人載脂蛋白ai的基因工程製備方法及其表達載體和工程菌的製作方法

2023-07-11 05:02:41 3

專利名稱：人載脂蛋白ai的基因工程製備方法及其表達載體和工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的生產蛋白質或多肽的DNA重組技術領域，特別是，涉 及人載脂蛋白AKApolipoproteinI，ApoAl)的基因工程製備方法，及其相關的表達載體和 工程菌。
背景技術：
隨著人民生活水平的提高，冠狀動脈粥樣疾病的發病率顯著增高，目前已成為危 害人類健康的三大疾病之一。據聯合國衛生組織2002年研究報告，全球約三分之一的病人 死亡與心血管疾病(cardiovasculardisease)有關。其中，動脈粥樣硬化性心血管病首當 其衝。動脈粥樣硬化主要損傷動脈內壁，這是由於膜膽固醇酯在中膜脈管壁的大量堆積形 成粥樣硬化斑塊，使血管壁纖維增厚並導致動脈病變。其主要發生於大動脈和中等動脈，如 主動脈、冠狀動脈和腦動脈，導致某些臟器的局部供血不足，因而出現心腦血管疾患，如冠 心病、心肌梗塞、中風等，極易引起致命性損傷。不溶性的脂類在血漿中是作為可溶性的脂蛋白顆粒而運輸的。脂蛋白顆粒含有一 個疏水性的膽固醇脂和甘油三脂核心，外表面包裹著單層的雙性磷脂分子，結合著游離膽 固醇和載脂蛋白。載脂蛋白(apolipoprotein，Apo)是一類能與血漿脂質(主要是指膽固 醇、甘油三脂和磷脂)結合的蛋白質，為構成血漿脂蛋白的主要成份。載脂蛋白在肝臟和小 腸黏膜細胞中合成。目前已報導的載脂蛋白有二十餘種。載脂蛋白在分子結構上具有一定 特點，往往含有較多的雙性α —螺旋結構，表現出兩面性，螺旋的一側極性較高可與水溶 劑及磷脂或膽固醇極性區結合，構成脂蛋白的親水面；而另一側極性較低可與非極性的脂 類結合，構成脂蛋白的疏水核心區。載脂蛋白在參與脂類核心代謝反應的酶中充當輔助因 子，並且作為識別因子而調控脂蛋白的分泌和攝入。載脂蛋白可分為載脂蛋白A(ApoA)，載 脂蛋白Β(ΑροΒ)，載脂蛋白C(ApoC)和載脂蛋白E(ApoE).其中載脂蛋白A又可分為載脂蛋 白AI (也稱為ApoAl)、載脂蛋白AII和載脂蛋白AIV。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要 並且複雜的生理功能，不論是質或量的改變，都會引起脂蛋白代謝異常。國內外大量臨床資 料顯示，心血管患者體內的載脂蛋白水平與病情有很大的相關性。目前臨床上主要檢測載 脂蛋白Al，載脂蛋白B兩種，其兩者分別被認為是動脈粥樣硬化的保護因素和危險因素。因 此測定其含量和比值為動脈粥樣硬化及心血管疾病的判定、預測提供了有價值的指標，具 有重要的診斷和預防意義。載脂蛋白AI在肝臟和小腸黏膜細胞中合成。它是高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-CHOL)的主要結構蛋白，佔HDL-CHOL總蛋白的60% 70%，載脂蛋白AI的測定可直 接反映HDL-CHOL的水平。載脂蛋白B也由肝臟合成，是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-CHOL)的 主要結構蛋白，約佔LDL-CHOL總蛋白含量的97%，載脂蛋白B的測定可直接反映LDL-CHOL 的水平。即對載脂蛋白AI與載脂蛋白B的檢測可分別直接反映HDL與LDL的含量與功能。 並且它們的比值與動脈粥樣硬化有密切關係，可作為判斷心血管疾病危險性大小的指標。血漿中HDL和載脂蛋白AI的含量與冠狀動脈疾病(Coronary artery disease, CAD)的發 生呈負相關性，即HDL和ApoAl含量越高，CAD的發病率越低。載脂蛋白AI是參與細胞膽固醇逆向轉運(RCT)的重要因素。載脂蛋白AI能與磷 脂、多種血漿因子及細胞膜受體結合，激活卵磷脂膽固醇醯基轉移酶(LCAT)，促進細胞內膽 固醇的移出、酯化、轉移從而調節HDL的代謝。相較於其他的各種HDL亞類，載脂蛋白AI空 間結構有較大差異，有研究表明這與HDL成熟過程及運載膽固醇等生理功能密切相關。人體內的載脂蛋白AI蛋白分子為243個胺基酸殘基組成的肽鏈，分子質量為 28. 3KD，無糖基化修飾，具較強的疏水性。它主要含有8個由22個胺基酸構成的重複片段 和2個由11個胺基酸組成的重複片段。這些重複片斷形成兩性α螺旋，相互之間被脯氨 酸殘基間隔。當有磷脂存在時，帶電荷的殘基面朝水相，非極性殘基則面朝磷脂雙層鏈。在 許多重複片段的親水面存在多個影響螺旋結構穩定性的胺基酸(DERKG)，這可能有利於載 脂蛋白AI在和脂質相互作用過程中產生構象變化。載脂蛋白AI相互間容易形成二聚體以 利於蛋白的穩定。但是研究發現，當蛋白濃度低於0. lmg/mL時，載脂蛋白AI均以單體形式 存在。與其它形式的載脂蛋白AI相比，游離的載脂蛋白AI結構相對鬆散，其螺旋程度只有 40-50%，而當周圍有脂質存在時，蛋白暴露的疏水區能迅速與脂類相互作用，螺旋程度可 提高到75%。研究表明載脂蛋白AI蛋白還具有抗氧化、抗凝抗炎作用，並能調節細胞粘附分子 的表達、介導細胞內信號傳導等功能，對保護人體動脈管壁具有十分重要的意義。目前對冠 狀動脈粥樣疾病發生的確切機制雖然還存在爭議，但載脂蛋白AI能治療並預防冠狀動脈 粥樣疾病的事實卻受到學術界的高度重視。大量的動物和臨床試驗已證明，目前通過基因 工程獲得的重組人載脂蛋白AI結構與功能和天然載脂蛋白AI相似，其不僅能防止動脈粥 樣硬化的發生和發展，而且能逆轉病變，更可貴的是臨床研究也未見明顯的毒副反應。因 此，重組載脂蛋白AI有可能成為治療和預防動脈粥樣硬化的理想藥物，具有廣闊的臨床應 用前景。因而研發一種適合大規模生產重組ApoAl蛋白的方法具有很高的經濟和社會價 值。雖然製備人載脂蛋白AI方法已有報導，但這些方法均有不盡人意之處。如從人血 漿中製備載脂蛋白Al，面臨著產量低、步驟多、成本高等缺點。這些缺點限制了其作為靶向 藥物的規模化生產。因此，研發一種新的、有效的、產量高、適合大規模生產的製備重組人載 脂蛋白AI蛋白的方法具有很高的迫切性和重要性。在各類通過基因工程表達體外重組蛋 白的表達系統中，最常見的是應用大腸桿菌原核表達系統。但是在常用的37°C大腸桿菌表 達過程中，載脂蛋白AI的mRNA極不穩定，表達的重組載脂蛋白AI成熟蛋白很容易被降解。 有報導在用此常規的大腸桿菌表達系統表達載脂蛋白AI蛋白時，由於上述原因導致產量 較低，只能達到4mg/L培養菌液，不適合高效地、大規模地生產重組載脂蛋白AI蛋白。而運 用其它表達系統如酵母，昆蟲細胞及哺乳動物細胞表達系統均存在表達過程較複雜、表達 成本高，並且表達量低、純化步驟繁瑣等缺點，同樣不利於大規模生產。本發明的人載脂蛋白AI的基因I程製備方法克服現有技術的多個技術缺陷，比 如，本發明採用PCold表達載體，是一種被用來大量表達外源重組蛋白的載體，帶有一個 cspA啟動子，在該啟動子下遊為乳糖操縱子。該載體在多種大腸桿菌宿主菌中經誘導後在 10-20°C低溫下大量表達外源重組蛋白。本發明利用其具有低溫誘導表達外源重組蛋白的一升培養菌液中人載脂蛋白AI蛋白的表達量高達40mg以上，與現 有技術報導的表達量比較，表達量提高了 10倍之多。同時，利用本發明的鎳交聯親和柱一 步法蛋白製備工藝，使得整個過程操作簡便、蛋白得率高、耗時短，目的蛋白純度高，完全適 用於工業化大規模生產。

發明內容
本發明的目的是提供一種可在大腸桿菌中表達，並能通過親和柱高效製備重組可 溶ApoAl的方法，及其相關的表達載體和工程菌。本發明提供了一種人載脂蛋白AI的基因工程表達載體，該載體構建過程如附圖1 如示。該載體為含有人載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold，並且載脂蛋白AI編碼序 列位於pCold載體上NdeI和HindIII酶切位點之間。載體pCold是一種被用來大量表達 外源重組蛋白的載體，其帶有一個cspA啟動子，在該啟動子下遊為乳糖操縱子，這樣的載 體可在低溫下啟動表達外源基因。同時在其5 『端非轉錄區還含有翻譯爭強子(Translate enhancefactor, TEF)、多聚組氨酸靶標融合位點、凝血因子X酶切位點及多克隆位點。因 此，該載體可在多種大腸桿菌宿主菌中，在低溫條件下，經誘導後大量表達外源重組蛋白。 本發明的表達可溶性人載脂蛋白AI重組蛋白的表達載體pCold，以及以cspA啟動子低溫誘 導表達可溶性人載脂蛋白AI重組蛋白，在10-20°C下進行低溫誘導表達，正是本發明的創 新所在。本發明還提供了 一種基因工程菌，該基因工程菌為pCold-ApoAl/Escherichia coli，該宿主菌被含有人載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold所轉化。本發明的宿主 菌可以是大腸桿菌(Escherichia coli) Rosetta-gami，該宿主菌還可選用其他各種可被上 述載體所轉化的大腸桿菌表達宿主B121、B121 (DE3)、L21 (DE3)PlysS、Roesetta-gami、或 KSIOOOo本發明所用的pCold表達載體具有低溫誘導表達特性，見於TARKAR公司的pCold 載體說明書。至目前，尚未有文獻公開報導有關任何低溫誘導表達重組人載脂蛋白AI蛋 白的資料。本發明首次創新地提出，可以利用低溫誘導表達重組人載脂蛋白AI蛋白，利用 pCold表達載體具有的低溫誘導表達特性，突破性地克服了人載脂蛋白AI的mRNA在大腸杆 菌宿主菌中的極不穩定性和表達的成熟蛋白很容易被降解的難題，使得重組人ApoAl蛋白 產量大大提高。通過本發明方法，可以從IL培養菌液中獲得的最終得到的重組人載脂蛋白AI蛋 白濃度測定經計算為3. 7mg/ml，透析後得到的總體積為11ml。故，總蛋白得率約為40mg/ 升菌液，而美國專利US patent 5643757公開的大腸桿菌生產人重組載脂蛋白AI蛋白的方 法，所得到的表達量僅為4mg/升菌液。比較可見，本發明方法的表達量高於其達10倍之多。本發明還提供了一種克隆、表達、純化人載脂蛋白AI的基因工程方法，通過基因 重組技術體外表達，通過改良的鎳親和柱一步純化法，純化獲得高純度的可溶性的目的蛋 白載脂蛋白Al，包括步驟如下(1)通過RT-PCR技術從人肝組織總RNA中擴增獲得人載脂蛋白AI的cDNA ；
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(2)擴增人載脂蛋白AI基因並克隆到pCold載體中；(3)培養和表達基因工程菌 pCold-ApoAl/Rosetta-gami ；(4)離心收集基因工程菌 pCold-ApoAl/Rosetta-gami ；(5)人載脂蛋白AI融合蛋白的親和柱純化；(6)透析除鹽，得到可溶性蛋白，經鑑定為目的蛋白。本發明的人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，是以大腸桿菌(Escherichia colDRosetta-gami為宿主菌，所述載體選用含有載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold， 且載脂蛋白AI編碼序列位於pCold載體上NdeI和HindIII酶切位點之間。通過基因人工 合成的方法，針對載脂蛋白AI的成熟肽進行克隆重組，去除了載脂蛋白AI前體蛋白N-端 的信號肽，並在其N端加上6個多聚組氨酸(6x His)親和多肽標籤，構成ApoAl-6His融合 蛋白，進而用大腸桿菌Rosetta-gami作為宿主菌。本發明的人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其步驟(2)中，自人載脂蛋白AI基 因cDNA的第73個核苷酸位置起開始設計以下引物上遊引物5『AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT，下遊引物為5，ATAAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA。本發明的人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其步驟(3)中，基因工程菌 pCold-ApoAl/Rosetta-gami的經誘導後在10_20°C低溫繼續培養15小時。本發明首次揭 示採用多聚組氨酸融合低溫表達載體(PCold)在低溫下(10-20°C )表達無信號肽ApoAl蛋 白的技術方案，從而可以在大腸桿菌內穩定高效表達大量可溶的ApoAl蛋白，這一創新內 容目前在國內外尚未見有其他報導。本發明所述的「載脂蛋白AI前體蛋白」，是指由載脂蛋白AI cDNA編碼，在細胞內 合成的，未切除信號肽的ApoAl全長蛋白。本發明所述的「載脂蛋白AI的成熟肽」，是指在 細胞內切除信號肽，及信號肽後7個胺基酸的成熟肽，其分泌到血清中，具有生物功能的載 脂蛋白AI蛋白。本發明的人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其步驟(5)中，所述融合蛋白為無 信號肽的人載脂蛋白AI在其N端加上6個多聚組氨酸構成的蛋白。本發明此創新在於，利 用融合蛋白N端的6個多聚組氨酸多肽標籤，簡便高效地純化獲得高純度重組載脂蛋白AI， 以利於後續的大量生產純化工藝的開展。本發明的人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其步驟(5)中，所述本發明的自主 改良的「鎳親和柱一步純化法」，是指只通過一根鎳親和柱，運用改良的特定洗脫方式，即， 通過對親和柱多次三種不同濃度咪唑洗滌液的洗滌，及對目的蛋白的兩種不同濃度咪唑洗 脫液的洗脫。洗脫方式如附圖2所示。本發明方法不需要依賴其他純化方法及步驟，也不需要用其他試劑再做進一步的 純化，即可直接獲得高純度所需目的蛋白，所獲得目的蛋白的純度90%以上。純化步驟簡 單，所得目的蛋白純度很高，純化全程時間較短，優選的純化全程時間為4-6小時。在實驗 室規模(小於5升菌液的純化規模)下，純化優化全程時間與純化的菌液體積關係為純化 1升(IL)表達菌液，需4小時左右。簡要地說本發明首先通過基因擴增及重組的方法，獲得了人載脂蛋白AI成熟蛋 白的cDNA並克隆至pCold表達載體上；然後在N-端加上多聚組氨酸(6x His)親和肽標籤以便鎳親和柱一步法純化；進而選用大腸桿菌Rosetta-gami作為宿主菌，獲得可溶的目的 蛋白。本發明的有益效果在於(1)使用大腸桿菌Rosetta-gami，可以最大限度地防止 重組載脂蛋白AI蛋白大量表達對宿主細胞的毒性，從而提高重組蛋白的產量。(2)本發明 採用的pCold低溫表達載體，避開了載脂蛋白AI的mRNA在大腸桿菌宿主菌中極不穩定、表 達的成熟蛋白很容易被降解的問題，克服了載脂蛋白AI在大腸桿菌表達過程中mRNA和其 表達產物-蛋白質的不穩定性；並且，低溫表達的載脂蛋白AI蛋白為可溶性成熟蛋白，有利 於得到載脂蛋白AI的高效表達；(3)以本發明方法修飾後表達的載脂蛋白AI為可溶性成 熟蛋白，最大可能性地還原了該蛋白在體內的摺疊結構，有利於保持其生物活性；(4)多聚 組氨酸的使用可以簡化該蛋白的純化方法；(5)發明人自主改良的鎳親和柱一步純化法工 藝的應用，使得純化方法進一步簡化，且純化得率很高。採用本發明的載脂蛋白AI製備方 法，可以在1升工程菌液中獲得高達40mg以上的可溶性重組載脂蛋白AI蛋白。


圖1 人載脂蛋白AI的基因工程表達載體的構建示意圖；圖2 鎳親和柱一步純化法的洗脫方式的示意圖；圖3 人載脂蛋白AI基因的RT-PCR結果圖譜；圖4 :pCoId-ApoAl重組表達質粒的酶切鑑定；圖5A 未經親和柱純化的不同表達宿主菌總菌裂解液電泳結果；圖5B 親和柱純化以後產物電泳的結果；圖6:蛋白印跡試驗；圖7 純化蛋白分子量的質譜分析。圖8 純化蛋白多肽的質譜分析。
具體實施例方式以下結合實施例和附圖，來進一步闡述本發明。以下各實施例是為說明本發明而 非為限制本發明範圍。實施例1人載脂蛋白AI的編碼基因PCR擴增及重組表達質粒pCold-HuApoAl的 構建1)目的基因的PCR擴增①抽提總RNA 取病人新鮮肝臟組織，勻漿器粉碎後用RNA抽提試劑盒抽提總RNA②RT-PCR 以總RNA為模版，運用反轉錄試劑盒，得到人載脂蛋白AI的eDNA.③目的基因的PCR擴增根據基因庫中公布的人載脂蛋白AI序列設計一對引物， 引物為上遊引物5『AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT(NdeI)下遊引物5，ATAAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA(HindIII)參考已報導的人載脂蛋白AI序列，引物設計時從cDNA的第73個核苷酸開始，從 而人為地去除了載脂蛋白AI的信號肽及前體肽部分。採用以下PCR反應系統和程序
在一個200ul微量PCR反應管內加入以下試劑10XPCR 緩衝液5 μ 1 ；模版cDNA 庫Iyg;dNTPImM ；上下遊引物各IOOpM;Taq 酶2U ；加入去離子滅菌水至終體積50ul反應條件為94°C 5分鐘，然後進入94°C 30秒，48°C 30秒，72 °C 30秒的40個擴增 循環，最後72°C延伸10分鐘。瓊脂糖電泳結果如圖3所示，圖3為人載脂蛋白AI基因的RT-PCR結果圖譜；其 中，Lanel =RT-PCR產物；M Ikb DNA標準DNA分子量maker。如圖3所示，瓊脂糖電泳結果 條帶在750-500bp之間，可以判斷產物的分子量為720bp左右，與預期實驗設計相符。2) PCR產物克隆擴增得到的PCR片段，用PCR產物回收試劑盒回收，然後用雙酶切，經瓊脂糖凝膠 電泳，用膠回收試劑盒純化後，直接定向連接到PCold載體上，將連接產物轉化到DH5a宿主 菌中，提取質粒，用NdeI和HindIII雙酶切鑑定。瓊脂糖電泳結果如圖4所示，酶切片段大 小與設計一致的，約為700個核苷酸的酶切片段為陽性克隆。圖4為pCold-ApoAl重組表達 質粒的酶切鑑定；其中，M =DNA ladder ；1-14 雙酶切鑑定的不同克隆質粒，限制性內切酶 為NedI、HindlII ；酶切片段大小為700bp，與從核苷酸序列推斷的插入片段大小吻合。(以 上常規實驗方法，見Sambrooks等編著的《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社1998年 出版。)3) DNA序列測定①將陽性克隆進行DNA序列測定，其測序結果如序列1 :SEQ NO. 1所示，該序列已 除去信號肽序列部分。②將陽性克隆的DNA測序結果，與其基因庫已報導人載脂蛋白AI序列的比較 (NM_000039)，兩者是一致的，如序列2 =SEQ N0. 2所示。③根據以上DNA測序結果，重組人載脂蛋白AI的胺基酸序列如序列3 =SEQ N0. 3 所示。實施例2基因重組菌的大規模表達及純化方法1)重組人ApoAl-多聚組氨酸融合蛋白在大腸桿菌宿主中的表達①將pCold-ApoAl轉化到Rosetta-gami大腸桿菌中在帶有氨苄黴素抗性(IOOng/ ml)的LB培養板上，37°C培養過夜②挑取一個單菌落在50ml含有100微克/毫升氨苄黴素的LB培養中37°C 250轉 /分鐘，培養過夜③2%接種培養到IL 2YT培養基中(包括100ug/ml氨苄黴素)，37°C to A600， 0. D. 0. 5④將培養溫度降至10_2(TC，讓菌液繼續培養30分鐘⑤加入IPTG至終濃度ImM 10°C，300轉/分鐘誘導培養15hours⑥高速離心4000rpm 20分鐘，收集沉澱並保存在_80°C
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2)純化重組人載脂蛋白AI-多聚組氨酸融合蛋白的試劑A、試劑①裂解液50mMTris-HCl Ph 8. 0,500mM NaCl, IOmM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-Me②洗洚液1 :50mM Tris-HCl Ph 8. 0,500mM NaCl, IOmM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-Me③洗滌液2:50mM Tris-HCl Ph 8. 0,500mM NaCl,20mM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-Me④洗洚液3:50mM Tris-HCl Ph 8. 0,500mM NaCl,30mM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-Me⑤洗脫液l:50mM Tris-HCl Ph 8. 0,150mM NaCl, IOOmM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-Me⑥洗脫液2:50mM Tris-HCl Ph 8. 0,150mM NaCl,300mM imidazole, ImM PMSF, 5mM 2-MeB、純化步驟(1)將1升2YT培養基表達人載脂蛋白AI重組融合蛋白的大腸桿菌懸浮在50ml 裂解液中(2)在冰上超聲4-5次，30秒/次，(3) IOOOOg高速離心I5分鐘(4)取上清再IOOOOg高速10分鐘(5)取上清上柱到5ml鎳柱中(6)用50ml洗滌液1清洗鎳柱(7)用50ml洗滌液2清洗鎳柱
(8)用50ml洗滌液3清洗鎳柱(9)用6ml洗脫液1從鎳柱上洗脫目的蛋白，每11滴收集一個試管(10)用6ml洗脫液2從鎳柱上洗脫目的蛋白，每11滴收集一個試管(11)將洗脫的樣品混合在一起，並用1XPBS，4°C透析三次過夜(12)將透析好的樣品保存在-80°C實施例3重組蛋白的證明(15%的SDS-丙稀醯胺凝膠電泳和蛋白印跡法)詳細步驟1) 15%的SDS-丙稀醯胺凝膠，通過Tris-glycine緩衝液，90V電壓，3小時電泳， 檢測最終獲得的重組蛋白。檢測結果為該特異條帶與人載脂蛋白AI分子量相符。圖5A是親和柱純化以前不同表達宿主菌的總菌裂解液電泳的結果。如電泳結果 所示，經含有人載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold所轉化的宿主菌BL21(DE3)PlysS， Roesetta-gami，KS1000，分別經IPTG誘導後，與IPTG誘導前的樣品相比，在30KD左右可見 一條明顯的誘導蛋白差異條帶，與預期人重組ApoAl蛋白分子量相符。如圖5A所示，E. coli 該類宿主菌種均可成功表達重組人ApoAl蛋白。圖5A為未經親和柱純化的不同表達宿主 菌總菌裂解液電泳結果；15% SDS-PAGE檢測最終獲得的重組蛋白；其中，M 標準蛋白；1 IPTG誘導前BL21(DE3) PlysS總菌裂解液；2 IPTG誘導後BL21 (DE3) PlysS總菌裂解液；3，
9IPTG誘導前Roesetta-gami總菌裂解液；4 =IPTG誘導後Roesetta-gami總菌裂解液；5， IPTG誘導前KS1000總菌裂解液；6 :IPTG誘導後KS1000總菌裂解液。(不同宿主菌中重組 質粒轉化方法均相同，詳細見Sambrooks等編著的《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版 社1998年出版)。圖5B是經含有人載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold所轉化的宿主菌 Roesetta-gami經IPTG誘導後的菌液，經繼續純化後所獲得人載脂蛋白A的蛋白條帶，該蛋 白分子量大小約為30kD，電泳結果表明該純化產物純度很高，與預期的蛋白分子量大小相 符。因此，從分子大小上判斷該純化產物為人載脂蛋白AI蛋白。圖5B為親和柱純化以後 產物電泳的結果；其中，1 為親和柱純化產物；M 標準蛋白。2)在15%丙稀醯胺膠，90V，3小時電泳後，通過Tris-glycine緩衝液將丙稀醯胺 上的蛋白片段電轉到PVDF膜上，條件為lXtris-glycine緩衝液，20%甲醇，70V電壓下，室 溫轉移3小時。①將電轉後的PVDF膜取出，用IX PBST清洗30分鐘②用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉45分鐘③用IX PBST漂洗PVDF膜3次，10分鐘/次④加入含1 2000稀釋的抗人ApoAl抗體的PBST 8mL,室溫反應1小時⑤用IX PBST洗滌PVDF膜三次，15分鐘/次⑥加入含1 :1000稀釋的抗小鼠的抗體，室溫反應40分鐘⑦用IX PBST洗滌PVDF膜三次，15分鐘/次⑧用含0. 3% H202和6mg 二氨基聯苯胺的顯色液，顯色1分鐘。實驗結果如圖6所示，經蛋白印跡法驗證所得蛋白與已知抗人載脂蛋白AI商業 化抗體呈特異性反應，因而，判斷所得蛋白為人載脂蛋白Al。圖6為蛋白印跡試驗；其中， Lane 1 IPTG誘導以前總菌裂解液；Lane 2 IPTG誘導以後總菌裂解液；Lane 3 鎳柱純化 後的產物；Lane M 標準蛋白。實施例4純化蛋白分子量的質譜分析該實驗委託浙江理工大學完成，具體實驗方法見儀器操作手冊。人載脂蛋白AI分 子量為28KD，本發明的重組人載脂蛋白ΑΙ-his tag蛋白分子量大小約為30KD，圖7所示的 大峰為單一的重組載脂蛋白Al，小峰為重組載脂蛋白AI 二聚體。實驗結果如圖7所示，表 明所得目的蛋白的分子量除去his-tag後與人載脂蛋白AI分子量一致，可以判斷所得目的 蛋白為人載脂蛋白Al-his。實施例5純化蛋白多肽的質譜分析該實驗委託浙江理工大學完成，詳細操作步驟見質譜儀器說明書。通過對純化產 物的肽段分子量及胺基酸組成分析，並與已知的多肽資料庫進行比較；得出的結論為該純 化產物是人載脂蛋白AI蛋白。實驗結果如圖8所示，經多肽的胺基酸分析確認所得蛋白為 人載脂蛋白Al。
權利要求
一種人載脂蛋白AI(ApoA1)的基因工程表達載體，其特徵在於，該載體為含有人載脂蛋白AI基因序列的質粒載體pCold，並且載脂蛋白AI編碼序列位於pCold載體上Nde I和HindIII酶切位點之間。
2.一種基因工程菌，其特徵在於，該基因工程菌為pCold-ApoAl/Escherichia coli， ^^.M^iXMl^fM Escherichia coli Rosetta-gami> BL2U BL21 (DE3)、BL21 (DE3)PlysS> Roesetta-gami、或KSiOOO，並被權利要求1所述的表達載體所轉化。
3.如權利要求2所述的基因工程菌，其特徵在於，所述基因工程菌為pCold-ApoAl/ Rosetta-gami0
4.一種人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)通過RT-PCR技術從人肝組織總RNA中擴增獲得人載脂蛋白AI的cDNA；(2)擴增人載脂蛋白AI基因並克隆到pCold載體中；(3)培養、表達如權利要求3所述的基因工程菌pCold-ApoAl/Rosetta-gami；(4)離心收集基因工程菌pCold-ApoAl/Rosetta-gami ；(5)人載脂蛋白AI融合蛋白的親和柱純化；(6)透析除鹽，得到可溶性目的蛋白。
5.如權利要求4所述人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，在步驟(2)中 自所述人載脂蛋白AI基因cDNA編碼的第一個胺基酸的核苷酸起第73個核苷酸的位置起 設計引物；其中，上遊引物5 『AAT CATATG GATGAACCCCCCCAGAGCCCCT,下遊引物為5』 AT AAGCTT CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA。
6.如權利要求4所述人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，在步驟(3)中， 基因工程菌pCold-ApoAl/Rosetta-gami在生長到對數期0. D.值為0. 4-0. 8左右時加入 IPTG後，對宿主菌進行10-20°C的低溫誘導培養10-15小時；然後收集表達菌。
7.如權利要求4所述人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中， 所述融合蛋白為無信號肽的人載脂蛋白AI在其N端加上6個多聚組氨酸構成的蛋白。
8.如權利要求4所述人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中， 所述親和柱純化時採用不同梯度咪唑濃度的洗脫方式。
9.如權利要求8所述人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中， 所述親和柱純化時採用的洗滌液為IOmM咪唑、20mM咪唑、30mM咪唑；洗脫液為IOOmM咪唑、 300mM咪唑。
全文摘要
本發明提供一種高效可溶性人載脂蛋白AI的基因工程製備方法，及其表達載體和工程菌。其中選用含有重組人載脂蛋白AI基因序列的質粒pCold為融合表達載體，ApoA1編碼序列位於pCold載體上Nde I和Hind III酶切位點之間。所用的基因工程菌為大腸桿菌，並經本發明所述的表達載體質粒pCold轉化為pCold-ApoA1/Rosetta-gami，在10-20℃下低溫培養即可誘導表達可溶性目的蛋白。本發明並使用了鎳交聯親和柱一步法，操作簡便、得率高、耗時短，得到的目的蛋白純度大於90％，適用於工業化大規模生產。
文檔編號C07K1/22GK101921793SQ201010170319
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月7日 優先權日2010年5月7日
發明者吳峻, 張豔, 王榮芳, 錢震斌 申請人:德賽診斷系統(上海)有限公司