分離純化人羊水幹細胞的方法

2023-10-04 22:21:29 1

專利名稱：分離純化人羊水幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞的分離純化方法，特別是涉及一種分離純化人羊水幹細胞的方法。
背景技術：
人羊水幹細胞(human amniotic fluid-derived stem cells, hAFSCs)的研究 近幾年逐漸受到關注。2003年，In't Anker等證實從孕中期(17-22周)羊水中能夠分 離培養出hAFSCs，從而開闢了一條新的成體幹細胞的獲取途徑，引起了研究者的極大 興趣和關注。目前的研究表明hAFSCs除了具備一般成體幹細胞的生物學性狀，以及 良好的增殖能力及多向分化潛能之外，還能表達一些全能幹細胞特有的標誌分子如 SSEA-4 (stage-specific embyronic antigen-4，特殊期胚月臺抗原-4) 、 Oct-4及腿og 等，說明hAFSCs是一群發育更為原始的成體幹細胞；羊水屬於人體遺棄組織，取材方 便，不會對供者造成新的創傷，且沒有倫理、法律方面的限制，利用hAFSCs有可能研 發出通用型組織工程產品，因而具有誘人的應用前景；美國《時代》周刊將羊水幹細 胞的研究進展評為2007年度世界十大醫學突破之一，說明了人們對其應用前景的高度 關注和認可程度。
人羊水細胞是一群混雜細胞，hAFSCs只佔其中很少的一部分，目前通常採用的貼 壁培養方法難以得到生物學性狀一致的hAFSCs，影響其體外擴增和向特定目的細胞的 多向誘導分化效率。近年來，隨著對成體幹細胞生物學性狀及其調控機制的研究不斷 深入，研究人員對成體幹細胞分離純化的特異性標誌物進行了進一步的研究；研究表 明成體幹細胞是胚胎發育過程中保存下來的未分化的細胞，提示成體幹細胞與胚胎 幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)可能會有更多的相似性與同源性；進一步還 有學者發現在大鼠骨髓組織中存在著一種數量稀少的胚胎樣原始幹細胞，表達胚胎幹 細胞的特異性標誌如Oct-4、 Rex-1及SSEA-1，體外培養條件也類似於胚胎幹細胞； 另有研究表明人骨髓間充質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 中確實存在著一群數量極少的SSEA-4陽性表達的細胞群，經過分離純化的這群細胞 具備了全能幹細胞的某些性狀，同時提高了向其它組織細胞誘導分化的能力和效率。

發明內容
本發明的目的是提供一種性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細 胞的分離純化方法。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案 一種分離純化人羊水幹細胞的 方法，是以特殊期胚胎抗原-4 (stage-specific embyronic antigen-4， SSEA-4)為 篩選標誌，從貼壁培養的人羊水幹細胞中分離純化出性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽 性表達的人羊水幹細胞。
可通過免疫磁珠篩選方法從人羊水幹細胞中分離純化出性狀均一的特殊期胚胎 抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞，具體來講，是將帶有磁珠的特殊期胚胎抗原-4單 抗標記人羊水千細胞，使人羊水幹細胞表面的特殊期胚胎抗原-4與特殊期胚胎抗原-4 單抗特異結合，再將特殊期胚胎抗原-4單抗孵育後的人羊水幹細胞置於外帶磁場的過 濾柱中過濾，濾完後撤除磁場，收集過濾柱內細胞，得到特殊期胚胎抗原-4陽性表達 的人羊水幹細胞。
所述人羊水幹細胞的獲取方法是多種多樣的，例如為取正常分娩的人羊水組織， 通過貼壁培養獲取人羊水幹細胞，並常規傳代2-3代。
為獲得更好的分離純化效果，所述方法中還包括將收集的特殊期胚胎抗原-4陽性 表達的人羊水幹細胞置於人羊水幹細胞培養基中進行傳代擴增培養的步驟。
此外，為檢測分離純化效果，還可對分離純化的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人 羊水幹細胞進行生物學性狀檢測，包括流式細胞術檢測(特殊期胚胎抗原-4陽性細胞 所佔比例在95%以上說明獲得了較好的分離純化效果)、人全能幹細胞特異性標誌物 Nanog及Oct-4檢測、核型分析、多向誘導分化及致瘤實驗等，得到性狀均一，具有 良好的增殖和誘導分化能力，G0/G1期細胞比例在90X以上，並能表達人全能幹細胞 特異性標誌物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及Oct-4的人羊水幹細胞。
用上述方法獲得的性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞也屬 於本發明的保護範圍。
本發明提供了一種以SSEA-4抗原作為分離和純化成體幹細胞的特異性標誌的分 離純化特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞的方法。實驗結果表明用本發明的 方法可得到性狀均一，具有良好的增殖和誘導分化能力，G0/G1期細胞比例在90X以 上，並能表達人全能幹細胞特異性標誌物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及0ct-4的人羊 水幹細胞。本發明提供了一條獲得人羊水幹細胞的新途徑，並為人羊水幹細胞的深入 應用奠定了基礎。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例中描述到的各種生物 材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反 法律和道德倫理能夠獲取的同類生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用；在產 業實施中，來源於大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物的各種細胞或組織、廢棄物均為離 體的，並包括從生物材料庫、細胞庫中取得，或商業購買獲得，還包括按照已有文獻 的介紹製備獲得。
本發明實施例中所用人羊水組織，來源於正常生產過程中的遺棄人羊水組織，羊 水標本的獲取均經過供者的知情同意，並通過提供羊水組織的醫院倫理委員會批准。 本方法的要旨是提供從這些已有的人羊水組織中獲取人羊水幹細胞的過程，人羊水組 織的獲取途徑不構成對本發明的限制。
實施例1、性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞的分離純化 獲得性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞，具體方法包括以下 步驟
一、人羊水幹細胞的獲取和培養
0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液0.25g胰蛋白酶與0.02g EDTA溶於100mL磷酸鹽緩 衝液，經0.22微米濾膜過濾，4'C保存備用。
磷酸鹽緩衝液KH2P04 0. 2g、 Na2HP04'12H20 3 . 4g、 KC1 0. 2g、 NaCl 8. 0g，雙蒸 水溶解並加至1000mL，調pH值為7.2，用0. 22 ^ m的微孔濾膜過濾，4"C保存備用。
細胞培養基低糖DMEM培養液，補充胎牛血清15% 、 bFGF4ng/mL、青黴素50U/mL 及鏈黴素50U/mL， 4'C保存備用。
取正常人羊水組織，通過貼壁培養獲取人羊水幹細胞，並常規傳代2-3代，具體 方法為無菌羊水組織5-10mL，於1800rpm離心5分鐘，在超淨臺內去上清，並加 lmL培養基充分混懸細胞，然後接種於25cm2培養瓶中，放於37。C、 5%0)2孵箱中培 養，四天後觀察，正常情況下會看到貼壁生長的細胞，後全量更換培養基繼續培養， 待培養瓶內細胞長至80%以上融合時，用0.25X的胰蛋白酶37"C消化細胞，傳代， 常規傳代培養，以擴增細胞數。
其中，常規傳代培養方法如下
當培養瓶中細胞長到70-80%融合狀態，即可消化傳代，在超淨臺中，去除培養 瓶中培養基，後加入lmL 0.25X胰蛋白酶-EDTA溶液，消化1-2分鐘，在顯微鏡下看 到細胞由梭形變為橢圓形時，即可加含血清培養基lmL終止消化，然後用滴管吹打貼 壁細胞，使細胞混懸，把細胞懸液移至lOraL無菌離心管，1100rpm離心5分鐘，於超 淨臺內去除上清，並加lraL培養基重懸細胞，按l: 3比例稀釋，接種於3個75 cm2 培養瓶中，輕輕搖勻細胞，置於37T:、 5XC02孵箱中培養，每3天換液一次。通過上述貼壁培養方法可初步獲得一群主要為成纖維細胞樣的混雜細胞群。流式
細胞檢測貼壁培養的人羊水幹細胞中特殊期胚胎抗原-4陽性細胞數為55-70%，遠遠 高於文獻報導的骨髓來源間充質幹細胞的2-3%。
二、 特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞的篩選
通過免疫磁珠篩選方法從步驟一的混雜細胞群中分離純化出性狀均一的特殊期 胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞，具體來講，是向培養後由胰酶消化而得的人羊 水幹細胞混懸液中添加特殊期胚胎抗原-4單抗(R&D) ， 100 ii 1體系10til單抗/107 個細胞，5'C孵育30分鐘，使人羊水幹細胞表面的特殊期胚胎抗原-4與特殊期胚胎抗 原-4單抗特異結合，加2mL磷酸緩衝液，300rpra離心10分鐘洗脫未結合的單抗，混 懸細胞，再加入能與特殊期胚胎抗原-4單抗結合的磁珠(MiltenyiBiotec) ， 100ul 體系10ul單抗/107個細胞，孵育後，加2mL磷酸緩衝液，300rpm離心10分鐘洗脫 未結合的磁珠，充分混懸細胞，並使單細胞懸液置於外帶磁場(Mini MACS Miltenyi Biotec)的過濾柱(Miltenyi Biotec)中過濾，濾完後撤除磁場，收集過濾柱內細 胞，得到特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞，此後即可進行培養與擴增。
通過細胞計數檢測過濾柱中細胞佔總細胞的比例，結果過濾柱中細胞(SSEA-4 陽性細胞)佔總細胞比例為50-60%，與流式細胞檢測結果基本一致，證明獲得了較 好的分離純化效果。
三、 傳代擴增培養
將收集的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞置於人羊水幹細胞培養液中 進行傳代擴增培養，傳代培養方法，試劑及劑量、培養基及其配方及培養條件，均與 步驟一 (人羊水幹細胞的獲取和培養)相同。
四、 生物學性狀的檢測
為檢測分離純化效果及細胞多向分化潛能，對步驟三經分離純化及傳代培養得到 的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞進行了相應生物學性狀的檢測，具體內
容如下
1、 SSEA-4表達檢測
將篩選後的羊水幹細胞繼續培養，通過流式細胞術檢測觀察SSEA-4陽性細胞比 例。結果，篩選後的羊水幹細胞呈貼壁生長，細胞呈梭形、成纖維細胞樣，排列規則， 群體倍增時間為34小時，92X的細胞處於G0/G1期，SSEA-4表達率為100% ，並且 常規傳代培養能維持100%表達，說明可以利用本發明的免疫磁珠分選方法篩選得到 人羊水幹細胞中SSEA-4表達陽性細胞，篩選後的人羊水幹細胞在相當長的傳代培養 過程中其SSEA-4表達率仍能保持100%，細胞持續處於未分化狀態。2、 人全能幹細胞特異性標誌物Nanog及Oct-4檢測
用Western Blotting方法檢測步驟經分離純化及傳代培養得到的特殊期胚胎抗 原-4陽性表達的人羊水幹細胞的人中全能幹細胞特異性標誌物Nanog及Oct-4的表達 水平，所用抗體分別為鼠抗人Nanog抗體和兔抗人Oct-4抗體(R&D)，結果經分離 純化及傳代培養得到的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞中均能表達人全 能幹細胞特異性標誌物Nanog及Oct-4，進一步說明該群細胞具有全能幹細胞某些特 異性標誌物的表達。
3、 CD29、 CD90、 CD105及CD34表達檢測
選取生長狀態良好的經過篩選的人羊水幹細胞製備成單細胞懸液，調整細胞密度 為2.0X107mL，加入Ep管中，PBS洗兩次，在每隻Ep管中分別加入鼠抗人CD29、 CD34、 CD90、 CD105—抗(以PBS代替一抗作為陰性對照)，室溫反應30min， PBS洗滌 2次後，再滴加FITC標記的抗鼠IGg，反應15min，流式細胞儀檢測。
結果篩選後的人羊水幹細胞表達CD29、 CD90、 CD105等間充質幹細胞標識，不表 達CD34等造血幹細胞標誌，表明細胞具有多能幹細胞性狀，而非單能幹細胞。
4、 核型分析
具體實施和分析方法包括以下步驟(參考文獻杜傳書，劉祖洞，主編.醫學
遺傳學.第二版，北京人民衛生出版社。)
(1) 篩選得到的人羊水幹細胞在指數生長期加秋水仙素(應用液5mg/L)，終濃度 0.03mg/L， 5%C02 37'C繼續培養4h，胰蛋白酶消化；
(2) 離心，吸棄上清，加O. 075M KC1低滲液，37。C低滲20min。加O. 3mL固定液 (甲醇冰醋酸3:1)混勻固定lmin;
(3) 離心，吸棄上清，加固定液7-8mL，重懸固定30min;
(4) 重複步驟(3) 2次，留固定液滴片，製備出染色體標本；
(5) Giemsa染色後顯微鏡下觀察分析；尋找染色體分散較少，長短適宜的中期 分裂細胞，在油鏡下計數染色體數目及結構畸變；
(6) 選形態佳的中期分裂細胞3 5個，顯微攝影，經衝洗、放大，剪貼後進行染 色體核型分析。
結果，篩選後的人羊水幹細胞持續培養20代以上仍表現為正常的二倍體核型， 表明篩選得到的人羊水幹細胞具有遺傳性狀的穩定性和應用的安全性。
5、 多向誘導分化能力檢測 (1)神經元樣細胞誘導分化
誘導培養基a成分低糖DMEM， 10%胎牛血清，二甲基亞碸，butylatedhydroxyanisole (BHA， Sigma-Aldrich)200 u M， e -NGF25ng/mL。
誘導培養基b成分低糖DMEM88X，胎牛血清10%， 0-NGF25ng/niL。 誘導方法以3X 107cm2的密度接種細胞，加誘導培養基a培養兩天，後換為誘
導培養基b，繼續培養15-30天。培養結束後，通過反轉錄聚合酶鏈式反應(檢測引
物為正向引物 5' AGAGGGGAATTCCTGGAG 3'和反向弓|物 5'
CTGAGGACCAGGACTCTCTA3')及免疫螢光技術(檢測抗體為抗人nestin抗體，
Sigma公司)即可檢測到細胞內特定蛋白nestin的表達。 (2)肝細胞誘導分化 誘導培養基成分低糖DMEM，胎牛血清10%，硫代甘油300yM， 20ng/mLHGF，
10ngAiL腫瘤抑制因子，10—7M地塞米松，10ng/mLFGF4， IX ITS (胰島素鐵硒傳遞蛋白)。
誘導方法以5X107cm2的密度接種細胞，加誘導培養基培養，三天換液一次， 培養兩周，把細胞消化傳代於鋪有兩層膠原凝膠的培養皿中(膠原凝膠上下兩層均為 1.0mg/mL)，持續培養兩周以上。結果可檢測到肝細胞相關標誌如甲胎蛋白(AFP)、白 蛋白(Alb)、細胞角蛋白18(CK18)的表達。 (3)成骨樣細胞誘導分化
誘導培養基成分低糖DMEM， 10%胎牛血清，青黴素50U/mL及鏈黴素50U/mL， Vc50yM，地塞米松O. lyM, P-甘油磷酸10mM。
誘導方法以3000cells/cr^的密度接種細胞，加誘導培養基培養，三天換液一 次，培養十一天。結果可檢測到成骨細胞相關標誌如鹼性磷酸酶(AKP)和骨橋蛋白(OPN) 的表達。
上述檢測結果顯示在特定的誘導培養基作用下，篩選後的人羊水幹細胞可以向神 經元樣細胞、肝樣細胞及成骨樣細胞代表三個不同胚層細胞的誘導分化，表明SSEA-4 陽性細胞具有很好的多向分化潛能。
6、致瘤實驗
將篩選後的人羊水幹細胞接種於裸鼠皮下，接種細胞數量為1X17個細胞，結果 2個月後仍無腫瘤形成，表明SSEA-4陽性細胞沒有明確的致瘤效能，臨床治療應用安 全可靠。
上述檢測結果表明用本發明的方法可得到性狀均一，具有良好的增殖和誘 導分化能力，G0/G1期細胞比例在90X以上，並能表達人全能幹細胞特異性標 志物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及Oct-4的人羊水幹細胞，且具有良好的臨床應 用前景。
權利要求
1、一種分離純化人羊水幹細胞的方法，是以特殊期胚胎抗原-4為篩選標誌，從貼壁培養的人羊水幹細胞混雜細胞群中分離純化出性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於通過免疫磁珠篩選方法從貼壁培養的人羊水幹細胞中分離純化出性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹 細胞。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述免疫磁珠篩選方法是向人羊水幹細胞混懸液中添加特殊期胚胎抗原-4單抗，再加能與特殊期胚胎抗原-4單抗結 合磁珠，然後把人羊水幹細胞混懸液置於外帶磁場的過濾柱中過濾，濾完後撤除磁場， 收集過濾柱內細胞，得到特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述貼壁培養的人羊水幹細胞由 人羊水組織通過貼壁培養獲取人羊水幹細胞，並常規傳代2-3代獲得。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括將收集的特殊 期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞置於人羊水幹細胞培養基中進行傳代擴增培 養的步驟。
6、 根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特徵在於還可對分離純化的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞進行生物學性狀檢測，包括流式細胞術檢測、 人全能幹細胞特異性標誌物Nanog及Oct-4檢測、核型分析、多向誘導分化及致瘤實 驗。
7、 用權利要求1-6任一項所述方法得到的性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表 達的人羊水幹細胞。
全文摘要
本發明公開了一種分離純化人羊水幹細胞的方法。該方法是以特殊期胚胎抗原-4為篩選標誌，從貼壁培養的人羊水幹細胞中分離純化出性狀均一的特殊期胚胎抗原-4陽性表達的人羊水幹細胞。實驗結果表明用本發明的方法可得到性狀均一，具有良好的增殖和誘導分化能力，G0/G1期細胞比例在90％以上，並能表達人全能幹細胞特異性標誌物特殊期胚胎抗原-4、Nanog及Oct-4的人羊水幹細胞。本發明提供了一條獲得人羊水幹細胞的新途徑，並為人羊水幹細胞的深入應用奠定了基礎。
文檔編號C12N5/08GK101418284SQ200810227670
公開日2009年4月29日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者慧 劉, 劉大慶, 偉 師, 李保偉, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所