含氧化槐定鹼或氧化槐定鹼鹽的藥物組合物、製備方法及用途的製作方法

2023-10-17 14:30:09

專利名稱：含氧化槐定鹼或氧化槐定鹼鹽的藥物組合物、製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含半合成生物鹼或含半合成生物鹼鹽的藥物組合物、製備方法及用途，特別是涉及一種含氧化槐定鹼或含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物、製備方法及在製備抗腫瘤和抗腫瘤轉移藥物中的應用。
背景技術：
苦豆子(Sophora alopecuroides L)為豆科槐屬植物，始載於《新疆草藥手冊》，維吾爾名「布亞」，別名苦甘草、苦參草、苦豆根及西豆根。它集中分布在我國西北地區，尤以寧夏、甘肅、青海、新疆及內蒙古為多。全株味極苦，性寒，有毒，具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風殺蟲等多種功效。民間用其根治療喉痛、咳嗽、痢疾及溼疹等。
苦豆子植物體內化學成分主要是蛋白、糖類、有機酸、色素及生物鹼等。國內外研究的重點是放在生物鹼上。苦豆子生物鹼屬喹諾裡西啶(quinolizidine)生物鹼，是由三價氮原子形成稠合的哌啶環，所以又稱雙稠哌啶，仍屬於哌啶或吡啶(piperidine)的衍生物，一般稱之為羽扇豆生物鹼(Lupin alkoloids)。
苦豆子種子中生物鹼含量約8.11％，目前已分離出的生物鹼有23種之多。按其結構可分為四個類型①羽扇豆鹼(Lupinine)——二環型，②金雀花鹼(Cytisine)——三環型，③鷹爪豆鹼(Sparteine)——四環型，④苦參鹼(Matrine)——四環型。這些生物鹼包括苦參鹼、槐定鹼、槐果鹼、拉馬寧鹼、槐胺鹼、新槐胺鹼、3α-羥基槐定鹼，13，14-脫氫槐定鹼、N-羥基槐定鹼、氧化苦參鹼、氧化槐定鹼、氧化槐果鹼、苦豆鹼、臭豆鹼、金雀花鹼等。研究發現苦豆子生物鹼在抗腫瘤、抗菌、抗心律失常、抗B肝、免疫調節等方面具有重要的藥理活性和應用前景。
中國專利CN 1739510A公開了一種「氧化槐定鹼在製備抗癌藥的用途」在這篇專利中提到，「氧化槐定鹼可從豆科槐屬野生植物苦參、苦豆子、白刺花、沙生槐中分離提取」。從自然界的上述植物中獲取的氧化槐定鹼為反式構型、N-O鍵為直立鍵。構型如圖所示 原植物苦豆子僅含氧化槐定鹼不足0.01％，故從植物中提取分離氧化槐定鹼產率較低，且工藝繁雜，產品難於純化，無法滿足作為藥物原料的需要，而苦豆子中含槐定鹼0.6％，故原料槐定鹼易得，若以槐定鹼為原料對其進行半合成反應製備氧化槐定鹼，可以使其產率提高，因而可以滿足大規模生產的需要並可成為藥物的原料。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種含氧化槐定鹼的藥物組合物。
本發明的第二個目的是提供一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物。
本發明的第三個目的是提供一種含氧化槐定鹼的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
本發明的第四個目的是提供一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
本發明的技術方案概述如下一種含氧化槐定鹼的藥物組合物，是將結構為 的氧化槐定鹼與1-6之一種藥學上可接受的載體混合，使所述氧化槐定鹼的量佔該藥物組合物總重量的0.5％-60％。
一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，是將氧化槐定鹼鹽與1-6之一種藥學上可接受的載體混合，使所述氧化槐定鹼鹽的量佔該藥物組合物總重量的1％-60％，所述氧化槐定鹼鹽是將1摩爾權利要求1所述的氧化槐定鹼用水或甲醇或乙醇或四氫呋喃或異丙醇或二氧六環中至少一種溶解，加入1-1.5摩爾有機酸或無機酸的溶液，15℃-30℃反應1-2小時，過濾，濾液減壓濃縮至幹，真空乾燥，即製成一種氧化槐定鹼鹽。
所述有機酸為C1-C15的一元酸或C2-C15的二元酸或C2-C9的胺基酸或C1-C12的磺酸，所述無機酸為鹽酸或硫酸或磷酸。
所述一元酸為甲酸、乙酸、十酸、十三酸或十五酸。
所述二元酸為乙二酸、丁二酸、十三二酸、十五二酸。
所述胺基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸。
所述磺酸為甲磺酸、乙磺酸、丁磺酸、十二烷基磺酸。
一種如權利要求1所述的含氧化槐定鹼的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
一種如權利要求1所述的含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
本發明含氧化槐定鹼的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法製備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然後將其製成所需的劑型。
本發明的施藥量可根據用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴重程度等諸多因素加以調整，日劑量一般為10～300mg/kg；較好為30～200mg/kg；最佳為50～150mg/kg。可根據臨床的病例表現適當加以改變。
本發明的優點是通過儀器檢驗和分析證明，本發明的一種氧化槐定鹼其結構式與現有技術公開的從天然物質中提取的氧化環定鹼並非同一個化合物，兩者系一對立體異構體，本發明的氧化槐定鹼的喹諾裡西啶環為順式構型、N-O鍵為平伏鍵，而現有技術中的氧化槐定鹼的喹諾裡西啶環為反式構型、N-O鍵為直立鍵。在大量的調查和藥效學、毒理學、藥代動力學研究後證明，以本發明的氧化槐定鹼及其鹽類為活性成分配製的藥物組合物用於治療惡性腫瘤有意想不到的效果，本發明氧化槐定鹼的產率為72.4％，可以滿足大規模生產和作為醫藥原料的需求。
以本發明的氧化槐定鹼及其鹽類為活性成分的藥物組合物具有如下特點①毒性低，小鼠LD50僅為4362mg/kg，CN 1739510A所述氧化槐定鹼LD50為560mg/kg，慢性毒性實驗和遲緩性毒性實驗也未見藥物毒副作用，三致實驗也未發現致畸、致癌、致突變作用；②代謝快，不易蓄積，藥物消除T1/2β僅0.3442h，2h僅存痕量，4h完全測不出；③抑瘤譜廣，對淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌、肝癌、實體瘤、宮頸癌等多種腫瘤具有良好的抑瘤效果，且抑瘤率為50％-70％，比中國專利CN 1739510A所述氧化槐定鹼的腫瘤抑制率45％要高。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1 片劑取10kg氧化槐定鹼，加入5kg澱粉、1kg硬脂酸鎂、2kg羧甲基纖維素、27kg乙醇(體積百分比含量為70％)、25kg微晶纖維素、32kg玉米澱粉，充分攪拌混合製成溼顆粒，在60～70℃乾燥2～4小時壓製成片，每片含氧化槐定鹼30mg。
在實際操作時，可用氧化槐定鹼鹽替代氧化槐定鹼，氧化槐定鹼鹽可以是氧化槐定鹼的鹽酸鹽或硫酸鹽或磷酸鹽。
氧化槐定鹼鹽還可以是氧化槐定鹼的甲酸鹽或乙酸鹽或十酸鹽或十三酸鹽或十五酸鹽。
氧化槐定鹼鹽還可以是氧化槐定鹼的乙二酸鹽或丁二酸鹽或十三二酸鹽、十五二酸鹽。
氧化槐定鹼鹽還可以是氧化槐定鹼的甘氨酸鹽或丙氨酸鹽或纈氨酸鹽或亮氨酸鹽或穀氨酸鹽或苯丙氨酸鹽。
氧化槐定鹼鹽還可以是氧化槐定鹼的甲磺酸鹽或乙磺酸鹽或丁磺酸鹽或十二烷基磺酸鹽。
實施例2 膠囊劑取30kg氧化槐定鹼，加入2kg硬脂酸鎂、20kg羧甲基纖維素、48kg微晶纖維素，充分攪拌混合製成溼顆粒，將製成的溼顆粒直接在60～70℃乾燥2～4小時，然後充填入空膠囊殼中，每粒膠囊含氧化槐定鹼50mg。
實施例3 緩釋片劑取30kg氧化槐定鹼鹽(鹽可以是實施例1中所舉的任意一種)，加入7kg羥丙基甲基纖維素、25kg羧甲基纖維素、37kg乙醇(體積百分比濃度為70％)、1kg硬脂酸鎂等充分攪拌混合製成溼顆粒，在60～70℃乾燥2～4小時壓製成片。
或取60kg氧化槐定鹼，加入28kg羥丙基甲基纖維素、3kg硬脂酸、8kg乳糖、1kg硬脂酸鎂，充分攪拌混合幹法制粒，壓片，每片含氧化槐定鹼100mg。
實施例4 滴丸取10kg氧化槐定鹼鹽(鹽可以是實施例1中所舉的任意一種)，加入90kg的聚乙二醇，90℃加熱熔融，使原料和輔料充分混熔，將熔融物滴入二甲基矽油接受液體中，自然冷卻形成滴丸，使每粒滴丸含氧化槐定鹼鹽5～25mg。
實施例5 顆粒劑取60kg氧化槐定鹼，加入2kg硬脂酸鎂、18kg羧甲基纖維素、20kg微晶纖維素，充分攪拌混合用12-14目篩製成顆粒。在60-70℃乾燥2-4小時，使每克顆粒劑含氧化槐定鹼200mg。
實施例6 口服液取0.5kg氧化槐定鹼及其鹽類，加入純水74.5kg和25kg食用糖，攪拌使溶解，分裝滅菌，製得。
實施例7 凍乾粉針取4.5kg氧化槐定鹼鹽(鹽可以是實施例1中所舉的任意一種)，4kg的甘露醇，加入91kg的注射用水中，攪拌使溶解，滴加體積比1∶1的鹽酸水溶液，調節pH值至6.2，再加入0.5kg的針劑用活性炭，室溫攪拌20分鐘，過濾除活性炭，再用0.22μm濾膜過濾除菌，得澄明無菌液，灌入5ml管制瓶中，每瓶3ml，放入真空冷凍乾燥器中進行冷凍乾燥，製得。
實施例8 注射液取1kg氧化槐定鹼鹽(鹽可以是實施例1中所舉的任意一種)、9kg氯化鈉與90kg注射用水配液，攪勻，濾過，灌封，於115℃熱壓滅菌30分鐘，製得。
或取1kg氧化槐定鹼鹽(鹽可以是實施例1中所舉的任意一種)、10kg葡萄糖與89kg注射用水配液，滴加體積比1∶1的鹽酸水溶液，調節pH值至4.0，加活性炭0.1kg，在攪拌下煮沸30分鐘，過濾除活性炭，再用0.22μm濾膜過濾除菌，得澄明無菌液，灌封，於115℃熱壓滅菌30分鐘，製得。
實施例9一種氧化槐定鹼
的製備方法，包括如下步驟1)在150ml 30％(V/V)的H2O2水溶液中，加入50g槐定鹼，用濃鹽酸調pH＝2，30℃反應8小時；2)用1，2-二氯乙烷萃取未反應的槐定鹼，直至反應液經薄層色譜檢查無槐定鹼為止，用10％NaOH水溶液調反應液pH為8.5；3)將反應液減壓濃縮至原體積的1/15，無水乙醇溶解，過濾，濾液減壓濃縮至幹，真空乾燥至完全固化；4)用無水乙醇∶丙酮(1∶3)混合溶劑重結晶3次，得到白色氧化槐定鹼粉末36.2g。
薄層色譜檢查方法為取薄層層析矽膠板，將萃取液樣品及對照品點於薄層板底部，以體積比為1∶1∶1的正丙醇∶氯仿∶甲醇為展開劑，進行薄層層析，再用改良碘化鉍鉀試液顯色。
實施例10一種氧化槐定鹼鹽，用如下步驟製成將實施例9製備的1摩爾氧化槐定鹼用水溶解，再加1摩爾有機酸(或無機酸的溶液)，20℃反應2小時，過濾，濾液減壓濃縮至幹，真空乾燥，即製成一種氧化槐定鹼鹽。(溶解氧化槐定鹼的溶劑換成甲醇、乙醇、四氫呋喃、異丙醇、二氧六環中至少一種，其它步驟與上述相同，構成新的實施例)有機酸為C1-C15的一元酸或C2-C15的二元酸或C2-C15的胺基酸或C1-C15的磺酸，所述無機酸為鹽酸或硫酸或磷酸。
本發明的一種含氧化槐定鹼的藥物組合物，可以是口服製劑、液體製劑。其中口服製劑為普通片劑、膠囊劑、緩釋片、滴丸或顆粒劑；液體製劑為口服液、凍乾粉針、注射液、大小輸液或靜脈滴注液等。
所述的藥學上可接受的載體，包括製劑中常規的稀釋劑、填充劑(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合劑(澱粉、微晶纖維素)，崩解劑(如羧甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素)，潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鎂)，溼潤劑(如丙二醇、乙醇)，穩定劑(EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙醇胺、碳酸氫鈉、煙醯胺)等。上述輔料可以是常用劑量，以常用的配比與氧化槐定鹼或與氧化槐定鹼鹽類混合，當氧化槐定鹼及其鹽類的用量確定後，各藥用輔料之間的配比可以根據需要適當調節。本發明的含氧化槐定鹼的藥物組合物優選含有重量比為0.5％-60％。
壓片製成片劑的使用，用作賦型劑的輔料有MgSO4、玉米澱粉、滑石粉，規格有25mg、50mg、100mg、150mg、200mg。
實施例11實施例9所製備的氧化槐定鹼的經元素分析、IR、MS、1H-NMR、UV、熔點、TLC及性狀分析，分子式為C15H24N2O2，分子量(MW)264。1H-NMR的圖中有δ4.08(1H，dd，17-He，J＝13.5和7.5Hz)和δ3.41(1H，dd，17-Ha，J＝13.5和8Hz)的吸收峰，在UV中無2800cm-1的吸收峰，說明製備的氧化槐定鹼立體結構為順式喹諾裡西啶結構。產品質量檢驗合格，並對其穩定性進行了研究。
氧化槐定鹼具有如下理化性質本品為白色固體粉末，在水中極易溶解，在乙醇中易溶，在氯仿中溶解，在乙醚中不溶，極易引溼。
Mp 216-217℃。
TLC Rf值0.17(展開劑為正丙醇∶氯仿∶甲醇＝1∶1∶4)結構確證1.元素分析分子式C15H24N2O2，分子量264理論值C％ 68.18％H％ 9.09％N％ 10.61％實測值C％ 68.27％H％ 8.66％N％ 10.42％2.紅外光譜IR(KBr)cm-13423(OH)，2940，2873(CH)，1616(C＝O)，1459，1145(CN)，962(N→O)。
3.質譜氧化槐定鹼的分子量為264.30，(理論計算值264.37)，ESI-MS m/z(％)265(M+H，100)，247(M-OH，13.7)。
4.氫核磁共振譜δ4.08(1H，dd，17-He)，δ3.41(1H，dd，17-Ha)，δ3.48(2H，m，11-H，10-He)，δ3.13(2H，m，2-2H)，δ3.03(2H，m，14-2H)，δ2.98(1H，m，6-H)，δ2.85(1H，m，10-Ha)，δ2.35(2H，m，5-H，7-H)，δ2.07(2H，m，13-2H)，δ1.94(8H，m，3-2H，4-2H，8-2H，9-2H)，δ1.41(1H，m，12-He)，δ1.23(1H，m，12-Ha)。
5.紫外光譜將氧化槐定鹼溶於水，配成0.5mg/ml的溶液，進行紫外掃描，掃描波長為190-800nm。掃描結果，氧化槐定鹼的紫外最大吸收峰位於197nm處。
6.產品質量檢驗取本發明所得氧化槐定鹼20g進行檢驗，結果如下檢查項目 檢查結果[性狀] 白色結晶性粉末[鑑別]*(1)正反應[檢查]水分％ 8％熾灼殘渣％ 0.01酸鹼度 7.8～8.6澄清度 澄清重金屬 10ppm
有關物質％* 0.5[含量測定]* 按乾燥品計算98.6％結論符合規定。
*項目鑑別方法詳述如下(1)取本品1.0mg，加水5ml溶解，置兩隻試管中，分別滴加碘化汞鉀試液和碘化鉍鉀試液，即生成淡黃色沉澱和橙紅色沉澱。
*項目檢查方法詳述如下有關物質照高效液相色譜法(中國藥典附錄VD)測定。
色譜條件與系統適應性試驗 用氨基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈∶磷酸緩衝液(pH2.0)∶無水乙醇＝80∶13∶8為流動相；流速為1ml/min；檢測波長220nm。
取本品適量，精密稱定，加水溶解製成每1ml中含1mg的溶液，作為高濃度供試品溶液；精密量取1ml高濃度供試品溶液至25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，作為低濃度供試品溶液。分別取20μl低濃度和高濃度供試品溶液注入液相色譜儀，並記錄色譜圖，測量峰面積，按下列公式計算。
(1)最大雜質峰量不得大於2.0％。
最大雜質峰量＝100ri/rt+25rv(2)有關物質的總量不得大於5.0％。
有關物質總量＝100ri/rt+25rv式中ri為除溶劑峰外高濃度供試品溶液中最大有關物質的峰響應；rt為除溶劑峰以外高濃度供試品溶液中所有有關物質的峰響應之和；rv為低濃度供試品溶液中的氧化槐定鹼峰響應。
含量測定 照中國藥典2005版(中國藥典附錄VD)高效液相色譜法測定。
色譜條件與系統適應性試驗 用氨基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-磷酸水溶液(pH2.0)-無水乙醇(80∶13∶8)為流動相；流速為每分鐘1ml；檢測波長為220nm。理論板數氧化槐定鹼峰計算不低於1000。
測定法 取本品適量，精密稱定，加水溶解並定量稀釋製成每1ml中約含1mg的溶液，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取施普睿達對照品適量，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。
7.對其穩定性進行加速實驗考察(高溫、高溼、強光照射)，結果發現其對高溫、高溼、強光照射穩定、無分解，純度及理化指標不變。技術指標達到新藥報批的要求，工藝適合工業化生產。
實施例12氧化槐定鹼體外抗腫瘤作用肝癌SMMC-77211實驗方法採用MTT比色分析法
(1)接種細胞取對數生長期細胞，經0.02％的EDTA消化後加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養液，將細胞稀釋成單細胞懸液，調整細胞數，接種於96孔板。將接種後的細胞置37℃二氧化碳培養箱內培養24小時。
(2)加藥將樣品濃度設為10～1000μg/ml等不同濃度，每個濃度設4個復孔，對照設10個以上復孔。實驗樣品用DMSO助溶，用RPMI-1640培養液稀釋。加樣後仍將細胞置37℃二氧化碳培養箱內繼續培養72小時。
(3)加MTTMTT以RPMI-1640溶解，每孔加50μL。再置37℃繼續培養4小時後取出。
(4)測OD值棄除96孔板內的上清液，每孔加入DMSO 150μL。在酶標儀490nm測定OD值。
2評價指標細胞生長抑制率。抑制率＝(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100％。以對數直線回歸方法計算IC50。
3實驗結果樣品對體外培養的肝癌SMMC-7721細胞的生長抑制有明顯作用，並呈劑量依賴關係，其IC50為161.5μg/ml。
人肺腺癌A5491實驗方法採用MTT比色分析法(1)接種細胞取對數生長期細胞，經0.02％的EDTA消化後加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養液，將細胞稀釋成單細胞懸液，調整細胞數，接種於96孔板。將接種後的細胞置37℃二氧化碳培養箱內培養24小時。
(2)加藥將樣品濃度設為10～1000μg/ml等不同濃度，每個濃度設4個復孔，對照設10個以上復孔。實驗樣品用DMSO助溶，用RPMI-1640培養液稀釋。加樣後仍將細胞置37℃二氧化碳培養箱內繼續培養72小時。
(3)加MTTMTT以RPMI-1640溶解，每孔加50μL。再置37℃繼續培養4小時後取出。
(4)測OD值棄除96孔板內的上清液，每孔加入DMSO 150μL。在酶標儀570nm測定OD值。
2評價指標細胞生長抑制率。抑制率＝(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100％。以對數直線回歸方法計算IC50。
3實驗結果樣品對體外培養的人肺腺癌A549細胞有一定的細胞毒作用，其IC50為228.4μg/ml。
實施例13氧化槐定鹼體內抗腫瘤作用(一)抑制自發淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌實驗1.材料1.1動物的選擇本研究所自行繁殖IRM-2純系小鼠，雌雄兼用，體重22-30g。
1.2瘤株淋巴瘤，從IRM-2純種小鼠自發淋巴瘤傳代接種；乳腺癌、Lewis肺癌，由天津醫科大學提供，本室傳代接種。
1.3配製藥物取氧化槐定鹼，配製成濃度為50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg，溶劑為注射用水。
2.方法2.1接種選擇腫瘤生長旺盛且無潰破，健康情況良好的荷瘤鼠，脫臼處死，固定於手術板上，用碘酒，新潔爾滅消毒動物皮膚，無菌條件下在超淨臺內剝腫瘤，切開腫瘤成直徑2mm左右的小塊，在動物左側腹股溝處皮下接種。
2.2分組給藥接種後次日將動物隨機分組，設對照組及給藥組，對照組給予生理鹽水，給藥組給予3個不同劑量的氧化槐定鹼水溶液，每日1次，腹腔注射，每次0.5ml，連續給藥10天。
2.3觀察指標停藥後24小時處死動物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。
抑瘤率＝(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％3.結果測得氧化槐定鹼對小鼠淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌的抑制率分別見表1-表3。
表1 氧化槐定鹼對淋巴瘤的抑制作用

表2 氧化槐定鹼對乳腺癌的抑制作用

表3 氧化槐定鹼對Lewis肺癌的抑制作用

結果表明，氧化槐定鹼對小鼠移植性腫瘤淋巴瘤、乳腺癌及Lewis肺癌都有一定的抑制作用，在實驗中使用100mg/kg劑量效果更為明顯。
(二)抑制肉瘤S180、宮頸癌U14、肝癌H22實驗1.實驗材料1.1實驗動物 昆明種小鼠210隻，體重(20±2g)，雌雄各半，購於中國醫學科學院實驗動物研究所，動物許可證號SCXK京2004-0001。
1.2瘤種 小鼠宮頸癌U14、肉瘤S180、肝癌H22瘤株，購於天津醫藥科學研究所。
1.3藥物 氧化槐定鹼，白色固體粉末，在水中極易溶解，極具引溼性，經HPLC檢測純度大於96％，由本課題組自製。
1.4儀器 電子精密天平，瑞士，Mettler Toledo；光學顯微鏡，日本，OLYMPUS。
2.實驗方法2.1動物模型的建立 將小鼠在正常條件下餵養3d，稱重後(原始體重)，在無菌條件下抽取接種7d後的小鼠宮頸癌U14、肉瘤S180、肝癌H22腹水瘤瘤液，用生理鹽水稀釋成(1∶2)的液體充分混合，將腫瘤細胞懸液用新鮮配製的0.2％臺盼藍染色，混勻後按白細胞計數方法計數。染藍色者為死細胞，不染色者為活細胞，按如下公式計算細胞濃度和細胞存活率。
細胞濃度＝4大方格內活細胞數/4×104×稀釋倍數＝細胞數/ml細胞存活率＝活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100％接種U14、S180、H22腫瘤計數分別為4.5～7.5×107個/ml、4.2～5.7×107個/ml、4.1～5.8×107個/ml，細胞存活率均大於95％。用0.25ml注射器以0.2ml/只接種於小鼠的右前肢腋下，製成實體瘤動物模型。
2.2動物分組 腫瘤接種後，將70隻小鼠嚴格按隨機數字表示分成5組模型組(空白對照組)，給藥組(氧化槐定鹼高、中、低劑量組)，陽性對照組(順鉑組)，每組14隻，各組同時於接種腫瘤24h後開始給藥。
2.3給藥劑量與給藥途徑 空白對照組給予生理鹽水(0.3ml/d×10d)，氧化槐定鹼高、中、低劑量組(50，100，150mg/kg/d×10d)，陽性對照組順鉑(4mg/kg/2d×10d)。樣品臨用前以注射用水配製，ip給藥。
2.4檢測指標及方法2.4.1一般情況 每日觀察小鼠的自主活動，精神狀態，毛髮，呼吸，飲食，糞便性狀及對外界刺激的反應。
2.4.2實體瘤抑瘤率和體重增長的測定 移植瘤株24h後小鼠給藥，連續給藥10d，於第11d脫頸椎處死小鼠，稱取體重(處死體重)，然後用鑷子鑷住小鼠右腋腫瘤生長部位皮膚，用手術剪子剪開皮膚，暴露腫瘤，用手術剪鈍性剝離腫瘤，並用天平稱取瘤重，按如下公式計算抑瘤率。
腫瘤抑制率(％)＝[1-(平均實驗組瘤重/平均空白對照組瘤重)]×100％體重增長＝處死體重-原始體重-瘤重2.4.3肝重、脾指數和胸腺指數的測定 採用稱重法即剝離腫瘤後的小鼠，再解剖取出肝、脾和胸腺，用天平稱取肝重(g)、脾重(mg)和胸腺重(mg)，並按如下公式計算脾指數和胸腺指數。
脾指數＝脾重/處死體重(mg/g)胸腺指數＝胸腺重/處死體重(mg/g)2.5統計方法數據用SPSS10.0 for windows統計分析軟體處理，本實驗數據統計均採用t檢驗和方差分析，以mean±SE表示。
3.實驗結果3.1氧化槐定鹼對U14荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響結果。(見表4)實驗表明，氧化槐定鹼(50-150mg/kg)對U14小鼠腫瘤具有非常顯著的抑制作用(P＜0.01)，並存在一定的劑量依賴關係。雖然陽性對照藥順鉑抑瘤效果優於氧化槐定鹼，但荷瘤小鼠的體重、肝重及免疫指標(脾指數和胸腺指數)明顯下降，氧化槐定鹼與空白對照組差異極其顯著(P＜0.001)，而組的體重、脾指數、胸腺指數等指標均較空白對照組有所提高，提示氧化槐定鹼可能還有一定的改善荷瘤動物免疫機能的作用。(詳見表5)表4 氧化槐定鹼對U14荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared wi th control group，*P＜0.01。
表5 氧化槐定鹼對U14荷瘤小鼠各臟器指標的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。
3.2氧化槐定鹼對S180荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響結果。(見表6)實驗表明，氧化槐定鹼(50-150mg/kg)對S180小鼠腫瘤具有極其顯著的抑制作用(P＜0.001)，其中中劑量組(100mg/kg)抑瘤率最高為73.9％。儘管陽性對照藥抑瘤效果優於氧化槐定鹼，但荷瘤小鼠的體重、肝重及免疫指標(脾指數和胸腺指數)明顯下降，與空白對照組差異均極其顯著(P＜0.001)，而氧化槐定鹼組的這些指標與空白對照組比相差無幾。(詳見表7)表6 氧化槐定鹼對S180荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。
表7 氧化槐定鹼對S180荷瘤小鼠各臟器指標的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group**P＜0.001。
3.3氧化槐定鹼對H22荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響結果。(見表8)實驗表明，氧化槐定鹼(50-150mg/kg)對H22小鼠腫瘤具有極其顯著的抑制作用(P＜0.001)，其中中劑量組(100mg/kg)抑瘤率最高為79.3％。儘管陽性對照藥抑瘤效果優於氧化槐定鹼，但荷瘤小鼠的體重、肝重及免疫指標(脾指數和胸腺指數)明顯下降，與空白對照組差異均極其顯著(P＜0.001)，而氧化槐定鹼組的這些指標與空白對照組比相差無幾。(詳見表9)表8 氧化槐定鹼對H22荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。
表9 氧化槐定鹼對H22荷瘤小鼠各臟器指標的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group**P＜0.001。
實施例14氧化槐定鹼體外抗轉移實驗研究(一)抑制SMMC-7721肝癌細胞粘附實驗1.實驗方法採用MTT比色分析法。
96孔板每孔中分別鋪上ECM CEL各50ul，4℃過夜。加入1％BSA 150ul/孔，37℃孵箱內孵育2小時，倒置瀝乾。氧化槐定鹼與細胞共培養24小時，調節細胞濃度為8×104/ml，每孔加0.2ml，吸附1小時，用無血清培養液洗二次，加入200ul完全培養液，加MTT 20ul/孔，37℃孵箱內孵育4小時，加DMSO 150ul/孔。全自動酶標儀測定波長490nm的光密度(A)值。
2.評價指標粘附抑制率。粘附抑制率(％)＝(1-加藥組A值/未加藥組A值)×100％3實驗結果粘附實驗是人們創建的模擬腫瘤侵襲轉移過程的實驗模型之一。氧化槐定鹼在本試驗劑量範圍內，對肝癌細胞的粘附功能有明顯抑制作用，並呈劑量依賴關係。當氧化槐定鹼藥物濃度為3.7879×10-4mol/L、1.1364×10-3mol/L、2.2727×10-3mol/L時，粘附抑制率分別為68％、90％、77％。(詳見表10)表10 氧化槐定鹼對SMMC——7221肝癌細胞粘附功能的影響

實施例15氧化槐定鹼體外誘導腫瘤細胞凋亡實驗研究(一)SMMC-7721肝癌細胞形態學實驗1.實驗方法將對數生長期細胞接種於預先置有蓋玻片的6孔培養板內，細胞濃度為8×104/ml，每孔2ml，氧化槐定鹼終濃度分別為3.7879×10-4mol/L、1.1364×10-3mol/L、2.2727×10-3mol/L與細胞共培養24h，取出蓋玻片，Ciemsa染色後光鏡下進行細胞形態學觀察。
2.實驗結果觀察不同濃度的氧化槐定鹼作用於SMMC——7221細胞24h後發現，而氧化槐定鹼組細胞稀疏，數目少，形態不規則，有的呈梭形，有的呈圓形，核質比大，染色質較疏鬆。當氧化槐定鹼濃度為1.1364×10-3mol/L時，可見有明顯的凋亡細胞形態出現；細胞體積明顯變小，薄膜皺縮，胞核固縮，染色質濃染，有的細胞表現為核碎裂，個別細胞部分胞漿崩解為碎片狀，可見由膜裹內容物的所謂凋亡小體形成。
實施例16氧化槐定鹼體內抗轉移實驗研究(一)抑制Lewis肺癌自發性肺轉移1.實驗材料1.1實驗動物 C57BL/6小鼠，體重(20±2g)，雌雄各半，購於中國醫學科學院實驗動物研究所。
1.2瘤種 Lewis肺癌瘤株，購於天津醫藥科學研究所。
1.3藥物 氧化槐定鹼鹽酸鹽，白色固體粉末，在水中極易溶解，極具引溼性，經HPLC檢測純度大於96％，由本課題組自製。
2.實驗方法Lewis腫瘤小鼠，在無菌條件下取瘤塊，勻漿液放入無菌小瓶內，生理鹽水調整濃度，0.2ml/只鼠接種於C57BL/6小鼠腋部皮下，取接種後的實驗小鼠50隻，隨機分為5組，模型組給於生理鹽水；5-FU給予5-FU 20mg/kg；氧化槐定鹼3個劑量組(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)。以上各組小鼠均ip給藥，每日1次，14d後脫頸處死。解剖取出小鼠完整肺，用Bouin氏液固定24h，然後放入無水乙醇，漂洗至黃色褪去，轉移灶成白色小點，用顯微鏡觀察轉移灶數，計算轉移率轉移率＝(1-給藥組平均轉移灶數/對照組平均轉移灶數)×100％3.實驗結果氧化槐定鹼3個劑量組均可明顯抑制肺轉移灶數，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)，肺轉移抑制率分別為62.4％，67.1％，68.5％。(詳見表11)表11 氧化槐定鹼對Lewis肺癌小鼠自發性轉移的影響(Mean±SE)

注與模型組比較，*P＜0.05。
實施例17氧化槐定鹼急性毒性研究1.材料與方法1.1藥物氧化槐定鹼，白色固體粉末，易吸溼，可溶於水，純度大於95％。
1.2動物昆明種小白鼠，雌雄各半，體重18-22g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證書醫動字第01-3001號。
1.3方法取50隻小鼠，雌雄各半，體重18-22g，隨機分為5組，每組10隻(雌雄各只)。精密稱取氧化槐定鹼5.41g加注射用水配成17.1ml，此濃度在給最高劑量組8000mg/kg時，20g體重ip 0.5ml，然後按0.7等比遞減，將原藥液依次稀釋，使以下各劑量級即5600mg/kg、3920mg/kg、2744mg/kg及1921mg/kg組均按20g體重ip0.5ml的相應藥液，注射後觀察各組動物的中毒症狀。若有死亡記錄死亡數，連續觀察7天，除1921mg/kg組外，其他各組均有部分動物在注射後5分鐘出現安靜、匍伏、少動、行走蹣跚、有的出現震顫隨後呼吸停止死亡。一般死亡在48小時發生，7天後根據各組死亡數，按綜合計算法測定LD50。
2.結果各項數據見表12
LD50＝4362±810mg/kg3.結論單次腹腔注射氧化槐定鹼對小鼠的毒性較小，在劑量達到2744mg/kg以上時，部分動物可出現安靜、匍伏、少動、行走蹣跚等症狀，嚴重者可發生震顫及呼吸停止死亡，死亡一般在48小時內發生，測得的LD50為4362±810mg/kg，毒性較低。
表12 氧化槐定鹼急性毒性的測定(LD50)

實施例18氧化槐定鹼藥代動力學研究1.材料1.1藥物 氧化槐定鹼，白色固體粉末，引溼性強，純度大於95％，本研究室自製。
1.2儀器 System Gold高效液相色譜儀(Beckman公司產品)，166可變波長紫外檢測器1.3動物 昆明種雌性小鼠，體重28~32g，中國醫學科學院實驗動物所提供(合格證號，醫動字第01-3001號)1.4試劑 乙腈為色譜純，其餘試劑為分析純。
2方法實驗用昆明種雌性小鼠80隻，隨機分為8組，每組10隻，腹腔注射氧化槐定鹼生理鹽水溶液250mg/kg，給藥後0.03-0.04h內分組眼眶取血。血液凝固後，離心取血清。取200ml血清加入乙腈400μL沉澱蛋白，離心後取上清液100μL，直接進樣。色譜柱為C18Ultrasphere半製備柱(5U，10mm×250mm)，流動相20％乙腈-80％磷酸緩衝液(1/15molH3PO4+1/15mol KH2PO4，pH＝3)，流速2ml/min，檢測波長210nm。分別測定不同給藥時間的血藥濃度。
3結果見表13。
表13 給藥後不同時間小鼠氧化槐定鹼血清藥物濃度(M±s，μg/ml)

用給藥0.1h之後的給藥時間和相應血清藥物濃度的對數值logC作回歸分析，得方程Y＝2.1447-0.8753×T，消除係數(Ke)-2.0133/h；消除相半衰期(T1/2β)0.3442h；最大血藥濃度(Cmax)125.48μg/ml；血漿濃度達峰時間(Tmax)0.1h；表觀分布容積(Vd)3.29mg/L；清除率(CL)6.62L/(h·kg)。
4結論4.1系統中氧化槐定鹼分離良好，保留時間tB7.4～7.5min，藥物含量與峰面積線性相關，Y(μg)＝0.0412+0.181/γA(峰面積)，γ＝0.9999，最低檢測限為0.1μg。
4.2本方法測定的是血清中游離的氧化槐定鹼原型藥物，未能測出可能的還原產物。
4.3藥物吸收快，給藥後0.10h即達到最高濃度，0.5h內維持較高濃度，藥物消除T1/2β僅0.3442h，2h僅存痕量，4h完全測不出。
實施例19氧化槐定鹼鹽酸鹽體內抗腫瘤研究1.實驗材料1.1實驗動物 昆明種小鼠，體重(20±2g)，雌雄各半，購於中國醫學科學院實驗動物研究所，動物許可證號SCXK京2004-0001。
1.2瘤種 小鼠宮頸癌U14、肉瘤S180、肝癌H22瘤株，購於天津醫藥科學研究所。
1.3藥物 氧化槐定鹼鹽酸鹽，白色固體粉末，在水中極易溶解，極具引溼性，經HPLC檢測純度大於96％，由本課題組自製。
1.4儀器 電子精密天平，瑞士，Mettler Toledo；光學顯微鏡，日本，OLYMPUS。
2.實驗方法2.1動物模型的建立 將小鼠在正常條件下餵養3d，稱重後(原始體重)，在無菌條件下抽取接種7d後的小鼠宮頸癌U14、肉瘤S180、肝癌H22腹水瘤瘤液，用生理鹽水稀釋成(1∶2)的液體充分混合，用0.25ml注射器以0.2ml/只接種於小鼠的右前肢腋下，製成實體瘤動物模型。
2.4動物分組 腫瘤接種後，將小鼠嚴格按隨機數字表示分成5組模型組(空白對照組)，給藥組(氧化槐定鹼鹽酸鹽高、中、低劑量組)，陽性對照組(順鉑組)，每組10隻，各組同時於接種腫瘤24h後開始給藥。
2.5給藥劑量與給藥途徑 空白對照組給予生理鹽水(0.3ml/d×10d)，氧化槐定鹼鹽酸鹽高、中、低劑量組(50，100，150mg/kg/d×10d)，陽性對照組順鉑(4mg/kg/2d×10d)。樣品臨用前以注射用水配製，ip給藥。
2.4實體瘤抑瘤率和體重增長的測定 移植瘤株24h後小鼠給藥，連續給藥10d，於第11d脫頸椎處死小鼠，稱取體重(處死體重)，然後用鑷子鑷住小鼠右腋腫瘤生長部位皮膚，用手術剪子剪開皮膚，暴露腫瘤，用手術剪鈍性剝離腫瘤，並用天平稱取瘤重，按如下公式計算抑瘤率。
腫瘤抑制率(％)＝[1-(平均實驗組瘤重/平均空白對照組瘤重)]×100％體重增長＝處死體重-原始體重-瘤重3.實驗結果氧化槐定鹼鹽酸鹽3個劑量組對U14、S180、H22小鼠腫瘤，均有顯著的抑制作用，且抑瘤效果略優於氧化槐定鹼。(詳見表14-16)表14 氧化槐定鹼鹽酸鹽對U14荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，*P＜0.01。
表15 氧化槐定鹼鹽酸鹽對S180荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，*P＜0.01。
表16 氧化槐定鹼鹽酸鹽對H22荷瘤小鼠的抑瘤率及體重的影響(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。
實施例20氧化槐定鹼長期毒性實驗研究實驗動物選用中國醫學科學院實驗動物研究所提供的大白鼠和兔，分兩大組，大白鼠為一大組，兔為一大組。每大組再按給藥量分為小劑量(LD10)、中劑量(LD15)、大劑量(LD20)、空白對照四個小組。每組20隻，每隻按實際體重和所在組用藥比例計算每次給藥量，注射給藥，每天給藥1次，連續給藥6個月，停藥15天，觀察遲緩性毒性反應。
觀察指標觀察給藥前後動物體徵、生長曲線、外觀行為、注射局部反應，血、尿常規，心、肝、腎功能和重要器官的肉眼觀察和病理檢查等。
結果慢性毒性實驗和遲緩性毒性實驗歷時6個月，未發現1例動物死亡。觀察動物體徵、生長曲線、外觀行為、注射局部反應，血、尿常規及心、肝、腎功能檢測，未發現藥物毒副作用。
同時，進行氧化槐定鹼三致(致畸、致癌、致突變)實驗，也未發現致畸、致癌、致突變的作用。
權利要求
1.一種含氧化槐定鹼的藥物組合物，其特徵是將結構為 的氧化槐定鹼與1-6之一種藥學上可接受的載體混合，使所述氧化槐定鹼的量佔該藥物組合物總重量的0.5％-60％。
2.一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是將氧化槐定鹼鹽與1-6之一種藥學上可接受的載體混合，使所述氧化槐定鹼鹽的量佔該藥物組合物總重量的1％-60％，所述氧化槐定鹼鹽是將1摩爾權利要求1所述的氧化槐定鹼用水或甲醇或乙醇或四氫呋喃或異丙醇或二氧六環中至少一種溶解，加入1-1.5摩爾有機酸或無機酸的溶液，15℃-30℃反應1-2小時，過濾，濾液減壓濃縮至幹，真空乾燥，即製成一種氧化槐定鹼鹽。
3.根據權利要求2所述的一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是所述有機酸為C1-C15的一元酸或C2-C15的二元酸或C2-C9的胺基酸或C1-C12的磺酸，所述無機酸為鹽酸或硫酸或磷酸。
4.根據權利要求3所述的一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是所述一元酸為甲酸、乙酸、十酸、十三酸或十五酸。
5.根據權利要求3所述的一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是所述二元酸為乙二酸、丁二酸、十三二酸、十五二酸。
6.根據權利要求3所述的一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是所述胺基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸。
7.根據權利要求3所述的一種含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物，其特徵是所述磺酸為括甲磺酸、乙磺酸、丁磺酸、十二烷基磺酸。
8.一種如權利要求1所述的含氧化槐定鹼的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
9.一種如權利要求1所述的含氧化槐定鹼鹽的藥物組合物在製備抗腫瘤及其轉移藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種含氧化槐定鹼或氧化槐定鹼鹽的藥物組合物、製備方法及用途，含氧化槐定鹼的藥物組合物，是將氧化槐定鹼與1－6之一種藥學上可接受的載體混合，使所述氧化槐定鹼的量佔該藥物組合物總重量的0.5％－60％，試驗證明，本發明含氧化槐定鹼或氧化槐定鹼鹽的藥物組合物毒性低，代謝快，不易蓄積，抑瘤譜廣，腫瘤抑制率高，用於治療惡性腫瘤效果好。
文檔編號A61K9/08GK1843355SQ20061001360
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者劉培勳, 沈秀, 洪閣, 周則衛, 李松年, 胡璧, 徐文清, 劉正明 申請人:中國醫學科學院放射醫學研究所