使用甲醯-甘氨酸生成酶(fge)對多種硫酸酯酶缺乏症和其它病症進行診斷和治療的製作方法

2023-10-18 01:43:19

專利名稱：使用甲醯-甘氨酸生成酶(fge)對多種硫酸酯酶缺乏症和其它病症進行診斷和治療的製作方法
使用甲醯-甘氨酸生成酶(FGE)對多種硫酸酯酶缺乏症和其它病症進行診斷和治療
本申請是申請號200480006490. 0，申請日2004年02月10日的同名申請的分案申請。發明領域
此發明涉及診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)以及其它硫酸酯酶缺乏症的方法和組合物。更特異地，本發明涉及被分離的調節硫酸酯酶翻譯後修飾的分子。這類修飾為硫酸酯酶的正確功能所必需。
發明背景
硫酸酯酶是高度保守的基因家族的成員，共享廣泛的序列同源性(Franco，B. 等，Cell，1995，81:15-25;Parenti, G.等，Curr. Opin. Gen. Dev.，1997，7:386-391)，高度的結構類似性(Bond, C. S.等，Structure, 1997，5:277-289; Lukatela, G.等，Biochemistry, 1998, 37:3654-64)，和獨特的為硫酸酯斷裂所必需的翻譯後修飾(Schmi dt, B.等，Ce 11， 1995，82:271-278; Selmer, T.等，Eur. J. Biochem.，1996，238:341-345)。翻譯後修飾包括對保守的半胱氨酸(在真核細胞中)或絲氨酸(在某些原核細胞中)殘基在Ce處的氧化，得到L-Ca-甲醯甘氨酸(也叫做FGly，2-氨基-3-氧代丙酸)，其中醛基代替了側鏈的硫代甲基基團。醛基是硫酸酯酶催化位點的必需部分，很可能作為醛水合物起作用。成對的羥基之一在硫酸酯斷裂時接受硫酸基團，導致共價硫酸化的酶中間物的形成。其它羥基是隨後的硫酸基團消去和醛基再生所需要的。此修飾在初生硫酸酯酶多肽輸入期間或間隔很短時間之後發生於內質網，並被圍繞著將被修飾的半胱氨酸(或絲氨酸)殘基的短線性序列所調控。此高度保守序列是六肽L/V-C(S)-X-P-S-R(SEQ ID NO:32)，出現在所有真核細胞硫酸酯酶的N末端區域,並最頻繁地在殘基X上攜帶輕基或硫輕基(Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A.，1997，94:11963-11968)。
迄今為止，已在人體中鑑別出13個硫酸酯酶基因。它們編碼具有不同底物專一性和亞細胞定位如溶酶體、高爾基體和內質網定位的酶。這些基因中的四種ARSC，ARSD, ARSEjPARSF (分別編碼芳基硫酸酯酶C，D，E和F)，位於相同的染色體區域(Xp22. 3)內。 它們共享顯著的序列類似性和幾乎相同的基因組組織方式，說明它們來源於在進化中近來才發生的複製事件(Franco B 等，Cell, 1995，81:15-25;Meroni G 等，Hum Mol Genet, 1996,5:423-31)。
由單獨硫酸酯酶活性的缺乏所引起的至少八種人單基因疾病的鑑定，強調了硫酸酯酶在人體代謝中的重要性。這些病症中的大部分是溶酶體存貯病，其中，表型結果源於被儲存物質的類型和組織分布。在它們中，有五種不同類型的因硫酸酯酶對粘多糖分解代謝作用的缺乏而引起的粘多糖病(MPS類型II, IIIA, HID, IVA和VI) (Neufeld和 Muenzer，2001，The mucopolysaccharidoses,In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，C. R. Scriverj A. L. Beaudetj W. S. Sly, D. Valle, B. Childs, K. W. Kinzler 和 B. Vogelstein 編，New Yor k:Mc Graw-Hi ll，pp. 3421-3452)，和以腦硫脂在中樞和外周神經系統中儲存並引起嚴重和漸進性神經退化為特徵的異常染性腦白質營養不良(MLD)。兩種另外的人類疾病由非溶酶體硫酸酯酶缺乏引起。這些包括X-連鎖的魚鱗病，因類固醇硫酸酯酶(STS/ARSC)缺乏而引起的皮膚病；和點狀軟骨發育不全，由芳基硫酸酯酶E(ARSE)缺乏引起的影響骨和軟骨的疾病。硫酸酯酶也牽涉到藥物誘導的人畸形綜合症，例如Warfarin胚胎病，由懷孕期間在宮內暴露於殺鼠靈而抑制ARSE活性所引起。
在引起人興趣的人類單基因疾病中，多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)是所有硫酸酯酶活性同時有缺陷。因此，此嚴重的多系統性疾病的表型結合了在單獨硫酸酯酶缺乏中所觀察到的特徵。來自多種硫酸酯酶缺乏症患者的細胞即使以編碼人硫酸酯酶的cDNAs轉染之後也缺乏硫酸酯酶活性，暗示所有硫酸酯酶活性所需要的普遍機制的存在(Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad. Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565)。硫酸酯酶的翻譯後修飾被發現在多種硫酸酯酶缺乏症患者中有缺陷，暗示此疾病由基因的突變所引起，該基因牽涉到半胱氨酸至甲醯甘氨酸的轉化機制(Schmidt，B.等，Cell，1995，82:271-278)。儘管存在強烈的生物學和醫學興趣，以鑑別此基因為目標的努力卻被多種硫酸酯酶缺乏症患者的稀有性和隨之帶來的缺乏合適的家族病例而無法完成遺傳圖譜繪製所妨礙。
發明概述
本發明提供診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏症(MIM 272200)及治療其它硫酸酯酶缺乏症的方法和組合物。更特異地，已鑑別出編碼甲醯甘氨酸生成酶(FGE)的基因，此酶負責發生於硫酸酯酶的獨特的翻譯後修飾(形成L-Ca-甲醯甘氨酸；也叫做FGly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)，該翻譯後修飾為硫酸酯酶功能所必需。已發現，出乎意料的是FGE基因中的突變導致受試者中的多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)的發展。也發現，出乎意料的是FGE 增強了硫酸酯酶的活性，包括但不限於，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。考慮到這些發現，本發明的分子可用於診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏症以及其它硫酸酯酶缺乏症。
在多種硫酸酯酶缺乏症的診斷中應用本發明的分子的方法被提供。
另外，為調節硫酸酯酶上FGly形成的目的而在體內或體外應用這些分子的方法， 治療與這種修飾相關的病症的方法，和對製備治療多種硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的藥學製劑有用的組合物，也被提供。
本發明因此在幾個方面包括調節硫酸酯酶上FGly形成的多肽，分離的編碼那些多肽的核酸，它們的功能修飾物和變體，它們的有用的片段，以及與其相關的治療、診斷和研究的方法、組合物與工具。
根據本發明的一個方面，選自下列的分離的核酸分子被提供(a)與SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列所組成的分子在嚴格條件下雜交的核酸分子，該核酸分子編碼具有 Ca-甲醯甘氨酸生成活性的甲醯甘氨酸生成酶(FGE) ；(b)與(a)的核酸分子在密碼子序列上因遺傳密碼簡併性而有所區別的核酸分子；和(c) (a)或(b)的互補鏈。在一定的實施方案中，分尚的核酸分子包括SEQ ID NO:1所不的核苷酸序列。在某些實施方案中，分尚的核酸分子由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其片段組成。
本發明的另一方面提供分離的選自下列的核酸分子(a)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的獨特(unique)片段，和(b) (a)的互補鏈，條件是(a)中的獨特片段包括了不與某些序列相同的連續核苷酸序列，所述某些序列選自(I)與SEQ ID NO. 4和/或SEQ ID NO. 4的核苷酸20-1141相同的序列，和(2) (I)中核酸分子的互補鏈。在任何前述的實施方案中，互補鏈指全長互補鏈。
在一個實施方案中，連續核苷酸序列選自(I)至少兩個不與序列組完全相同的連續核苷酸，(2)至少三個不與序列組完全相同的連續核苷酸，(3)至少四個不與序列組完全相同的連續核苷酸，(4)至少五個不與序列組完全相同的連續核苷酸，(5)至少六個不與序列組完全相同的連續核苷酸，和(6)至少七個不與序列組完全相同的連續核苷酸。
在另一實施方案中，片段大小選自至少8個核苷酸，10個核苷酸，12個核苷酸，14個核苷酸，16個核苷酸，18個核苷酸，20個核苷酸，22個核苷酸，24個核苷酸，26 個核苷酸，28個核苷酸，30個核苷酸，40個核苷酸，50個核苷酸，75個核苷酸，100個核苷酸，200個核苷酸，1000個核苷酸和其間的每一整數長度。
根據又一方面，本發明提供包含上述核酸分子的表達載體和以該表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
根據又一方面，本發明提供表達內源FGE基因的活化形式的細胞。在一個實施方案中，內源FGE基因的活化通過同源重組發生。
根據本發明又一方面，分離的多肽被提供。分離的多肽被前述的本發明核酸分子所編碼。在某些實施方案中，分離的多肽被SEQ ID NO:1的核酸編碼，產生出具有SEQ ID N0:2序列和Ca-甲醯甘氨酸生成活性的多肽。在其它的實施方案中，分離的多肽也許是前述的片段或變體，其長度足以代表人基因組中獨特序列並且是具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的多肽，條件是該片段包括不與任何被具有SEQ ID NO. 4的核酸序列所編碼的序列相同的連續胺基酸的序列。在另一實施方案中，上述多肽分子的免疫源性片段被提供。免疫源性片段也許具有也許不具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性。
根據本發明又一方面，分離的結合多肽被提供，其選擇性地與前述的本發明核酸分子所編碼的多肽結合。優選分離的結合多肽選擇性地結合包含SEQ ID N0:2序列的多肽、其片段或屬於分離的具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的多肽家族而在本文其它部分所述的多肽。在優選的實施方案中，分離的結合多肽包括抗體和抗體片段(如Fab，F (ab) 2，Fd和包括了與FGE多肽選擇性結合的CDR3區域的抗體片段)。在一定的實施方案中，抗體是人抗體。在某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在某一實施方案中，抗體是多克隆抗血清。 在進一步的實施方案中，抗體是人源化的。在更進一步的實施方案中，抗體是嵌合的。
根據本發明又一方面，具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的分離的多肽的家族被提供。每一所述多肽從氨基端到羧基端包含(a)氨基端亞結構域I ;亞結構域2 ;包含35到 45個胺基酸的羧基端亞結構域3，而其中亞結構域3與選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結構域3具有至少約75%的同源性和大致相同的長度。在重要的實施方案中，亞結構域2含有120到140個胺基酸。在進一步的重要實施方案中，亞結構域2中至少5%的胺基酸是色氨酸。在某些實施方案中， 亞結構域 2 與選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64 ，66，68，70，72，74，76 ，和78的多肽的結構域2之間具有至少50%的同源性。在一定的實施方案中，每一多肽的亞結構域 3 與選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結構域3具有介於約80%和約100%之間的同源性。
根據本發明進一步的方面，用於測定某一受試者中的FGE表達水平的方法被提供。方法包括測量來自某一受試者的測試樣本中的FGE表達以確定FGE在受試者中的表達水平。在一定的實施方案中，測得的測試樣本中的FGE表達與對照樣本(含有已知FGE表達水平)中的FGE表達進行比較。表達被定義成FGE mRNA表達，FGE多肽表達，或如本文其它部分所定義的FGE的Ca-甲醯甘氨酸生成活性。多種方法能用於測量表達。本發明優選的實施方案包括用於測量mRNA表達的PCR和RNA印跡，作為測量FGE多肽表達的試劑的FGE 單克隆抗體或FGE多克隆抗血清，以及測量FGE Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法。
在一定的實施方案中，測試樣本例如活檢樣本和生物液體如血液被用作測試樣本。FGE在某一受試者的測試樣本中的表達與對照樣本中的FGE表達比較。
根據本發明另一方面，用於鑑別在調節分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性中有用的物質的方法被提供。方法包括(a)將具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的分子與候選物質接觸，(b)測量該分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性，和(c)將測得的該分子Ca-甲醯甘氨酸生成活性與對照進行比較以確定候選物質是否調節分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性，其中該分子是具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73， 75，77，和80-87的核苷酸序列的核酸分子，或其表達產物(例如，具有選自SEQ ID NO. 2, 5 ，46，48，50, 52，54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。在一定的實施方案中，對照是在缺乏候選物質的條件下測得的該分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性。
根據本發明又一方面，在受試者中診斷多種硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括將生物樣本與試劑接觸，所述生物樣本來自被懷疑具有多種硫酸酯酶缺乏症的受試者，所述試劑特異結合選自下面的分子(i)具有SEQ ID NO: 1，3，或4核苷酸序列的FGE 核酸分子，(ii)核酸分子(i)的表達產物，或(iii) ( )的表達產物的片段；以及測量結合的試劑數量並由此確定所述核酸分子或其表達產物的表達是否異常，異常表達表明受試者患有多種硫酸酯酶缺乏症。
根據本發明又一方面，用於對特徵為核酸分子或其表達產物的異常表達的病症進行診斷的方法被提供。方法包括將來自受試者的生 物樣本與試劑接觸，其中所述試劑特異結合所述核酸分子、其表達產物或其表達產物的片段；並測量結合的試劑數量並由此確定所述核酸分子或其表達產物的表達是否異常，異常表達表明具有所述病症，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO:1核苷酸序列而所述病症是多種硫酸酯酶缺乏症。
根據本發明又一方面，用於在受試者中測量特徵為核酸分子或其表達產物的異常表達的多種硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括對來自患者的樣本監測選自下面的參數(i)具有SEQ ID NO:1, 3，4的核苷酸序列的核酸分子或具有來源於FEG基因組位點的序列的核酸分子，(ii)所述核酸分子編碼的多肽，(iii)來源於所述多肽的肽，和(iv)選擇性結合所述多肽或肽的抗體，將它們作為對受試者中的多種硫酸酯酶缺乏症的測定。在某些實施方案中，樣本是如前述實施方案任一項所描述的生物液體或組織。在一定的實施方案中，監測步驟包括將樣本與選自下面的可檢測的試劑接觸(a)在嚴格條件下與(i)中的核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)選擇性結合(ii)中的多肽或(iii)中的肽的抗體，和(c)與(iv)中的抗體結合的多肽或肽。抗體、多肽、肽或核酸能用放射性標記或酶進行標記。在進一步的實施方案中，方法進一步包含檢驗樣品中的肽。
根據本發明又一方面，試劑盒被提供。試劑盒包含包裝，包裝包含選擇性結合前述 FGE的分離的核酸或其表達產物的任一種的試劑，和用於與測量值比較的對照，此測量值為所述試劑與前述FGE的分離的核酸或其表達產物的任一種結合的測量值。在某些實施方案中，對照是用於與測量值比較的預定值。在一定的實施方案中，對照包含前述FGE的分離的核酸的任一種的表達產物的表位。在一種實施方案中，試劑盒進一步包含選擇性結合選自下面的多肽的第二試劑艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶(sulfamidase)，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6，或其肽段，和用於與所述第二試劑結合到所述多肽或其肽段的測量值進行比較的對照。
根據本發明進一步的方面，治療多種硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括對需要這種治療的受試者施用調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑，用量為治療受試者的多種硫酸酯酶缺乏症的有效量。在某些實施方案中，方法進一步包含某一試劑的共施用，所述試劑選自編碼艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C， 芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HS ulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6的核酸分子，該核酸分子的表達產物，和該核酸分子的表達產物的片段。在一定的實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的分離的核酸分子(例如如權利要求1-8所要求的核酸分子或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4 ，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在重要的實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的肽(例如，如權利要求 11-15，19，20 所要求的肽，或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑可通過表達內源和/或外源FGE核酸分子的細胞產生。在重要的實施方案中，內源FGE核酸分子可被活化。
根據本發明的一個方面，用於在受試者中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括施用本發明的分離的FGE核酸分子(例如，權利要求1-8的核酸分子，或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，和/或其表達產物到受試者中，用量為在受試者中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的有效量。
根據本發明的一個方面，用於治療患多種硫酸酯酶缺乏症的受試者的方法被提供。方法包括對需要這種治療的受試者施用調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑，用量為 在受試者中增Wca-甲醯甘氨酸生成活性的有效量。在某些實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的有義核酸(例如，權利要求1-8的核酸分子，或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在一定的實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的分離的多肽(例如，權利要求11-15，19，20的多肽或具有選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。
根據本發明又一方面，用於在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括將細胞與本發明的分尚的核酸分子接觸(例如，權利要求1_8的核酸分子,或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，或其表達產物，用量為在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的有效量。在重要的實施方案中，方法包括活化內源FGE基因以在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性。
根據本發明進一步的方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療多種硫酸酯酶缺乏症的藥學有效量的某種試劑，該試劑含有本發明的分離的核酸分子(例如，權利要求1-8 中任一項的分離的核酸分子，具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，6 3，65，67，69，71，73，75，77，和80-87序列的FGE核酸分子)，或其表達產物，以及藥學上可接受的載體。
根據本發明的一個方面，用於鑑別在治療多種硫酸酯酶缺乏症中有用的候選物質的方法被提供。方法包括測定一套核酸分子在細胞或組織中的表達，條件是缺乏候選物質時，允許該套核酸分子的最初量的表達，其中該套核酸分子包含至少一種選自下面的核酸分子(a)嚴格條件下與由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列組成的分子雜交並編碼具有匕-甲醯甘氨酸生成活性(FGE)的多肽的核酸分子，(b)遺傳密碼簡併性引起的在密碼子序列中與(a)或(b)中核酸分子不同的核酸分子，(c)具有選自SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51 ，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子，和(d) (a)或 (b)或(C)的互補鏈，將細胞或組織與候選物質接觸並探測該套核酸分子表達的測試量，其中在候選物質存在的條件下表達的測試量相對於表達最初量的增加表明候選物質在治療多種硫酸酯酶缺乏症中有用。
根據本發明進一步的方面，製備在治療多種硫酸酯酶缺乏症和/或其它硫酸酯酶缺乏症中有用的藥劑的方法被提供。
根據本發明又 一方面，固相核酸分子陣列被提供。陣列基本上由固定於固相基質的一套核酸分子、其表達產物或其片段(或是核酸的或是多肽分子的)組成，每一核酸分子編碼選自下面的多肽SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74 ，76，和78，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HS ulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在某些實施方案中，固相陣列進一步包含至少一種對照核酸分子。在一定的實施方案中，該套核酸分子包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或甚至至少五種核酸分子，每一種選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66 ，68，70，72，74，76，和78，艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺_6_硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6。
根據本發明進一步的方面，用於在受試者中治療硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。 方法包括對需要這種治療的受試者施用已根據本發明生產出的硫酸酯酶，用量為在受試者中治療硫酸酯酶缺乏症的有效量，而此硫酸酯酶缺乏症不是多種硫酸酯酶缺乏症。在重要的實施方案中，通過已與調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑接觸的細胞產生硫酸酯酶。在一定的實施方案中，硫酸酯酶缺乏症包括但不限於粘多糖病II (MPS II;Hunter綜合症)，粘多糖病IIIA (MPS IIIA; Sanfilippo綜合症A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA(MPS IVA;Morquio 綜合症 A),粘多糖病 VI (MPS VI;Maroteaux-Lamy 綜合症)，異常染性腦白質營養不良(MLD)，X-連鎖的隱性點狀軟骨發育不全1，或X-連鎖的魚鱗病(類固醇硫酸酯酶缺乏症)。在一定的實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑可以是本發明的核酸分子或肽。在一種實施方案中，硫酸酯酶和調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑在同一細胞中共表達。硫酸酯酶和/或調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑可以是內源性或外源性的來源。如果是內源性來源，它可被活化(例如，通過在本領域中已知的合適的位置插入強啟動子和/或其它元件)。如果是外源性的，其表達可被表達載體上的元件所驅動，或它可靶向於細胞基因組中合適的位置以允許其被增強的表達(例如，強啟動子下遊)。
根據本發明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏症的藥學有效量的某種試劑，該試劑含有本發明的分離的核酸分子或其表達產物，及藥學上可接受的載體。
根據本發明更進一步的方面，用於在細胞中增加硫酸酯酶活性的方法被提供。方法包括將表達硫酸酯酶的細胞與本發明的分離的核酸分子(例如，權利要求1-8中任一項的分離的核酸分子，具有選自 SEQID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表達產物(例如，權利要求 11-15，19，20 的多肽，或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，6 8，70，72，74，76，和78的序列的肽)接觸，用量為在細胞中增加硫酸酯酶活性的有效量。細胞可表達內源性和/或外源性的硫酸酯酶。在重要的實施方案中，內源性的硫酸酯酶被活化。在一定的實施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6。在一定的實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。
根據本發明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏症的藥學有效量的被細胞產生的硫酸酯酶，和藥學上可接受的載體，其中所述細胞已與包含本發明的分離的核酸分子(例如，權利要求1-8中的，或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49， 51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)，或其表達產物(例如，選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76， 和78的肽)的試劑接觸。
根據本發明又一方面，分離的人FGE基因的變體等位基因(其編碼變體FGE多肽) 被提供。分離的變體等位基因包含某一胺基酸序列，該胺基酸序列在SEQ ID NO:2中至少包含一個變異，其中這至少一個變異包含MetlArg;MetlVal; Leu20Phe; Serl55Pro; Alal77 Pro;Cys218Tyr;Arg224Trp;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Ar g345Cys; Ala348Pro; Arg349Gln; Arg`349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
根據本發明又一方面，分離的人類變體FGE多肽被提供。分離的人類變體FGE多肽包含某一胺基酸序列，該胺基酸序列在SEQ ID NO: 2中至少含有一個變異，其中這至少一個變異包含:Met IArg; Met IVa ; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp; A sn259Ile;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg349G In; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
以前述任何人類變體FGE多肽為免疫原的抗體也被提供。這類抗體包括多克隆抗體、單克隆、嵌合的抗體，也可被進行可探測性的標記。可探測性的標記也許包含放射性元素，螢光化學物或酶。
根據本發明又一方面，產生硫酸酯酶的細胞被提供，其中被細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率得到增加。細胞包含(i)表達增強的硫酸酯酶，和(ii)表達增強的甲醯甘氨酸生成酶，其中被細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率(即，硫酸酯酶的比活性)相對於由缺乏甲醯甘氨酸生成酶的細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率至少增加5%。在一定的實施方案中，被細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率相對於由缺乏甲醯甘氨酸生成酶的細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，增加 了至少 10%, 15%, 20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。
根據本發明進一步的方面，在受試者中治療硫酸酯酶缺乏症的改進方法被提供。 方法包括以在受試者中治療硫酸酯酶缺乏症的有效量對需要這種治療的受試者施用硫酸酯酶，其中硫酸酯酶與有效增加硫酸酯酶比活性的量的甲醯甘氨酸生成酶接觸。在重要的實施方案中，硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在一定的實施方案中，甲醯甘氨酸生成酶被權利要求 1-8 的核酸分子或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸所編碼。在某些實施方案中，甲醯甘氨酸生成酶是權利要求 11-15，19，20 的肽，或是具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，6 O, 62，64，66，68，70，72，74，76，和 78 的序列的肽。
本發明的這些和其它目標將被進一步結合本發明詳細描述進行詳述。
序列簡述
SEQ ID NO:1是人FGE cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是人FGE cDNA(SEQ ID NO:1)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO: 3是編碼SEQ ID NO: 2的多肽的人FGE cDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:1 的核苷酸 20-1141)。
SEQ ID NO:4 是 G enBank Acc. No. AK075459 的核苷酸序列。
SEQ ID N0:5是SEQ ID N0:4翻譯產物的預期胺基酸序列，一未命名的具有 GenBank Acc. No. BACl 1634 的蛋白產物。
SEQ ID NO: 6 是人艾杜糖醛酸 _2_ 硫酸酯酶 cDNA (GenBank Acc. No. M58342)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 7是人艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶cDNA (SEQ ID NO: 6)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO:8 是人硫酸胺酶 cDNA(GenBank Acc. No. U30894)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9是人硫酸胺酶cDNA (SEQ ID NO: 8)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID N0:10是人N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. U06088) 的核苷酸序列。SEQ ID唚11是人^乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:10)的翻譯產 物的預期胺基酸序列。SEQ ID N0:12是人N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. Z12173) 的核苷酸序列。SEQ ID唚13是人^乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:12)的翻譯產 物的預期胺基酸序列。SEQ ID N0:14是人芳基硫酸酯酶A cDNA (GenBank Acc. No. X52151)的核苷酸序 列。SEQ ID而15是人芳基硫酸酯酶AcDNA(SEQ ID N0:14)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID而16是人芳基硫酸酯酶8 cDNA (GenBank Acc. No. J05225)的核苷酸序 列。SEQ ID而:17是人芳基硫酸酯酶8 cDNA(SEQ ID N0:16)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID N0:18是人芳基硫酸酯酶C cDNA (GenBank Acc. No. J04964)的核苷酸序 列。SEQ ID而:19是人芳基硫酸酯酶CcDNA(SEQ ID N0:18)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID而:20是人芳基硫酸酯酶D cDNA (GenBank Acc. No. X83572)的核苷酸序 列。SEQ ID而:21是人芳基硫酸酯酶D cDNA(SEQ ID N0:20)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID而:22是人芳基硫酸酯酶E cDNA (GenBank Acc. No. X83573)的核苷酸序 列。SEQ ID而:23是人芳基硫酸酯酶E cDNA(SEQ ID N0:22)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID N0:24是人芳基硫酸酯酶F cDNA (GenBank Acc. No. X97868)的核苷酸序 列。SEQ ID而:25是人芳基硫酸酯酶GcDNA(SEQ ID N0:24)的翻譯產物的預期氨基 酸序列。SEQ ID N0ツ6是人芳基硫酸酯酶G cDNA (GenBank Acc.No.BC012375)的核苷酸序 列。SEQ ID而:27是人芳基硫酸酯酶G(5￡0 ID N0:26)的翻譯產物的預期胺基酸序 列。SEQ ID N0J8iHSulf-l cDNA(GenBank Acc.No.AY101175)的核苷酸序列。SEQ ID N0:29iHSulf-l cDNA(SEQ ID N0:28)的翻譯產物的預期胺基酸序列。SEQ ID N0:30iHSulf-2 cDNA(GenBank Acc.No.AY101176)的核苷酸序列。
SEQIDN0:31是HSulf-2 cDNA(SEQ ID NO:30)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO: 32是出現於硫酸酯酶的高度保守的六肽L/V-FGly-X-P-S-R。
SEQIDNO: 33是合成的FGly形成底物；其一級序列是來源於人芳基硫酸酯酶A。
SEQIDNO: 34是混雜寡肽 PVSLPTRSCAALLTGR。
SEQIDNO: 35是 Ser69 寡肽 PVSLSTPSRAALLTGR。
SEQIDNO: 36是人FGE-特異性引物1199nc。
SEQIDNO: 37是人FGE-特異性正向引物lc。
SEQIDNO: 38是人FGE-特異性反向引物1182c。
SEQIDNO: 39是包含EcoRI位點的人5』 -FGE-特異性引物。
SEQIDNO: 40是HA-特異性引物。
SEQIDNO: 41是c-myc-特異性引物。
SEQIDNO: 42是RGS-His6-特異性引物。
SEQIDNO: 43是來自人FGE製備物的胰蛋白酶解寡肽SQNTPDSSASNLGFR。
SEQIDNO: 44是來自人FGE製備物的胰蛋白酶解寡肽MVPIPAGVFTMGTDDPQIK。
SEQIDNO: 45I 是人 FGE2 平行進化同源物(paralog) (GenBank G1:24308053)的核苷酸序列。
SEQIDNO:46是人FGE2平行進化同源物(SEQ ID NO:45)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:47是小鼠FGE平行進化同源物(GenBank 61:26344956)的核苷酸序列。
SEQIDNO:48是小鼠FGE平行進化同源物(SEQ ID NO:47)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDN0:49 是小鼠 FGE 定向進化同源物(ortholog)(GenBank G1:22122361)的核苷酸序列。
SEQIDN0:50是小鼠FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:49)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO: 51是果蠅FGE定向進化同源物(GenBank 61:20130397)的核苷酸序列。
SEQIDNO:52是果蠅FGE定向進化同源物(SEQ ID N0:51)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:53是蚊子FGE定向進化同源物(GenBank 61:21289310)的核苷酸序列。
SEQIDNO:54是蚊子FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:53)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:55是密切相關的S. coelicolor FGE定向進化同源物(GenBank61:21225812)的核苷酸序列。
SEQ ID勵56是5.(^^11。010『FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:55)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:57是密切相關的C. efficiens FGE定向進化同源物(GenBankG1:25028125)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58 是 C. efficiens FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO:57)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO:59 是 N. aromaticivorans FGE 定向進化同源物(GenBank G1:23108562)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60 是 N. aromaticivorans FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO: 59)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID勵:61是]\110衍FGE定向進化同源物(GenBank 61:13474559)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:62是M. loti FGE定向進化同源物(SEQ ID N0:61)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID N0:63 是 B. fungorum FGE 定向進化同源物(GenBank 61:22988809)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是B. fungorum FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:63)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID N0:65 是 S.meliloti FGE 定向進化同源物(GenBank G1: 16264068)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:66是S.meliloti FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:65)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID N0:67是微顫菌屬物種FGE定向進化同源物(GenBank G1: 14518334)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:68是微顫菌屬物種FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:67)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO: 69 是 P. putida KT2440FGE 定向進化同源物(GenBank G1:26990068)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 70 是 P. putida KT2440 FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO:69)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO: 71 是 R. metal lidurans FGE 定向進化同源物(GenBank G1:22975289)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 72 是 R. metal lidurans FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO: 71)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID勵:73是卩.11^廳FGE定向進化同源物(GenBank 61:23132010)的核苷酸序列。
SEQ ID勵:74是？.1^1^皿8 FGE定向進化同源物(SEQ ID NO:73)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO:75 是 C. crescentus CB15 FGE 定向進化同源物(GenBank G1:16125425)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:76 是 C. crescentus CB15 FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO:75)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID NO:77 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向進化同源物(GenBank G1:15607852)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 78 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向進化同源物(SEQ ID NO: 77)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQ ID N0:79是出現在FGE定向進化同源物和平行進化同源物的亞結構域3的高度保守六肽。
SEQ ID NO:80 是具有 GenBank Acc. No. :CA379852 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID N0:81 是具有 GenBank Acc. No. :AI721440 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:82 是具有 GenBank Acc. No. :BJ505402 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:83 是具有 GenBank Acc. No. :BJ054666 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:84 是具有 GenBank Acc. No. :AL892419 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:85 是具有 GenBank Acc. No. :CA064079 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:86 是具有 GenBank Acc. No. :BF189614 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:87 是具有 GenBank Acc. No. :AV609121 的 FGE 定向進化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQIDNO:88 是 HSulf-3cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:89 是 HSulf-3cDNA(SEQ ID NO :88)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:90 是 HSulf-4cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:91 是 HSulf-4cDNA(SEQ ID NO :90)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:92 是 HSulf-5cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:93 是 HSulf-5cDNA(SEQ ID NO :92)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
SEQIDNO:94 是 HSulf-6cDNA核苷酸序列.
SEQIDN0:95 是 HSulf-6c DNA(SEQ ID NO:94)的翻譯產物的預期胺基酸序列。
附圖簡述


圖1:在缺乏(A)或存在(B)來自牛睪丸微粒體的可溶性抽提物的條件下培育後的P23的MALD1-T0F質譜圖示。
圖2:來源於人FGE和PFAM-DU F323種子的21種蛋白的排列的系統發生樹。
圖3:人和鼠FGE基因位點的組織。外顯子顯示為以盒子和亮盒子(鼠的位點) 表示。內含子線上的數字指出了以kb表示的內含子大小。
圖4:顯示FGE表達質粒pXM G.1. 3結構圖的圖表。
圖5:柱狀圖描述以FGE表達質粒瞬時轉染的36F細胞中的N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶活性。
圖6:柱狀圖描述以FGE表達質粒瞬時轉染的36F細胞中的N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶比活性。
圖7:柱狀圖描述以FGE表達質粒瞬時轉染的36F細胞中的N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶生產。
圖8:描述以FGE表達質粒瞬時轉染的30C6細胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。
圖9:描述了囊括本發明的特徵的試劑盒。
發明詳述
本發明包括對編碼甲醯甘氨酸生成酶(FGE)的基因的發現，此酶負責發生在硫酸酯酶上的對硫酸酯酶功能必需的獨特翻譯後修飾形成L-Ca-甲醯甘氨酸(a. k. a. FGly和 /或2-氨基-3-氧代丙酸)。已發現，出人意料地，FGE基因中的突變引起受試者中的多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)的發展。也已發現，出人意料地，FGE增強硫酸酯酶的活性，包括但不限於，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶 D,芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4 ,HSulf-5,和 HSulf-6,及在申請號為 20030073118, 20030147875, 20030148920, 20030162 279和20030166283的U. S.臨時申請中所述的硫酸酯酶(其內容被清楚地整合在本文中)。 考慮到這些發現，本發明的分子可用於診斷和/或治療多種硫酸酯酶缺乏症，以及其它硫酸酯酶缺乏症的治療。
在診斷多種硫酸酯酶缺乏·症中應用本發明的分子的方法被提供。
此外，為了對硫酸酯酶上FGly的形成進行調節的目的而在體內或體外應用這些分子的方法，治療與這種修飾相關的病症的方法，及在製備用於治療多種硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的治療性製劑中有用的組合物也被提供。
本發明因此在幾個方面中包括調節硫酸酯酶上的FGly的形成的多肽，編碼這些多肽的分離的核酸，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及治療、診斷和研究的方法、組合物和與其相關的工具。
「Ca-甲醯甘氨酸生成活性」指分子在底物上形成FGly或增強FGly形成的能力。底物也許是如本文其它部分所述的硫酸酯酶，或合成的寡肽(參見，例如SEQ ID NO: 33，和實施例)。底物優選包含SEQ ID NO: 32的保守六肽[L/V-C (S) -X-P-S-R]。 分析FGly形成的方法如本領域中(參見，例如Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. , 1997,94:11963-11968),和本文其它部分(參見，例如實施例)所描述。在本文中所用的「分子」包含「核酸」和「多肽」。FGE分子能在體內和體外形成FGly，或增強/增加 FGly的形成。
在本文中所用的「增強(或「增加」)」Ca_甲醯甘氨酸生成活性，典型地指增加FGE 和/或它編碼的多肽表達。增加的表達指增加(即，到可探測的程度)本發明任意核酸 (如本文其它部分所描述的FGE核酸)的複製、轉錄和/或翻譯，既然上調任何這些過程將導致基因(核酸)所編碼多肽的濃度/數量的增加。增強(或增加)Ca-甲醯甘氨酸生成活性也指防止或抑制FGE的降解(例如通過增加的泛素化作用)、下調等，所述降解和下調導致例如相對於對照被增加的或穩定的FGE分子t1/2 (半衰期)。下調或減少的表達指基因和/或它編碼的多肽減少的表達。通過使用本領域已知的任何適合的方法例如核酸雜交或抗體探測方法，分別探測基因(例如FGE)mRNA水平或基因所編碼的多肽的蛋白表達水平相對於對照的增加或是減少，可直接測定基因表達的上調或下調。FGE基因表達的上調或下調也能通過探測Ca-甲醯甘氨酸生成活性的變化而間接測定。
在本文中所用的「表達」指核酸和/或多肽表達，以及多肽分子的活性(例如分子的匕-甲醯甘氨酸生成活性)。
本發明的一個方面包括對編碼FGE的cDNA的克隆。根據本發明的FGE是包含SEQ ID NO:1的核酸分子的分尚的核酸分子,並編碼具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的多肽。人 FGE cDNA的序列以SEQ ID NO:1而出現，此cDNA編碼的蛋白產物的預期胺基酸序列以SEQ ID NO:2 出現。
在本文中所用的受試者是哺乳動物或非人類的哺乳動物。在所有實施方案中，人 FGE和人受:試者都是優選。
本發明因此在一個方面包括分離的FGE多肽，編碼此多肽的cDNA，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及與其相關的診斷和治療。
在本文中所用的關於核酸的術語「分離的」表示(i)在體外通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)所擴增的；(ii)通過克隆所重組性地產生的；(iii)如通過切斷和凝膠分離所純化的；或(iv)通過例如化學合成所合成。分離的核酸是容易通過本領域眾所周知的重組DNA技術操作的類型。因此，包含在一定載體中的核苷酸序列被認為是分離的，其中所述載體的5』和3』限制性位點已知或者其聚合酶鏈式反應(PCR)引物序列已被公開，但在其天然宿主中以其天然狀態存在的核酸不是分離的。分離的核酸可被充分純化，但不必這樣。 例如，在克隆或表達載體內的分離的核酸不純，這在於它在其寄生的細胞中也許只包含很少百分比的物質。然而，這種核酸是分離的，如本文中所用的術語一樣，因為它容易通過本領域中一般技術人員所知道的標準技術被操作。
在本文中所用的關於多肽的術語「分離的」表示從其天然環境中被以充分純的形式分開以至於它可被操作於或用於本發明的任一目的。因此，「分離的」表示純度足以a) 用於生產和/或分離抗體，(ii)用作分析中的試劑，(iii)用於測序，(iv)用作治療等。
根據本發明，編碼具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的FGE多肽的分離的核酸分子包括(a)核酸分子,其在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的核酸所組成的分子雜交並編碼具有(。_甲醯甘氨酸生成活性的FGE多肽，(b) (a)的刪除、添加和置換物，其編碼各自的具有 Ca-甲醯甘氨酸生成活性的FGE多肽，(c)因為遺傳密碼簡併性而與(a)或(b)的核酸分子在密碼子序列中不同的核酸分子，和(d) (a), (b)或(C)的互補鏈。在本文中所用的「互補鏈」包括「(a)，(b)或(C)的全長互補鏈或100%的互補鏈」。
也具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的本發明的FGE核酸的同源物和等位基因也被本發明所包含。本文所述的同源物，包括本文其它部分所鑑別的分子(參見例如SEQ ID NOs:4, 5，45-78，和80-87)即定向進化同源物和平行進化同源物。進一步的，同源物能依照本發明的指導以及傳統技術所鑑別。既然本文所述的FGE同源物全都具有(。_甲醯甘氨酸生成活性，它們能與人FGE分子在本發明的所有方面中互換性使用。
因此，本發明的一個方面是那些編碼FGE多肽並在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的編碼區所組成的核酸分子雜交的核酸序列。在重要的實施方案中，如在此所用的術語「嚴格條件」指本領域所熟悉的參數。對核酸，被稱為嚴格的雜交條件典型的是在低離子強度和恰好低於DNA雜交複合物熔點(Tm)(典型地，低於雜交物Tm約3° C)的溫度下。更高的嚴格性限定了探針序列和靶之間更專一的相關性。核酸雜交中所用的嚴格條件在本領域中眾所周知，可在彙編這類方法的參考文獻中找到，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，John Wiley & Sons, Inc. , New York. 「嚴格條件」的實例是在6xSSC中於65° C下雜交。另一嚴格條件的實例是在雜交緩衝液中於65° C下雜交， 雜交緩衝液由3. 5xSSC, O. 02%Ficoll, O. 02%聚乙烯吡咯烷酮，O. 02%牛血清白蛋白，2. 5mM NaH2PO4 [pH7]，O. 5%SDS, 2mM EDTA 組成(SSC 是 0. 15M 氯化鈉 /0. 15M 檸檬酸鈉，pH7; SDS 是十二烷基硫酸鈉；而EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交之後，轉上DNA的膜在2xSSC中於室溫下清洗，然後在最高68°C的溫度下於O. lxSSC/0.1xSDS中清洗。在進一步的實施例中，雜交水溶液的使用的替代是雜交甲醯胺溶液的使用。應用例如50%甲醯胺溶液和42° C，嚴格的雜交條件能因此被實現。有其它能被應用的條件、試劑等，並將導致類似的嚴格程度。技術人員將熟悉這類條件，因此它們不在這裡給出。然而，需要被理解的是，技術人員將能以允許清晰鑑別本發明FGE核酸的同源物和等位基因的方式操控條件。技術人員也將熟悉對於細胞和之後將被常規分離的這類分子的表達庫進行篩選，然後再分離相關的核酸分子和序列的方法。
一般地，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少40%核苷酸同一性和/或至少50%胺基酸同一性,在某些情況下將具有至少50%核苷酸同一'I"生和/或至少65%胺基酸同一'丨生,而在其它情況下將具有至少60%核苷酸同一'丨生和/ 或至少75%胺基酸同一性。在進一步的情形中，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少90%, 95%或甚至99%的核苷酸同一性和/或至少95%, 98% 或甚至99%的胺基酸同一'丨生。同一'丨生可應用多種由NCBI (Bethesda, Maryland)開發的公開可得的軟體工具計算得到。示例的工具包括Altschul SF等的啟發式算法(J M ol Biol, 1990, 215:403-410),也稱為 BLAST。Pairwise 和 ClustalW 比對(BL0SUM30 矩陣設置)以及Kyte-Doolittle水療分析可應用公開(EMBL, Heidelberg, Germany)和商業(例如來自 Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI 的 MacVector 序列分析軟體)的類型而獲得。前述核酸的Watson-Crick互補鏈也被本發明所包括。
在對FGE相關基因如FGE的同源物和等位基因的篩選中，Southern印跡可應用前述條件以放射性探針來完成。對DNA最終轉移上去的膜進行清洗之後，此膜可放置到X-射線膠片或磷成像平板(phosphoimager plate)以探測放射性信號。
在此給定關於全長人FGE cDNA克隆的指導，則對應於人FGE基因的其它哺乳動物序列如小鼠cDNA克隆可應用標準菌落雜交技術從cDNA庫中分離。
本發明也包括含有天然物質中出現的那些密碼子的替代物的簡併核酸。例如，絲氨酸殘基被密碼子TCA，AGT, TCC, TCG, TCT和AGC編碼。因此，本領域一般技術人員將很明白，任何絲氨酸編碼核苷酸三聯體可被用於在體內或體外指導蛋白質合成裝置，以將絲氨酸殘基整合進入正在延伸的FGE多肽。類似地，編碼其它胺基酸殘基的核苷酸序列三聯體包括但不限於CCA，CCC, CCG和CCT (脯氨酸密碼子);CGA, CGC, CGG, CGT, AGA和AGG (精氨酸密碼子)；ACA, ACC, ACG和ACT (蘇氨酸密碼子)；AAC和AAT (天冬醯胺密碼子)；及ATA，ATC 和ATT(異亮氨酸密碼子)。其它胺基酸殘基可類似地被若干核苷酸序列編碼。因此，本發明包括與生物學上分離的核酸在密碼子序列中因遺傳密碼簡併性而有所不同的簡併核酸。
本發明也提供分離的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或其互補鏈的獨特片段。獨特片段是這樣的類型，它是更大的核酸的「標誌」。例如，獨特片段長度足以確保其精確序列無法在人基因組中位於上述FGE核酸(及人的等位基因)之外的分子中找到。那些本領域中的一般技術人員可不必應用常規之外的程序來測定片段是否在人基因組中是獨特的。然而， 獨特片段排除完全由選自SEQ ID N0:4和/或其它如本申請的申請日以前發表過的序列的核苷酸序列所組成的片段。
完全由前述GenBank保藏庫描述的序列所組成的片段不包括任何對於本發明序列而言獨特的核苷酸。因此，根據本發明的獨特片段必須包含除那些GenBank保藏庫中的確切序列或其片段之外的核苷酸序列。區別可以是相對於GenBank序列的添加、刪除或置換，或可以是完全不同於GenBank序列的序列。
獨特片段能在Southern和Northern印跡分析中用作探針以鑑別這類核酸,或能用於如那些採用PCR的擴增分析。如本領域技術人員已知的，大探針如200，250，300或更多的核苷酸優選用於一定的應用如Southern和Northern印跡,而更小的片段將優選用於例如PCR。獨特片段也能被用於產生融合蛋白，以產生抗體或測定如實施例中證明的多肽片段的結合或產生免疫分析組分。同樣地，獨特片段可被用於產生例如在抗體製備、免疫分析或治療應用中有用的FGE多肽非融合片段。獨特片段進一步地可被用作反義分子以抑制 FGE核酸和多肽各自的表達。
如將被本領域技術人員所認識到的一樣，獨特片段的大小將依賴於其遺傳密碼中的保守性。因此，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的部分區域和互補鏈將需要更長的節段來實現獨特，而其它的只需要短節段，典型的是長12和32個核苷酸之間(例如12，13，14，15，16 ，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31 和 32 鹼基)或更長，長到公開序列的全長。如上述所提及的，此公開內容傾向於包含每一序列的每一片段，起點在第一核苷酸、 第二核苷酸等等，直到離末端剩下8個核苷酸，而終點在從第8、9、10核苷酸等等開始直到恰好最後一個核苷酸的任何位置(前提為序列是如上述的獨特片段)。事實上SEQ ID NO:1 區域的以核苷酸I開始而在核苷酸1180終止或SEQ ID NO 3區域的以核苷酸I開始而在核苷酸1122終止的任何節段或其互補鏈，長度為20或更多核苷酸都將是獨特的。本領域技術人員對選擇這類序列的方法(一般是基於獨特片段選擇性區分目的序列與人類基因組中其它序列的能力)很精通，雖然可以進行體外的證實性的雜交和序列分析。
如上述所提及的，本發明包含選擇性結合編碼FGE多肽的核酸分子以減少FGE活性的反義寡核苷酸。
在本文中所用的術語「反義寡核苷酸」或「反義」描述一定的寡核苷酸，該寡核苷酸是在生理條件下與包含特定基因的DNA或該基因的mRNA轉錄產物雜交，而因此抑制該基因的轉錄和/或該mRNA的翻譯的寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾後的寡核糖核苷酸，或 修飾後的寡脫氧核糖核苷酸。反義分子被設計成與靶基因或轉錄物雜交以幹擾靶基因的轉錄或翻譯。本領域技術人員將認識到反義寡核苷酸的確切長度和它與其目標互補的程度將依賴於所選的特異靶，包括靶的序列和構成那一序列的特定鹼基。優選反義寡核苷酸被構建和安排成在生理條件下選擇性地與靶結合，即相對於靶細胞中的任何其它序列在生理條件下更充分地與靶序列雜交。基於SEQ ID NO:1或基於等位基因或同源基因組和/或cDNA序列，本領域中的技術人員能容易地挑選和合成出大量合適的反義分子中的任何類型以根據本發明而應用。為了具有充分的選擇性和充分有能力進行抑制，這類反義寡核苷酸應包含與靶互補的至少10個和更多連續鹼基，優選至少15個，雖然在某些情形中長度短至7個鹼基的修飾後的寡核苷酸被成功用作反義寡核苷酸(Wagner 等，Nat. Med, 1995，1(11) : 1116-1118; Nat. Biotech.，1996，14:840-844)。最優選的是，反義寡核苷酸包含20 - 30個鹼基的互補序列。雖然對基因或mRNA轉錄物任何區段反義的寡核苷酸可被選出，在優選實施方案中，反義寡核苷酸對應於N端或5』上遊位點例如翻譯起點、轉錄起點或啟動子位點。此外，3』 -非翻譯區可被反義寡核苷酸所祀向。對mRNA拼接位點的靶向也在本領域中應用，但如果替代性的mRNA拼接發生，則可能不是那麼被優選。此外，反義物優選祀向於不希望出現mRNA 二級結構(參見,例如Sainio等，Cell Mol. Neurobiol. 14(5) :439-457, 1994)和不希望出現蛋白結合的位點。最後，雖然SEQ ID No:1 公開了 cDNA序列，本領域中的一般技術人員可容易地得到對應於此序列的基因組DNA。因此，本發明也提供與對應於SEQ ID NO:1的基因組DNA互補的反義寡核苷酸。類似地，等位基因或同源FGE cDNAs和基因組DNAs的反義物也能應用，而不需要過度的實驗。
在一組實施方案中，本發明的反義寡核苷酸可由「天然」脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或它們的任意組合所組成。也就是，一種天然核苷酸的5』末端和另一天然核苷酸的 3』末端可通過核苷間的磷酸二酯鍵共價連接，如在天然系統中的一樣。這些寡核苷酸可通過領域內認可的方法製備，所述方法可人工或通過自動合成儀而實施。它們也可通過載體被重組性地產生。
然而，在優選的實施方案中，本發明的反義寡核苷酸也可包括「修飾後的」寡核苷酸。也就是，寡核苷酸可通過許多不會阻止它們雜交至其目標但增強它們的穩定性或靶向性或者增強它們的治療效力的方式被修飾。
在本文中所用的術語「修飾後的寡核苷酸」描述這樣的寡核苷酸，其中⑴其核苷酸中的至少兩個通過合成性的核苷間連接而共價連接(即，一個核苷酸5』末端和另一核苷酸3』末端之間除磷酸二酯鍵之外的連接)和/或(2)通常不與核酸連接的化學基團已被共價附著到寡核苷酸。優選的合成性核苷間連接是硫代磷酸酯，烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，燒基硫代硫酸酯(alkylphosphonothioates),氨基磷酸酯，氨基甲酸酯， 碳酸酯，磷酸三酯，acetamidates,羧甲基酯和肽。
術語「修飾後的寡核苷酸」也包括具有被共價修飾的鹼基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾後的寡核苷酸包括具有已在除3』位置羥基和5』位 置磷酸基之外的位置共價附著到低分子量有機基團的糖骨架的寡核苷酸。因此修飾後的寡核苷酸可包括2』-O-烷基化核糖基團。此外，修飾後的寡核苷酸可包括糖，例如代替核糖的阿拉伯糖。本發明因此涉及含有修飾後的反義分子與藥學上可接受的載體的藥物製劑，所述反義分子與編碼FGE多肽的核酸互補並在生理條件下雜交。反義寡核苷酸可作為藥物組合物的一部分被施用。這類藥物組合物可包括與任何本領域中已知的生理性和/或藥學上可接受的標準載體組合的反義寡核苷酸。組合物應是消毒過的，並以適合對患者施用的單位重量或體積而含有藥學有效量的反義寡核苷酸。術語「藥學上可接受的」表示不幹擾活性成分的生物活性的效力的非毒性物質。術語「生理上可接受的」指與生物系統如細胞、細胞培養物、組織或器官相容的非毒性物質。載體的特徵將依賴於施用途經。生理上和藥學上可接受的載體包括本領域眾所周知的稀釋劑、填充物、鹽、緩衝劑、穩定物、增溶劑和其它物質。
本發明也包括在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法。在重要的實施方案中，這通過應用載體(「表達載體」和/或「靶向載體」)而完成。
在本文中所用的「載體」可以是多種某類核酸中的任何類型，所需序列可通過限制和連接而插入所述核酸以在不同遺傳環境間運輸或在宿主細胞中表達。載體典型地由DNA 組成，雖然RNA載體也可用。載體包括但不限於質粒、噬菌粒和病毒基因組。克隆載體是能在宿主細胞中複製，並進一步以一個或更多核酸內切酶限制性位點為特徵的類型，載體能以可測方式在所述核酸內切酶限制性位點處被切斷，所需DNA序列可連接進入所述位點處而使得新重組載體保持其在宿主細胞中複製的能力。在質粒的情形中，所需序列的複製可因為質粒在宿主菌內增加拷貝數目而發生很多次，或在宿主通過有絲分裂而複製之前在每一宿主中恰好單獨一次。在噬菌體的情形中，複製可在裂解期期間主動發生或在溶原期被動發生。「表達載體」是這樣的類型，所需DNA序列(例如SEQ ID NO: 3的FGE cDNA)通過限制和連接插入其中而使得所需DNA序列被可操作性地連接於調節序列並可表達為RNA轉錄物。載體可進一步包含一個或更多適合用於鑑別細胞已被或未被載體轉化或轉染的標記序列。標記包括，例如增加或減少對抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的編碼基因，其活性通過本領域中已知的標準分析可測的酶(例如β-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酶) 的編碼基因，及可視性地影響轉化或轉染細胞、宿主、菌落或菌斑的表型(如綠色螢光蛋白) 的基因。
「靶向載體」是典型地含有一定靶向性結構/序列的類型，所述靶向性結構/序列用於例如在內源性基因中(例如，在外顯子和/或內含子序列內)，內源性基因啟動子序列中，或內源性基因啟動子序列上遊插入調節序列。在另一實施例中，靶向載體可包含目的基因(例如SEQ ID NO:1的cDNA所編碼的)和對基因靶向於基因組中優選位置所需的其它序列(例如，轉錄活躍位置如無關基因的內源啟動子下遊)。靶向性構建體和載體的構建在 U. S. Patents 5，641，670和6，270, 989中詳細描述，其被清楚地整合在本文中作為參考。
事實上，任何能被異源性DNA或RNA轉化並能在培養基中生長或保存的細胞(原核或真核)，可被用在本發明的實踐中。實施例包括細菌細胞如大腸桿菌，昆蟲細胞，和哺乳動物如人、小鼠、倉鼠、豬、山羊、靈長類等的細胞。它們可以是原代或次級細胞株(其在培養中顯示有限數目的平均群體倍增而不是永久的)和永久的細胞系(其在培養中顯示明顯的無限壽命)。原代和次級細胞包括，例如，成纖維細胞，角質化細胞，上皮細胞 (例如乳腺上皮細胞，腸上皮細胞)，內皮細胞，神經膠質細胞，神經細胞，血液的組成成分(例如淋巴細胞，骨髓細胞)，肌肉細胞和這些體細胞類型的前體包括胚胎幹細胞。 在細胞將被在基因治療中應用時，原代細胞優選從施予操作後的細胞的個體中獲得。然而，原代細胞能從相同物種的供體(而不是受體)獲得。可與本發明的DNA構建物和方法一起應用的永久的人細胞系實例包括但不限於HT-1080細胞(ATCC CCL 121) ,HeLa細胞和 HeLa 細胞衍生物(ATCC CCL 2，2.1 和 2. 2)，MCF-7 乳腺癌細胞(ATCC BTH 22)，K-562 白血`病細胞(ATCC CCL 243)，KB 癌細胞(ATCC CCL 17)，2780AD 卵巢癌細胞(Van der Blick, A. Μ.等，Cancer Res, 48:5927-5932 (1988)，Raji 細胞(ATCC CCL 86)，WiDr 結腸腺癌細胞(ATCC CCL 218)，SW620 結腸腺癌細胞(ATCC CCL 227)，Jurkat 細胞(ATCC TIB 152) ,Namalwa 細胞(ATCC CRL1432)，HL-60 細胞(ATCC CCL 240) ,Daudi 細胞(ATCC CCL 213), RPMI 8226 細胞(ATCC CCL 155)，U_937 細胞(ATCC CRL 1593)，Bowes 黑色素瘤細胞 (ATCC CRL 9607)，W1-38VA13 亞系 2R4 細胞(ATCC CLL 75.1),和 M0LT-4 細胞(ATCC CRL 1582)，CHO細胞，和COS細胞，以及通過人細胞和另一物種細胞融合而產生的異雜交瘤細胞。次級人成纖維細胞株，如W1-38(ATCC CCL 75)和MRC-5 (ATCC CCL 171)也可被應用。 對可在實踐本發明的方法中應用的細胞類型的進一步討論，在U. S. Patents 5，641，670和 6，270，989中被描述。無細胞的轉錄系統也可代替細胞。
本發明的細胞被保存在本領域已知的條件下，這將引起FGE蛋白或其功能性片段的表達。應用所述方法，表達的蛋白可從細胞裂解物或細胞上清中純化。根據此方法製得的蛋白質能被製成藥學上有用的配劑，並通過本領域中已知的傳統藥學途徑而遞送至人或非人的動物(例如口服，靜脈內，肌肉內，鼻內，氣管內或皮下)。如本文其它部分所描述的，重組細胞可以是永生化的、原代的或次級的細胞，優選人的細胞。來自其它物種的細胞的應用可在一定的情形中是合意的，所述情形為非人細胞有利於在所產生的非人FGE在藥學上有用的情況下的蛋白產生的目的。
在本文中所用的編碼序列和調控序列，當它們以將編碼序列的表達或轉錄置於調控序列的影響或控制之下的方式而共價連接時，被表述成「可操作性地」連接。如果期望編碼序列被翻譯成功能性蛋白質，而假如5』調控序列中的啟動子的誘導導致編碼序列的轉錄，並且兩個DNA序列間的連接(I)不會導致移碼突變的引入，(2)不會干擾啟動子區域指導編碼序列轉錄的能力，或(3)不會干擾相應的RNA轉錄物被翻譯成為蛋白的能力，則兩個 DNA序列被表述成「可操作性地」連接。因此，如果啟動子區域能影響那一 DNA序列的轉錄從而所得的轉錄物可被翻譯成所期望的蛋白或多肽，則啟動子區域將可操作性地連接編碼序列。
基因表達所需的調控序列的精確本質可在物種或細胞類型間變動，但將一般性地包括，如所必需的，於轉錄和翻譯各自啟動有關的5』非轉錄和5』非翻譯序列，如TATA盒， 加帽序列，CAAT序列和類似物。尤其是，這類5』非轉錄調控序列將包括包含對可操控性連接的基因進行轉錄控制的啟動子序列的啟動子區域。調控序列也可包括所期望的增強子序列或上遊激動子序列。本發明的載體可隨意包括5』前導或信號序列。對合適載體的選擇和設計是在本領域一般技術人員的能力和指導之內。
包含所有表達必需的元件的表達載體可商業性地獲得，並為本領域技術人員所知。參見，例如 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。細胞通過編碼 FGE 多妝或其片段或變體的異源性DNA (RNA)被引入而基因工程化。那一 DNA (RNA)被置於轉錄元件的可操作性控制之下，以允許異源DNA在 宿主細胞中的表達。
用於在哺乳動物細胞中表達mRNA的優選系統例如包含選擇標記如給予G418 抗性的基因(其促進對穩定性轉染的細胞系的選擇)和人細胞巨化病毒(CMV)增強子-啟動子序列的pRc/CMV(可從Invitrogen, Carlsbad, CA得到)。此外，適合在靈長類和犬類細胞系中進行表達的類型有pCEP4載體(Invitrogen, Carlsbad, CA),其包含促進質粒作為多拷貝的染色體外元件而保存的EB病毒(EBV)複製起點。另一表達載體是包含多肽延伸因子Ia的啟動子的PEF-BOS質粒，其有效刺激了體外的轉錄。質粒被 Mishizuma 和 Nagata(Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990)描述，而其在轉染實驗中的應用已得到公開，例如，Demoulin(Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716，1996)。又一優選的表達載體是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒，其El和E3蛋白有缺陷(J. Clin.1nvest. 90:626-630, 1992)。腺病毒作為Adeno. PlA重組體的應用被Warnier等所公開，用於在小鼠皮內注射以得到抗PlA的免疫化(Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996)。
本發明也包括所謂的表達試劑盒，其允許技術人員製備所期望的表達載體或載體。這類表達試劑盒至少包括每一前面討論的編碼序列的單獨部分。其它成分可按需要添加，只要前面提到的所需的序列被包括在內。
也應認識到，本發明包含上述的包含表達FGE cDNA序列的載體轉染宿主細胞和細胞系的應用，這些細胞是原核(例如大腸桿菌)或真核性(例如CHO細胞，COS細胞，酵母表達系統和在昆蟲細胞中表達的杆狀病毒)的。尤其有用的是哺乳動物細胞如人，小鼠， 倉鼠，豬，山羊，靈長動物等的細胞。它們可以是多種組織類型，包括如本文其它部分所描述的原代細胞和永生化的細胞系。具體實例包括HT-1080細胞，CHO細胞，樹狀細胞，U293 細胞，外周血白細胞，骨髓幹細胞，胚胎幹細胞，和昆蟲細胞。本發明也允許細胞和動物中的FGE基因「敲除」的構建，為研究FGE活性的某些方面提供材料。
本發明也提供被前述FGE核酸編碼的分離的多肽(包括完整蛋白和部分蛋白)，也包括SEQ ID N0:2的多肽和其獨特片段。這類多肽可用於，例如，單獨或作為融合蛋白的部分去產生作為免疫分析成分的抗體。多肽可以是從生物樣本包括組織或細胞勻漿中分離的，也可是在多種原核或真核表達系統中重組性表達的，所述重組性表達通過構建適合於表達系統的表達載體，將表達載體引入表達系統，及分離重組性表達的蛋白而完成。短多肽，包括抗原性肽(如被MHC分子呈遞在細胞表面以進行免疫識別的)也能應用已良好建立的肽合成方法化學合成。
一般而言，FGE多肽的獨特片段具有如上述討論的與核酸相關的獨特片段的特徵和特性。如本領域技術人員將認識到的，獨特片段的大小將依賴於一定的因素，例如片段是否組成了保守蛋白結構域的一部分。因此，SEQ ID N0:2的部分區域將需要更長的片段以保證獨特，而其它的只需要短片段，典型的是在5和12個胺基酸之間(例如5，6，7,8,9, 10，11 和12胺基酸長或者更多，包括每一整數直到全長，287個胺基酸長)。
多肽的獨特片段優選保持明顯的多肽功能能力的那些片段。可被保持在多肽的獨特片段中的功能能力包括與抗體的相互作用、與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種重要的活性是作為鑑別多肽的標籤而起作用的能力。本領域技術人員很精通於選擇獨特胺基酸序列的方法，典型的是基於獨特片段從非家族成員中選擇性識別出目的序列的能力。片段的序列與那些資料庫中已知序列進行比較即是所需的。
本發明包括上述FGE多肽的變體。在本文中所用的FGE多肽的「變體」是包含一種或更多對FGE多肽一級胺基酸序列的修飾的多肽。創造FGE多肽變體的修飾，典型的 是被施加給編碼FGE多肽的核酸，可包括刪除、點突變、截斷、胺基酸置換和胺基酸或非胺基酸部分的添加，以1)減少或消除FGE多肽的活性；2)增強FGE多肽的性質，如表達系統中的蛋白穩定性或蛋白-配體結合的穩定性；3)對FGE多肽提供新活性或性質，如抗原性表位的添加或可探測部分的添加；或4)提供與FGE多肽受體或其它分子的相等或更好的結合。替代性地，修飾可直接施加給多肽，如通過切斷，連接分子的添加，可探測部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和類似的方式。修飾也包括包含全部或部分FGE胺基酸序列的融合蛋白。本領域技術人員將會熟悉預測蛋白序列變化對蛋白構象的影響的方法，並能因此根據已知方法而「設計」 FGE多肽的變體。這種方法的一個實例被Dahiyat和Mayo在 Science278:82-87，1997中描述，其中蛋白質可被重新設計。此方法能被應用於已知的蛋白，以僅改變多肽序列的一部分。通過應用Dahiyat和Mayo的計算方法，具體的FGE多肽的變體可得到提議和被測試以測定變體是否保持了所期望的構象。
變體可包括被專一修飾的FGE多肽，所述修飾是為了改變多肽的與其生理活性無關的特徵。例如，半胱氨酸殘基能被置換或刪除以防止不必要的二硫鍵連接。類似地，一定的胺基酸可被改變以通過消除表達系統中由蛋白酶作用的蛋白水解而增強FGE多肽的表達(例如存在KEX2蛋白酶活性的酵母表達系統中的雙鹼性胺基酸殘基)。
編碼FGE多肽的核酸的突變優選保存編碼序列的胺基酸閱讀框，並優選不在核酸中創造出很可能雜交以形成二級結構的區域，二級結構例如發卡或環結構能對變體多肽的表達有害。
突變可通過選擇胺基酸置換或多肽編碼核酸中選定位置的隨機突變而發生。變體多肽隨後得到表達，並進行對一種或更多活性的檢測，以測定哪個突變為變體多肽提供了期望的性質。進一步的對多肽的胺基酸序列而言沉默的突變可提供給變體(或非變體的 FGE多肽)，但其提供在特定宿主中優選的翻譯密碼子，或改變mRNA的結構以，例如，增強穩定性和/或表達。優選的在例如大腸桿菌、哺乳動物細胞等中的核酸翻譯密碼子，對本領域中的一般技術人員而言眾所周知。其它突變也可提供給FGE基因或cDNA克隆的非編碼序列以增強多肽的表達。
技術人員將意識到保 守胺基酸置換可發生在FGE多肽中以提供功能等同的前述多肽的變體，即，變體保持FGE多肽的功能能力。在本文中所用的「保守胺基酸置換」指不顯著改變三級結構和/或多肽活性的胺基酸置換。變體可根據本領域一般技術人員已知的改變多肽序列的方法而製備，並包括那些在彙編這類方法的參考文獻中找到的類型，例如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，John Wiley & Sons, Inc. , New York。示例性的FGE多肽的功能等同性變體包括對SEQ ID NO:2的保守胺基酸置換。保守胺基酸置換包括發生在下列組群內部胺基酸中間的置換(a)M，I，L，V; (b)F, Y,ff; (c) K, R,H; (d)A,G; (e)S,T; (f)Q,N;和(g)E，D.
因此FGE多肽的功能等同的變體，即，保持天然FGE多肽功能的FGE多肽的變體被本發明所涉及。FGE多肽胺基酸序列中產生功能等同性變體的保守胺基酸置換，典型地是通過編碼FGE多肽的核酸(SEQ ID NOs:1, 3)的改變所提供。這類置換可通過多種本領域一般技術人員已知的方法而得到。例如，胺基酸置換可通過PCR導向突變，根據Kunkel的方法(KunkeI, Proc. Nat. Acad. Sc1. U. S. A. 82:488-492，1985)的定點突變，或編碼 FGE 多肽的基因的化學合成而得到。FGE多肽的功能等同片段的活性能通過將編碼改變後的FGE多肽的基因克隆進細菌或哺乳動物表達載體，將載體引入合適的宿主細胞，表達改變後的FGE 多肽，和測試在本文中公開的FGE多肽的功能能力(例如Ca-甲醯甘氨酸生成活性等)，而得到測試。
在本文中所述的發明具有許多應用，其中的一部分在本文其它部分被描述。首先， 本發明允許對FGE多肽的分離。技術從業人員眾所周知的多種方法能被用於得到分離的 FGE分子。多肽可從天然產生多肽的細胞中通過層析方式或免疫識別而純化。替代性地，表達載體可被引入細胞以引起多肽的產生。在另一方法中，mRNA轉錄物可被微注射或另外地被引入細胞以引起被編碼的多肽的產生。FGE mRNA在無細胞抽提物如網織紅細胞降解系統中的翻譯也可被用於產生FGE多肽。本領域技術人員也可容易地遵循已知的分離FGE多肽的方法。這些包括但不限於免疫層析，HPLC，大小排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在一定的實施方案中，本發明也提供來源於FGE多肽的「顯性失活」多肽。顯性失活多肽是蛋白質的失活變體，其通過與細胞機制相互作用而從活性蛋白與細胞機制的相互作用中取代了活性蛋白，或與活性蛋白競爭，而減小了活性蛋白的效應。例如，與配體結合但不會轉導響應於配體結合的信號的顯性失活受體能減小配體表達的生物學效應。同樣地，與靶蛋白正常相互作用但不磷酸化靶蛋白的顯性失活催化惰性激酶，能減少靶蛋白響應於細胞信號的磷酸化。類似地，結合到基因調控區域的啟動子位置但不增加基因轉錄的顯性失活轉錄因子能通過佔據啟動子結合位置而不增加轉錄來減小正常轉錄因子的效應。
顯性失活多肽在細胞中表達的最終結果是活性蛋白質的功能的減少。本領域一般技術人員能評估顯性失活蛋白變體的潛力，並用標準突變技術創造一種或更多顯性失活變體蛋白。參見，例如 U. S. Patent No. 5，580，723 和 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。技術人員隨後能測試經誘變的蛋白群體的選定活性的減少和/或對這種活性的保持力。其它類似的用於創造和測試蛋白的顯性失活變體的方法對本領域一般技術人員將是很顯然的。
FGE cDNA的分離也使技術人員可能診斷以FGE異常表達為特徵的疾病。這些方法包括測定FGE基因和/或源於其的FGE多肽的表達。在前者的情形下，這類測定能通過任何標準的核酸測定分析而進行，包括聚合酶鏈式反應，或如下面作為例子的採用標記性雜交探針的分析。在後者的情形下，這類測定能通過任何標準的(應用例如結合到分泌出的 FGE蛋白的抗體的)免疫分析而進行。優選的可根據本發明診斷的疾病是多種硫酸酯酶缺乏症。
本發明也包括分離的肽結合試劑，所述試劑，例如，可以是具有選擇性結合到FGE 多肽的能力的抗體或抗體片段(「結合性多肽」)。抗體包括根據傳統方法製備的多克隆和單克隆抗體。在一定的實施方案中，本發明排除了與SEQ ID N0:4的核酸所編碼的多肽 結合的結合性試劑(例如抗體)。
值得注意的是，如本領域中眾所周知的，只有抗體分子的一小部分，即抗原互補位，涉及抗體與其表位的結合(參見，一般地，Clark, ff. R. (1986)The Experimental Foundations of Modern Tmmunologv Wiley & Sons, Inc. , New York;Roitt,1. (1991) Essential Tmmunol ogv. 7th Ed. , Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如， pFc』和Fe區域是補體級聯的效應子但不涉及抗原結合。pFc』區域已被酶切掉的抗體或產生時不含pFc』區域的抗體，它們被稱為F(ab』)2片段，保持了完整抗體的兩個抗原結合位點。類似地，Fe區域已被酶切掉的抗體或產生時不含Fe區域的抗體，它們被稱為Fab片段，保持了完整抗體分子的一個抗原結合位點。進一步地，Fab片段由共價結合的抗體輕鏈和被表示為Fd的抗體重鏈的一部分所組成。Fd片段是抗體專一性的主要決定因素(單一 Fd片段可與多達10條的不同輕鏈相連而不改變抗體專一性)，並且Fd片段在分離後保持表位一結合能力。
如本領域中眾所周知的，在抗體的抗原結合部分內部有直接與抗原表位相互作用的互補性決定區域(CDRs)，也有保持抗體結合部位三級結構的構架區域(FRs)(參見，一般地，Clark, 1986;Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白重鏈Fd片段和輕鏈中，有通過三個互補決定區域(⑶Rl到⑶R3)分別分開的四個構架區域(FRl到FR4)。⑶Rs尤其是⑶R3區域，更尤其是重鏈CDR3，很大程度上對抗體專一性負責。
現在在本領域中已很好地認識到，哺乳動物抗體的非CDR區域可被同種或異種特異性抗體的類似區域所替代，而保持原始抗體的表位專一性。這在製備和應用「人源化」抗體中表現得最清晰，其中非-人⑶Rs共價連接到人FR和/或Fc/pFc』區域以產生功能抗體。參見，例如 U. S. patents 4，816，567，5，225，539，5，585，089，5，693，762 和 5，859，205。 因此，例如，PCT國際公開號WO 92/04381教授了人源化的鼠類RSV抗體的生產和應用，其中至少鼠FR區域的一部分被人源性的FR區域所取代。這類抗體，包括具有抗原結合能力的完整抗體的片段，經常被表示成「嵌合的」抗體。
因此，正如對本領域一般技術人員而言是很明白的，本發明也提供 F(ab，)2，Fab, Fv和Fd片段；其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3 區域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和 /或輕鏈CDR3區域已經被同源的人或非序列所取代的嵌合F(ab』 )2片段抗體；其中FR和 /或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的 Fab片段抗體；以及其中FR和/或CDRl和/或CDR2區域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的Fd片段抗體。本發明也包括所謂的單鏈抗體。
因此，本發明包括與FGE多肽專一結合的多種大小和類型的多肽，及FGE多肽與其結合伴侶的複合物。這些多肽也可由抗體技術之外的其它來源得來。例如，這類多肽結合試劑能由簡併肽庫而提供，所述簡併肽庫可很容易以溶液、以固定的形式作為細菌鞭毛肽展示庫或噬菌體展示庫而製備。也可製備含有一個或更多胺基酸的肽組合文庫。文庫能進一步由肽和非肽的合成部分合成。
噬菌體展示能在鑑別根據本發明而有用的結合肽中特別有效。簡而言之，可應用傳統程序製備顯示4到約80個胺基酸殘基插入物的噬菌體庫(應用例如ml3，fd，或λ噬菌體)。插入物可代表，例如，完全的降解物或有偏差的陣列。然後可挑選噬菌體承載性插入物，其結合到FGE多肽或FGE和結合伴侶的複合物。此過程可通過複選結合到FGE多肽或複合物的噬菌體的幾個循環而重複。重複的循環導致承載特定序列的噬菌體的富集。DNA 序列分析可以進行，以鑑別所表達多肽的序列。結合FGE多肽或複合物的序列的最小線性部分可被測定。應用含有插入物的偏差性的庫，可重複這些程序，所述插入物包含最小線性部分的一部分或 全部外加一個或更多附加的其上遊或下遊的簡併殘基。酵母雙雜交篩選方法也可用於鑑別結合到FGE多肽的多肽。因此，本發明的FGE多肽或其片段或FGE與結合伴侶的複合物能被用於篩選肽庫，包括噬菌體展示庫，以鑑別和選擇本發明FGE多肽的肽結合伴侶。這類分子能用於，如所述的，篩選分析，純化方案，對FGE功能的直接幹擾，及其它對本領域一般技術人員而言很顯然的目的。
FGE多肽或其片段也能用於分離它們的天然結合伴侶。對結合伴侶的分離可根據眾所周知的方法完成。例如，分離的FGE多肽能被附著於某一基質，然後被懷疑含有FGE結合伴侶的溶液可應用到基質上。如果FGE多肽的結合伴侶在溶液中存在，那麼它將結合到基質固著的FGE多肽。之後結合伴侶可被分離出。充當FGE結合伴侶的其它蛋白質可通過類似方法分離出，而不需要過度的實驗。優選的結合伴侶是硫酸酯酶。
本發明也提供測量FGE在受試者中表達水平的方法。這可通過首先得到來自受試者的測試樣本而完成。測試樣本可以是組織或生物液體。組織包括腦，心臟，血清，乳房，結腸，膀胱，子宮，前列腺，胃，睪丸，卵巢，胰，垂體腺，腎上腺，甲狀腺，唾液腺，乳腺，腎，肝，腸，脾，胸腺，血管，骨髓，氣管，和肺。在一定的實施方案中，測試樣本源自心臟和血管組織,生物液體包括血液，唾液和尿。創傷性和非創傷性技術都能用於獲得這類樣本，並在本領域中被很好地記載。在分子水平上，應用本發明在此所述的產物和可在彙編這類方法的參考文獻中找到的本領域眾所周知的方案,PCR和Northern印跡都能用於測定FGE mRNA的水平。在蛋白質水平上，應用多克隆或單克隆抗FGE血清結合標準免疫分析，FGE表達可被測定。優選的方法將會把測得的測試樣本的FGE表達水平與對照進行比較。對照可包括已知量的核酸探針、FGE表位(如FGE表達產物)，或來自具有對照或「正常」水平FGE表達的受試者的類似測試樣本。
FGE多肽優選重組性產生，雖然這類蛋白可從生物抽提物中分離出。重組性產生的FGE多肽包括含有FGE蛋白與另一多肽的融合物的嵌合的蛋白質，所述多肽例如能提供或增強蛋白一蛋白結合、序列專一性核酸結合(如GAL4)，增強FGE多肽在分析條件下的穩定性，或提供可探測性的部分例如綠色螢光蛋白。融合到FGE多肽或片段的多肽也可提供易於探測融合蛋白的手段，例如通過免疫識別或通過螢光標記。
本發明也在產生非人的轉基因動物中有用。在本文中所用的「非人的轉基因動物」 包括具有整合在生殖系細胞和/或體細胞中的一種或更多的外生性核酸分子的非人的動物。因此轉基因動物包括通過同源重組而具有純合或雜合基因斷裂的「敲除的」動物，具有游離或染色體整合的表達載體的動物等。敲除動物能通過應用本領域眾所周知的胚胎幹細胞的同源重組而製得。重組可應用例如本領域一般技術人員已知的cre/lox系統或其它重組酶系統而促進。在一定的實施方案中，重組酶系統本身是條件性地表達，例如在一定組織或細胞類型中，在一定胚胎或胚胎後發育階段，因增加或減弱表達的化合物或類似物質的加入而被誘導。一般地，在這類系統中應用的條件表達載體應用多種可賦予所期望的基因表達模式(例如時間或空間性的)的啟動子。條件啟動子也能可操縱性地連接到FGE核酸分子以受調節或條件性的方式增加FGE的表達。FGE活性或表達的反式-作用負調節子也能可操縱性地連接到上述的條件啟動子。這類反式-作用調節子包括反義FGE核酸分子，編碼顯性失活FGE分子的核酸分子，對FGE核酸專一的核酶分子，和類似物。非人的轉基因動物在用於對診斷或治療方法的生化或生理效應進行測試的實驗中有用，所述診斷或治療方法針對以增加或減少FGE表達為 特徵的病症。其它應用對本領域一般技術人員而言是很顯然的。
本發明也涉及基因治療。完成離體基因治療的程序在U. S. Patent5, 399，346中概述，也顯示於該專利審查中所提交的文件，其所有內容都是公開可得的文件。一般地，它包括在體外將基因的功能拷貝引入到包含基因缺陷性拷貝的受試者的細胞中，將基因工程化的細胞回置到受試者中。基因的功能拷貝是處於允許基因在基因工程化細胞中表達的調控元件的可操作性控制下。許多轉染和轉導技術以及適當的表達載體為本領域一般技術人員所熟知，其中的一部分在PCT申請W095/00654中被描述。應用例如腺病毒，逆轉錄病毒， 皰疹病毒，和靶向的脂質體之類載體的體內基因治療也根據本發明而涉及。
本發明進一步提供鑑別試劑或引導化合物以得到在FGE或FGE片段依賴性細胞功能的水平上有活性的試劑的有效方法。這類功能尤其包括與其它多肽或片段的相互作用。 一般地，篩選方法包括對幹擾FGE活性(如Ca-甲醯甘氨酸生成活性)的化合物的分析，雖然增強FGE Ca-甲醯甘氨酸生成活性的化合物也能應用該篩選方法而被分析。這類方法能被適應於自動化的高產出的化合物篩選。靶指標包括被FGE調節的細胞過程如Ca-甲醯甘氨酸生成活性。
多種對備選(藥理上的)試劑的分析被提供，包括標記的體外蛋白質一配體結合分析，電泳遷移改變分析，免疫分析，基於細胞的分析例如雙雜交或三雜交篩選，表達分析等。 轉染的核酸能編碼例如，組合肽庫或cDNA庫。便於這類分析的試劑例如GAL4融合蛋白在本領域中眾所周知。可作為範例的基於細胞的分析包括，以編碼融合到GAL4 DNA結合結構域的FGE多肽的核酸和編碼可操作性地連接到基因表達調節區(如一個或更多GAL4結合位點)的報告基因的核酸而轉染細胞。報告基因轉錄的活化發生在FGE和報告融合多肽結合以例如激·活報告基因的轉錄時。之後，調節FGE多肽介導的細胞功能的試劑通過報告基因表達的變化而被探測。測定報告基因表達變化的方法在本領域中眾所周知。
方法中所用的FGE片段當不是由轉染的核酸所產生時，作為分離的多肽加入到分析混合物中。FGE多肽優選重組產生，雖然此多肽可從生物抽提物中分離。重組產生的FGE 多肽包括包含FGE蛋白與另一多肽的融合體的嵌合蛋白質，另一多肽例如能提供或增強蛋白質一蛋白質結合、序列專一性核酸結合(如GAL4)、增強FGE多肽在分析條件下的穩定性或提供可探測部分例如綠色螢光蛋白或Flag表位。
分析混合物包含能與FGE相互作用的天然的細胞內FGE結合祀。當天然FGE結合靶可用時，常常優選應用FGE結合靶的局部(例如肽-參見例如SEQ ID NO: 33的肽-或核酸片段)或類似物(即，為分析目的而模擬天然結合靶的FGE結合性質的試劑)，只要局部或類似物提供分析中可測量的對FGE片段的結合親合性和強烈結合傾向。
分析混合物也包含候選物質。典型地，多個分析混合物以不同試劑濃度平行進行， 以得到對多種濃度的不同反應。典型地，這些濃度中的某一個用作負對照，即，試劑的零濃度或在分析的探測極限之下的試劑濃度。候選物質包括許多化學種類，雖然它們典型的是有機化合物。優選地，候選物質是小分子有機化合物，即那些具有大於50然而小於約2500 的分子量的類型，優選小於約1000，而更優選小於約500。候選物質包含與多肽和/或核酸的結構性相互作用所必需的功能化學基團，並典型地包括至少一個氨基、羰基、羥基或羧基基團，優選至少兩個功能化學基團，而更優選至少三個功能化學基團。候選物質可包含被一種或更多上述確定的功能基團所取代的環碳或雜環結構和/或芳香或聚芳香結構。候選物質也可是生物分子例如肽，糖，脂肪酸，固醇，類異戊二烯，嘌呤，嘧啶，上述物質的衍生物或結構類似物，或者其組合，以及類似物質。試劑是核酸的情形中，試劑典型地是DNA 或RNA分子，雖然在此所定義的修飾後的核酸也被涉及。
候選物質從多種來源包括合成或天然化合物的庫得到。例如，對於多種有機化合物和生物分子的隨機和定向合成，有許多方式可用，包括隨機寡核苷酸的表達、合成性的有機組合庫、隨機肽段的噬菌體展示庫和類似方式。替代性地，細菌、真菌、植物和動物抽提物形式的天然化合物的庫唾手可得或易於產生。此外，天然和合成性產生的庫和化合物能通過傳統化學、物理和生化方式被修飾。進一步地，已知的(藥理學上)試劑可進行定向或隨機化學修飾例如醯化，燒基化，酯化，amidification,等，以產生試劑的結構類似物。
多種其它試劑也能被包括在混合物中。這些包括試劑例如鹽，緩衝劑，中性蛋白質(例如白蛋白)，去汙劑，等，其可被用於促進最佳的蛋白質一蛋白質和/或蛋白質一核酸結合。這樣的試劑也可減少反應成分的非專一性的或背景性的相互作用。其它改善分析效率的試劑如蛋白酶，抑制劑，核酸酶抑制劑，抗微生物劑和類似物也可被應用。
前述分析材料的混合物在由此確定的條件下培育，但對於候選物質存在的情形中，FGE多肽特異性地與細胞結合靶、其部分或其類似物結合。組分加入的順序，培育溫度， 培育時間和分析的其它參數可容易地確定。這類實驗只包括分析參數的最優化，而不涉及分析的基本組成。培育溫度典型地是在4°C和40°C之間。培育時間優選最小化以促進快速、 高產出的篩選，而典型的是在O.1和10小時之間。
培育之後，FGE多肽與一種或更多結合靶的專一性結合的存在與否通過使用者可用的任何方便的方法而探測。對於非細胞結合類型分析，分離步驟常被用於從未結合的組分中分離結合的組分。分離步驟可以多種方式完成。方便的是，組分中的至少一種在固相基質上被固定，未結合組分可容易地從其中分離。固相基質可由多種材料製成多種形式，例如微量滴定平板，微珠，計量棒(dipstick)，樹脂顆粒，等。優選基質被選擇成最大的信噪比，主要是最小化背景結合，以及使分離程序和成本簡化。
分離可被多種因素影響，例如從庫中除去珠子或計量棒，清空或稀釋庫如微量滴定平板孔，以清洗溶液或溶劑清洗珠子，顆粒，層析柱或過濾器。分離步驟優選包括多次漂洗或清洗。例如，當固相基質是微量滴定平板時，孔可典型地被包括培育混合物的那些不參與特異性結合的組分的清洗溶液清洗數次，所述組分如鹽，緩衝劑，去汙劑，非專一性蛋白質等。在固相基質是磁珠的情形中，珠子可用清洗溶液清洗一次或更多，並用磁體而分罔出。
探測可以任何方便的方式被影響，以進行基於細胞的分析例如雙雜交或三雜交篩選。與靶分子相互作用的FGE多肽的報告基因轉錄分析所得到的轉錄物典型地編碼直接或間接可測的產物，例如半乳糖苷酶活性，螢光素酶活性，和類似物。對於非細胞結合分析，組分的一種通常包含或被偶連到可探測的標記。多種標記都能用，例如那些提供直接探測的類型(例如放射性，發光，視覺或電子密度等)，或提供間接探測的類型(例如，表位標籤如FLAG表位、酶標籤如辣根過氧化物酶等)。標記可被固著於FGE結合伴侶，或整合進結合伴侶的結構中。
多種方法可被用於探測標記，這取決於標記的天性和其它的分析組分。例如，當固著到固相基質時或從固相基質分離之後，標記可被探測。標記可通過視覺或電子密度，放射性輻射，非放射性能量轉移等直接探測，或以抗體綴合物、鏈黴抗生物素-生物素綴合物等間接探測。探測標記的方法在本領域中眾所周知。
本發明提供FGE專一`結合試劑，鑑別和生產這類試劑的方法，及它們在診斷、治療和藥物開發中的應用。例如，FGE專一性藥理試劑在多種診斷和治療性應用中有用，尤其是在疾病或疾病預後與改變的FGE結合特徵相關的情形例如多種硫酸酯酶缺乏症中。新的 FGE專一結合試劑包括FGE專一抗體，細胞表面受體，被例如雙雜交篩選的分析法所鑑別的其它天然細胞內和細胞外結合試劑，及被對化學庫的篩選所鑑別的非天然細胞內和細胞外結合試劑，和類似物。
一般而言，FGE結合到特異分子的專一性通過結合平衡常數被測定。能選擇性結合FGE多肽的靶優選具有至少約IO7M4的結合常數，更優選至少約IO8M'而最優選至少約 IO9M'多種基於細胞的和非細胞的分析可被用於證明FGE專一結合。基於細胞的分析包括單、雙和三雜交篩選，其中FGE介導的轉錄得到抑制或增加等的分析。非細胞分析包括FGE 蛋白結合分析、免疫分析等。其它對篩選結合FGE多肽的試劑有用的分析包括螢光共振能量轉移(FRET)和電泳遷移改變分析(EMSA)。
根據本方面的另一方面，鑑別在調節本發明的分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性中有用的試劑的方法被提供。方法包括(a)將具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的分子與候選物質相接觸，(b)測量該分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性，和(c)將測得的分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性與對照比較以確定是否候選物質調節分子的Ca-甲醯甘氨酸生成活性，其中分子是本發明的FGE核酸分子或其表達產物。「接觸」指具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的分子與候選物質的直接和間接的接觸。「間接」接觸表示候選物質通過第三者試劑(例如信使分子，受體等)對分子的匕-甲醯甘氨酸生成活性施加了其影響。在一定實施方案中，對照是在缺乏候選物質時測得的分子Ca-甲醯甘氨酸生成活性。分析方法和候選物質如前述有關FGE的實施方案中所述。
根據本發明的另一方面，診斷以核酸分子、其表達產物或其表達產物片段的異常表達為特徵的疾病的方法被提供。方法包括將從受試者中分離的生物樣本與專一結合到核酸分子、其表達產物或其表達產物片段的試劑接觸，並測定作為疾病判定依據的試劑和核酸分子或表達產物之間的相互作用，其中核酸分子是根據本發明的FGE分子。疾病是多種硫酸酯酶缺乏症。導致FGE分子異常表達的FGE基因中的突變引起下面的SEQ ID N0:2上的胺基酸改變MetlArg; MetlVal; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp ;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg34 9Gln; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
在分子是核酸分子的情形中，這類測定能通過任何標準的核酸測定分析進行，包括聚合酶鏈式反應或在本文中作為例子的以標記性雜交探針進行的分析。在分子是核酸分子表達產物或核酸分子表達產物片段的情形中，這類測定能通過應用例如結合到任何多肽表達產物的抗體的任何標準的免疫分析而進行。
「異常表達」指FGE分子(核酸和/或多肽)相對於對照(即，相同分子在健康或 「正常」受試者中的表達)的減少的表達(表達不足)或增加的表達(過表達)。在本文中所用的「健康受試者」，指根據標準的醫學標準沒有出現多種硫酸酯酶缺乏症或具有發展多種硫酸酯酶缺乏症的風險的受試者。健康受試者也沒有另外顯現出病症。換句話說，如果被醫學專業人員檢查，這類受試者將被表徵 為健康和不帶多種硫酸酯酶缺乏症的症狀。這些包括異常染性腦白質營養不良和粘多糖病的特徵，例如在幾種組織中的酸性粘多糖的量增加，輕微『脂肪軟骨營養不良』，快速神經性衰退，尿中的腦硫脂和粘多糖的過量存在，增加的腦脊液蛋白和外周神經中的髓磷脂的異染性退化。
本發明也提供新的試劑盒，其將被用於測量本發明的核酸和本發明的表達產物的水平。
在某一實施方案中，試劑盒包含包裝，該包裝包含下列物質選擇性結合任何前述 FGE的分離的核酸或其表達產物的試劑，及用於與所述試劑和任何前述FGE的分離的核酸或其表達產物結合的測得值進行比較的對照。在某些實施方案中，對照是用於與測得值比較的預先測定值。在一定實施方案中，對照包含任何前述FGE的分離的核酸的表達產物的表位。在某一實施方案中，試劑盒進一步包含選擇性結合選自下列的多肽的第二試劑艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和 HSulf-6,或其肽段，和用於與所述第二試劑和所述多肽或其肽段的結合的測得值進行比較的對照。
在核酸探測的情形中，用於擴增本發明的核酸分子的引物對可被包括進去。優選的試劑盒將包括對照，例如已知量的核酸探針、表位(例如艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6，表達產物)或抗表位的抗體，以及指南或其它複印材料。在一定的實施方案中，複印材料能基於分析結果而表徵發展硫酸酯酶缺乏狀態的風險。試劑可按預先測定的量被包在容器中和/或被塗在小孔上，而試劑盒可包括標準物質，例如標記好的免疫試劑(如標記好的抗-1gG抗體)和類似物。一種試劑盒是包好的用FGE蛋白塗層的聚苯乙烯微量滴定平板和含有標記好的抗人 IgG抗體的容器。平板的小孔與例如生物液體接觸，清洗，然後與抗-1gG抗體接觸。之後探測標記。體現本發明特徵的試劑盒，通常以數字11指定，在圖25中顯示。試劑盒11包含下列主要元件包裝15，本發明的試劑17，對照試劑19和指南21。包裝15是用於盛含有本發明的試劑17的一個小瓶(或多個小瓶)，含有對照試劑19的一個小瓶(或多個小瓶)和指南21的類似盒子的結構。本領域技術人員可易於修飾包裝15以適合個體的需要。
本發明也包含在受試者中治療多種硫酸酯酶缺乏症的方法。方法包括對有這類治療需要的受試者施用調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑，用量為在受試者中有效增加 Ca-甲醯甘氨酸生成活性的量。在某些實施方案中，方法進一步包含一定試劑的共施用，所述試劑選自編碼下列蛋白的核酸分子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6 ;核酸分子的表達產物，和/或核酸分子的表達產物的片段。
在本文中所用的「調節核酸或多肽的表達的試劑」在本領域中已知，指有義和反義核酸，顯性失活核酸，多肽的抗體和類似物。調節分子表達(和如本文中所述的，調節其活性)的任何試劑根據本發明有用。在一定實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的分離的核酸分子(例如SEQ ID NO. 3的核酸)。在重要的實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的肽(例如SEQ ID NO. 2的肽)。在某些實施方案中，調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性的試劑是本發明的有義核酸。
根據本發明的一個方面，在受試者中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括對受試者施用本發明的分離的核酸分子和/或其表達產物，用量為在受試者中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的有效量。
根據本發明的另一方面，增加細胞中的Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法被提供。 方法包括將細胞與本發明的分離的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)，或其表達產物 (例如SEQ ID NO. 2的肽)接觸，用量為在細胞中有效增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的量。 在重要的實施方案中，方法包括激活內源性的FGE基因以增加細胞中的Ca-甲醯甘氨酸生成活性。
在任何的前述實施方案中，核酸可被操作性地偶聯到指導真核細胞例如HT-1080 細胞內的核酸分子表達的基因表達序列。「基因表達序列」是任何調節性的核苷酸序列，例如啟動子序列或啟動子一增強子組合，其促進它所可操作性地連接的核酸的有效轉錄和翻譯。基因表達序列可以是，例如，哺乳動物或病毒的啟動子如組成型或可誘導型的啟動子。 組成型的哺乳動物啟動子包括但不限於下列基因的啟動子次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶 (HPTR),腺苷脫氨酶，丙酮酸激酶，a-肌動蛋白啟動子和其它組成型啟動子。可作為範例的在真核細胞中組成性地發揮功能的病毒啟動子包括，例如，來自猿猴病毒，乳頭狀瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，勞斯肉瘤病毒，細胞巨化病毒，莫洛尼氏白血病毒的長末端重複序列(LTR)和其它逆轉錄病毒的啟動子，和單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其它組成型啟動子為本領域一般技術人員所知。作為本發明的基因表達序列而有用的啟動子也包括可誘導的啟動子。可誘導的啟動子在誘導劑存在時被活化。例如，金屬硫蛋白啟動子在一定的金屬離子存在時被激活而增加轉錄和翻譯。其它可誘導的啟動子為本領域一般技術人員所知。
一般而言，基因表達序列將包括(如果必要)分別涉及轉錄和翻譯起始的5』非轉錄和5』非翻譯序列，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和類似物。尤其是，這類5』非轉錄序列將包括啟動子區域，所述啟動子區域包括用於對可操作性連接的核酸進行轉錄控制的啟動子序列。基因表達序列可選性地包括所期望的增強子序列或上遊激活子序列。
優選任何本發明的FGE核酸分子連接到允許核酸分子在特定細胞系的細胞如神經細胞中表達的基因表達序列。允許核酸分子在細胞如神經細胞中表達的序列，是在這類細胞類型中選擇性地有活性從而引起核酸分子在這些細胞中表達的類型。例如，突觸蛋白-1啟動子能被用於在神經細胞中表達任何前述的本發明的核酸分子；而例如von Willebrand因子基因啟動子能被用於在血管內皮細胞中表達核酸分子。本領域中一般技術人員將能易於鑑別能在本發明的任何優選細胞中表達核酸分子的替代性的啟動子。
當它們以將核酸編碼序列(例如，在FGE的情形中，SEQ ID NO. 3)的轉錄和/或翻譯置於基因表達序列的影響或控制下這樣的方式而被共價連接時，核酸序列和基因表達序列被表述為「可操作性地連接」。如果期望核酸序列被翻譯成為功能性蛋白，並且如果在 5』基因表達序列中的啟動子的誘導導致核酸序列的轉錄，且如果在兩個DNA序列之間的連接的本性不會(2)導致移碼突變的引入，(2)幹擾啟動子區域指導核酸序列轉錄的能力，和 /或(3)幹擾對應的RNA轉錄產物翻譯成為蛋白質的能力時，兩個DNA序列被表述成可操作性地連接。因此，如果基因表達序列能影響核酸序列的轉錄以至於得到的轉錄產物可被翻譯成為所期望的蛋白質或多肽，則基因表達序列將被認為可操作性地連接到核酸序列。
本發明的分子能單獨的或與載體(也見對於載體的更早的討論)一起被運送到本發明優選細胞類型。按其最廣泛的含義(且與本文中其它部分對表達和靶向載體的描述一致)，「載體」是能促進(1)分子到靶細胞的運送，和/或⑵分子被靶細胞的吸取，的任何載體。優選運送載體以有所減少的降解運輸分子到靶細胞中，所述有所減少的降解相對於載體缺乏時所產生的降解的程度而言。可選地，「靶向配體」能被附著於載體以選擇性地將載體運送到其表面表達靶向配體的相關受體的細胞。以這種方式，載體(含有核酸或蛋白質) 能被選擇性地運送到神經細胞。祀向的方法包括綴合，例如那些在Priest的U. S. Patent 5，391，723中所述的。另一眾所周知的靶向載體的實例是脂質體。脂質體從Gibco BRL可商業性地獲得。生產靶向脂質體的多種方法被發表。
一般而言，在本發明中有用的載體包括但不限於質粒，噬菌粒，病毒，源於病毒或細菌來源的其它載體，所述其它載體已通過本發明核酸序列和能被附著到本發明的核酸序列的另外的核酸片段(例如增強子、啟動子)的插入或整合而被操作。病毒載體是載體的優選類型，包括但不限於來自下列病毒的核酸序列腺病毒；腺伴隨病毒；逆轉錄病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈維肉瘤病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；勞斯肉瘤病毒；SV40-型病毒； 多瘤病毒；EB病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疫病毒；牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；和RNA病毒例如逆轉錄病毒。也能容易地採用沒有指出但在本領域中已知的其它載體。
對某些應用特別優選的病毒是腺伴隨病毒，一種雙鏈DNA病毒。腺伴隨病毒能感染廣泛的細胞類型和物種，且能被工程化為複製缺陷型。它進一步地具有優點例如熱和脂溶劑穩定性、在多種株系細胞包括造血細胞中的高轉導頻率，和缺乏超感染抑制因此而允許多重系列的轉導。經報導，腺伴隨病毒能以位點特異的方式整合進人細胞DNA，從而將插入性基因突變的可能性和插入基因的表達的可變性最小化。此外，野生型腺伴隨病毒感染已在組織培養物中於缺乏選擇壓力的條件下存在超過100代，意味著腺伴隨病毒基因組整合是相對穩定的事件。腺伴隨病毒也能以染色體外方式發揮功能。
一般而言，其它優選的病毒載體基於非細胞病變性真核病毒，在這些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非細胞病變性病毒包括逆轉錄病毒，其生命周期包括基因組病毒RNA到DNA的逆轉錄及隨後的前病毒整合到宿主細胞DNA中。腺病毒和逆轉錄病毒已被許可用於人基因治療的試驗。一般而言，逆轉錄病毒是複製缺陷型(即，能指導所需蛋白的合成，但不能製造出感染性的顆粒)。這類基因改變的逆轉錄病毒表達載體具有對基因在體內的高效轉導的一般性用途。產生複製缺陷型逆轉錄病毒的標準流程(包括步驟外源性遺傳物質整合進質粒，質粒對包裝細胞系的轉染，重組性逆轉錄病毒通過包裝細胞系的產生，從組織培 養基中收集病毒顆粒和病毒顆粒對靶細胞的感染)在Kriegler，M.，「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, , W. H. Freeman C. 0. , New York (1990)和 Murry, E. J. EcL 「Methods in Molecular Biology, 」卷7，Humana Press Inc. , Cliffton, New Jersey(1991)中被提供。
另一優選的逆轉錄病毒載體是源自鼠莫洛尼白血病毒的載體，如在Nabel，E. G.等，Science，1990，249:1285-1288中所述的。這些載體據報導對基因運送到動脈壁的所有三層(包括中間層)都有效。其它優選載體在Flugelman等，Circulation,1992,85:1110-1117中公開。另外的對運送本發明的分子有用的載體在U. S. Patent No. 5，674，722 中被 Mulligan 等描述。
除前述載體外，其它傳送方法可被用於傳送本發明的分子到細胞例如神經細胞， 肝，成纖維細胞，和/或血管內皮細胞，並促進在那裡的吸收。
本發明的優選的這類運送方法是膠態分散體系統。膠態分散體系統包括基於脂質的系統，包括水包油乳液，微囊，混合微囊，和脂質體。本發明優選的膠態系統是脂質體。脂質體是人造膜容器，其作為體內或體外的運送載體而有用。已有顯示，大小範圍在O. 2-4. Oym的單層容器(LUV)能包裹進大的大分子。RNA，DNA和完整病毒粒子能被封裝在含水內部，並以生物活性形式運送到細胞中(Fraley等，Trends Biochem. Sc1.，1981,6:77)。為了脂質體是有效的基因轉運載體，一種或更多的下列特徵應具備(I) 目的基因高效被封裝，而保持生活活性；(2)相對於非靶細胞的與靶細胞的優選和牢固的結合；(3)囊泡的水內容物到靶細胞細胞質的高效運送；和(4)遺傳信息的準確和有效表達。
脂質體可通過脂質體到特異配體例如單克隆抗體，糖，糖脂，或蛋白質的偶聯， 而靶向於特定組織，例如心肌或血管細胞壁。可對靶向脂質體於血管壁有用的配體包括但不限於，仙臺病毒的病毒衣殼蛋白。此外，載體可偶聯到核靶向性肽上，其將定向核酸到宿主細胞核。
脂質體可從Gibco BRL商業性地獲得，例如由陽離子脂質如N-[l-(2，3雙油氧基)_丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)形成的 LIP0FECTIN 和LIP0FECTACE 。生產脂質體的方法在本領域中眾所周知，也在許多出版物中被描述。脂質體也已被 Gregoriadis, G.在 Trends in Biotechnology,卷 3，235-241 頁 (1985)中所回顧。用於大分子包括核酸的細胞內運送的新的脂質體也在PCT國際申請PCT/ US96/07572 (公開號 W096/40060,名稱為「 Int racellular Delivery of Macromolecules」) 中被描述。
在一個特定的實施方案中，優選的載體是適合植入哺乳動物受體的生物相容性的微顆粒或植入物。作為範例的根據此方法而有用的生物侵蝕性植入物在PCT國際申請PCT/ US/03307(公開號 W095/24929,名稱為「Polymeric Gene Delivery System」，其要求 1994 年3月15日提交的美國專利申請系列號213，668的優先權)中被描述。PCT/US/0307描述了用於包含(受適當的啟動子調控的)外源性基因的生物相容性的聚合性基質，優選生物降解性的聚合性基質。聚合性基質被用於實現外源性基因在患者中的持續性釋放。根據本發明，在此所述的核酸在PCT/US/03307中所公開的生物相容性優選生物降解性的聚合性基質中被封裝或分散。聚合性基質優選微顆粒形式例如微球體(其中核酸被分散到整個固體聚合性基質中)或微囊(其中核酸被儲存在聚合性殼的核心中)。包含本發明的核酸的聚合性基質的其它形式包括膜，塗層，膠，植入物和支架。聚合性基質裝置的大小和組成被選作引起基質裝置被植入的組織中的良好的釋放動力學。進一步設計的聚合性基質的大小根據將被應用的運送方法而選擇，所述運送方法典型地是組織注射或懸浮液通過霧化施用到鼻部和/或肺部區域。聚合性基質組合物能被選成同時具有良好的降解速率，及由生物粘附性物質形成，以在設計物被施用到血管表面時進一步增加轉運的有效性。基質組合物也能被選成不降解，但更適合通過持續相當一段時間的擴散而釋放。
非生物降解性和生物降解性的聚合性基質都能被用作將本發明的核酸運送到受試者。優選生物降解性基質。這類聚合物可以是自然或合成性的聚合物。優選合成性聚合物。根據釋放所需要的時間長度而選擇聚合物，一般是幾個小時到一年或更長時間的級別。 典型地，範圍從幾個小時到三至十二個月的時間長度的釋放最合意。聚合物可選性地是能吸收高到其重量的約90%的水的水凝膠的形式，而進一步地，可選性地與多價離子或其它聚合物交聯。
一般而言，本發明的核酸應用生物侵蝕性植入物以擴散方式而被運送，或更優選地，通過聚合性基質的降解。作為範例的能被用於形成生物降解性運送系統的合成性聚合物包括聚醯胺，聚碳酸酯，聚亞烷基，聚亞烷基二醇，聚環氧烷，聚亞烷基對苯二酸酯， 聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚-乙烯滷化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚矽氧烷，聚氨基甲酸乙酯和其共聚物，烷基纖維素，羥基烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯， 硝基纖維素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纖維素，乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，醋酸纖維素，丙酸纖維素，纖維素醋酸丁酸酯，纖維素醋酸鄰苯二甲酸酯，羧乙基纖維素，三醋酸纖維素，纖維素硫酸鈉鹽，聚(甲基異丁烯酸酯)，聚(乙基異丁烯酸酯)，聚(丁基異丁烯酸酯)，聚(異丁基異丁烯酸酯)，聚(己基異丁烯酸酯)，聚(異癸基異丁烯酸酯)，聚(十二烷基異丁烯酸酯)，聚(苯基異丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(異丙基丙烯酸酯)，聚(異丁基丙烯酸酯)，聚(十八烷基丙烯酸酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(環氧乙烷)，聚(對苯二甲酸乙二酯)，聚(乙烯醇)，聚乙烯醋酸，聚氯乙烯，聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮.
非生物降解性聚合物的實例包括亞乙基乙烯醋酸，聚(甲)丙烯酸，聚醯胺，其共聚物和混合物。
生物降解性聚合物的實例包括合成性聚合物例如乳酸和乙二酸的聚合物，聚酸酐，聚(原)酸酯，聚氨基甲酸乙酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚(丙交酯-共己內酯)，天然聚合物例如藻酸和其它多糖包括葡聚糖和纖維素，膠原，其化學衍生物(化學基團例如，烷基， 亞烷基，羥化，氧化的取代和增加，和其它由本領域技術人員常規進行的修飾)，白蛋白和其它親水蛋白質，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水蛋白質，其共聚物和混合物。一般而言，這些物質或者通過酶水解或者在體內暴露於水時通過表面或整體侵蝕而降解。
特別受關注的生物粘附性聚合物包括H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J. A. Hubell在 Macromolecules, 1993，26，581-587中所述的生物侵蝕性水凝膠，其教導在此被整合，聚透明質酸，酪蛋白，明膠，谷膠酪蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸，脫乙醯殼多糖，聚(甲基異丁烯酸酯)，聚(乙基異丁烯酸酯)，聚(丁基異丁烯酸酯)，聚(異丁基異丁烯酸酯)，聚(己基異丁烯酸酯)，聚(異癸基異丁烯酸酯)，聚(十二烷基異丁烯酸酯)，聚(苯基異丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(異丙基丙烯酸酯)，聚(異丁基丙烯酸酯)，和聚(十八烷基丙烯酸酯)。 因此，本發明提供用作藥物的本發明的上述分子的組合物，製備此藥物的方法和在體內用於持續釋放藥物的方法。
壓縮試劑也能與本發明的載體結合應用。在本文中所用的「壓縮試劑」指試劑例如組蛋白，它中和核酸上的負電荷從而允許核酸壓縮成細顆粒。核酸的壓縮促進了核酸被靶細胞的吸收。壓縮試劑能單獨使用，即以被細胞更有效地吸收的形式運送分離的本發明的核酸或，更優選地，與一種或更多上述載體組合。
其它作為範例的能被用於促進靶細胞對本發明的核酸的吸收的組合物包括磷酸鈣及細胞內運輸、微注射組合物和電穿孔的其它化學調節物。本發明包含在細胞中增加硫酸酯酶活性的方法。這類方法包括以有效地在細胞中增加硫酸酯酶活性的量將分離的本發明的核酸分子(例如如權利要求1-8中任一項所要求的分離的核酸分子，具有選自 SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表達產物(例如如權利要求11-15，19，20 中所要求的多肽或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)與表達硫酸酯酶的細胞接觸。在本文中所用的「增加」硫酸酯酶活性，指增加的對硫酸酯酶的特異性底物的親合性和/或對其的轉化，典型地導致硫酸酯酶分子上的FGly的形成的增加。在某一實施方案中，細胞以比野生型細胞更高的水平表達硫酸酯酶。「在細胞中增加硫酸酯酶活性」也指增加細胞所分泌的硫酸酯酶的活性。細胞可表達內源性和/或外源性的硫酸酯酶。與FGE分子的所述接觸也指激活細胞的內源性FGE基因。在重要的實施方案中，內源性硫酸酯酶被活化。在一定實施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4, HSulf-5,和/或HSulf-6。在一定的實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。根據本方面的另一方面，藥物組合物被提供。組合物以藥學上有效治療硫酸酯酶缺乏症的量包含細胞產生的硫酸酯酶，也包含藥學上可接受的載體，其中所述細胞已與包含分離的本發明的核酸分子(例如如權利要求1-8所要求的分離的核酸分子或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)或其表達產物(例如選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，7 6，和78的肽)的試劑接觸。在重要的實施方案中，硫酸酯酶以高於正常/對照細胞的水平表達。本發明也包含產生硫酸酯酶的細胞，其中細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率增加。細胞包含(i)相對於對照具有增加的活性的硫酸酯酶，和(ii)相對於對照具有增加的活性的甲醯甘氨酸生成酶，其中相對於甲醯甘氨酸生成酶缺乏的細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率增加至少5%。在本領域中已知,硫酸酯酶的過表達能減少內源性硫酸酯酶的活性(Anson等，Biochem. J.，1993，294:657-662)。此外，僅有重組硫酸酯酶的一部分有活性。出乎意料地，我們發現在具有硫酸酯酶的增加的表達/活性的細胞中，FGE增加的表達/活性導致更有活性的硫酸酯酶的產生。既然FGly在硫酸酯酶分子上的存在與硫酸酯酶活性相關，則「有活性的硫酸酯酶」就能通過應用MALD1-T0F質譜(如本文中其它部分所描述的)對FGly在硫酸酯酶細胞產物上的存在的測定而定量。然後對總硫酸酯酶的比率能很容易測定。本發明也提供用於硫酸酯酶缺乏症的診斷和治療的方法。這類疾病包括但不限於，多種硫酸酯酶缺乏症，粘多糖病II(MPS II;Hunter綜合症)，粘多糖病IIIA (MPSIIIA; Sanfilippo 綜合症 A),粘多糖病 VIII(MPS VIII),粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio綜合症A)，粘多糖病VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy綜合症)，異常染性腦白質營養不良(MLD)，X-連鎖的隱性點狀軟骨發育不全1，和X-連鎖的魚鱗病(類固醇硫酸酯酶缺乏症)。
本發明的方法在對任何前述病症的急性或預防性治療中都有用。在此所用的急性治療指對具有特定病症的受試者的治療。預防性治療指對可能具有此病症但現在並沒有或並未經歷此病症的症狀的受試者的治療。就其最廣泛的意義而言，術語「治療」表示急性和預防性治療兩者。如果需要治療的受試者正經歷病症(或具有或正具有特定病症)，那麼治療病症指改善、減弱或消除病症或來自病症的一種或更多的症狀。在某些優選的實施方案中，治療此病症指改善、減弱或消除與病症相關的特異的症狀或特異亞型的症狀。如果需要治療的受試者是可能具有此病症的受試者，那麼對受試者治療指減小受試者產生此病症的風險。本發明的治療劑的施用模式和劑量將隨著被治療的病症的特定階段、被治療的受試者的年齡和生理狀態、同時進行的治療(如果有)的本性、施用的特定途徑和在醫學實踐者的知識和專業技術範圍內的類似因素而變化。如本文中所述的，本發明的試劑以治療任何前述硫酸酯酶缺乏症的有效量而被施用。一般而言，有效量是能引起受試者的所期望的組織中的有益變化的任何量。有效量優選在特定病症中足以弓I起良好表型變化例如症狀或病症的整體性減輕、緩和或消除的量。—般而言，有效量是藥學製劑單獨或與進一步的藥劑一起產生出所期望的反應那樣的量。這可包括只短暫減慢病症的進程，雖然更優選它包括長期性地阻止病症進程，或延緩病症的發作，或防止病症發生。這可通過常規方法監測。一般地，活性化合物的劑量將從約0. 01mg/kg每天到1000mg/kg每天。期望範圍在50 u g-500mg/kg的劑量將是適合,優選口服和每天施用一次或幾次。當然，這類量將取決於被治療的特定病症，病症的嚴重程度，患者個體的參數包括年齡、生理狀況、身材尺寸和體重，治療的持續時間，同時進行的治療(如果有)的本性，施用的特異途徑和在醫學實踐者的知識和專業技術範圍內的類似因素。低劑量將源自施用的一定形式，例如靜脈內施用。在應用初始劑量時受試者中的反應不充分的情形中，更高的劑量(或通過不同的更局部化的運送途徑的有效更高劑量)可應用到患者耐受力所允許的程度。每天多重劑量被預期能 實現化合物的合適的系統水平。一般地，優選應用最大劑量，也就是，根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。然而將被本領域中一般技術人員所理解的是，患者可出於醫學原因、心理原因或事實上的其它任何原因而堅持較低劑量或可耐受性劑量。本發明的試劑可選性地與藥學上可接受的載體組合以形成藥學製劑。在本文中所用的術語「藥學上可接受的載體」表示適合對人施用的一種或更多相容性的固體或液體填充物、稀釋劑或封裝物質。術語「載體」表示天然或合成性的有機或無機成分，活性成分與其組合以促進應用。藥學組合物的成分也能被與本發明的分子共混合，及彼此混合，其方式是確保沒有實質性破壞所期望的藥學效力的相互作用存在。在某些方面，藥學製劑以有效治療疾病的量包含本發明的試劑。藥學製劑可包含合適的緩衝劑，包括鹽形式的醋酸、鹽形式的檸檬酸、鹽形式的硼酸或鹽形式的磷酸。藥學組合物可選性地，也可包含合適的防腐劑例如苯扎氯；氯代丁醇；對輕基苯甲酸酯或乙基萊硫代水楊酸鈉(thimerosal)。多種施藥途徑可用。當然，選出的特定模式將取決於選定的特定藥物，被治療的病症的嚴重程度和治療效力所需的劑量。本發明的方法，一般而言，可應用醫學上可接受的任何施用模式，即產生活性化合物的有效水平而不引起臨床上無法接受的不利效應的有意義的任何模式而實行。施用的這類模式包括口服，直腸，局部，鼻，皮內，經皮，或非腸道途徑。術語「非腸道的」包括皮下，靜脈內，intraomental，肌肉內，或輸注。靜脈內或肌肉內途徑不是特別適合長期性治療和預防。作為實例，用於對具有偏頭痛的受試者的急性治療的藥學組合物可配製成多種不同的方式和多種施用模式，包括片劑，膠囊，粉末，栓齊U，注射液和鼻噴霧劑。藥學製劑可方便地以單位劑型存在，也可通過任何製藥領域中眾所周知的方法製備。所有方法包括將活性試劑與載體相連的步驟，所述載體組成了一種或更多附屬成分。一般而言，組合物通過統一地和密切地將活性化合物與液體載體、很好地分隔的固體載體或同時二者相連而製備，然後如果需要，將產物定形。適合口服施用的組合物可作為離散性單位存在，例如膠囊，片劑，錠劑，每一個都包含預定量的活性化合物。其它組合物包括水性或非水性的懸浮液例如糖漿，酏劑或乳劑。適合非腸道施用的組合物方便地包含消毒過的本發明試劑的水製劑，其優選與接受者的血液等滲。此水製劑可根據已知方法應用合適的分散或潤溼劑和懸浮試劑進行配製。無菌的可注射性製劑也可是非毒性的注射用可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的注射溶液或懸浮液，例如在1，3- 丁二醇中的溶液。可接受的可用載體和溶劑有水、Ringer』 s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油傳統上被用作溶劑或懸浮介質。為了這一目的，任何溫和的固定油可被應用，包括合成性的甘油單酯或雙酯。此外，脂肪酸例如油酸可在可注射的製劑中應用。適合口服，皮下，靜脈內，月幾肉內等施用的配方能在Remington』 sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, PA 中找至丨J。根據本發明的一個發明，用於在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括將分離的本發明的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)或其表達產物(例如SEQ ID NO. 2的肽)以在細胞中增加(。-甲醯甘氨酸生成活性的有效量與細胞接觸。在重要的實施方案中，方法包括激活`內源性FGE基因以在細胞中增加Ca-甲醯甘氨酸生成活性。在某些實施方案中，接觸在允許本發明的分子進入細胞的條件下進行。根據本發明的術語「允許分子進入」細胞具有下面基於分子本性的含義。對分離的核酸，它用於描述核酸通過細胞膜而進入細胞核，在其基礎上「核酸轉基因」能利用細胞機制產生核酸所編碼的功能多肽。「核酸轉基因」用於描述所有的有或沒有相連載體的本發明的核酸。對於多肽，它用於描述多肽通過細胞膜進入細胞質，及如果需要，對細胞的細胞質機制的利用以功能性地修飾多肽(例如修飾成活性形式)。多種技術可被用於將本發明的核酸引入細胞，其依賴於核酸是在體外還是體內而被引入宿主。這類技術包括核酸-CaPO4沉澱的轉染，與DEAE相連的核酸的轉染，包括目的核酸的逆轉錄病毒的轉染，脂質體介導的轉染和類似方法。對於一定的應用，優選將核酸靶向於特定細胞。在這類例子中，用於將本發明的核酸運送進細胞的載體(例如逆轉錄病毒或其它病毒；脂質體)可以具有附著於其上的靶向分子。例如，分子例如對靶細胞上的表面膜蛋白專一的抗體或靶細胞上的受體的配體能被固定到核酸運送載體上或整合在其中。例如，脂質體被用於運送本發明的核酸的情形中，結合到與內吞作用相關的表面膜蛋白的蛋白質可被整合進用於靶向和/或促進吸收的脂質體的配劑。這類蛋白質包括對特定細胞類型有親和力的衣殼蛋白或其片段，針對循環中經歷內化的蛋白質的抗體，靶向細胞內定位和增強細胞內半衰期的蛋白質，和類似物。聚合性運送系統也已被成功用於運送核酸進入細胞，如本領域技術人員所已知的。這類系統甚至允許核酸的口服運送。其它運送系統能包括定時釋放性、延遲釋放性或持續釋放性運送系統。這類系統能避免本發明的試劑的重複施用，增加對受試者和醫生的方便性。多種類型的釋放運送系統可用，且為本領域一般技術人員所已知。它們包括以聚合物為基礎的系統例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸，聚己內酯，聚酯醯胺，聚原酸酯，聚羥基丁酸和聚酸酐。包含藥物的前述聚合物的微囊在例如U. S. Patent 5，075，109中被描述。運送系統也包括非聚合物系統脂類，包括固醇例如膽固醇，膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如單-二-和三-甘油酯；水凝膠釋放系統；SylaStic系統；以肽為基礎的系統；蠟塗層；應用傳統粘合劑和賦形劑的壓製成的藥片；部分融合的植入物；和類似物。具體的實例包括但不限於(a)本發明的試劑以某一形式被包含在基質內的侵蝕性系統例如U. S. PatentNos. 4，452，775，4，675，189和5，736，152中所描述的那些類型，和(b)活性成分以受控的速率從聚合物中滲出的擴散系統例如U. S. Patent Nos. 3，854，480，5，133，974和5，407，686中所述的。此外，以泵為基礎的硬體運送系統能被應用，其中部分適於植入。長期持續釋放性植入物的應用可以是合乎期望。在本文中所用的長期釋放，表示植入物被構建和計劃成至少30天運送治療水平的活性成分，優選60天。長期持續釋放性植入物是本領域中一般技術人員眾所周知的，包括部分上述的釋放系統。具體的實例包括但不限於，在U. S. Patent No. 4，748，024和加拿大No. 1330939中所述的長期持續釋放性植入物。

本發明也包括本發明的FGE分子之外的試劑的施用，和在某些實施方案中的共施用，所述試劑當以有效劑量施用時可與本發明的分子合作性地、加成性地或協同性地起作用，以(i)調節Ca-甲醯甘氨酸生成活性，和(ii)治療涉及本發明分子的(。-甲醯甘氨酸生成活性的任何病症(例如硫酸酯酶缺乏症包括多種硫酸酯酶缺乏症)。本發明的分子之外的試劑包括艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6，(核酸和多肽，和/或其片段)，和/或其組合。在本文中所用的「共施用」指同時施用兩種或更多的本發明的化合物(例如已知在對例如硫酸酯酶缺乏症的治療中有益的FGE核酸和/或多肽和試劑，——例如治療MPSII中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，其作為單一組合物中的混合物，或以足夠的時間間隔順序施用以至於化合物可發揮出相加性或甚至協同性的效力。本發明也包含固相核酸分子陣列。陣列基本上由固定於固體基質的一套核酸分子、其表達產物或其(或者核酸或者多肽分子的)片段組成，每一核酸分子選自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。在某些實施方案中，固相陣列進一步包含至少一種對照核酸分子。在一定實施方案中，這套核酸分子包含至少一種，至少兩種，至少三種，至少四種或甚至至少五種核酸分子，每一種選自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在優選的實施方案中，這套核酸分子包含最多100種不同核酸分子。在重要的實施方案中，這套核酸分子包含最多10種不同核酸分子。根據此發明，標準的微陣列技術的雜交技術被用於評估核酸表達的模式和鑑別核酸表達。微陣列技術，其也稱為其它名字，包括DNA晶片技術，基因晶片技術和固相核酸陣列技術，為本領域一般技術人員已知，並基於但不限於，獲得在固定的基質上的已鑑別出的核酸探針的陣列(例如在本文中其它部分所述如FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6 的分子)，以報告分子(例如放射性的，化學發光的，或螢光性的標記例如螢光素，Cye3-dUTP或Cye5-dUTP)標記靶分子，將靶核酸與探針雜交，和評估靶一探針的雜交。一般而言，具有與靶序列完全匹配的核酸序列的探針，將比不完全匹配的探針檢測到更強的報告分子信號。在核酸微陣列技術中應用的多種成分和技術在The Chipping Forecast,Nature Genetics,卷21，Jan1999中呈現，其全部內容在本文中被整合作為參考。根據本發明，微陣列基質可包括但不限於玻璃，矽土，鋁矽酸鹽，硼矽酸鹽，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，多種粘土，硝基纖維素或尼龍。在所有實施方案中，優選玻璃基質。根據本發明，探針選自核酸，其包括但不限於DNA，基因組DNA，cDNA和寡核苷酸；且可以是天然的或合成的。寡核苷酸探針優選20到25聚體寡核苷酸，而DNA/cDNA探針優選長度為500到5000個鹼基，雖然其它長度也可被應用。合適的探針長度可被本領域一般技術人員通過本領域內已知的程序而測定。在某一實施方案中，優選的探針是以SEQID NOs:1, 3, 4, 6, 8, 10,和/或12給出的核酸分子中的兩種或更多的組合。探針可應用本領域一般技術人員已知的標準方法例如凝膠過濾或沉澱純化，以除去汙染物。

在某一實施方案中，微陣列基質可用化合物塗層以增強探針在基質上的合成。這類化合物包括但不限於，寡聚乙二醇。在另一實施方案中，基質上的偶聯試劑或基團能被用於共價連接第一核苷酸或寡核苷酸到基質。這些試劑或基團可包括但不限於氨基，羥基，溴基和羧基。這些活性基團優選通過烴基例如亞烷基或亞苯基二價基團附著於基質，一個化合價位置被鏈連接佔據而餘下的一個附著到活性基團。這些烴基基團可包含多至約10個碳原子，優選多至約6個碳原子。亞烷基通常優選在主鏈中包含2到4個碳原子。本方法的這些和另外的細節在例如U. S. Patent 4，458，066中被公開，其全部內容被整合作為參考。在某一實施方案中，應用方法例如光導向的化學合成、光化學去保護或核苷酸前體到基質的運送及隨後的探針產生，探針以預先確定的柵格模式直接在基質上被合成。在另一實施方案中，基質可用化合物塗層以增強探針與基質的結合。這類化合物包括但不限於聚賴氨酸，氨基娃燒，氨基-反應性娃燒(Chipping Forecast, 1999)或鉻(Gwynne和Page，2000)。在此實施方案中，預合成的探針以精確的、預先確定體積的和柵格的模式被應用於基質，利用了計算機控制的機器人將探針以接觸列印方式或非接觸方式例如噴墨或壓電運送而應用於基質。以包括但不限於UV照射的方法，探針可共價連接到基質。在另一實施方案中，探針熱連接到基質。靶標是選自包括但不限於下列的核酸DNA，基因組DNA, cDNA, RNA, mRNA,且可以是天然的或合成性的。在所有實施方案中，優選來自被懷疑為發展或具有硫酸酯酶缺乏症的受試者的核酸分子。在本發明的一定的實施方案中，一種或更多對照核酸分子被附著於基質。優選地，對照核酸分子允許了對包括但不限於下列的因素的測定核酸質量和結合特徵；試劑質量和有效性；雜交成功性；和分析閾值和成功性。對照核酸可包括但不限於，基因如管家基因的表達產物或其片段。為選擇一套硫酸酯酶缺乏疾病的標記物，優選分析由例如基因表達的微陣列分析產生的表達數據，以確定在不同患者類別(每一患者類別是一種不同的硫酸酯酶缺乏疾病)中的哪個基因是顯著差異性地表達。基因表達的顯著性可應用Permax計算機軟體被測定，雖然任何能區分表達的顯著差異的標準統計包也可被使用。Permax實現了對數據的大規模陣列的排列雙樣本t-檢驗。對於觀察中的高維度載體，Permax軟體計算了對每一屬性的t-統計，並應用全部屬性的最大值與最小值的排列分布評估了顯著性。主要應用是確定兩組之間差異最大的屬性(基因)(例如對照的健康受試者和具有特定硫酸酯酶缺乏症的受試者)，應用t-統計的值測量「最大差異」和它們的顯著性水平。硫酸酯酶缺乏疾病相關性核酸分子的表達也能應用蛋白測量方法測定，以測定SEQ ID NOs: 2的表達，例如通過測定SEQ ID NOs:1和/或3編碼的多肽的表達。特異和定量測量蛋白質的優選方法包括但不限於基於質譜的方法例如表面增強的雷射解吸電離(SELDI;例如Ciphergen蛋白質晶片系統)，非基於質譜的方法，和基於免疫組織化學的方法例如二維凝膠電泳。通過本領域一般技術人員已知的程序，SELDI方法可被用於蒸發顯微量的蛋白，和創造個體蛋白質的「指紋」，從而 允許對在單一樣本中的多種蛋白質的含量的同時測量。優選地，基於SELDI的分析可被用於鑑別多種硫酸酯酶缺乏症的特徵，以及這類病症的階段。這類分析優選包括，但不限於下列實例。RNA微陣列所發現的基因產物可通過被專一(抗體介導的)捕獲到SELDI蛋白質盤(例如選擇性SELDI)而被選擇性地測量。蛋白篩選(例如以2維凝膠)所發現的基因產物可通過最優化的「總蛋白SELDI」解析以可視化那些來自SEQ ID NOs:1, 6, 8, 10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的特定的目的標記。來自SEQ ID NOs:1, 6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的多種標記物的 SELDI 測量的特定硫酸酯酶缺乏症的預測模型可被用於SELDI策略。任何前述微陣列方法在測定硫酸酯酶缺乏疾病相關核酸的蛋白中的應用，能以本領域一般技術人員已知的常規方法完成，而通過蛋白質測量方法測定的表達可與標記物的預測定水平相關，用作對硫酸酯酶缺乏疾病患者治療策略進行選擇的預測性方法。本發明也包含硫酸酯酶產生性細胞，其中細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率(即比活性)被增加。細胞包含(i)具有增強的表達的硫酸酯酶，和(ii)具有增強的表達的甲醯甘氨酸生成酶，其中細胞產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，相對於甲醯甘氨酸生成酶缺乏時細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，增加至少5%。在本文中所用的「具有增強的表達的硫酸酯酶」典型地指硫酸酯酶和/或其編碼的多肽相對於對照的增加的表達。增加的表達指增加(即到可探測的程度)任何硫酸酯酶核酸(如本文中其它部分所描述的本發明的硫酸酯酶核酸)的複製、轉錄和/或翻譯，因為任何這些過程的上調會導致基因(核酸)所編碼的多肽的濃度/數量的增加。這能應用大量本領域中已知也在本文中其它部分描述的方法而完成，例如以硫酸酯酶cDNA和/或包含硫酸酯酶位點的基因組DNA對細胞的轉染，通過應用同源重組將例如強啟動子元件置於內源性硫酸酯酶基因的基因組位點上遊而激活內源性硫酸酯酶基因(參見，例如U. S. PatentsNos. 5，733，761,6, 270，989和6，565，844中詳細描述的基因激活技術，所有這些被整合在本文中作為參考)等。典型的對照將是載體質粒所轉染的同樣的細胞。增強(或增加)硫酸酯酶活性也指防止或抑制硫酸酯酶的降解(例如通過增強的泛素化)，下調等，其導致例如相對於對照的增加的或穩定的硫酸酯酶分子t1/2(半衰期)。下調或降低的表達指基因和/或其編碼的多肽的降低的表達。基因表達的上調或下調能通過一定方式直接測定，所述方式為應用任何本領域已知的適合的方式例如核酸雜交或抗體探測方法分別探測基因(例如，硫酸酯酶)的mRNA水平或基因所編碼多肽的蛋白質表達水平的增加或降低，並與對照比較。硫酸酯酶基因表達的上調或下調也能通過探測硫酸酯酶活性的變化而間接測定。類似地，在本文中所用的「具有增強的表達的甲醯甘氨酸生成酶」，典型地指本發明的FGE核酸和/或其編碼的多肽相對於對照的增加的表達。增加的表達指增加(即到可探測的程度)任何本發明的FGE核酸(如本文中其它部分所描述的)的複製、轉錄和/或翻譯，因為任何這些過程的上調會導致基因(核酸)所編碼的多肽的濃度/數量的增加。這能應用上述的(對硫酸酯酶)和在本文中其它部分描述的方法而完成，在一定實施方案中，相對於甲醯甘氨酸生成酶缺乏的細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，細胞所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率增加至少10%，15%,20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。本發明進一步包 含在受試者中治療硫酸酯酶缺乏症的改進的方法。方法包括對需要這類治療的受試者以有效劑量施用硫酸酯酶以治療受試者中的硫酸酯酶缺乏症，其中硫酸酯酶與一定量的甲醯甘氨酸生成酶接觸，所述量是增加硫酸酯酶比活性的有效量。如本文中其它部分所描述的，「比活性」指所產生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率。在此所用的「接觸」指如本文中其它部分所描述的FGE翻譯後修飾硫酸酯酶。將對一般技術人員顯然的是，如果編碼FGE和硫酸酯酶的核酸在細胞中共表達，或甚至如果分離的FGE多肽與分離的硫酸酯酶多肽在體內或體外接觸，則FGE能接觸硫酸酯酶並對它進行修飾。即使分離的FGE多肽能與分離的硫酸酯酶多肽共施用於受試者，以治療受試者中的硫酸酯酶缺乏症，在FGE和硫酸酯酶之間的接觸也優選在硫酸酯酶施用於受試者之前在體外發生。既然更低量的硫酸酯酶需要被施用，和/或以更低頻率施用(因為硫酸酯酶具有更高的比活性)，此改進的治療方法對受試者有益。參考下面的實施例，本發明將被更充分地理解。然而，這些實施例只傾向於舉例說明本發明的實施方案，而不應被解釋為限制本發明的範圍。
實施例實施例1 多種硫酸酯酶缺乏症由編碼人(。_甲醯甘氨酸生成酶(FGE)的基因中的突變所引起。實駘稈序材料和方法FGE的體外分析為監測FGE的活性，N-乙醯化和C-醯胺化的23聚肽P23 (MTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRS)(SEQ ID NO: 33)被用作底物。位點11的半胱氨酸殘基向FGly的轉化通過MALD1-T0F質譜監測。30%乙氰和0. 1%三氯乙酸(TFA)中的6 ii M的P23原液被製備。在標準條件下，6pmol的P23與高至10 u I的酶一起在最終體積為30 ii I的50mM Tris/HCl (pH9. 0,含有67mM NaCl, 15 u MCaCl2, 2mM DTT,和0. 33mg/ml牛血清白蛋白)中於37°C培育。為停止酶反應，加入1. 5 y I10%TFA。然後P23被固著於ZipTip C18 (Millipore)，以0. 1%TFA清洗，並在3 y I的50%乙氰和
0.1%TFA中洗脫。0.5U I的洗脫液與0. 5ii I的基質溶液(50%乙氰和0. 1%TFA中的5mg/ml a-氰基-4-輕基-肉桂酸(Bruker Daltonics, Billerica, MA))在不鎊鋼的祀上混合。MALD1-TOF質譜應用反射模式和剛好高於解吸/電離閾值的雷射能量以Reflex III (Bruker Daltonics)完成。所有譜線是來自靶標上幾個點的200-300次射擊(shot)的平均值。質量軸應用分子質量範圍在1000到3000Da的肽作為外部標準而校準。P23的單同位素MlT是2526. 28，而包含FGly產物的是2508. 29。活性(pmol產物/小時)根據產物的峰值高度除以P23和產物的峰值高度總和而計算。來自牛睪丸的FGE的純化牛睪丸得自當地屠宰場，冰上保存最多20小時。實質(Parenchyme)從結締組織中釋放，並在韋林氏攪切器中和通過三輪次的馬達陶製(motor pottering)而勻眾。通過所得到的勻眾的細胞分級分離，粗微粒體(RM)的製備按(Meyer等，J. Biol.Chem.，2000，275:14550-14557)所述並進行下面的修正而完成。三次差異離心步驟，每次4°C下 20 分鐘，在 500g(JA10 轉子)，3000g(JA10)和 IOOOOg(JA20)下完成。RM 膜從最後一次的上清液中沉澱(125000g，Ti45轉子，45分鐘，4°C )，通過馬達陶製勻漿並在蔗糖墊層上分層(50mMHepes, pH7. 6, 50mM KAc, 6mM MgAc2, ImM EDTA,1. 3M鹿糖，5mM P _疏基乙醇)。在Ti45轉子中以45000rpm4°C下離心210分鐘後，RM從沉澱中回收。通常100000-150000等價的 RM,如 Walter 和 Blobel (Methods Enzymol. , 1983, 96:84-93)所定義，從 Ikg 睪丸組織中得到。reticuloplasm,即RM的腔內容物通過低濃度脫氧Big Chap下的分級抽提而得到，如 Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028 所述。對 FGE 的純化，95ml 的reticuloplasm4°C 下對 20mM Tris/HCl, pH8. 0, 2. 5mM DTT 透析 20 小時，而通過 125000g下離心I小時澄清。32ml澄清reticuloplasm等份物室溫下被裝在MonoQ HR10/10柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上，清洗和用線性梯度的 80ml Tris 緩衝液中的0到0. 75M NaCl以2ml/min洗脫。三輪洗脫的包含FGE活性的級分(50_165mM NaCl洗脫)被收集(42ml),與2ml的伴刀ii球蛋白A-Sepharose (Amersham Biosciences,已用含有
0.5M KCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM CaCl2,和 2. 5mM DTT 的 50mM Hepes 緩衝液，pH7. 4 清洗過)混合。4°C下培育16小時後,伴刀豆球蛋白A-Sepharose在柱中被收集,並用6ml相同的H印es緩衝液清洗。固著的物質通過柱在室溫下與6ml 0. 5M a-甲基甘露糖苷在50mMHepes, pH7. 4,2. 5mM中培育I小時而洗脫。洗脫用4ml的相同洗脫劑重複。來自伴刀豆球蛋白A-Sepharose的合併的洗脫液(IOml)以0. 5MTris/HCl (pH9. 0)調至pH8. 0,並與用IOmg 混雜肽(PVSLPTRSCAALLTGR) (SEQ ID NO: 34)衍生化的 2ml 的 Aff igel 10 (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)混合，以緩衝液 A(50mM Hepes, pH8. 0,含有 0. 15M 乙酸鉀，0. 125M蔗糖，ImM MgCl2,和2. 5mM DTT)清洗。4°C下培育3小時後，親和基質在柱中被收集。收集經過的液體(flow through)和用4ml緩衝液A清洗的組分,合併,並與已用IOmg的 Ser69肽(PVSLSTPSRAALLTGR) (SEQ ID N0:35)取代的 2ml Affigel 10 混合，用緩衝液A清洗。4°C下培育過夜，親和基質在柱中被收集，用6ml的緩衝液B (含有2M NaCl和20種組成蛋白質的胺基酸(每一濃度為50mg/ml)的混合物的緩衝液A)清洗3次。通過將Affigel與含有25mM Ser69肽的6ml緩衝液B培育兩次，每次90min，而將固著的物質從親和基質洗脫。洗脫液的等分組分以lmg/ml牛血清白蛋白取代，對緩衝液A透析，並分析活性。活性的保留部分(11.8ml)在 Vivaspin500 濃縮器(Vivascience AG, Hannover, Germany)中濃縮，並在95°C下溶於Laemmli SDS樣品緩衝液。起始物質和層析步驟後得到的製劑的多肽組成以SDS - PAGE (15%丙烯醯胺，0. 16%雙丙烯醯胺)監測，和以SYPRO Ruby (Bio-RadLaborator·ies)染色。通過質譜對FGE的鑑定對於肽質量指紋分析，純化的多肽用胰蛋白酶在凝膠內被消化(Shevchenko等，Anal. Chem.，1996，68:850-855)，在C18 ZipTip上脫鹽，並應用二氫苯甲酸作為基質和兩種來自胰蛋白酶的自降解肽(m/z 842. 51和2211. 10)作為內標準而以MALD1-T0F質譜進行分析。對串聯質譜分析，選出的肽通過MALD1-T0F post-source decay質譜而被分析。它們對應的帶雙電荷的離子被分離出，並被offline nano-ESI離子講質譜(EsquireLC, Bruker Daltonics)所片段化。質譜數據通過Mascot檢索算法用於NCBInr蛋白質資料庫中和NCBI EST核苷酸資料庫中的蛋白質鑑定。生物信息學信號肽和切斷的位置根據在EMBOSS (Rice 等，Trends in Genetics, 2000, 16:276-277)中實行的 von Heijne (von Hei jne, Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683-90)的方法被描述。N-糖基化位點應用 Brunak 的算法(Gupta 和 Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22)被預測。功能結構域通過搜索 PFAM-Hidden-Markov-Models (version 7. 8) (Sonnhammer 等，Nucleic AcidsRes.，1998，26:320-322)而被探測至Li。為搜索FGE 同源物,National Center for BiotechnologyInformation 的資料庫(Wheeler 等，Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16)用 BLAST (Altschul等，Nucleic Acids Res.，1997，25:3389-3402)查詢。序列類似度應用來自EMBOSS的標準工具而計算。基因組位點組織和同線性應用NCBI的人和小鼠基因組資源及也來自NCBI，BetheSda，MD的人類-小鼠同源性圖譜而確定。人FGEcDNA 的克隆從人成纖維細胞應用RNEASY Mini試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia, CA)製備的總 RNA，應用 OMNISCRIPT RT 試劑盒(Qiagen, Inc.，Valencia, CA)以及寡(dT)引物或者FGE 專一的引物 1199nc(CCAATGTAGGTCAGACACG) (SEQ ID NO:36)而被反轉錄。cDNA 的第一鏈通過應用正向引物lc(ACATGGCCCGCGGGAC) (SEQ ID NO:37)和作為反向引物的1199nc或 1182nc(CGACTGCTCCTTGGACTGG) (SEQ ID NO:38)的 PCR 而擴增。PCR 產物被直接克隆進pCR4-T0P0 載體(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。通過對克隆 PCR 產物(其從不同的個體和獨立的RT - PCR反應得到)的多種測序，FGE cDNA的編碼序列被確定(SEQ IDNOs:1 和 3)。突變探測，基因組測序，定點誘變和RNA印跡分析此研究中採用的標準流程本質上如LU bke等(Nat. Gen. ,2001,28:73-76)和Hansske 等(J. Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)所述。Northern 點與覆蓋整個編碼區cDNA探針雜交，並與P -肌動蛋白cDNA探針雜交而作為RNA負載的對照。細胞系和細胞培養來自多種硫酸酯酶缺乏症患者1~6的成纖維細胞分別從E. Christenson (RigshospitaletCopenhagen) , M. Bec k (Universititskinderkliaik Mainz) , A.Kohlschtitter (Uni veiS i tstskrankenhaus Eppendorf, Hamburg), E. Zammarchi (MeyerHospital, University of Florence), K. Harzer(Institut filr Himforschung, Ulli VGTS i tiitTiibingen),和 A. Fensom(Guy’s Hospital, London)得到。人皮膚成纖維細胞，HT-1080, BHK21 和 CHO細胞被以37°C和5%C02下保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco的修飾後的Eagle培養基中。轉染，間接免疫螢光，Western印跡分析和FGE活性的探測通過add-on PCR(其應用了 Pfu 聚合酶(Stratagene, La Jolla, CA)和下列引物GGAATTCGGGACAACATGGCTGCG(EcoRI)(SEQ ID NO:39), CCCAAGCTTATGCGTAGTCAGGCACATCATACGGATAGTCCATGGTGGGCAGGC(HA)(SEQ ID NO:40), CCCAAGCTTACAGGTCTTCTTCAGAAATCAGCTTTTGTTCGTCCATGGTGGGCAGGC(c-Myc)(SEQ ID NO:41), CCCAAGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGTCCATGGTGGGCAGGC (RGS-His6) (SEQ ID NO:42) ), FGE cDNA 被裝上 5』EcoR1-位點以及3』 HA-, c-Myc或者RG S-His6-標記序列，及其後的終止密碼子和HindIII位點。得到的PCR產物作為 EcoRI/Hindlll 片段被克隆進 pMPSVEH(Artelt 等，Gene, 1988，68:213-219)。應用EFFECTENE (Qiagen)作為轉染試劑，得到的質粒被瞬時轉染進生長在蓋玻片上的HT-1080，BHK21和CHO細胞。轉染48小時後，細胞通過如前面所述的間接免疫螢光(Lubke 等,Nat.Gen.,2001, 28:73-76;Hansske 等,J.Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)，應用抗HA的單克隆IgGl抗體(Berkeley抗體Company, Richmond, CA),抗c_Myc的單克隆 IgGl 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA)或抗 RGS-His 的單克隆IgGl抗體(Qiagen)作為第一抗體而被分析。內質網標記蛋白即蛋白二硫鍵異構酶(PDI)被用不同亞型的單克隆抗體(IgG2A, Stressgen Biotech. , Victoria BC, Canada)所探測。第一抗體被用分別偶聯到CY2或CY3的同型-專一性的山羊第二抗體(MolecularProbes, Inc. ,Eugene, OR)所探測。免疫螢光圖像在Leica TCS Sp2 AOBS雷射掃描顯微鏡上得到。對Western印跡分析,應用相同的單克隆抗體,HRP-綴合的抗-小鼠IgG被用作第二抗體。對FGE活性的測定，胰蛋白酶化的細胞用含有2. 5mM DTT、蛋白酶抑制劑和l%TritonX-100的IOmM Tris (pH8. 0)所溶解的磷酸緩衝鹽溶液清洗，其含有蛋白酶抑制劑的混合物(208 u M 4-(2-氨基乙基)鹽酸苯磺醯基氟，0. 16 ii M抑酶肽，4.2 ii M亮抑酶肽，7.2 ii M苯丁抑制素，3 ii M抑胃酶肽A，2. 8 ii ME-64)，並通過在125，OOOg離心I小時而澄清。上清液在MonoQ PCl. 6/5柱上應用上述條件進行層析。在50_200mM NaCl中洗脫的組分被收集，冷凍乾燥，並重構成原始體積的十分之一，隨後用肽P23測定FGE活性。逆轉錄病毒轉導目的cDNAs被克隆進基於莫洛尼鼠白血病病毒的載體pLPCX和pLNCX2 (BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA) 嗜親性的 FNX-Eco 細胞(ATCC, Manassas, VA)的轉染，及兼嗜性RETR0PACK PT67細胞(BD Biosciences Clontech)和人成纖維細胞的轉導按 Lubke 等，Nat. Gen.，2001，28:73-76; Thiel 等，Biochem. J.，2002，376，195-201 所述完成。對部分實驗，在測定硫酸酯酶活性前，用嘌呤黴素選擇PLPCX轉導的PT67細胞硫酸酯酶分析ASA, STS 和 GalNAc6S 的活性按 Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad.Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565; GloSSl和 Kresse, Clin. Chim. Acta, 1978，88:111-119 中所述被測定。MS對FGE活性的基於肽的快速分析我們已發展出應用體外合成的[35S]ASA片段作為底物而用於在微粒體抽提物中測定FGE活性的分析法。片段被加入分析混合物而作為核糖體相連的初生鏈複合物。對產物的定量包括胰蛋白酶消化、肽通過RP-HPLC的分離，及通過化學衍生為腙、RP-HPLC分離和液閃計數的組合而對含有[35S]-標記的FGly的胰蛋白酶降解肽的鑑別和定量(Fey等，J. Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。為監測純化過程中的酶活性，此麻煩的程序需要被修正。對應於ASA殘基65-80和含有FGly形成所需的序列基序的合成性的16聚肽在體外分析中抑制了 FGE活性。這暗示了肽例如ASA65-80可作為FGE的底物而起作用。我們合成了 23聚肽P23(SEQ ID NO: 33)，其對應於ASA殘基60-80並附加了 N-乙醯化的甲硫氨酸和C-醯胺化的絲氨酸殘基以分別保護N-和C-末端。含有半胱氨酸和FGly的P23形式能通過基質輔助的雷射解析/電離飛行時間(MALD1-T0F)質譜鑑別和定量。FGly殘基在P23位點11的存在通過MALD1-T0F post source decay質譜證實(參見Peng等，J. MassSpec.，2003，38:80-86)。P23和來自牛胰或牛睪丸微粒體的抽提物的培育將高至95%的肽轉化成為含有FGly的衍生物(圖1)。在標準條件下，反應與酶的數量和培育的時間成正比例，只要少於50%的底物被消耗和培育時間不超過24小時。P23的km是13nM。減少的和氧化的穀胱甘肽、Ca2+和 pH的效應與在應用核糖體相連初生鏈複合物作為底物的分析中所見到的那些相當(Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028)。FGE的純化對FGE的純化,牛睪丸微粒體的可溶性的級分(reticuloplasm)作為起始物質。FGE的比活性比那些來自牛胰微粒體的reticuloplasm中的類型高10-20倍(Fey等，J.Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。FGE的純化通過四個層析步驟的組合而完成。前兩個步驟是在MonoQ陰離子交換柱和伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱上的層析。在pH8,FGE活性物被固著到MonoQ，並在50-165mM NaCl被洗脫，而具有60-90%的回收率。當此級分與伴刀豆球蛋白A-S印harose混合時，FGE被固著。起始活性的30-40%能用0. 5M a-甲基甘露糖苷洗脫。後面兩個純化步驟是以16聚肽衍生的親和基質上的層析。第一親和基質是ASA65-80肽的變體所取代的Affigel 10，其中對FGly形成很關鍵的殘基Cys69，Pro71和Arg73被攪亂(混雜肽PVSLPTRSCAALLTGR-SEQ ID NO:34)。當以IOmM濃度加入體外的分析中時，此肽不會抑制FGE活性，且當固定到Affigel 10時不會保持FGE活性。在混雜肽親和基質上的層析除去了肽結合性蛋白，包括內質網的伴侶。第二親和基質是ASA65-80肽的變體所取代的Affigel 10，其中Cys69被絲氨酸取代(Ser69肽PVSLSTPSRAALLTGR-SEQ IDNO: 35)。Ser69肽親和基質有效結合FGE。FGE活性物能用2M KSCN或者25mM Ser69肽洗脫，而具有20-40%的回收率。在活性測定之前，KSCN或Ser69肽必須通過透析除去。Cys69被絲氨酸的取代對活性FGE的洗脫至關重要。被野生型ASA65-80肽所取代的Affigel 10有效結合FGE。然而，幾乎沒有活性能在用離液鹽(KSCN，MgCl2)，肽(ASA65-80或Ser69肽)，或者低或高pH值緩衝液洗脫的洗脫液中回收。在圖2中顯示了起始物質和在經歷了典型純化過程的四個層析步驟之後得到的活性組分的多肽模式。在最終級分中，5%的起始FGE活性和0. 0006%的起始蛋白被回收(8333-倍純化)。純化的39. 5和41. 5kDa多肽被單個基因編碼在純化的FGE製劑中的39. 5和41. 5kDa多肽被進行肽質量指紋分析。通過MALD1-T0F質譜得到的兩個多肽的胰蛋白酶肽的質譜很大程度地重疊，暗示著兩個蛋白質源自相同基因。在兩個多肽的胰蛋白酶肽中，兩個富含肽(MH+1580. 73, SQNTPDSSASNLGFR(SEQ ID NO:43)和 MH+ 2049. 91, MVPIPAGVFTMGTDDPQIK-SEQ IDNO: 44外加兩處甲硫氨酸氧化)被發現，其與具有GenBank Acc. No. AK075459 (SEQ ID NO: 4)的cDNA所編碼的蛋白質吻合。這兩個肽的胺基酸序列被MALD1-TOF post source decay譜和應用 offline nano-electrospray ionisation (ESI)離子講質譜的 MS/MS 分析所確認。人cDNA的牛定向進化同源物的EST序列，其覆蓋FGE的C端部分並與兩個肽的序列都吻合，提供了牛FGE的另外的序列信息。FGE的進化保守和結構域結構人FGE基因被SEQ ID NOs:1和/或3的cDNA編碼，並位於染色體3p26。它跨度約為105kb，而編碼序列分散在9個外顯子中。人FGE基因的三個定向進化同源物在小鼠中(87% —致)，黃果蠅(48% —致)，和瘧蚊(47% —致)被發現。定向進化同源物的EST序列在更多的8個物種中被發現,包括奶牛，豬，非洲爪蟾，Silurana tropicalis,斑馬魚，鮭魚和其它魚物種(對於細節，參見實施例2)。外顯子-內含子結構在人與小鼠基因間保守，而在染色體6E2上 的小鼠基因位於與人染色體3p26同線的區域內。S. cerevisiae和C. elegans的基因組缺乏FGE同源物。在原核生物中，12種人FGE的同源物被發現。人FGE的cDNA被預測編碼一個374殘基的蛋白(圖3和SEQ ID NO:2)。此蛋白包含一個33殘基的可切斷的信號序列，其表明FGE到內質網中的遷移，此蛋白也包含了在Asnl41處的單一 N-糖基化位點。FGE與伴刀豆球蛋白A的結合暗示著此N-糖基化位點被應用。FGE的殘基87-367被列在PFAM蛋白質基序資料庫中，作為未知功能的結構域(PFAM:DUF323)。人FGE和其在資料庫中已鑑定出的真核生物的定向進化同源物的序列比較分析說明此結構域由三個不同的亞結構域組成。在四種已知的真核生物FGE定向進化同源物中，N端亞結構域(人FGE中的殘基91-154)具有46%的序列一致性和79%的相似性。在人FGE中，此結構域在Asn 141攜帶N-糖基化位點，這在其它定向進化同源物中保守。FGE的中間部分(人FGE中的殘基179-308)為富含色氨酸的亞結構域(每129殘基中12個色氨酸)。真核生物定向進化同源物在此亞結構域內的一致性是57%，相似性是82%。C端亞結構域(人FGE中的殘基327-366)是FGE家族內最高度保守的序列。人C端亞結構域與真核生物定向進化同源物(3個全長序列和8個EST)的序列一致性是85%，相似性是97%。在亞結構域3的40個殘基內，四個半胱氨酸殘基完全保守。三個半胱氨酸也在原核生物FGE定向進化同源物中保守。FGE家族的12個原核生物成員(細節參見實施例2)與真核生物FGE共享亞結構域結構。三個亞結構域之間的邊界在原核生物FGE家族中更加明顯，因為可變長度的非保守序列將亞結構域彼此分開。人和小鼠基因組編碼兩個密切相關的FGE同源物(SEQ ID NOs:43和44，GenBankAcc. No. NM_015411，在人中；和 SEQ ID NOs:45 和 46，GenBank Acc. No. AK076022，在小鼠中)。兩個平行進化同源物為86%—致。它們的基因位於同線染色體區域(在人中7qll，在小鼠中5G1)。兩個平行進化同源物都與FGE定向進化同源物分享亞結構域結構，與人FGE有35% —致性和47%的相似性。在兩個同源物中都100%—致的第三亞結構域中，含有半胱氨酸的亞結構域3的i^一體序列缺失。表達，亞細胞定位和分子形式2.1 kb的單一轉錄子通過來自成纖維細胞的總RNA和來自心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎和胰的聚A+RNA的RNA印跡分析可被探測。相對於P -肌動蛋白RNA，含量有一個數量級的變化，而在胰和腎中最高，腦中最低。多種真核生物細胞系，其穩定地或瞬時表達人FGE的cDNA或C端被HA-，Myc-或His6_tag所延長的FGE衍生物的cDNA，被用於對FGE活性和FGE亞細胞定位進行分析。標記或非標記的FGE的瞬時表達增加了1. 6-3. 9倍的FGE活性。FGE在PT67細胞中的穩定表達增加了約100倍的FGE活性。在BHK21，CHO和HT1080細胞中通過間接免疫螢光對帶標記的FGE形式的探測顯示多種帶標記的FGE形式與蛋白質二硫鍵異構酶(一種內質網的腔蛋白)共定位。來自BHK 21細胞(被編碼帶標記的FGE形式的cDNA所瞬時轉染)的抽提物的Western印跡分析顯示單一的免疫活性條帶,其表觀大小在42到44kDa之間。FGE基因攜帶多種硫酸酯酶缺乏症中的突變多種硫酸酯酶缺乏症由硫酸酯酶中無法產生FGly殘基的缺陷所引起(Schmidt, B.等，Cell, 1995，82:271-278)。FGE基因因此是多種硫酸酯酶缺乏症的候選基因。我們對7位多種硫酸酯酶缺乏症患者的FGE編碼性cDNA進行了擴增和測序，發現十個不同的突變，其被基因組DNA測序所確證(表I)。
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表1:MSD患者中的突變
權利要求
1.組合物，其包含由共表達硫酸酯酶和甲醯甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳類動物細胞產生的硫酸酯酶，其中相對於由缺乏甲醯甘氨酸生成酶的相同的哺乳類動物細胞所產生的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
2.權利要求1的組合物，其中相對於缺乏甲醯甘氨酸生成酶的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為5%。
3.權利要求1的組合物，其中相對於缺乏甲醯甘氨酸生成酶的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為10%。
4.權利要求1的組合物，其中相對於缺乏甲醯甘氨酸生成酶的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為20%。
5.前述任一項權利要求的組合物，其中的哺乳動物細胞過表達FGE。
6.權利要求5的組合物，其中通過激活內源性FGE使哺乳動物細胞過表達FGE。
7.權利要求5的組合物，其中通過過表達外源性FGE使哺乳動物細胞過表達FGE。
8.組合物，其包含由相比野生型細胞具有提高的Ca-甲醯甘氨酸生成活性的哺乳動物細胞產生的硫酸酯酶，其中相對於由野生型細胞所產生的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲醯甘氨酸形成活性。
9.權利要求8的組合物，其中所述哺乳動物細胞包含激活的內源性甲醯甘氨酸生成酶 (FGE)0
10.權利要求8的組合物，其中所述哺乳動物細胞包含外源性甲醯甘氨酸生成酶 (FGE)0
11.前述任一項權利要求的組合物，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶， 硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
12.權利要求11的組合物，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
13.權利要求12的組合物，其中的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶包含SEQID N0:7。
14.權利要求11的組合物，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
15.前述任一項權利要求的組合物，其中的哺乳類動物細胞是CHO細胞。
16.前述任一項權利要求的組合物，其中的哺乳動物細胞是人細胞。
17.藥物組合物在製備用於治療受試者硫酸酯酶缺乏症的藥物中的用途，所述藥物組合物包含由共表達硫酸酯酶和甲醯甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳動物細胞產生的硫酸酯酶， 其中相對於由缺乏甲醯甘氨酸生成酶的相同的哺乳類動物細胞所產生的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
18.藥物組合物在製備用於治療受試者硫酸酯酶缺乏症的藥物中的用途，所述藥物組合物包含由相比野生型細胞具有提高的Ca -甲醯甘氨酸生成活性的哺乳動物細胞產生的硫酸酯酶，其中相對於由野生型細胞所產生的對照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲醯甘氨酸形成活性。
19.權利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症選自粘多糖病II(MPSII; Hunter 綜合症)，粘多糖病IIIA(MPS IIIA; Sanfilippo綜合症A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio 綜合症 A)，粘多糖病 VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy 綜合症)，異常染性腦白質營養不良(MLD)，X-連鎖的隱性點狀軟骨發育不全1，和X-連鎖的魚鱗病 (類固醇硫酸酯酶缺乏症)。
20.權利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是粘多糖病II(MPS II;Hunter綜合症)。
21.權利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是異常染性腦白質營養不良(MLD)。
22.權利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是粘多糖病IIIA(MPS 11IA; Sanf i I ippo 綜合症 A)。
23.權利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
24.權利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
25.權利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
26.硫酸酯酶生產細胞，所述生產細胞共表達(i)硫酸酯酶，和( )甲醯甘氨酸生成酶(FGE)，其中，相比於野生型細胞所述細胞具有增加的Ca -甲醯甘氨酸生成活性，由此造成所述細胞生產的硫酸酯酶對總硫酸酯的活性百分比增加。
27.權利要求26的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞包含外源性FGE。
28.權利要求26的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞包含激活的內源性FGE。
29.權利要求26-28中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的FGE包含選自下述的胺基酸序列由 SEQ ID NO: 2 的第 34-374 位、SEQ ID NO: 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78構成的胺基酸序列。
30.權利要求29的硫酸酯酶生產細胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的34-374位胺基酸。
31.權利要求29的硫酸酯酶生產細胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的胺基酸序列。
32.權利要求26-31中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞生產的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性比率相比於缺乏FGE的該比率增加了至少5%。
33.權利要求26-32中任一項所述的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞生產的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性比率相比於缺乏FGE的該比率增加了至少10%。
34.權利要求26-33中任一項所述的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞生產的硫酸酯酶對總硫酸酯酶的活性比率相比於缺乏FGE的該比率增加了至少20%。
35.權利要求26-34中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸 2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
36.權利要求26-35中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的硫酸酯酶是內源性硫酸酯酶。
37.權利要求26-35中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的硫酸酯酶是外源性硫酸酯酶。
38.權利要求26-37中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的FGE是激活的內源性FGE。
39.權利要求26-37中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中的FGE是外源性FGE。
40.權利要求26-39中任一項的硫酸酯酶生產細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
41.權利要求40的硫酸酯酶生產細胞，其中所述哺乳動物細胞是人細胞。
42.權利要求40的硫酸酯酶生產細胞，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
43.由權利要求26-42中任一項的硫酸酯酶生產細胞所產生的硫酸酯酶。
44.包含權利要求43的硫酸酯酶的藥物組合物。
45.生產激活的硫酸酯酶的方法，包括培養權利要求26-42中任一項的硫酸酯酶生產細胞。
46.用於製備用來治療硫酸酯酶缺乏症藥物的多肽，其中，所述多肽具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性，且a)具有選自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或SEQ ID NO. 2的第34-374位胺基酸構成的胺基酸序列；或b)與SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)對於a)或b)所述的多肽具有I個或多個保守胺基酸突變；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一項的融合蛋白。
47.權利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度為至少75%。
48.權利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度為至少95%。
49.權利要求46-48中的多肽，其中的FGE是具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性的多肽，且其具有包含下述中至少一個的亞結構域3 (i)GFR基序(ii)RVXXGG (A) S 基序(iii)含3個精氨酸的七聚物(iv)三甘氨酸殘基。
50.編碼權利要求46-49中任一項的多肽的核酸或者含有所述核酸的載體。
51.權利要求50的核酸,其中的載體是病毒載體。
52.權利要求51的核酸,其中的病毒載體包含來自腺病毒、腺相關病或逆轉錄病毒的核酸序列。
53.權利要求50— 52中任一項的核酸,其中的核酸可操作地連接於表達調控序列的基因。
54.權利要求53的核酸，其中基因調控序列是哺乳動物或者病毒的啟動子。
55.含有權利要求46- 49中任一項所述的多肽和硫酸酯酶的組合物或試劑盒。
56.含有權利要求50- 54中任一項所述的核酸的組合物或試劑盒。
57.權利要求56的組合物或試劑盒，其中所述組合物或試劑盒進一步包含編碼硫酸酯酶的核酸。
58.權利要求55或57的組合物或試劑盒，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙醯半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
59.權利要求57或58的組合物或試劑盒，其中所述的核酸編碼的硫酸酯酶是由單獨分開的載體所編碼的。
60.包括使用甲醯甘氨酸生成酶(FGE)以此導入醛基的修飾底物的方法。
61.權利要求60的方法，其中的底物是包含有序列L/V-FGly-X-P-S-R(SEQID NO:32) 的硫酸酯酶。
62.權利要求60或61的方法，其中的醛基替換巰甲基。
63.權利要求61或62的方法，其中的半胱氨酸或絲氨酸是被氧化的。
64.權利要求60-63中任一項的方法，其中的FGE以多肽形式提供，且進一步地其中所述多肽具有Ca-甲醯甘氨酸生成活性，且a)具有選自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或者SEQ ID NO. 2的第34-374位胺基酸構成的序列；或b)與SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)對於a)或b)所述的多肽具有I個或者多個保守胺基酸突變；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一項的融合蛋白。
65.權利要求60-63中任一項的方法，其中的FGE以編碼權利要求64所述多肽的核酸的形式提供。
66.權利要求60-65中任一項的方法，其中的被修飾的底物與載體組合。
全文摘要
本發明涉及診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)及其它硫酸酯酶缺乏症的方法和組合物。更特異地，本發明涉及被分離的調節硫酸酯酶翻譯後修飾的分子。這類修飾為硫酸酯酶的正確功能所必需。
文檔編號A61K38/00GK103055306SQ201210302070
公開日2013年4月24日 申請日期2004年2月10日 優先權日2003年2月11日
發明者K·馮菲古拉, B·施密特, T·蒂爾克斯, M·W·希爾特萊恩, A·巴拉比奧, M·P·考斯瑪 申請人:夏爾人類遺傳性治療公司