與過氧化氫比為1:10,設置超聲強度3w/ml,超聲處理10min;
(4)超聲處理後,加入過量亞硫酸氫鈉,還原多餘h2o2,終止反應;
(5)將終止反應後的溶液通過陽離子交換樹脂,控制流速為0.5ml/min,充分置換其中的鐵離子;
(6)將置換後的溶液過0.22μm的水膜,取濾液用2mol/lnaoh調整ph為6.0;
(7)將上述溶液轉移至500da的透析袋中,流水透析24h,純水透析12h,後將其置於真空冷凍機中凍幹。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定,重均分子量為4876da,抗xa因子活性為96u/mg。
實施例2:
(1)取300ml蒸餾水,加入3mol/lhcl溶液,調整ph至3.5,加入fecl2·4h2o和抗壞血酸,配置成含有3mmol/lfe2+和1mmol/l抗壞血酸的溶液a;
(2)取3g肝素溶解於300ml溶液中,攪拌充分溶解後,轉移至超聲槽中;
(3)將其置於30℃恆溫槽中,並開啟超聲設備,同時加入8mol/lh2o2溶液,使金屬離子與過氧化氫比為1:18,設置超聲強度10w/ml,超聲處理10min;
(4)超聲處理後,加入過量亞硫酸氫鈉,還原多餘h2o2,終止反應;
(5)將終止反應後的溶液通過陽離子交換樹脂,控制流速為0.5ml/min,充分置換其中的鐵離子;
(6)將置換後的溶液過0.22μm的水膜,取濾液用2mol/lnaoh調整ph為5;
(7)將上述溶液轉移至500da的透析袋中,流水透析24h,純水透析12h,後將其置於真空冷凍機中凍幹。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定,重均分子量為4618,抗xa因子活性為94u/mg。
實施例3:
(1)取3000ml蒸餾水,加入3mol/lhcl溶液,調整ph至5,加入fecl2·4h2o和抗壞血酸,配置成含有5mmol/lfe2+和2mmol/l抗壞血酸的溶液a;
(2)取60g肝素溶解於3l溶液中,攪拌充分溶解後,轉移至超聲槽中;
(3)將其置於30℃恆溫槽中,並開啟超聲設備,同時加入8mol/lh2o2溶液,使金屬離子與過氧化氫比為1:25,設置超聲強度15w/ml,超聲處理10min;
(4)超聲處理後,加入過量亞硫酸氫鈉,還原多餘h2o2,終止反應;
(5)將終止反應後的溶液通過陽離子交換樹脂,控制流速為0.5ml/min,充分置換其中的鐵離子;
(6)將置換後的溶液過0.22μm的水膜,取濾液用2mol/lnaoh調整ph為8;
(7)將上述溶液轉移至500da的透析袋中,流水透析24h,純水透析12h,後將其置於真空冷凍機中凍幹。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定,重均分子量為5319,抗xa因子活性為89u/mg。