檢測受試者體液內疾病相關蛋白聚合能力的方法

2023-10-05 07:16:29 2

專利名稱：：檢測受試者體液內疾病相關蛋白聚合能力的方法
技術領域：
：本發明涉及一種體外才全測受試者體液內疾病相關蛋白聚合能力的方法，更具體地說，涉及一種體外檢測帕金森病(PD)受試者體液(包括血清、血漿或腦脊液)內疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白(也稱為a-Syn)的寡聚體形成能力的方法。
背景技術：
：帕金森病(PD)是常見的神經退行性疾病，在60歲以上人口的發病率高達2%，臨床上以靜止性振顫、運動4餘糹爰、僵直和姿勢不穩定為主要症狀。上述症狀出現的主要原因是黑質多巴胺能神經元退變死亡，導致紋狀體多巴胺神經遞質釋放的減少。但是，從黑質多巴胺能神經元變性死亡開始到出現臨床症狀為止需要有4艮長的潛伏期(推測需至少5年之久)，直到70%-80%的黑質多巴胺神經元丟失後才出現臨床症狀。目前，PD的it斷主要依據臨床症狀，但由於PD臨床症狀的異質性，依據臨床症狀的誤診率可以高達10-25%。腦功能影像如PET和SPECT無疑在PD的早期i貪斷、鑑別診斷和病程監控方面具有潛在的前景，但其特異性仍然有待於提高，此外，價格昂貴和放射性使這一技術的普遍應用受到限制。PD臨床症狀雖然通過左旋多巴可以得到較好的糾正，然而，這些對症治療不能阻止多巴胺神經元的進行性退變和死亡。因此，努力尋找能夠阻止或延緩多巴胺神經元退變和死亡的神經保護藥是PD治療的方向，然而神經保護藥的研發需要令人信服的、臨床上簡便易行的、能夠反映帕金森病病理變化嚴重程度的生物標記物。至今，在症狀前和出現症狀的病人中，還沒有容易進4亍的以血液、腦脊液或尿液分析為基礎的可靠檢測方法可以對PD進行診斷、早期"i貪斷以及病理進程的監測。普通神經科醫生對於這種病的臨床診斷正確率大約在75%，運動障礙專家所估文的診斷正確率大約在85%,這些充分表明了對這種診斷方法的需要。這種方法也有利於對運動障礙病人的早期治療和對神經保護藥物療效的生物監測和評價。a-突觸核蛋白是一種小分子蛋白(~14KD)，在神經組織中的豐度4交高，^f旦也存在於其它組織、血液和腦脊液中。a-突觸核蛋白屬於突觸核蛋白家族(包括a-,P-和y-突觸核蛋白)的成員，大量證據表明該蛋白與多種神經退行性疾病的發病相關，包括帕金森病、路易體痴呆、阿爾茲海默病、多系統萎縮。編碼a-突觸核蛋白基因的三個點突變(A53T、A30P及E46K)與家族性帕金森病的發病有關，並提示該蛋白在原發性PD的發病中起重要作用。此外，a-突觸核蛋白基因的二倍體和三倍體可以導致野生型a-突觸核蛋白的過表達，並引起家族性早發性TO。遺傳學分析顯示，a-突觸核蛋白的某些基因多態性是散發性PD的危險因素。纖維化的a-突觸核蛋白是PD特徵性病理變化——路易體的主要成份。a-突觸核蛋白及其片革殳的病理性聚合和沉積也見於多種其它神經退行性疾病如阿爾茲海默病、路易體痴呆和多系統萎縮。有足夠的證據表明，腦內a-突觸核蛋白從可溶性的單體到不溶性的纖維的變化過程是PD和相關疾病的病理變化過程中的關4建事件，其中，纖維化過禾呈中形成的a-突觸核蛋白的寡聚體被證明對神經元具有毒性。a-突觸核蛋白在PD的病理變化過程中的重要作用使其成為非常有希望的、潛在的、能夠反映PD病理變化嚴重程度的生物標記物。對腦脊液和血液中的a-突觸核蛋白的分4斤表明，PD病人和3各易體痴呆病人血液與腦脊液中的a-突觸核蛋白的寡聚體的含量高於對照病人，4旦a-突觸核蛋白總含量的變化在不同實驗者之間得出相反的結果Lee等利用雙抗體夾心的ELISA方法證明血液中a-突觸核蛋白的總含量在PD升高，而Li和Tokuda等分別用蛋白質印跡法(Westernblot)和ELISA方法i正明血液和月畝脊'液中a-突觸核蛋白的總含量明顯降低，產生這種差別的原因尚不清楚。上述研究提示血液和腦脊液中的a-突觸核蛋白含量的變化作為PD"^斷的生物標記物仍然需要進4於大量的研究工作。我們i人為，一幾體中存在促進和抑制a-突觸核蛋白聚合的因素，這些因素在PD病人的才幾體中朝向有利於a-突觸核蛋白寡聚體形成的方向，這些影響聚合的因素不4又存在於腦組織，而且也存在於體液中。因此，衝企測體'液(血液和腦脊液)促進a-突觸核蛋白聚合的綜合能力比直接4企測a-突觸核蛋白寡聚體的含量更能夠完整地反映患者的病理狀態。最近的一項研究支持這種推測阿爾茲海默病人和路易體痴呆病人的腦脊液促進a-突觸核蛋白纖維的形成。表1列出了目前已才艮道的對血液與腦脊液突觸核蛋白才企測的方法與結果。表1:對血液與腦脊液突觸核蛋白檢測的現有方法及其結果tableseeoriginaldocumentpage8
發明內容本發明的目的在於提供一種體外檢測受試者體液(包括血清、血漿或腦脊液)內疾病相關蛋白(如a-突觸核蛋白)聚合能力的方法，本發明的方法不是直4妄4企測體液中疾病相關蛋白(如a-突觸核蛋白)寡聚體的水平，而是才企測受試者體液促進疾病相關蛋白(如a-突觸核蛋白)形成寡聚體的能力。該方法並不直4妄用於疾病的檯，測或治療，而是衝全測疾病相關蛋白聚合能力的一種方法，其目的用於獲得相關的信息。根據本發明的一方面，提供一種體外才企測受試者體液(包括血清、血漿或腦脊液)內疾病相關蛋白聚合能力的方法，所述方法包括將純化的重組人疾病相關蛋白如重組人a-突觸核蛋白與受試者體液(例如，正常人和帕金森病人血清)進行振蕩孵育，使其聚合，然後利用能夠才企測蛋白質寡聚體的方法(如ELISA方法)4企測孵育後的體液如血清或血漿中的疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白的寡聚體的含量。才艮據本發明的具體實施方式，所述方法包括a.提供來自受試者的體液樣本；b.製備a-突觸核蛋白的寡聚體通過將純化的重組人a-突觸核蛋白與受試者體液樣本(例如，正常人和帕金森病人血清)進行振蕩孵育，使其聚合而製得；c.用ELISA方法才企測孵育後的體液如血清中的a-突觸核蛋白寡聚體的含量。與文獻才艮道的方法相比4交，本發明提供的方法具有例如4旦不限於以下的優點只需要少量的(10-100pL)的體液樣本(如血清或腦脊液樣本)，受試者容易接受；操作簡單，通過將外源a-突觸核蛋白力o入體液如血清中，才展蕩孵育之後，直4妾可以進4亍鬥全測；本才企測方法在不明顯降低才企測特異性的前提下，明顯提高測的敏感性；本發明方法所獲得的結果反映了受試者各種導致疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白聚合的因素的綜合作用，這尤其對判定帕金森病人的綜合病理生理狀況更有利。本方法是測定受i式者體液(包4舌血清、血漿或腦脊、液)內疾病相關蛋白聚合能力的一種方法，因此，不僅適合於與帕金森病相關的a-突觸核蛋白的測試，而且也將適合於檢測其他蛋白變性病如阿爾茲海默病人、^各易體痴呆病人血液和腦脊液對相關疾病蛋白如p-澱粉樣肽的聚合能力。此外，由於測定的是外加的疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白形成的寡聚體，濃度較高，使測試比較容易，數據的重複性和穩定性也高。圖1示出了稀釋的振蕩後樣品與新鮮樣品的吸光度比較；圖2示出了不同孵育時間、不同oc-Syn濃度在帕金森病(PD_及對照血清中聚合體形成量的分析；圖3示出了本發明檢測方法在診斷帕金森病的靈敏性、特異性和總符合率的分析結果。具體實施例方式除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬4支術領域的普通4支術人員通常理解的相同含義。在本i兌明書中，如果沒有具體指明，則所有提及的試劑或化合物都是常用的試劑或化合物，優選為分析純級以上，其製備方法或獲取方法對於本領域技術人員來說都是已知的。儘管與本文描述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用於本發明的實施或測試，但是下面將描述合適的方法和材料。所述材料、方法和實施例僅用於說明目的而不用於限制。本發明的其它特徵和優點根據詳細描述和權利要求將會顯而易見。為了更清楚地描述本發明，在下文的描述中，本發明主要針對疾病相關蛋白中的a-突觸核蛋白作為示例性具體實例進4亍描述。如本文所述的，術語"疾病相關蛋白"是指在疾病病理生理過程中起作用的蛋白質，如a-突觸核蛋白。如本文所述的，術語"a-突觸核蛋白"是在神經退4亍性疾病如帕金森病(PD)的病理生理過程中起重要作用的蛋白質，主要存在於中樞神經系統。該蛋白同時也存在於正常人和帕金森病人的腦脊液和血液中。a-突觸核蛋白總含量在帕金森病人和正常人的血液中的變化尚不能肯定，但是血液中聚合形式的a-突觸核蛋白的含量在帕金森病人卻多於對照受試者。帕金森病人的血液中存在a-突觸核蛋白寡聚體這一現象提示病人血液中有促進a-突觸核蛋白聚集的因素。根據這一原理，本發明的發明人將純化的重組人a-突觸核蛋白與正常人和帕金森病人體液如血清進行振蕩孵育，使其聚合，然後利用特殊的ELISA方法衝企測孵育後的血清中的a-突觸核蛋白寡聚體的含量。如果帕金森病人的血液中有促進a-突觸核蛋白寡聚體形成的因素，則病人血清中的a-突觸核蛋白寡聚體含量則會高於對照病人或正常人。才艮據本發明的具體實施方式，所述方法的工藝流程包4舌首先，從受試者4是取體液樣本。作為本發明的體液樣本來源的受試者可以是臨床明確診斷的PD病人血清或血漿(H-Y分期在I-IV)，年齡在40-70歲，而對照體液樣本可以為正常健康體檢的40-70歲的中、老年人或其它年齡匹配的非PD的患者。在本發明中，體液可以是例如^f旦不限於血液和腦脊液。體液樣本的糹是取方法對於本領域技術人員來說是熟知的。正常人和病人血液中a-突觸核蛋白的水平很低，病人血液中a-突觸核蛋白寡聚體的含量非常低，因此直接測定a-突觸核蛋白寡聚體的含量難度較大。由於本發明的方法是才企測病人和正常人的體液(如血液或腦脊液)促進a-突觸核蛋白形成寡聚體的能力，所以體液樣本取樣量相比於現有方法的取才羊量大大降低，通常為約>10|uL,優選為10~100)aL，例如20)LiL，使得樣本易於獲得並且受試者容易接受。將體液樣本按照種類不同進4亍不同處理，現以腦脊液及血液為例進4iS兌明腦脊液收集於乾淨塑料管中冷凍儲存；血液可以收集在含有檸檬酸鈉或鉀-EDTA的塑料管中，經3000rpm，4'C離心l5-30分鐘，耳又上層血漿冷凍儲存(血漿)；血液樣本也可以收集在不含任4可抗凝物質的塑料管中，室溫靜置1-2小時後，經3000rpm離心15-30分鐘，取上層血清冷凍儲存(血清)。其次，製備a-突觸核蛋白寡聚體。將10)LiL以上體液樣本用PBS(磷酸緩沖液(pH7.4))稀釋1~5倍，加入重組人a-突觸核蛋白，用0.22jum的濾膜(由PALL公司出售，型號4612)過濾除菌。在搖床或Eppendorf漩渦振蕩混勻器振蕩孵育，其中振蕩孵育的溫度為約2540。C，優選約37°C;頻率範圍約100~1000rpm,優選約300rpm;時間為約2472小時，伊C選約為48小時。爿尋上述反應'液用PBS稀釋100—2004咅，備用。最後，利用ELISA(酶聯免疫吸附測定)方法衝企測a-突觸核蛋白寡聚體，步驟如下包被用NaHC03緩衝液稀釋非生物素化的3D5抗a-突觸核蛋白抗體(在下文描述)至終濃度為約0.1~2ng/mL。向酶標4反(96孔板，由Corning7>司出售，型號3590)各孔加入50-150(aL該抗體稀釋液，在010。C,優選4。C孵育過夜。用PBST(其為含有吐溫的PBS)衝洗酶標板各孔，根據需要確定衝洗次數和時間。*封閉向酶標板各孔加入50-200pL封閉液(其為含有明膠和吐溫的PBS),在3540。C，4尤選37。C孵育1~5小時。用PBST衝洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。向各孔加入100HL已製備的a-突觸核蛋白寡聚體才羊品(經100~200倍稀釋)，在35~40°C，優選37。C孵育1~5小時。用PBST衝洗酶標板各孔，才艮據需要確定衝洗次K和時間。*用封閉液稀釋生物素化的3D5抗體至終濃度為約0.1~2jag/mL。向酶標才反的各孑L加入50~150|aL該抗體稀釋液，在35~40°C，優選37。C孵育1~5小時。用PBST衝洗酶標板各孔，根據需要確定衝洗次悽t和時間。*用封閉液稀釋親和素標記的石鹹性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶標板的各孔加入50~150nL該抗體稀釋液，在35~40。C,優選37。C孵育0.5~2小時。用PBST沖洗酶標4反各孔，才艮據需要確定衝洗次悽t和時間。*向酶標才反的各孔加入50~150pNPP(對硝基酚石粦酸顯色液，由Sigma7>司出售)，室溫顯色10-50分鐘。*測定405nm處酶標^反各孔的吸光度值。其中，ELISA試劑盒(該試劑盒為現有技術)中可以使用對a-突觸核蛋白特異的抗體，在本文中所用抗體是本發明人研製的已經過嚴格特異性檢測的單克隆抗體，命名為3D5抗體。該抗體識別人a-突觸核蛋白C-末端的一段特異性序列，並與大鼠和小鼠產生較弱的交叉反應。其識別的胺基酸序列如下KDQLGKNEEGAPQEGILE2>MPraPDNEAYEMPSEEGY(5DYEPEA-COOH。該抗體識別a-突觸核蛋白的第115-121胺基酸序列。這部分胺基酸序列是人、猩猩和猴的a-突觸核蛋白所特有。與大鼠和小鼠相差l個胺基酸，即121位胺基酸。該測試中所用抗體也可以為除3D5以外的其j也可以特異性識別人a-突觸核蛋白的抗體。例如，Invitrogen7>司的Anti-ALPHA-SYNUCLEINMonoclonalAntibody(cloneLB509)，Chemicon公司的mouseanti-alpha-synucleinmonoclonalantibody(CatNo.MAB5320)，CovanceInnovativeAntibodies公司的monoclonalantibodyagainsta畫synuclein(CatNo.MMS畫530R，clonesyn204)，SantaCruz公司的a國synuclein(clone211，cat.No,SC-12767)。生物素化3D5抗體的製備將3D5抗體與硫-NHS-LC-生物素(pierce)反應而被生物素化。然後用柱子去除未偶合的生物素，儲存在4。C直至^f吏用。現在將參考以下非限制性實施例詳細描述本發明的具體實施方式。實施例實施例1體液樣本準備在本發明中，體液才羊本以血清為例加以i兌明，^f旦本領i或:技術人員應當理解，以其它體液如腦脊液作為體液樣本的製備方法類似。在本實施例中，血清獲自34位臨床明確診斷為PD病人(17位男性，17位女性，年齡在5482歲，平均年齡65.4歲)，而對照血清獲自5位體檢正常健康人(3位男性，2位女性，平均年齡為60歲)。在本實施例中，提取的血清體積為約20)LiL。製備PBS溶液本實施例中4吏用的PBS溶液的組成如下:tableseeoriginaldocumentpage14通過常失見方法將各組分加以混合，配製的包^皮液為約200mMNaHC03緩沖液，其pH為約9.6。製備PBST溶液本實施例中4吏用的PBST溶液的組成如下:tableseeoriginaldocumentpage15通過常規方法將各組分加以混合即可製得PBST溶液。製備封閉淮本實施例中使用的封閉液的組成如下:tableseeoriginaldocumentpage15通過常規方法將各組分加以混合即可製得封閉液。a-突觸核蛋白寡聚體的製備將lOpL血清用0.01MPBS(pH約7.4)稀釋34咅，加入50|iiM重組人a-突觸核蛋白，用0.22jum濾膜過濾除菌。在37。C、280rpm的搖床中振蕩孵育48小時。將上述反應液用PBS稀釋200倍。利用ELISA方法檢測a-突觸核蛋白寡^^體利用ELISA方法衝企測a-突觸核蛋白寡聚體的步驟如下包被用200mMNaHC03緩沖液稀釋非生物素化的3D5抗體至終濃度為約l昭/mL,向酶標板每孔加入lOOpL抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST衝洗酶標4反各孔4次，每次4分4中。*封閉酶標板各孔加入200nL封閉液，在37。C孵育2小時。PBST衝洗酶標才反各孔4次，每次4分鐘。向各孔加入lOOpL已製備的a-突觸核蛋白寡聚體樣品(經100倍或200倍稀釋)，在37°C孵育2小時。用PBST衝洗酶標板各孔4次，每次4分鐘。*用封閉液稀釋生物素化的3D5抗體至終濃度為約1(ag/mL,向酶標板各孔加入lOO(aL該抗體稀釋液，在37。C孵育2小時。用PBST衝洗酶標板各孔4次，每次4分鐘。*用封閉液稀釋親和素標記的石鹹性磷酸酶(3:5000),向酶標板各孔加入lOOpL該抗體稀釋液，在37。C孵育1小時。用PBST沖洗酶標板各孑"次，每次4分鐘。向酶標^反各孔加入1OOjaLpNPP，室溫顯色30分鐘*測定405nm處酶標糹反各孔吸光度值。作為檢測結果，圖1示出了稀釋的振蕩後樣品與新鮮樣品的吸光度的比較結果。經過老化(振蕩)的樣品含有突觸核蛋白寡聚體，本發明的試劑盒在樣品200倍稀釋前不識別新鮮樣品(主要含單體)，^旦識別老化樣品(含寡聚體)，^旦當濃度高於200倍時，由於新鮮樣品中也可有寡聚體形成，因此，出現吸光度增加的趨勢；圖2示出了不同孵育時間、不同a-Syn濃度在帕金森病及對照血清中聚合體形成量的分析。隨著振蕩時間的延長，寡聚體的含量增加，在0~96小時之間寡聚體的含量與振蕩時間呈線性關係；以上圖1和圖2的結果說明，本發明的試劑盒主要識別寡聚體。圖3示出了本發明檢測方法在診斷帕金森病的靈敏性、特異性和總符合率的分析結果。其中靈敏度及特異度評價結果如下16以OD二0.5為診斷標準a=29b二9c=2d二21靈敏度93.55%特異度70.00%總符合率81.97%以OD二0.55為診斷標準a=28b=6c=3d二24靈敏度90.32%特異度80.00%總符合率85.25%實施例2在本實施例中，；險測方法及步驟與實施例1相同，只是提取的血清體積為40|uL。作為4僉測結果，經過老化(振蕩)的樣品含有突觸核蛋白寡聚體，本發明的試劑盒在樣品200倍稀釋前不識別新鮮樣品(主要含單體)，但識別老化樣品(含寡聚體)，^旦當濃度高於200倍時，由於新鮮樣品中也可有寡聚體形成，因此，隨著振蕩時間的延長，寡聚體的含量增加，出現吸光度增加的趨勢，說明了本發明的試劑盒主要識別寡聚體。實施例3在本實施例中，檢測方法及步驟與實施例1相同，只是提取的體液才羊本為腦脊液，並JU是耳又的腦脊液量為10pL。作為4企測結果，證實了本發明的試劑盒主要識別寡聚體，確認了本發明方法能夠在取樣量4艮小(約10100j^L)的情況下反映受試者腦脊液內a-突觸核蛋白的聚合能力。綜上所述，與文獻報導的方法相比較，本發明提供的方法具有例如^f旦不限於以下的優點只需要少量(約10100|uL)的體液樣本，受試者容易接受；操作簡單，通過將外源疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白加入體液樣本如血清中，l展蕩孵育之後，直4妄可以進4亍測試；本測試方法所獲得的結果反映了受試者各種導致疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白聚合的因素的綜合作用，這尤其對判定帕金森病人的綜合身體狀況更有利。本方法是測定受試者體液(包括血清、血漿或腦脊液等)內疾病相關蛋白聚合能力的一種方法，因此，不^又可用於與帕金森病相關的a-突觸核蛋白的測糹式，而且也有可用於才企測阿爾茲海,默病人血液和腦脊液對P-澱粉樣肽的聚合能力。此夕卜，由於測定的是外加的疾病相關蛋白如a-突觸核蛋白形成的寡聚體，濃度較高，使測試比較容易，數據的重複性和穩定性也很高。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。權利要求1.一種體外檢測受試者體液促進疾病相關蛋白聚合能力的方法，所述方法包括a.提供來自受試者的體液樣本；b.製備所述疾病相關蛋白的寡聚體，其通過將純化的重組人疾病相關蛋白與所述體液樣本在一定溫度條件下進行振蕩孵育，使所述疾病相關蛋白聚合而製得；其中所述重組人疾病相關蛋白通過重組質粒原核或真核表達製備，並進行純化，最後冷凍抽乾保存；c.檢測所述疾病相關蛋白的寡聚體，其中檢測孵育後的所述體液樣本中的所述疾病相關蛋白寡聚體的含量。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述疾病相關蛋白是a-突觸核蛋白。3.根據權利要求2所述的方法，其中檢測a-突觸核蛋白寡聚體的方法是ELISA方法。4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述體液樣本是受試者的血清、血漿或腦脊液，其量為10100)uL。5.根據權利要求3所述的方法，其中，所述a-突觸核蛋白寡聚體的製備過程包括將體液樣本用PBS或生理鹽水稀釋；接著加入所述重組人a-突觸核蛋白，過濾除菌；然後振蕩孵育。6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述體液樣本用所述PBS或生理鹽水稀釋0~10倍。7.根據權利要求5所述的方法，其中，所述振蕩孵育的溫度為約2040。C、頻率為約100~1000rpm、時間為約6~72小時。8.根據權利要求5所述的方法，進一步包括在所述振蕩孵育後將所得反應液用所述PBS溶液稀釋100200倍。9.根據權利要求3所述的方法，其中，所述ELISA方法才企測所述a-突觸核蛋白寡聚體的步驟包括a.包被用NaHC03緩沖液稀釋非生物素化的3D5抗a-突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為約0.1~2.0i^g/mL,向酶標板各孔加入所述抗體稀釋液，孵育過夜，用PBST沖洗所述酶標板各孑L;b.封閉向酶標^反各孔加入50-200(aL封閉液，在35~40。C孵育1~5小時後，用PBST沖洗所述酶標板各孔，然後向酶標板各孔加入經稀釋的所述a-突觸核蛋白寡聚體樣品，在35-40。C孵育1-5小時後，用所述PBST衝洗所述酶標板各孔；c.用所述封閉液稀釋生物素化的3D5單克隆抗體至終濃度為約0.1~2|ig/mL,向酶標^反各孔加入該抗體稀釋液，在35—40。C孵育1~5小時，用所述PBST衝洗酶標4反各孑L;d.用所述封閉液稀釋親和素標記的石鹹性磷酸酶，向酶標才反各孔加入所述抗體稀釋液，在35~40。C孵育0.5~2小時，用所述PBST衝洗所述酶標糹反各孔；e.向酶標^反各孔加入pNPP,並室溫顯色10~50分鐘；f.在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值。10.才艮據權利要求1-9中任一項所述的方法在檢測與帕金森病相關的a-突觸核蛋白聚合能力中的應用。11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法在檢測路易體痴呆、阿爾茲海默病人或其他蛋白變性病血液和腦脊液對相關蛋白或多肽聚合能力中的應用。全文摘要本發明涉及一種體外檢測受試者體液促進疾病相關蛋白聚合能力的方法。更具體地說，涉及一種體外檢測受試者體液促進疾病相關蛋白如α-突觸核蛋白的寡聚體形成能力的方法。該方法包括將純化的重組人疾病相關蛋白與受試者體液在一定溫度下進行振蕩孵育，使其聚合，然後利用能夠檢測蛋白質寡聚體的方法(如ELISA方法)檢測孵育後的體液中的疾病相關蛋白如α-突觸核蛋白的寡聚體的含量。本發明提供的方法具有以下優點1)體液樣本需要量少，受試者容易接受；2)操作簡單；3)本檢測方法獲得的結果反映了受試者各種導致疾病相關蛋白聚合的因素的綜合作用，這尤其對判定由複雜因素導致的帕金森病人的綜合病理生理狀況更有利。文檔編號G01N33/68GK101308144SQ20081009610公開日2008年11月19日申請日期2008年4月29日優先權日2007年5月16日發明者順於,雁李,李堯華,彪陳申請人:首都醫科大學宣武醫院