α－澱粉酶活性抑制劑的製作方法

2023-10-17 14:39:09 1

專利名稱：α－澱粉酶活性抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有多酚類物質作為活性成分的α-澱粉酶活性抑制劑，所述多酚類物質來自於番石榴(Psidium guajava Linn.)(此後也稱為番石榴多酚)。還涉及含有該抑制劑的食品和飲料。
番石榴是一種起源於中美洲的灌木，它的果實、根和葉子一直被民間用於治療糖尿病和腹瀉。依最近的研究，用水或者一種親水性溶劑提取番石榴葉子得到的一種提取物抑制α-澱粉酶活性。日本專利公告第60-36746號公開了該提取物可以作為健康飲料的成分，日本專利公開第7-59539號公開了該提取物可以作為減肥食品和飲料的成分。
但是傳統的番石榴提取物還含有倍半萜、單寧及其他成分，並且它們的澱粉酶抑制劑活性也達不到上述節食作用的要求。
因此，本發明的目的之一是從番石榴提取物中分離一種組分，該組分具有很強的α-澱粉酶抑制活性，因此可能產生一種更有效的節食效果。本發明的另一個內容是含有此組分的食品和飲料。
因此，本發明提供了一種α-澱粉酶活性抑制劑，此抑制劑含有多酚類物質作為活性成分，所述多酚類物質是通過下面的工藝獲得用選自水和其他親水溶劑的溶劑對番石榴葉子和/或果實進行提取；對所得提取物進行超濾，由此去掉分子量小於5000的物質；剩餘級分上樣於丁基支持物疏水層析柱，用0.02mol/L磷酸二氫鈉水溶液與0.02mol/L磷酸鈉水溶液組成的水性溶液在兩溶液間的pH梯度下進行洗脫(流速1ml/分鐘)；從洗脫的物質中回收一個級分，該級分相應於當在260nm下檢測物質的光吸收時洗脫曲線中的第三個單峰。
本發明還提供了一種α一澱粉酶活性抑制劑，其含有多酚類物質作為活性成分，這些多酚類物質具有以下物理化學特性(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000--100000；(c)在3，428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和u1220cm-1處有強紅外吸收；(d)固態碳核磁共振光譜顯示與糖類信號(76ppm附近)、芳香族化合物信號(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(168ppm附近)相吻合；
(e)在下述條件下進行液相色譜時10分鐘左右出現一單峰柱填充物為硬質合成多聚反相分配膠，丁基以化學鍵與之結合(型號Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產品)，內徑4.6mm，長150mm，或類似於此柱的柱)。
流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測紫外光吸收儀(波長260nm)；流動相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數據進行梯度分析。
表1分析時間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4) 10004(4到8) 65 358(8到12) 0 10012(12到20)1000本發明還提供了含有α-澱粉酶活性抑制劑的食品和飲料。
本發明還提供了多酚類物質用於製備食品和飲料中的應用。
本發明還提供了包括攝入這類食品和飲料的節食方法。
實施本發明的最佳方案本發明多酚類物質可用下述步驟1-3生產。
1)步驟1用選自水和親水性溶劑的一種或多種溶劑提取番石榴的葉子和/或果實，以得到番石榴提取物。
本發明中使用的番石榴為Psidium guajava Linn.，對其種植地沒有特別限制。本發明中，番石榴是東南亞、南亞、南美或北美等熱帶或亞熱帶地區天然或人工栽培的。本發明中使用的是番石榴的葉子或果實。可以使用新鮮、半乾或者乾燥番石榴，但優選乾燥的番石榴葉子。使用番石榴果實時，優選未成熟果實。這些番石榴葉子或者果實作為原料時在使用前優選地經粉碎。比如，當使用番石榴葉時，番石榴葉子最好切成約3-5mm的小片。另外為了改進味道，可以使用在乾燥後再經焙烤的乾燥番石榴。
選自水和親水性溶劑的一種或多種溶劑用作提取溶劑。親水溶劑的例子包括甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮和丙二醇。上述溶劑可以兩種或多種組合使用，也可以與水按任何比例組成含水溶劑使用。為了操作方便並提高安全性，優選用水作為提取溶劑。
對所用溶劑的量沒有特別限制。當使用番石榴葉子時，葉子和溶劑的重量比優選1∶20；當時用未成熟番石榴果實時，溶劑的重量優選約為果實的約10倍。
對番石榴葉進行提取時，提取條件因使用的溶劑不同而不同。以水為溶劑時，提取在50-100℃進行，優選80-100℃；時間為5-60分鐘，優選5-25分鐘。
當使用未成熟番石榴果實時，提取優選在60-100℃進行10-60分鐘。
進行提取時，可在提取溶劑中加入如碳酸鈉的鹼以增加溶劑的pH值。也可以向提取溶劑中加入稀無機酸(如稀鹽酸)或者有機酸(如檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸或酒石酸)使溶劑變為弱酸性。
提取步驟完成後，優選將所得提取物冷卻然後離心，除去雜質。這樣得到的番石榴提取物可經濃縮或者稀釋以達到合適濃度。
2)步驟2對步驟1得到的番石榴提取物進行超濾，以此除去分子量小於5000的組分。
對於番石榴提取物的超濾，可以使用加壓過濾裝置、透析和離心等、也可以使用上述方法和技術的組合。
當進行透析時，將番石榴提取物裝入透析管。透析管由一種半透膜材料比如纖維素酯或者塞璐玢製成，其允許分子量小於5000的物質通過。然後對水或者對稀緩衝液(此後稱透析液)透析1-7天，最好2-3天，期間定期更換新鮮透析液或水。通過上述步驟，從番石榴提取物中除去小分子量物質。
3)步驟3對步驟2獲得的分子量為5000或大於5000的級分進行丁基支持物疏水層析。將樣品上柱，用磷酸二氫鈉(0.02mol/L)到磷酸鈉(0.02mol/L)pH梯度進行洗脫(流速1.0ml/分鐘)。
對疏水層析中使用的固定相填料沒有特別限制，只要其含有作為功能基團的丁基和具有足夠的機械強度即可。填料的例子包括聚苯乙烯、羧化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯以及纖維素衍生物。
以磷酸二氫鈉(0.02mol/L)水溶液和磷酸鈉(0.02mol/L)水溶液為流動相，在二者之間的濃度梯度下進行洗脫。
溶劑以1.0ml/分鐘的流速通過柱，檢測洗脫液在260nm處的光吸收值獲得被洗脫物質的分離模式。回收相應於第3個單一峰的級分，將所得級分真空或者冷凍乾燥，得到本發明中的多酚類物質。
如此得到的水溶性級分的物理化學性質將在下面給出。元素分析用通常方法進行元素分析，結果如表2所示。
表2元素分析結果元素 合量(％)碳(C) 49.6氫(H) 4.6氮(N) 0.6鑑於氮含量極低，認定此組分中不含蛋白質。分子量用通常的GPC-HPLC方法用多角度光散射檢測儀測定該組分分子量，結果表明該級分的分子量在5000-100000範圍內，平均分子量為70000。組成分析該級分的糖含量用下述方法測定將樣品在4mol/L三氟乙酸溶液中保持100℃2小時使之加熱並分解，依常規方式形成糠醛乙烯氰衍生物，然後用氣相色譜法計算糖含量。結果葡萄糖(2.1％)，阿拉伯糖(2.0％)，半乳糖(1.3％)，甘露糖(0.4％)，鼠李糖(0.3％)，木糖(0.3％)。沒食子酸含量、聯二沒食子酸含量和原花色素含量將樣品在含有硫酸鐵(III)銨的丁醇-鹽酸混合液(95∶5，V/V)中於100℃加熱24小時以使樣品分解，然後用HPLC方法分析分解的樣品中沒食子酸和聯二沒食子酸含量。沒食子酸和聯二沒食子酸的含量分別為0.6％和5.2％。用上述溶劑於95℃加熱樣品40分鐘分解樣品，根據分解溶液的光吸收值計算確定樣品中原花色素含量。原花色素以還原為花色素計含量為6.8％。紅外吸收光譜將樣品夾在兩層二氟化鋇晶體中間，加壓滾壓。用透射法測定光吸收。所獲得的紅外吸收光譜中，此組分的強吸收峰大約在3428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和1220cm-1處。紅外吸收光譜見

圖1。固態碳核磁共振譜(固態13C-NMR)採用通常的正交極化幻角自旋(CP-MAS)方法。獲得的CP-MAS光譜中可見糖類、芳香族化合物類、酚類和酯羰基化合物的信號。光譜證明樣該級分由主要是含有一個鞣花單寧基團的多酚。CP-MAS光譜見圖2。
從以下的實施例中將會看到，上述番石榴多酚具有很強的α-澱粉酶抑制劑活性，同時也有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性。因此，當攝入添加了這類多酚類物質的食物時，澱粉降解為糊精和麥芽糖的過程將被抑制，同時二糖(麥芽糖、異麥芽糖和蔗糖等)降解成葡萄糖的過程也將被抑制。這樣，多酚類物質的添加可賦予食物和飲料防止血糖升高和抵抗肥胖的作用。
本發明涉及到的食品和飲料的類型包括固態食品、半液態食品、膠質食品和各種飲料。具體的例子包括片劑、膠囊類產品和顆粒；糖果類食品如小甜餅、果凍和快餐食品；顆粒狀調味品、麵包和麵條；以及飲料類如提神飲料、果汁、以及由乳酸菌製備的飲料等。
除了本發明中的多酚類物質外，還有很多常用的食品添加劑也可以添加到上述食品和飲料中。這類添加劑包括糖醇類(如葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨糖醇、木糖醇、赤鮮糖醇、乳糖醇和palatinit)；乳化劑如蔗糖脂肪酸酯、多聚甘油脂肪酸酯和卵磷脂)；穩定劑(如果膠、羧甲基纖維素、水性大豆多糖、古蘭糖膠、阿拉伯樹膠、黃原膠、角叉藻聚糖和瓜耳豆膠)。其他可摻入的物質的例子包括維生素類(如維生素A、B族維生素、維生素C和維生素E)；礦物質(如乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、泛酸鈣、鎂化合物和鋅化合物)；和植物提取物。
當將本發明中的多酚類物質添加到食品和飲料中時，多酚的總量隨食品和飲料的形態而異，優選在0.005-0.5％(重量百分比)。每日攝入這類食品和飲料的量折算成該多酚類物質應在5-500mg，優先選擇5-100mg。
用上述檢測條件(e)中的條件對純化的番石榴多酚進行層析分析，結果見圖4。從圖4可見，本發明純化的番石榴多酚在上述條件下用層析譜色層檢測表現為單一峰。實施例3α-澱粉酶抑制劑活性對實施例1和實施例2中得到的番石榴提取物和純化的番石榴多酚對α-澱粉酶活性的抑制作用進行了研究。
α-澱粉酶抑制活性用常規方法測定。具體的，將來自豬胰液α-澱粉酶與0.02M磷酸鈉緩衝液(pH6.5)混合製備澱粉酶溶液。用8％的可溶性澱粉和0.08M的磷酸鈉緩衝液(pH6.5)製備底物溶液。將酶、底物溶液和測試溶劑混合物37℃反應7分鐘，以酶、底物溶液和水的混合物為對照。加熱至100℃中止反應。用HPLC方法檢測形成的麥芽糖，以阿拉伯糖為內對照。用下面公式計算抑制劑活性。結果見表3。

表3測試樣品濃度(mg/ml)澱粉酶抑制程度(％)番石榴提取物 0.80 46純化的番石榴多酚 0.79 74如表3所示，本發明的純化番石榴多酚對澱粉酶的抑制作用比番石榴提取物高大約30％。實施例4α-葡萄糖苷酶抑制活性對實施例1和實施例2中得到的番石榴提取物和純化的番石榴多酚對麥芽糖酶(α-葡萄糖苷酶的一種)活性的抑制作用進行了研究。
麥芽糖酶抑制活性測定用常規方法。將大鼠腸丙酮粉末(SIGMA)於56mM順丁烯二酸緩衝液(pH6.0)中勻漿，其中順丁烯二酸緩衝液約為丙酮粉末的9倍，收集離心上清液得到麥芽糖酶粗製液。用224mM順丁烯二酸緩衝液(pH6.0)製備底物溶液，使麥芽糖終濃度為1％。將酶、底物溶液和測試溶液的混合物37℃反應5分鐘，以酶、底物溶液和水的混合物為對照。加熱至100℃中止反應。用HPLC方法檢測形成的葡萄糖的量，以阿拉伯糖為內對照。用下面公式計算抑制劑活性。結果見表4。 表4試驗樣品濃度(mg/ml) 澱粉酶抑制程度(％)番石榴提取物 1.5 78.0純化的番石榴多酚 1.5 84.9
重量份配方麵粉 52精製糖 3煉乳 4無鹽黃油 3蛋 3精鹽 1鮮酵母 1.5水 31.5番石榴多酚 1烤制後，本麵包具有草藥香氣和很好的味道，與市場上常見的麵包產品的口味相當。
工業實用性本發明α-澱粉酶抑制物與番石榴提取物相比具有較強的α-澱粉酶抑制活性，同時具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，將此多酚類物質加到食品和飲料中時，可賦予這些食品和飲料抑制血糖水平和抗肥胖症的作用。具體來說，將此多酚類物質加到富含澱粉的食物中，如調味粉(condiment flour)、麵條、麵包、甜點等食品中，可提供適合於高血糖和高血脂人群的減肥食品和飲料。
權利要求
1.一種α-澱粉酶活性抑制劑，其包含作為活性成分的多酚類物質，所述多酚是通過以下工藝獲得的用一或多種溶劑對番石榴葉子和/或果實進行提取；所用溶劑選自水和親水性溶劑；對所得提取物進行超濾以除去分子量小於5000的物質；將剩餘級分上樣於丁基支持物疏水層析柱，用0.02mol/L磷酸二氫鈉水溶液和0.02mol/L磷酸鈉水溶液組成的水性溶液在pH梯度下以1.0ml/分鐘的流速洗脫；回收洗脫的物質之級分，所述級分相應於260nm下檢測物質的光吸收時洗脫曲線的第三個單峰。
2.權利要求1中的α-澱粉酶活性抑制劑，其中多酚類物質具有以下理化性質(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000-100000；(c)在3,428cm-1，1,705cm-1，1,615cm-1和1,220cm-1處有強紅外吸收；(d)表現穩定的固態碳核磁共振光譜，與糖信號(76ppm附近)、芳香族化合物信號(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(168ppm附近)相吻合；(e)在下述條件下進行液相色譜約10分鐘後顯示單一峰柱填充物為硬質合成多聚反相分配膠，丁基以化學鍵與之結合(型號Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產品)，內徑4.6mm，長150mm，或類似於此柱的柱)流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測紫外光吸收儀(波長260nm)；流動相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數據進行梯度分析表1分析時間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4) 100 04(4到8) 65 358(8到12) 0 10012(12到20)100 0
3.一種α-澱粉酶活性抑制劑，其含有多酚為活性成分，所述多酚類物質具有以下理化性質(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000——100000；(c)在3,428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和1220cm-1處有強紅外吸收；(d)固態碳核磁共振光譜顯示與糖類信號(76ppm附近)、芳香族化合物信號(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(168ppm附近)相吻合；(e)在下述條件下進行液相色譜時10分鐘左右出現一單峰柱填充物為硬質合成多聚反相分配膠，丁基以化學鍵與之結合(型號Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產品)，內徑4.6mm，長150mm，或類似於此柱的柱)流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測紫外光吸收儀(波長260nm)；流動相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數據進行梯度分析表1分析時間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4)100 04(4到8)65 358(8到12) 0 10012(12到20) 100 0
4.權利要求1到3中任一項的α-澱粉酶活性抑制劑，其還具有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性。
5.含有權利要求1到4中任一項所述的α-澱粉酶活性抑制劑的食品和飲料。
6.權利要求1到3中任一項所述的多酚類物質在製備減肥食品和飲料中的應用。
7.一種減肥方法，包括攝入權利要求5中所述的食品和飲料。
全文摘要
一種含有多酚類物質作為活性成分的α－澱粉酶活性抑制劑，所述多酚類物質通過提取番石榴葉和/或果實獲得，以一種或多種選自水和親水性溶劑的溶劑提取，用超濾方法除去分子量小於5000組分，用疏水層析法對剩餘組分進行純化，層析柱中結合有丁基的裝柱材料作為固相，用0.02M磷酸二氫鈉水溶液和0.02M磷酸鈉水溶液組成的步進濃度梯度以1.0M/分鐘的流速洗脫，260nm下檢測光吸收，回收洗脫曲線第三個單峰的組分；一種以具有特定理化性質的多酚類物質作為活性成分的α－澱粉酶活性抑制劑；含有此多酚類物質的食品和飲料等。
文檔編號A61P3/10GK1416464SQ01806328
公開日2003年5月7日 申請日期2001年3月9日 優先權日2000年3月10日
發明者牧野孝, 相山律男, 出口順子, 綿貫雅章, 中澤真子, 水越晴美, 長岡正人, 原田勝壽, 長田邦子 申請人:株式會社益力多本社