用於製備治療性肽的方法

2023-10-05 00:32:39 1

專利名稱：用於製備治療性肽的方法
技術領域：
本發明屬於肽合成領域，涉及治療由人鬆弛素介導的疾病(例如血管收縮)，特別是涉及合成鬆弛素鏈B的方法以及其在治療由鬆弛素介導的疾病中的用途。
背景技術：
鬆弛素(RLX)是約6，000Da的低分子量蛋白，屬於胰島素-生長因子家族，在月經周期的黃體期和女性的整個妊娠期在血液中循環。鬆弛素也由男性的前列腺產生。RLX在大鼠中也是孕激素。在兩個物種中，循環水平源自黃體。鬆弛素由稱為A和B的兩條肽鏈組成，以與胰島素類似的方式這兩條肽鏈通過二硫鍵連接且A鏈中具有鏈內二硫化物環。 鬆弛素在妊娠期間於卵巢的黃體中合成，並且在分娩之前釋放到血流中。卵巢組織的可得性已經使得能夠從豬(James等人(1977)，Nature，267，554-546)、大鼠(John等人(1981) Endocrinology,108,726-729)和鯊魚(Schwabe 等人(1982)Ann. N. Y. Acad. Sci. ,380, 6-12)中分離鬆弛素和確定其胺基酸序列。3種不同的人鬆弛素基因已被鑑定，並被命名為Hl (Hudson等人(1983)Nature， 301,628-631)、H2 (Hudson 等人(1984) Embo. J，3，2333-2339)、和 H3 (R. A. Bathgate 等人· J. Biol. Chem. 277 (2002)，第1148-1157頁)。H2基因編碼的肽被稱為「鬆弛素」，因為它是人中的主要C存和循環形式(Winslow 等人(1992)Endrocrinology，130,2660-2668)。已累積的證據表明，鬆弛素不僅僅是妊娠激素，還作用於女性生殖系統細胞和組織之外的細胞和組織上(E. D. Lekgabe 等人，Endocrinologyl47 (2006)，第 5575-5583 頁； I. Mookerjee 等人，Endocrinology 147 (2006)，第 754-761 頁)。鬆弛素引起腎、盲腸繫膜、 肺和周圍血管系統中的血管拓寬(血管擴張)，這導致這些組織中血流或灌注的速率增加並且刺激心率和冠脈血流量的增加，並且增加腎小球濾過率和腎血漿流量(T. D. Hewitson 等人，Endocrinology 148(2007)，第 660-669 頁；Bani 等人(1997)Gen. Pharmacol.28， 13-2 。腦是鬆弛素的另一個靶組織，其中已顯示該肽在室周器中與受體結合(Osheroff 等人(1991)Proc. Nal.Acad. ki. U.S. A. 88,6413-6417 ； Tan 等人(1999) Br. J. Pharmacol 127,91-98)影響血壓和飲水(Parry 等人(1990) J Neurodendocrinol 2，53-58 ；Summerlee 等人(1998) Endocrinology 139，2322-2328 ;Sinnahay 等人(1999) Endocrinology 140， 5082-5086)。鬆弛素的重要臨床應用出現在對血管舒張有反應的各種疾病中，所述疾病例如冠狀動脈疾病、周圍血管疾病、與動脈粥樣硬化或其它腎毛細血管狹窄有關的腎臟疾病、或體內(例如在眼睛或周圍趾指、盲腸繫膜、肺和周圍脈管系統中)的其它毛細血管狹窄(C. S. Samuel 等人，Pharmacol. Ther. 112(2006)，第 5四_552 頁；S. Nistri 等人， Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5(2007)，第 101-108 頁；D.Bani 禾口 M. Bigazzi， Curr. Med. Chem. -IEMA 5(2005)，第 403-410 頁；T. Dschietzig 等人，Pharmacol. Ther. 112 (2006)，第 38-56 頁)。鑑於與高血壓性血管疾病相關的現有問題，很明顯在本領域需要治療高血壓性血管疾病的其他方法。本發明解決了這種需要，並且也提供了相關優點。
發明概述本申請提供合成用於治療由鬆弛素介導的疾病的人鬆弛素鏈B的方法。本申請特別公開了使用固液相(「雜合」)法合成人鬆弛素鏈B的方法。一般而言，該方法包括使用固相化學合成3種不同肽中間體片段。然後應用液相化學偶聯這些片段。一方面，本申請提供了用於製備鬆弛素鏈B肽的方法，所述方法包括以下步驟a)引入包括Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH(SEQ ID NO. 3)的胺基酸序列的肽片段，其中 Z是N端保護基；b)將步驟a)的肽片段在溶液中與HIer-OtBu偶聯以提供包括 Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu(SE Q ID NO. 4)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基；c)去除N端保護基以提供包括Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu (SEQ ID NO. 4)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是H;d)引入包括Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-OH(SEQ ID NO. 2)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Fmoc-;e)將步驟d)的肽片段在溶液中與步驟C)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Tr P-Ser-OtBu (SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Fmoc ；f)去除N端保護基以提供包括Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-C ys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu(SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列的肽片段，其中Z 是 H ；g)引入包括Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-IIe-Lys-Leu-Cys-Gly-OH(SEQ ID NO. 1)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Boc-;h)將步驟f)的肽片段在溶液中與步驟g)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu (SEQ ID N0. 6)的胺基酸序列的肽，其中Z是N端保護基Boc-;以及i)將由步驟h)得到的肽與酸接觸以便去除N端保護基，從而提供脫保護的鬆弛素 B 鏈胺基酸序列 Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-V al-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH(SEQ ID NO. 6)的胺基酸序列，其中Z是H。在本發明方法的優選實施方案中，肽包括側鏈保護基，優選選自OtButyl (OtBu)、 叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯胺(I^bf)和叔丁基氧基羰基 (Boc)。在本發明方法的優選實施方案中，步驟i)包括將胺基酸側鏈脫保護以提供脫保護的鬆弛素B鏈胺基酸序列SEQ ID N0. 6的步驟。在本發明方法的優選實施方案中，步驟a)的肽片段包括Z-Met-Ser (OtBu) -Thr (0 tBu)-Trp-OH(SEQ ID N0. 3)的胺基酸序列和側鏈保護基，其中Z是N端保護基Fmoc-。在本發明方法的優選實施方案中，步驟d)的肽片段包括Z-Arg (Pbf) -Glu (OtBu)-Leu-Val-Arg (Pbf)-Ala-Gln (Trt)-IIe-Ala-IIe-Cys CTrt)-Gly-OH(SEQ ID N0. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基。
在本發明方法的優選實施方案中，步驟g)的肽片段包括Z-Asp (OtBu)-SeHtBu) -Trp (Boc)-Met-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH(SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基。在第二方面，本申請提供了用於製備鬆弛素B鏈肽的方法，所述方法包括以下步驟a)引入包括 Fmoc-Arg (Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Ala-Gln (Trt) -Ile-Ala-Ile-Cys (Trt)-Gly-OH(SEQ ID NO. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是 N端保護基Fmoc-；b)弓丨入包括 H-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -OtBu (SEQ ID NO. 4)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段；c)將步驟a)的肽片段在溶液中與步驟b)的片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯， 以提供包括 Fmoc-Arg(Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg(Pbf) -Ala-Gln (Trt) -Ile-Ala-Ile-C ys (Trt) -Gly-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -OtBu (SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段；d)去除N端保護基以提供包括Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-G In (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu(S EQ ID NO. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是H;e)引入包括 Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Val -Ile-Lys (Boc)-Leu-Cys (Trt)-Gly-OH (SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是N端保護基Boc-;f)將步驟e)的肽片段在溶液中與步驟d)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Val-Ile-L ys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile -Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu(SEQ ID N0. 6) 的胺基酸序列的肽，其中Z是N端保護基Boc。在另一方面，本申請提供了具有 Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu )-Glu (OtBu) -Val-Ile-Lys (Boc) -Leu-Cys (Trt) -Gly-OH (SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Boc。在另一方面，本申請提供了具有Z-Arg(Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg(Pbf) -Ala -Gln (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys (Trt)-Gly-OH(SEQ. ID N0. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。在另一方面，本申請提供了具有 Z-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-OH (SEQ. ID N0. 3)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。在另一方面，本申請提供了具有 Z-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -Ot Bu (SEQ ID N0. 4)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。在另一方面，本申請提供了具有Z-Arg (Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Ala-Gin (Trt)-Ile-Ala-IIe-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr (OtBu)-Trp-Ser (OtBu)-OtBu ( SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。在另一方面，本申請提供了具有 Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg( Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(Ot Bu) -OtBu (SEQ. ID. NO. 6)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Boc 或 Fmoc。發明詳述本文描述的本發明實施方案並不意圖是窮舉性的或並不意圖將本發明限制在下面詳述中所公開的精確形式。相反地，這些實施方案被選擇並描述以使本領域技術人員可懂得和理解本發明的原理和實踐。本發明涉及合成鬆弛素鏈B肽的新方法。該鬆弛素鏈B肽具有下式(SEQ. ID NO. 6)H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg -Ala-Gln-Ile—Ala—IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH0定義本文中使用的術語「一 (a或an) 」實體是指一或多個該實體；例如，一個化合物是指一個或多個化合物或至少一個化合物。因此，術語「一個(a或an)」、「一個或多個」和「至少一個」在本文中可以互換使用。無論是在過渡性短語中還是在權利要求中，本說明書中使用的術語「含有」和「包括」應當理解為具有開放的意義。也就是說，該術語應當理解為與短語「具有至少」或「包括至少」相同的意義。當在方法中使用時，術語「包括」是指該方法包括至少所述的步驟，但也可以包括另外的步驟。當在化合物或組合物中使用時，術語「包括」是指化合物或組合物包括至少所述的特徵或組分，但是也可以包括另外的特徵或組分。除非另外特別說明，本文中使用的術語「或者」表示「和/或」的「涵蓋性」意義，而非「任一 /或」的「排他性」意義。本文中使用的術語「獨立地」是指變量適用於任何一種情況，而不考慮在相同化合物中具有相同或不同定義的變量存在與否。因此，在化合物中出現2次R並且R被定義為 「獨立地碳或氮」時，兩個R可以均為碳，兩個R可以均為氮，或一個R可以為碳而另一個為氮。當在描繪或描述化合物(本發明所使用或所要求保護的化合物)的任何部分 (moiety)或式中任何變量出現一次以上時，則該變量在每次出現時的定義均獨立於其在任何其它出現時的定義。此外，取代基和/或變量的組合是允許的。本文中使用的術語「任選的」或「任選地」是指隨後描述的事件或情況可以但是並非需要發生，該表述包括其中事件或情況發生的情形，也包括它不發生的情形。例如，「任選取代的」是指該任選取代的部分可以併入氫或者取代基。本文中使用的術語「大約」意指大概地、在某個範圍內、粗略地、或左右。當術語「大約」用於表述數值範圍時，它通過延伸邊界高於和低於所述數值而修飾該範圍。通常，術語 「大約」在本文中用於修飾數值高於和低於所述值20%的差異。本文中使用的術語「包括胺基酸序列」優選是指「具有胺基酸序列」。本文中使用的術語「鹼金屬滷化物」是指包含鹼金屬離子例如Li+或Cs+和滷離子例如F-、Cl-、Br-或I-的鹽。在優選的實施方案中，該鹼金屬滷化物是LiBr。
一般而言，用於產生肽的胺基酸可以是天然存在的胺基酸殘基、非天然胺基酸殘基、或其組合。20個常用天然胺基酸殘基如下A(Ala，丙氨酸)；R(Arg，精氨酸)；N(Asn， 天冬醯胺)；D (Asp，天冬氨酸)；C(Cys，半胱氨酸)；Q (Gln，穀氨醯胺)、E (Glu，穀氨酸)； G(Gly，甘氨酸)；H(His，組氨酸)；I (lie，異亮氨酸)；L(Leu，亮氨酸)；K(Lys，賴氨酸)； M(Met，甲硫氨酸)；F(Phe，苯丙氨酸)；P (Pro，脯氨酸)；S(kr，絲氨酸)；T(Thr，蘇氨酸)； 評(！^)，色氨酸)；Y(Tyr，酪氨酸)；和V (Val，纈氨酸)。保護基的性質和使用為本領域所熟知。一般而言，適合的保護基是能夠有助於防止與其連接的原子(通常為氧或氮)在加工和合成期間參與不希望的反應的任何類型的基團。保護基包括側鏈保護基和氨基-或N-端保護基。保護基還可防止羧酸、硫醇等的反應或鍵合。側鏈保護基是指與胺基酸的側鏈(胺基酸通式H2N-C (R) (H) -COOH中的R基團) 偶聯的化學部分，其幫助防止側鏈的部分與在肽合成、加工等步驟中所用的化學品反應。側鏈保護基的選擇可取決於多種因素，例如所實施的合成類型、待對肽進行的加工以及所需中間體產物或最終產物。側鏈保護基還取決於胺基酸自身的性質。一般而言，選擇在合成期間於α-氨基的脫保護過程中不被去除的側鏈保護基。因此，α-氨基保護基和側鏈保護基通常不相同。在某些情況下，並且取決於固相合成和其它肽加工中所用的試劑類型，胺基酸可能不需要側鏈保護基的存在。此類胺基酸通常在側鏈中不包括反應性氧或氮。側鏈保護基的實例包括乙醯基(Ac)、苯甲醯基(Bz)、叔丁基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氫吡喃基、苄基醚(Bzl)、2，6-二氯苄基(DCB)、叔丁氧羰基(BOC)、2，2，4，6，7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯胺(Pbf)、硝基、對甲苯磺醯基(Tos)、金剛烷基氧基羰基、咕噸基 (Xan)、苄基、甲基、乙基和叔丁基酯、苄基氧基羰基(Z)、2_氯苄基氧基羰基(2-C1-Z)、叔戊基氧基羰基(Aoc)和芳族或脂肪族氨基甲酸酯型保護基、對光不穩定的基團例如硝基藜蘆基氧基羰基(NVOC)和對氟化物不穩定的基團例如三甲基甲矽烷基乙基氧基羰基(TEOC)。例如，肽片段的胺基酸殘基的側鏈可用標準保護基例如OtButyl (OtBu)、叔丁基 (t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁基氧基羰基(Boc)保護。在本發明中，優選的側鏈保護基包括用於Asp、Glu和Thr的OtBu基團，用於kr的tBu基團和OtBu基團，用於Cys和Gln 的Trt基團，用於Arg的Pbf基團，和用於Trp和Lys的Boc基團。氨基端保護基包括與胺基酸的α氨基偶聯的化學部分。通常，在添加下一個待加入至正在生長的肽鏈上的胺基酸之前，於脫保護反應中去除氨基-端保護基，但是當將肽從支持物上斷裂下來時可以保持氨基-端保護基。氨基端保護基的選擇可取決於各種因素，例如所進行的合成的類型和所需的中間體產物或所得的最終產物。氨基端保護基的實例包括(1)醯基型保護基，例如甲醯基、丙烯醯基(Acr)、苯甲醯基(Bz)和乙醯基(Ac) ； (2)芳族氨基甲酸酯型保護基，例如苄基氧基羰基(Z)和取代的Ζ，例如對氯苄基氧基羰基、對硝基苄基氧基羰基、對溴苄基氧基羰基、對甲氧基苄基氧基羰基；(3)脂肪族氨基甲酸酯保護基，例如叔丁基氧基羰基(BOC)、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙基氧基羰基；(4)環烷基氨基甲酸酯型保護基，例如9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、環戊基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基和環己基氧基羰基；和(5) 硫代氨基甲酸酯型保護基，例如苯基硫代羰基。優選的保護基包括9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、2-(4-聯苯基)-丙基⑵氧基羰基(Bpoc)、2-苯基丙基氧基羰基(Poc)和叔丁基氧基羰基(Boc)。現在將更詳細地描述代表性工藝實施方案(其中使用SPPS技術製備肽)。可以根據本發明方法使用任何類型的適於實施SPPS的支持物。在優選的實施方案中，該支持物包括樹脂，其可由一種或多種聚合物、共聚物或聚合物的組合製成，所述聚合物例如聚醯胺、 聚磺醯胺、取代的聚乙烯類、聚乙二醇、酚醛樹脂、多糖類或聚苯乙烯。聚合物支持物也可以是任何具有足夠不溶性並且對肽合成中使用的溶劑是惰性的固體。固體支持物通常包括連接體部分，生長肽在合成過程中與其偶聯，所述連接體部分可以在需要的條件下斷裂以自支持物上釋放肽。適宜的固體支持物可包括如下連接體，該連接體是可光斷裂的、可TFA斷裂的、可HF斷裂的、可氟離子斷裂的、可還原性斷裂的、可Pd(O)斷裂的、可親核性斷裂的或可自由基斷裂的(radically-cleavable)。優選的連接體部分可以在能夠使得該斷裂的肽仍然基本上被側鏈保護基保護的條件下斷裂。優選的固體支持物包括酸敏感性固體支持物，例如羥甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物樹脂(「Wang」 樹月旨，參見 Wang, S. S. 1973，J. Am. Chem. Soc. ,95 :1328-33)、 2-氯代三苯甲基氯樹脂(參見 Barlos 等人.(1989) Tetrahedron Letters 30 (30) 3943-3946)和4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂(參見Richter等人.(1994)， Tetrahedron Letters 35(27) :4705-4706)以及官能化的、交聯的聚N-丙烯醯基吡咯烷酮樹脂、以及氯甲基聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物樹脂。這些類型的固體支持物可從例如 Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego, Calif 商購得到。當利用SPPS時，優選在利用本文所述的本發明方法之前，將合成的肽從固體支持物(例如樹脂)斷裂下來。通過SPPS技術合成的肽可使用本領域技術人員所熟知的技術斷裂。例如，可以使用DCM中的或2%三氟乙酸(TFA)溶液或DCM中的和2% TFA 溶液的組合來斷裂肽。可選地，可以使用乙酸(HOAC)斷裂肽。選用於斷裂的具體斷裂劑、 溶劑和時間將取決於所斷裂的特定肽。這些參數在相關領域的技能範圍內。用於生產和裝載可在SPPS中使用的樹脂的一般操作方案，記載於「固相肽合成的原理和實踐(Principles and Practice of Solid Phase Peptide Synthesis) 」(由 Greagory A. Grant編輯，1992，W. H. Freeman and Company)以及在其中的參考文獻中，並且為本領域普通技術人員所熟知。用於裝載Wang樹脂的具體操作記載於例如Sieber(1987) Tet. Lett. 28 :6147-50 禾口 Granadas 等人.(1989)，Int.J. Pept. Protein Res. 33 :386-90 中。如本文所述，Fmoc是某些實施方案中用於保護胺基酸的α _氨基部分的保護基。 取決於所裝載的胺基酸，以及其所連接至的肽片段中間體中的位點，可以對胺基酸側鏈進行保護或可以不進行保護。在一些實施方案中，本發明的肽片段中間體通過SSPS技術使用標準Fmoc方案合成。參見，例如，Carpin 等人.(1970)，J. Am. Chem. Soc. 92 (19) :5748-5749 ； Carp in 等人· (1972)，J. Org. Chem. 37 (22) :3404-3409, "Fmoc 固相肽合成(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Weng C. Chan 禾口 Peter D. White 編輯(2000)Oxford University Press, Oxford, Engo用於裝載樹脂以及肽合成的受Fmoc保護的胺基酸(按需，有或沒有側鏈保護基)可以從 Genzyme Pharmaceuticals Inc. , Cambridge, Mass. ；BachemBiosciences Inc. , Torrance, Calif. ；Senn Chemicals, Dielsdorf, Switzerland ； 和Orpegen Pharma, Heidelberg, Germany商購得到，或可以使用本領域熟知的材料和方法而容易地合成。作為上述操作的替代方案，可以購買樹脂，例如，預裝載有適當的Fmoc- α -N—保護的氛基酸的樹月旨(例如得自Bachem Biosciences Inc.或Senn Chemicals)。用溶劑例如NMP洗滌裝載後的樹脂。然後在溶脹溶劑中攪拌樹脂並氮氣鼓泡，以溶脹樹脂小珠。使用NMP中的哌啶將Fmoc基團從末端胺上去除。然後用NMP洗滌脫保護的樹脂以去除Fmoc副產物和殘餘哌啶。活化待偶聯的胺基酸殘基或片段的羧基端以用於反應，並且進行偶聯。對於肽片段中間體的隨後胺基酸殘基之每一個，重複該偶聯循環。在最終偶聯循環之後，用溶劑例如 NMP洗滌樹脂，然後用惰性第二溶劑例如DCM洗滌。經由SPPS技術合成的肽片段中間體可使用本領域技術人員所熟知的技術例如通過添加酸溶液(例如TFA的DCM溶液)從樹脂上斷裂。然後可分離該斷裂下來的肽中間體。本發明涉及使用固相和/或溶液相技術製備肽鬆弛素(RLX)鏈B的合成方法。本發明的肽分子可以是被保護的、未被保護的或部分保護的。保護可包括N-端保護、側鏈保護、和/或C-端保護。儘管本發明一般涉及鬆弛素鏈B、其對應物、片段和它們的對應物、以及融合產物和它們的對應物的合成，但是本文的本發明教導也可用於合成其它肽，特別是使用固相和溶液相方法的組合合成的那些肽。本發明也可用於合成摻有雜質、特別是焦穀氨酸雜質的肽中間體片段。用於實施本發明的優選的鬆弛素鏈B分子包括天然和非天然鬆弛素鏈B及其對應物。如本文所用，「對應物」是指肽的天然和非天然類似物、衍生物、融合化合物、鹽類等。如本文所用，肽類似物一般是指這樣的肽，該肽相對於另一肽或肽對應物具有例如通過一個或多個胺基酸取代、缺失、到位和/或添加而改變的胺基酸序列。取代可涉及一個或多個天然或非天然胺基酸。取代優選可以是保守的或高度保守的。保守取代是指一個胺基酸被另一個通常具有相同淨電荷並通常具有相同大小和形狀的胺基酸替代。例如，具有脂肪族或取代的脂肪族胺基酸側鏈的胺基酸，當其側鏈中的碳原子和雜原子的總數相差不超過約4個時，具有近似相同的大小。當其側鏈中的支鏈數目相差不超過約1個或2個時，它們具有近似相同的形狀。側鏈中帶有苯基或取代的苯基的胺基酸被認為具有近似相同的大小和形狀。下面列出了五組胺基酸。化合物中的胺基酸被來自相同組的另一胺基酸取代通常導致保守取代。I組甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和具有C1-C4脂肪族側鏈或C1-C4-基取代的脂肪族側鏈(直鏈或單支鏈的)的非天然
胺基酸。II組穀氨酸、天冬氨酸和具有羧酸取代WC1-C4脂肪族側鏈(不分支或一個分支點)的非天然胺基酸。III組賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸和具有胺或胍基取代的C1-C4脂肪族側鏈(不分支或一個分支點)的非天然胺基酸。IV組穀氨醯胺、天冬醯胺和具有醯胺取代的C1-C4脂肪族側鏈(不分支或一個分支點)的非天然胺基酸。
V組苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。「高度保守取代」是胺基酸被在側鏈中具有相同官能團並且具有幾乎相同大小和形狀的另一胺基酸替換。具有脂肪族或取代的脂肪族胺基酸側鏈的胺基酸，當其側鏈中的碳原子和雜原子的總數目相差不超過2個時，具有幾乎相同的大小。當它們在其側鏈中具有相同數量的支鏈時，它們具有幾乎相同的形狀。高度保守取代的實例包括纈氨酸取代亮氨酸，蘇氨酸取代絲氨酸，天冬氨酸取代穀氨酸，以及苯基甘氨酸取代苯丙氨酸。肽衍生物通常是指在其側基、α碳原子、末端氨基和/或末端羧酸基團中的一個或多個上具有化學修飾的肽、肽類似物或其它肽對應物。例如，化學修飾包括但不限於添加化學結構部分，建立新鍵和/或去除化學部分。在胺基酸側基處的修飾包括但不限於，賴氨酸e-氨基的醯化，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，穀氨酸或天冬氨酸羧酸基團的烷基化，以及穀氨醯胺或天冬醯胺的脫醯胺。末端氨基的修飾包括但不限於脫氨基、N-低級烷基、N-二低級烷基和N-醯基(例如-CO-低級烷基)修飾。末端羧基的修飾包括但不限於醯胺、低級烷基醯胺、二烷基醯胺和低級烷基酯修飾。因此，部分或完全保護的肽構成肽衍生物。在優選的實施方案中，本發明提供了用於合成具有下式(SEQ ID NO. 6)的鬆弛素鏈B肽的方法Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Ar g-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH,其中Z 是 H 或 N 端保護基 Boc-或 Fmoc-o在優選的實施方案中，(SEQ.ID NO. 6)具有下式H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu_Va I-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser -Thr-Trp-Ser-OH0本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括側鏈受保護的形式，例如具有下式(SEQ ID NO. 6)的肽=Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-A rg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu,其中 Z是H或N端保護基Boc-或Fmoc-；且所述序列的一個或多個殘基任選地包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 6)具有下式Boc_Asp (OtBu)-Ser (tBu)-Trp (B oc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(0t Bu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gin (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr( OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu。本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括其片段的側鏈受保護的形式，例如具有式(SEQ ID N0. 5)的肽Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys -Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu,其中Z是H或N端保護基Fmoc-；且所述序列的一個或多個殘基任選包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 5)具有下式H_Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val -Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-S er(OtBu)-OtBu。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 5)具有下式 fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gin (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu。本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括其片段的側鏈受保護的形式，例如具有式(SEQ ID NO. 4)的肽Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu，其中:Z 是 H 或 N 端保護基Fmoc-；且所述序列的一個或多個殘基任選包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID NO. 4)具有下式H-Met_Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Tr p-Ser(OtBu)-OtBu。在優選的實施方案中，(SEQ.ID NO. 4)具有下式Fmoc-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser(OtBu)-OtBu。本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括其片段的側鏈受保護的形式，例如具有式(SEQ ID NO. 3)的肽Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH，其中Z是H-或N端保護基 Fmoc ；且所述序列的一個或多個殘基任選包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 3)具有下式H-Met_Ser (OtBu)-Thr (OtBu)-Tr P-OH0在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 3)具有下式Fmoc-Met-Ser (OtBu)-Thr (OtBu) -Trp-OH0本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括其片段的側鏈受保護的形式，例如具有式(SEQ ID N0. 2)的肽Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys -Gly-OH，其中Z是H或N端保護基Fmoc-；且所述序列的一個或多個殘基任選包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 2)具有下式H_Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val -Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH。在優選的實施方案中，(SEQ.ID N0. 2)具有下式 fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gin (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-0H。本發明提供了改進方法學用於製備鬆弛素鏈B肽，包括側鏈受保護的形式，例如具有式(SEQ ID NO. 1)的肽Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-OH， 其中Z是H、N端保護基Boc-或Fmoc-；且所述序列的一個或多個殘基任選包括側鏈保護。在優選的實施方案中，(SEQ.ID NO. 1)具有下式Boc_Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (B oc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-0H。鹼金屬滷化物例如LiBr可以通過增加片段的溶解度而促進上述片段2與3』以及 1與2+3』的偶聯。在優選的實施方案中，在溶液相偶聯中使用LiBr以增加片段的溶解度。 濃度可以為約5 20當量LiBr 當量片段。舉例來說，

圖1示出了用於合成鬆弛素鏈B肽及其對應物的示例性方案。圖1被認為特別合適於鬆弛素鏈B肽的按比例放大規模的合成。通常進行放大規模的操作來提供用於商業流通的肽量。例如，放大操作中的肽量可為每批500g或1kg，更典型為每批數十kg 至數百kg或更多。在優選的實施方案中，本發明方法可提供例如減少加工(合成)時間、 提高產物收率、提高產物純度和/或減少所需試劑和原料的用量的改進。圖1所示的合成使用固相和溶液相技術的組合來製備肽產物。
實施例
實施例1合成鬆弛素鏈B 片段 2+3』 (H-AA (13-29)-OtBu)在25 °C 浴中、將鬆弛素鏈 B 片段 2 (Fmoc-AA(13-24) -QH) (10. 88g)和片段 3，(H-AA (25-29)-OtBu) (4. 44g)在500mL 3頸圓底燒瓶中混合。在攪拌下將LiBr (3. 5g)在 THF(120mL)和NMP (80mL)中的溶液裝入含有混合物的燒瓶中。將瓶溫從驟升至27°C。 攪拌10分鐘後，將HOBt水合物(0. 64g)和BOP(2. Og)加入至該溶液中，用THF(20mL)漂洗。然後，將DIEA(1.6mL)加入至反應混合物中。將反應在25°C浴中攪拌，並通過HPLC監控。過夜反應結束檢查顯示反應並不完全。進行兩次推進性加料(kicker charges)(首先， 0. 304g 片段 2/0. 099g BOP/O. 16mL DIEA，之後，0. 605g 片段 2/0. 20gB0P/0. 32mL DIEA)。 總共反應20小時後，結束偶聯。將哌啶(5. OmL)加入至反應混合物中。攪拌2小時後去除 Fmoc0然後在溫度驟升2. 5°C下將鹽酸吡啶(10. Olg)加入至反應混合物。攪拌35分鐘，然後在15°C水浴中將反應混合物在水(SOOmL)中淬滅。攪拌20分鐘後，過濾分離固體，用水洗滌OX IOOmL)，乾燥過夜，得到16. 37g固體。然後將分離的固體(15. 4g)在MTBE/正庚烷(50/50)的250mL混合物中於35°C、1. 5小時以及25°C 3小時重新成漿。然後過濾分離固體，用正庚烷OX20mL)洗滌，經周末乾燥，得到14. 66g固體產物，純度為48. 6% AN。收率104.4% (基於片段2)。實施例2合成鬆弛素鏈B 片段 1+2+3，(Boc-AA (1-29)-OtBu)在25 0C 浴中將鬆弛素鏈 B 片段 2+3，(H~AA (13~29)-QtBu) (13. 46g)和片段 IBoc-AA(1-12)-OH) (6. 07g)在500mL 3頸圓底燒瓶中混合。在攪拌下將LiBr(3. 5g)在 THF(120mL)和NMP(80mL)中的溶液裝入含有混合物的燒瓶中。將反應溫度驟升至^°C。 15分鐘攪拌後，將HOBt水合物(0.65g)、B0P(2.0g)和DIEA(1.6mL)加入至該溶液中，用 NMP (5mL)漂洗。將反應在25°C下攪拌，並通過HPLC監控。基於HPLC結果，進行兩次推進性加料(首先，1. 17g 片段 1/0. 44g BOP/O. 3mL DIEA/5mL THF漂洗，之後，1. 50g 片段 1/0. 43g BOP/O. 3mL DIEA/5mL THF漂洗)。過夜反應結束檢查顯示需要再一次推進性加料(0. 2g BOP/O. 2mL DIEA)。總共反應20小時後，結束偶聯。然後在10°C浴中將反應混合物在水 (SOOmL)中淬滅。在25°C攪拌60分鐘後，通過過濾分離固體，用水洗滌GX50mL)，乾燥過夜，得到20. 77g固體產物，純度為56. 4% AN。收率93. 2% (基於片段2+3，)。實施例3合成鬆弛素鏈B (H-AA (1-29)-0H)粗品在25 0C 浴中將鬆弛素鏈 B 片段 1+2+3，(Boc-AA (1~29)-QtBu) (20. 25g)在 DCM (80mL)中的漿液與含有TFA (293mL)、DTT (13g)和水(13mL)的脫保護混合物混合。 攪拌3小時後，將反應混合物冷卻至-5 °C，通過在15分鐘內向其加入冷(_20°C )的 MTBE(1200mL)淬滅，同時保持反應溫度< 18°C。將淬滅的反應混合物在15°C浴中攪拌45 分鐘。過濾固體產物，用MTBE洗滌(5 X 50mL)，在真空烘箱中乾燥過夜。獲得15. 68g鬆弛素鏈B粗品(21.8%wt/wt)，純度為19.4% AN。收率127. 4% (基於片段1+2+3，)。合成鬆弛素鏈B，H-AA (1-29) -OHH-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg -Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
實施例4合成鬆弛素鏈B 片段 1，Boc-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH在3-L燒結玻璃樹脂燒瓶中進行FmoC-AA(l-^)-0-2CT樹脂的固相合成。將裝載量為0. 43mmol/g的H-Gly-2-CT樹脂(100. OOg)裝入到樹脂燒瓶中，在環境溫度下於 DCM(IOOOmL)中溶脹30分鐘。排乾二氯甲烷(DCM)溶劑，用N-甲基_2_吡咯烷酮(NMP)洗滌樹脂(3 X IOOOmL)。通過用20 %哌啶/40 % NMP/40 % DMSO (v/v/v) (2 X IOOOmL)處理樹脂，進行樹脂的所有Fmoc脫保護。第二次哌啶/NMP/DMS0處理後，相繼用NMP (IOOOmL)、IPA O X IOOOmL)、 DCM(IOOOmL)、IPA(2 X IOOOmL)、NMP(IOOOmL)、IPA(2 X IOOOmL)禾Π 50 % ΝΜΡ/50 % DMSO(3XlOOOmL)洗滌樹脂。為了製備活性酯溶液，稱重胺基酸和6-氯-羥基苯並三唑水合物(6-C1H0BT)，溶解於NMP中，用二異丙基碳二亞胺(DIC)處理，用DMSO稀釋在燒瓶中。將所得溶液加入到樹脂燒瓶中，用DMSO漂洗製備燒瓶，轉移到樹脂燒瓶中，在環境溫度下與樹脂攪拌190-295 分鐘。對溴酚藍(BPB)試驗取樣以確認反應完全。偶聯反應結束後，排乾偶聯溶液，相繼用 NMP(IOOOmL)、IPA (2 X IOOOmL)和 50% NMP/50% DMSO (v/v) (2X1000mL)洗滌樹脂。對於片段中的剩餘胺基酸，重複去除Fmoc基團和偶聯下一個胺基酸的順序(即， 以 Cys (Trt) — Leu — Lys (Boc) — Ile — Val — Glu (OtBu) — Glu (OtBu) — Met — Trp (Boc) — Ser (tBu) — Boc-Asp (OtBu)的順序)。通過於環境溫度下將樹脂在50 % TFE (三氟乙醇)/50 % DCM(v/v) (IOOOmL) 中攪拌15. 5小時，將完全構建的肽從樹脂上斷裂下來。排乾斷裂溶液，將樹脂用 DCM(6X IOOOmL)洗滌。於20°C _25°C在真空下從合併的濾液去除溶劑，得到98. 4%收率的鏈B片段1(純度為78.8%，AN)。此實施例中所用的所有試劑量在下表中列出
材料tt酸 (g)/Eq6-C1HOBT (g)/EqNMP (mL)DIC (mL)/EqDMSO (mL)哌啶 (mL)偶聯時間 (min)Fmoc-Cys (Trt)-OH50.37/2.0021.88/3.0050020.0/3.00500400197Fmoc-Leu -OH30.39/2.0021.88/3.0050020.0/3.00500400229Fmoc-Lys (Boc)-OH40.29/2.0021.88/3.0050020.0/3.00500400295Fmoc-Ilc-OH30.39/2.0021.88/3.0050020.0/3.00500400197Fmoc-Val-OH29.19/2.0021.88/3.0050020.0/3.0050040023權利要求
1.用於製備鬆弛素鏈B肽的方法，所述方法包括以下步驟a)引入包括Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH(SEQID NO. 3)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基；b)將步驟a)的肽片段在溶液中與HIer-OtBu偶聯以提供包括 Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu (SEQ ID NO. 4)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基；和c)去除N端保護基以提供包括Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu(SEQ ID NO. 4)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是H;d)引入包括Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-OH(SEQ ID NO. 2)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Fmoc-;e)將步驟d)的肽片段在溶液中與步驟c)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Arg-Glu-Leu-Val-Aal-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser -OtBu (SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Fmoc ；f)去除N端保護基以提供包括 Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-G Iy-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu(SEQ ID N0. 5)的胺基酸序列的肽片段，其中Z 是 H ；g)引入包括Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-IIe-Lys-Leu-Cys-Gly-OH(SEQ ID NO. 1)的胺基酸序列的肽片段，其中Z是N端保護基Boc-;h)將步驟f)的肽片段在溶液中與步驟g)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg -Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu (SEQ ID N0. 6)的胺基酸序列的肽，其中Z是N端保護基Boc-;i)將由步驟h)得到的肽與酸接觸以去除N端保護基，從而提供脫保護的鬆弛素鏈B胺基酸序列 Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg -Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH(SEQ ID N0. 6)，其中Z 是 H。
2.權利要求1的方法，其中肽包括側鏈保護基，優選選自OtButyl(OtBu)、叔丁基 (t-Bu)、三苯甲基(trt)、五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯胺(I^bf)和叔丁基氧基羰基(Boc)。
3.權利要求1或2的方法，其中所述步驟a)的肽片段包括Z-Met-Ser(OtBu) -Thr (OtB u)-Trp-OH(SEQ ID N0. 3)的胺基酸序列和側鏈保護基，其中Z是N端保護基Fmoc-。
4.權利要求1-3的方法，其中所述步驟d)的肽包括Z-Arg(I^bf)-Glu (OtBu)-Leu-Val -Arg (Pbf)-Ala-Gln (Trt)-IIe-Ala-IIe-Cys CTrt)-Gly-OH (SEQ ID N0. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基。
5.權利要求1-4的方法，其中所述步驟g)的肽包括Z-Asp(OtBu)-Ser (tBu)-Trp (Boc )-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys CTrt)-Gly-OH(SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基。
6.權利要求2-5的方法，其中步驟i)包括將胺基酸側鏈脫保護以提供脫保護的鬆弛素鏈B胺基酸序列SEQ ID N0. 6的步驟。
7.用於製備鬆弛素鏈B肽的方法，所述方法包括以下步驟a)弓丨入包括 Fmoc-Arg (Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Ala-Gln (Trt) -Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-0H(SEQ ID NO. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是N端保護基Fmoc-；b)引入包括H-Met-Ser (OtBu)-Thr (OtBu)-Trp-Ser (OtBu)-OtBu (SEQ ID NO. 4)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段；c)將步驟a)的肽片段在溶液中與步驟b)的片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Fmoc-Arg (Pbf) -Glu (OtBu) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Ala-Gln (Trt) -Ile-Ala-Ile-Cys (T rt)-Gly-Met-Ser (OtBu)-Thr (OtBu)-Trp-Ser (OtBu)-OtBu (SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段；d)去除N 端保護基以提供包括 Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln (Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu(SEQ ID NO. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是H;e)弓丨入包括Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Val-Ile-Lys (Boc) -Leu-Cys (Trt) -Gly-OH (SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽片段，其中Z是N端保護基Boc-;f)將步驟e)的肽片段在溶液中與步驟d)的肽片段在鹼金屬滷化物的存在下偶聯，以提供包括 Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Val-Ile-Lys (Boc )-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-I Ie-Cys (Trt) -Gly-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -OtBu (SE Q ID NO. 6)的胺基酸序列的肽，其中Z是N端保護基Boc。
8.具有Z-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Trp (Boc) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Val-Ile-Lys ( Boc)-Leu-Cys (Trt)-Gly-OH(SEQ. ID NO. 1)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H 或N端保護基Boc。
9.具有Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys (Trt)-Gly-OH(SEQ. ID N0. 2)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基 Fmoc ο
10.具有Z-Met-Ser (OtBu)-Thr (OtBu)-Trp-OH(SE Q. ID N0. 3)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。
11.具有Z-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -OtBu (SEQ ID N0. 4)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。
12.具有Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cy s (Trt) -Gly-Met-Ser (OtBu) -Thr (OtBu) -Trp-Ser (OtBu) -OtBu (SEQ ID N0. 5)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Fmoc。
13.具有Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys (Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-A Ia-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser (OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu(SEQ. ID N0. 6)的胺基酸序列和側鏈保護基的肽，其中Z是H或N端保護基Boc或Fmoc。
14.基本上如前文所述的方法和肽以及此類肽的用途。
全文摘要
本發明公開用於合成治療由鬆弛素介導的疾病的人鬆弛素鏈B的方法。本發明特別公開使用固相和溶液相(「雜合」)法合成人鬆弛素鏈B的方法。一般地，該方法包括使用固相化學合成3種不同肽中間體片段。然後利用液相化學偶聯這些片段。
文檔編號C07K14/435GK102239176SQ200980148207
公開日2011年11月9日 申請日期2009年11月24日 優先權日2008年12月3日
發明者L·陳 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司