一種象耳豆根結線蟲lamp快速檢測方法及應用的製作方法

2023-10-05 02:22:54

專利名稱：一種象耳豆根結線蟲lamp快速檢測方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測方法及應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne spp.)屬植物根系專性內寄生物，是世界性分布的威脅農業生產的主要病原物和世界各國的植物檢疫對象。迄今已記載的根結線蟲有70餘種，其中南方根結線蟲(M. incognita)、爪哇根結線蟲(M. javanica)和花生根結線蟲(M. arenaria) 因其廣分布性和多寄主性是最重要的種類。在我國，這三種根結線蟲在大多數省(區)均有發生，侵染農作物達百種以上，致使寄主常年減產15 25%，有時達70%以上(徐建華等.1994)，嚴重地制約了大棚蔬菜、 果樹、花卉等作物的生產和出口創匯。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數億元以上。據調查研究，我國分布最廣泛、最常見的根結線蟲與世界各地類似，包括南方根結線蟲(M. incognita)、爪哇根結線蟲(M. javanica)、花生根結線蟲(M. arenaria)和北方根結線蟲(M. hap la) 0近年來，另一種根結線蟲-象耳豆根結線蟲(M. enterolobii)越來越受到人們的重視。該線蟲是1983年在我國海南省儋州市象耳豆樹上發現的一個新種。根結線蟲的傳統鑑定方法主要根據形態學，主要是根據會陰花紋進行鑑定，但由於不同地理種群之間存在較大的變異性導致有時結果不夠準確。象耳豆根結線虫部分會陰花紋形態與南方根結線蟲會陰花紋形態相似，僅根據該特徵，有可能將象耳豆根結線蟲誤診。同時形態特徵細微複雜，對專業知識要求高，鑑定過程耗時、費力，且需要大量線蟲樣本，單頭線蟲不能鑑定到種。後來發展的同工酶技術雖然能快速準確的鑑定不同的根結線蟲種類，它同樣需要有大量的雌蟲，因而不適用於多數情況下幼蟲和卵的檢測。由於形態學和同工酶技術的局限性，上世紀90年代起開始了根結線蟲分子鑑定的研究。目前針對根結線蟲的PCR診斷法主要基於核糖體DNA(rDNA)的ITS和IGS序列的 rDNA-PCR 法，基於 mtDNA 的 mtDNA-PCR-RFLP 法和基於 SCAR 的 SCAR-PCR 法。真核生物的rDNA在基因組內是以串聯重複序列的形式出現，每一串聯重複序列包括 3 個編碼區(18SrRNA，5. 8SRNAJ8SRNA)和兩個 ITSanternal Transcribed Spacers) 區，兩個串聯重複序列之間各一段IGSantergenetic Spaces)區。ITS是由Gonzalez在 1990年提出隨後發展起來的全新分子標記，其優點在於拷貝數多，同時包含保守和變異序列，根據保守序列中的變異位點設計特殊引物進行特異性擴增。Zijlstra 等(Zijlstra C. , Α. Ε. M. lever, B. J. Uenk, and C. H. Van Silfhout. Differences betweenlTS regions of islatoes of root-knot nematodes Meloidogyne hapla and M. chitwoodi[J], Phytopatholgy,1995,85 :1260 1268 ；Zijlstra Carolien. , A fast PCR assay to identifyMeloidogyne hapla, M. chitwoodi, and M. fallax, and to sensitively differentiate them from eachother and from M. incognita in mixtures[J]. Fundam. appl. Nematol.,1997,20 (5),505 ~ 511.)分析了 M. hapla, M. chitwoodi 和 M. fallax ITS 區的差異進行了 ITS-PCR-RFLP 分析，發現用Aui I、DraI, HinfI可將二者分開，並且還能將二者與M. incognita和M. javanica 分開。Pertersen 等(Petersen, D. J. , Zi jlstra, C. , ffishart, J. , Blok, V. &Vrain, Τ.C. (1997). Specific probes efficientlydistinguish root-knot nematode species using signature sequence in the ribosomal intergeneticspacer. Fundamental and Applied Nematology 20，619-626.)根據 IGS 區的差異，設計了 5 條 PCR 引物，應用multiplex-PCR同時實現了對Μ. chitwoodi、Μ. fallax和Μ. hapla的鑑定，其靈敏度 ^IgU^J^TfC。 M胃 Powers · (Powers， T， 0. and C. Fleming 1998. Biochemical andmolecular characterization. In Perry, R. N. and D.J. Wright(edts)Free-living and Plant-parasiticnematodes. CABI Publishing 1998. Pp355-380)發現 M. incognita、 M. javanica和Μ. arenaria ITS序列一致，Hugall等(1999)通過序列分析發現3種多倍體的主要根結線蟲(M. incognita,M. javanica和Μ. arenaria) ITS區遺傳變異較大，因此基於 rDNA的鑑別方法無法有效區分主要根結線蟲種群。隨機擴增的 DNA 多態性技術(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)是依賴一系列不同的隨機排列的寡核苷酸作為引物，對所研究的基因組DNA進行擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，經EB染色檢測擴增產物的多態性。Wiliamson等 (Williamson, V. Μ, Caswell-Chen, Ε. P.，B. B. Westerdahl, F. F. &G. Caryl. 1997. A PCR Assay to identify and distinguish singlejuveniles of Meloidogyne hapla and M. chitwoodi. Journal ofNematology, 29(1) :9-15.)通過對 Μ· chitwoodi 禾口 Μ· hapla 基因組DNA的RAPD分析，篩選出具有Μ. hapla種鑑定特徵的特異性片段，經克隆測序後，設計了一對特異性引物，準確鑑定了 M. hapla ；Zijlstra等(Zijlstra, C.，2000. Identificationof Meloidogyne chitwoodi,M. fallax and Μ. hapla based on SCAR-PCR a powerful way of enabling reliableidentification of populations orindividuals that share common traits. European Journal of Plant Pathology 106 :283-290.)
據 Μ· incognita、Μ. javanica 和 Μ· arenaria 3 種根結線蟲的 RAPD 標記，設計了 3 對 SCAR 引物，快速、準確的鑑定了這3種根結線蟲。以PCR為基礎的分子鑑定方法一定程度上克服了傳統形態鑑定上的缺陷。但PCR 檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(紫外儀)等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以檢測，需要較長的時間，限制了 PCR檢測方法在生產中的推廣應用。循環恆溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本學者Notomi (2000年)等人開發的一種新型循環恆溫核酸擴增技術。反應採用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase), 在等溫條件下。C (左右)可以高效(30min Ih)和特異的擴增目標DNA。在LAMP反應過程中，從dNIPs中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子結合，能產生焦磷酸鎂沉澱物，出現渾濁沉澱，因此用肉眼就判定擴增結果，也可通過向其擴增產物中添加螢光染料通過變化來判定結果，也可通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察可以看到梯形條帶，尤其適宜於基層的簡潔快速檢測。LAMP反應具有簡單、快速、高效、經濟等特徵。因而具有極為廣泛的應用前景
目前，LAMP在動物疫病和食品安全方面廣泛應用，國內最早報導是在2002年北京奶牛中心運用引進的LAMP法進行胚胎性別的檢測。2009年日本Kikuchi開發出松材線蟲 LAMP快速檢測體系，能在1小時內檢測到松材線蟲。但在象爾豆根結線蟲上的尚無相關報導。本發明第一次採用LAMP技術檢測象耳豆根結線蟲。

發明內容
本發明的目的是建立循環恆溫擴增技術(LAMP)檢測象耳豆根結線蟲的LAMP快速檢測方法。同時提供該檢測方法所用的試劑盒。一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測方法，其特徵在於其中LAMP反應體系所使用的引物是①MEF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，，②MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，，③MEFIP 5 』 -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 』，④MEBIP 5，-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3，， MELB 5 』 -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3 』。
其中的LAMP反應體系包括1)引物混合液夕卜弓I物MEF3禾口 MEB3各0. 2ymol/L，內引物MEFIP和MEBIP各 1. 6 μ mol/L,環引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L ；2)反應混合液10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl, 5mmol/L MgSO4, IOmmo 1/L (NH4) 2SO4,0. 1% Triton x-100，0. lmol/L 甜菜鹼，8U Bst DNA 聚合酶大片段，3) 1 μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ 1。其中LAMP反應條件如下將引物混合液和反應混合液混合均勻後加入1 μ 1 DNA 模板，61 65°C保溫 30 90min，82°C保溫 lOmin。其中LAMP反應的最終產物中加入有顯色劑，輕甩離心管觀察。所述顯色劑為STOR green I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1 9。所述DNA模板的提取方法為挑取單頭象耳豆根結線蟲放入裝有10 μ IddH2O的 0. 2mL離心管中，加入8 μ 1的LB溶液，2 μ 1的20mg/ml蛋白酶K溶液，點動離心後，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化後放入液氮中，重複6 7次，然後在-80°C下冷凍 30min ；然後將離心管在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於 LAMP 和 PCR 反應，所述 LB 溶液為 500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/ LMgCl2,1. Ommo 1/L DTT，4. 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測試劑盒，包括反應混合液和引物混合液，所述引物混合液為外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內引物MEFIP和BIP各1. 6 μ mol/L, 環引物 MELB 為 0.4ymol/L，所述反應混合液為 10mmol/L dNTP, 20mmo 1/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04,0. 1 % Triton x-100,0. lmol/L betaine，和單獨包裝的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分別為
① MEF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，，②MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，，③MEFIP 5 』 -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 』，④MEBIP 5 』 -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3 』， MELB 5 』 -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3 』。所述試劑盒還包括顯色劑，所述顯色劑為STOR green I與PCR級DMSO的混合物， 其體積比為1 9。所述試劑盒還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括1)8μ 1的LB(Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4. 5% Tween20，等體積混勻，2)2μ 1的蛋白酶K :20mg/ml蛋白酶K。上述任一檢測方法或上述任一試劑盒在診斷植物、土壤的象耳豆根結線蟲感染情況或鑑別象耳豆根結線蟲中的應用。本發明利用循環恆溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立針對象耳豆根結線蟲的檢測方法。本方法具有多條引物的擴增，並在兩端形成了帶有引物功能的環狀結構，這種多引物結合和可自產生引物的原理使其具有了靈敏度高、 特異性強等特點，由於LAMP反應操作步驟簡單及反應產物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉澱，螢光劑顯色後可以用肉眼觀察判定反應結果，適用於各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。本發明的方案具體實施步驟如下1.線蟲DNA提取試劑配製1)LB(Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2, 1. 0mmol/LDTT,4. 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。2)蛋白酶 K 20mg/ml 蛋白酶 K。2. DNA 的提取挑取單頭根結線蟲放入裝有10 μ IddH2O的0.2ml離心管中，加入8 μ 1的LB (lysis buffer)溶液，2 μ 1蛋白酶K溶液，點動離心後，放入液氮中，再放入3°C水浴鍋中，待融後放入液氮中，重複6 7次，然後在_8°C下冷凍30min。然後將離心管取出，在6°C下溫育 90min, °C 9反應IOmin處理後作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應。3.象耳豆根結線蟲rDNA-ITS擴增及序列分析採用ITS 區的通用引物 rDNAl (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3，)和 rDNA2(5，-T TTCACTCGCCGTTACTAAGG-3』 )擴增兩種象耳豆根結線蟲種群ITS區片段。PCR擴增反應體系為 50 μ 1，PCR 反應體系為 10XBuffer (含 Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP 4 μ 1，弓丨物 rDNAl 禾口 rDNA2 (10 μ mol/L)各 1 μ 1，Taq 酶(5U/ μ 1，Takara) 0· 5 μ 1，模板 DNA 5 μ 1，滅菌 ddH20 補足至50 μ 1。PCR擴增條件為V 9預變性5min, V 5退火30sec，72°C延伸Imin ；9°C變性 45sec，"C 5退火30sec，7°C延伸lmin，;35個循環；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增後，取5 μ 1擴增產物加1 μ 1加樣緩衝液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相回收、克隆和測序如SEQ ID Ν01，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。4.象耳豆根結線蟲LAMP引物設計根據象耳豆根結線蟲ITS測序結果為模板，設計以下5條引物，序列如下
① MEF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，
② MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，③MEFIP 5 』 -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 』④MEBIP 5 』 -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3 』(5) MELB :5，-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3』5. LAMP反應體系配置外引物MEF3和MEB3各0. 2ymol/L,內引物MEFIP和BIP 各 1.6ymol/L，環引物 MELB 為 0. 4ymol/L，10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， 10mmol/LKCl,5mmol/L MgSO4,10mmol/L(NH4)2S04,0. 1% Triton x-100,0. lmol/L betaine, 8U BstDNA聚合酶大片段，1 μ 1 DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ 1。6LAMP反應擴增條件將以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反應管中混合後，置於95°C反應5min，然後冰浴;3min，加入1μ 1的Bst DNA聚合酶，然後置於65°C恆溫水浴中等溫擴增60min，再82°C保溫5min，反應結束後加入2 μ 1配製好的顯色劑混勻後觀察結果。7LAMP結果檢測結果可以採用以下三種檢測方法1)將上述反應完的體系中加入2μ1的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；幻取2 μ 1擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；3)將反應後的離心管3000rpm離心30sec，陽性的管底可觀察到白色沉澱。本發明所提供的象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測方法具有以下優點一、靈敏度高，對象耳豆根結線蟲的檢測極限可達到1/200000條幼蟲水平，比常規PCR檢測象耳豆根結線蟲的檢測靈敏度高100倍。二、特異性強，所用的特異引物根據象耳豆根結線蟲的ITS六個不同區域設計出5 條引物，特異性比常規PCR要強。三、檢測時間短，1小時左右可獲得檢測結果，比常規PCR檢測縮短2 4h。四、不需要PCR儀，對儀器設備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統， 只需要一個水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測。五、操作簡單、結果明顯，整個檢測過程不涉及複雜儀器和設備，一般技術人員即可完成檢測，結果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。六、對人和環境友好，檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環境非常安全。綜上所述，本發明具有比現有PCR技術檢測象耳豆根結線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產中現場應用檢測。該技術可應用於對象耳豆根結線蟲田間土壤樣品及植物上象耳豆根結線蟲病發生的早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。


圖1為象耳豆根結線蟲ITS序列的LAMP引物設計示意圖，圖2為象耳豆根結線蟲LAMP方法檢測A為加螢光染料檢測結果，1 陽性結果，具有綠色螢光，2 陰性對照，為深褐色。B檢測結果為電泳圖，M :D2000DNA標準分子量(Takara) 1 陽性結果，為LAMP擴增梯形條帶，2 陰性對照，無擴增產物。圖3為象耳豆根結線蟲LAMP檢測方法對不同地理種群的檢測結果圖，A為加螢光染料檢測結果，1 =MEXED, 2 =MEDT, 3 陰性對照。B 為電泳檢測結果，M :D2000DNA 標準分子量(Takara)，1 =MEXED, 2 =MEDT, 3 陰性對照，圖4為象耳豆根結線蟲LAMP檢測方法特異性檢測結果圖A為LAMP加螢光染料檢測結果圖，1 13分別為MEXED、MIDX、MHYJ、MJYN、MAYN、 RSAM、、PLD、GS-14、GS-11、DdCL、BD 和陰性對照。B為LAMP檢測結果電泳圖，M :D2000DNA標準分子量(Takara)，1 13分別為 MEXED, MIDX、MHYJ, MJYN、MAYN、RSAM、、PLD、GS-14、GS-IUDdCL, BD 和陰性對照。圖5為象耳豆根結線蟲靈敏度檢測結果A為LAMP加螢光染料檢測結果圖，1 7分別為單頭線蟲，10—1、10_2、10_3、10_4、 10_5和陰性對照。B為LAMP檢測結果電泳圖，M :D2000DNA標準分子量(Takara)，1 7分別為單頭線蟲，10—1、10_2、10_3、10_4、10_5 和陰性對照。C為普通PCR法檢測結果電泳圖，M :D2000DNA標準分子量(Takara)，1 7分別為單頭線蟲，10人10_2、10_3、10_4、10_5、陰性對照。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。所述試劑均為市售，所用根結線蟲本申請人實驗室均有保存，可以免費向公眾發放。實驗材料共收集2個象耳豆根結線蟲種群(DT和XED)(見表1)。表1供試象耳豆根結線蟲種群及其來源
樣品代號 Code群體種類 Species採樣地點 Originof population寄主植物 Hosts樣品來源 ProviderMEDTMeloidogyne enterolobii海南Hainan象耳豆本實驗室採集MEXEDMeloidogyne enterolobii海南Hainan光棍樹本實驗室採集主要試劑Taq DNA聚合酶購自天根公司；DNAmarker購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；pGEM-T Easy Vector購於美國promega Pro K(蛋白酶K) 購自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購自New England Biolabs公司；SYBR green I購自 Invitrogen 公司。實施例1象耳豆根結線蟲DNA的提取、rDNA-ITS擴增及序列分析1. 1象耳豆根結線蟲DNA的提取挑取單頭根結線蟲放入裝有10 μ IddH2O的0.2ml離心管中，加入8 μ 1的LB (lysis buffer)溶液，2 μ 1蛋白酶K溶液，點動離心後，放入液氮中，再放入3°C水浴鍋中，待融後放入液氮中，重複6 7次，然後在_8°C下冷凍30min。然後將離心管取出，在6°C下溫育 90min, °C 9反應IOmin處理後作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應。1. 2象耳豆根結線蟲rDNA-ITS擴增及序列分析利用ITS 區的通用弓丨物 rDNAl (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3，)和 rDNA2 (5，-T TTCACTCGCCGTTACTAAGG-3』 )擴增兩種象耳豆根結線蟲種群ITS區片段。PCR擴增反應體系為 50 μ 1，PCR 反應體系為 10XBuffer (含 Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP 4 μ 1，弓丨物 rDNAl 禾口 rDNA2 (10 μ mol/L)各 1 μ 1，Taq 酶(5U/ μ 1，Takara) 0· 5 μ 1，模板 DNA 5 μ 1，滅菌 ddH20 補足至50 μ 1。PCR擴增條件為V 9預變性5min，V 5退火30sec，7°C延伸Imin ；9°C變性 45sec，"C 5退火30sec，7°C延伸lmin，;35個循環；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增後，取5 μ 1擴增產物加1 μ 1加樣緩衝液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相回收、克隆和測序如SEQ ID NOl所示，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。實施例2LAMP技術檢測象耳豆根結線蟲方法的建立2. ILAMP 引物設計根據象耳豆根結線蟲ITS序列測序結果，設計並篩選下述LAMP引物，引物交上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下①MF3 5 』 -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3 』②MB3 5 』 -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3 』③MFIP 5，-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTT-AAGACT-3，④MBIP 5，-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3，(5) MELB :5，-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3』2. 2LAMP反應體系配置弓I物混合液外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內引物MEFIP和MEBIP各 1. 6ymol/L，環引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L,反應混合液10mmol/LdNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),10mmol/L KCl, 5mmol/LMgSO4, IOmmol/L(NH4)2SO4jO. 1% Triton χ-100,0. lmol/L betaine，8U Bst DNA 聚合酶大片段，1 μ 1 DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ 1。2. 3LAMP反應擴增條件將以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反應管中混合後，置於95°C反應5min，然後冰浴;3min，加入1μ 1的Bst DNA聚合酶，然後置於65°C恆溫水浴中等溫擴增60min，再82°C保溫5min，反應結束後加入2 μ 1配製好的顯色劑混勻後觀察結果(如圖2中的A所示)。取2 μ 1產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相(如圖2中的B所示)，可看到有LAMP的特徵性梯形帶。實施例3LAMP法檢測不同地理種群象耳豆根結線蟲將本實驗室採集的兩種象耳豆根結線蟲進行LAMP檢測，將上述的引物混合液和反應混合液混合均勻後，加入1 μ 1模板DNA，按2. 3的反應條件進行，反應結束後加入2 μ 1 配製好的顯色劑混勻後，觀察顏色變化(如圖3中的A所示)，加有象耳豆根結線蟲DNA的管中能看到綠色螢光，陰性對照則為紅褐色。取2 μ 1產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測並照相(如圖3中的B所示)，可看到1 2泳道有LAMP的特徵性梯形帶，陰性對照沒有發現有擴增產物。
實施例4象耳豆根結線蟲LAMP特異性檢測收集南方根結線蟲、北方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、香蕉穿孔線蟲、 短體線蟲、甘薯莖線蟲、大豆孢囊線蟲、禾穀孢囊線蟲、豆傘滑刃線蟲(見表2)，分別提取其 DNA作為模板與象耳豆根結線蟲DNA模板一起進行LAMP檢測，以檢測象耳豆根結線蟲LAMP 檢測方法的特異性。表2供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源
權利要求
1.一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測方法，其特徵在於其中LAMP反應體系所使用的引物是①MEF3 :5』 -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3』，②MEB3 :5』 -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3』，③MEFIP :5』 -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3』，@ MEBIP :5』 -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3』，(5)MELB :5』 -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3』
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於其中的LAMP反應體系包括1)引物混合液外引物MEF3和MEB3各0.2 μ mol/L,內引物MEFIP和MEBIP各 1. 6ymol/L，環引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L ；2)反應混合液1Ommol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4,10mmol/L (NH4)2SO4jO. 1% Triton χ-100，0. lmol/L 甜菜鹼，8U Bst DNA 聚合酶大片段；3)1 μ 1 DNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ 1。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其中LAMP反應條件如下將引物混合液和反應混合液混合均勻後加入1 μ 1 DNA模板後，61 65°C溫育30 90min，82°C保溫lOmin。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其中LAMP反應的最終產物中加入有顯色劑，輕甩離心管觀察即可。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述顯色劑為STORgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1 9。
6.根據權利要求3所述的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為挑取單頭象耳豆根結線蟲放入裝有 ομ 1 ddH20的0. 2mL離心管中，加入8μ 1的LB溶液，2μ 1的20mg/ml蛋白酶K溶液，點動離心後，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化後放入液氮中，重複6 7次，然後在-80°C下冷凍30min。然後將離心管在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理後上清液作為線蟲DNA模板直接用於LAMP和PCR反應，所述LB溶液為500mmol/L KCl， IOmmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT，4· 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。
7.一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測試劑盒，包括反應混合液和引物混合液，所述引物混合液為外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內引物MEFIP和BIP各1. 6 μ mol/L,環引物 MELB 為 0.4 μ mol/L，所述反應混合液為 10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04,0. 1% Triton χ-100,0. lmol/L betaine 和單獨包裝的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分別為①MEF3 :5』 -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3』，②MEB3 :5』 -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3』，③MEFIP :5』 -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3』，@ MEBIP :5』 -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3』，(5) MELB :5』 -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3，。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，還包括顯色劑，所述顯色劑為STORgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1 9。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括 1)LB 溶液500mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4. 5% Tween20,等體積混勻，2) 20mg/ml蛋白酶K。
10.權利要求1-6所述任一檢測方法或7-9所述任一試劑盒在診斷植物、土壤的象耳豆根結線蟲感染情況或鑑別象耳豆根結線蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及「一種象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測方法及應用」。根據克隆測序的象耳豆根結線蟲ITS序列，在其序列保守區域設計了5條LAMP引物MEF3、MEB3、MEFIP、MEBIP和MELB；並配製了LAMP反應體系。通過對象耳豆根結線蟲DNA提取，象耳豆根結線蟲等溫擴增、擴增產物顯色檢測，從而快速檢測出象耳豆根結線蟲。本發明的檢測方法特異性強、靈敏度高、成本低廉、操作簡便，在象耳豆根結線蟲現場快速檢測和象耳豆根結線蟲病的早期診斷方面具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102174650SQ201110034960
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月9日 優先權日2011年2月9日
發明者何旭峰, 彭德良, 彭煥 申請人:中國農業科學院植物保護研究所