一種創製能穩定遺傳的攜帶蘿蔔染色體的白菜種質的方法與流程
2023-10-07 00:05:54 1
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種創製能穩定遺傳的攜帶蘿蔔染色體的白菜種質的方法。
背景技術：
白菜和蘿蔔是我國的兩種重要蔬菜，分別屬於十字花科的蕓薹屬和蘿蔔屬。在蔬菜作物雜交育種中，利用種間、屬間、科間的遠緣雜交在提高作物的抗病性和抗逆性、提高作物品質、創造新類型或新種質等方面發揮了重要的作用，已成為解決植物基因資源匱乏的重要手段，它可以解決近緣雜交不能解決的問題。因此，越來越被育種家們重視和利用，在植物遺傳育種中已有廣泛的應用，如在小麥、棉花、油菜、黃瓜等多種作物上通過種間或屬間雜交進行品種改良，獲得了豐富的遺傳變異類型。
但是，有性遠緣雜交經常會遇到雜交不親和、雜種不育、雜種後代遺傳變異複雜等問題。儘管白菜與蘿蔔同屬十字花科，但白菜屬於蕓薹屬蕓薹種(基因組A，n＝10)，而蘿蔔屬於蘿蔔屬蘿蔔種(基因組R，n＝9)。白菜和蘿蔔直接雜交後代沒法繼續回交的研究(李旭峰等，1995)。事實證明，蘿蔔與蕓薹屬植物雜交獲得雜種非常困難，而且雜種高度不育，難以繼續回交。為了克服兩者之間雜交的不親和問題，許多學者嘗試用不同技術和方法，如：植株嫁接後雜交、混合花粉授粉、化學藥物處理等，但這些技術和方法對蕓薹屬植物與蘿蔔的遠緣雜交幾乎沒有效果。後來組織培養技術和體細胞融合技術推動了這一領域的發展，如通過原生質體融合技術將蘿蔔的細胞質雄性不育基因轉入蕓薹屬蔬菜，獲得白菜細胞質雄性不育材料。與有性雜交相比，體細胞融合技術雖然可以在一定程度上克服遠緣雜交不親和性，但存在結果不確定性、成本偏高等缺陷，難以得到廣泛的應用。
因此，尋求一種能克服遠緣雜交障礙，使白菜與蘿蔔可以通過有性雜交獲得有利用價值的雜種後代的方法，對白菜育種具有重要的應用價值。
技術實現要素：
本發明的一個目的是提供一種創製攜帶蘿蔔染色體的白菜種質的方法。
本發明提供的方法，為以附加蘿蔔d染色體的甘藍型油菜作為蘿蔔染色體的載體，將所述蘿蔔染色體轉移到白菜或具備白菜生物學特性的植物，得到攜帶蘿蔔染色體的白菜或具備白菜生物學特性的植物。
上述方法包括如下步驟：
1)將所述附加蘿蔔d染色體甘藍型油菜作為母本，所述白菜或具備白菜生物學特性的植物作為父本，進行雜交，得到F1代植株；選取含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞的染色體數為30的所有F1代單株，記作F1-A；
2)將所述F1-A單株作為母本，所述白菜作為父本，回交，得到BC1群體；選取含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞的染色體數為21，且形態與所述白菜相同或接近的所有BC1單株，命名為BC1-A；
3)將所述BC1-A單株自交，得到BC1F2群體，選取含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞的染色體數為22，且形態與所述白菜相同或接近的所有BC1F2單株，為能穩定遺傳的攜帶蘿蔔染色體的白菜或能穩定遺傳的攜帶蘿蔔染色體具備白菜的生物學特性植物。
上述根尖細胞的染色體數為單個根尖細胞中的染色體數。
上述方法中，所述選取含有蘿蔔d染色體的方法為用SSR標記RSSH173-219的引物對對植株進行分子鑑定，選取含有該標記的植株；
所述SSR標記RSSH173-219的引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成。
上述方法中，所述選取符合所需根尖細胞的染色體數的植株的方法為顯微鏡鏡檢。
上述方法中，所述附加蘿蔔d染色體的甘藍型油為甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加系05-1CGMCC No.3596。
甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加系05-1CGMCC No.3596在白菜育種中的應用也是本發明保護的範圍。
含蘿蔔d染色體的白菜在形態上不是唯一的，只要具備白菜的生物學特性即可。
甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加系05-1於2010年1月27日，保藏於中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為：CGMCC No.3596，分類命名：油菜brassica napus；該附加系記載在公開號為102138515A的專利中，該專利的申請號為201010104342X，授權號為ZL201010104342X，申請日為2010.2.1。
本發明的實驗證明，本發明可以克服蘿蔔與白菜之間的遠緣雜交障礙，通過有性回交將蘿蔔染色體導入白菜且在白菜基因組背景中能穩定遺傳的方法。
與傳統的白菜和蘿蔔直接遠緣雜交方法相比，本發明以甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加系(基因組AACC+dd)作為白菜(基因組AA)與蘿蔔(基因組RR)的中間橋梁，用附加蘿蔔d染色體的甘藍型油菜與白菜進行雜交，兩者完全親和，解決了白菜與蘿蔔之間不親和的問題；並且只有1對蘿蔔染色體與白菜基因組整合，可以避免用整個蘿蔔基因組雜交引起的更多遺傳累贅，因此這種方法不但可以克服白菜與蘿蔔之間的遠緣雜交障礙，避免了白菜與蘿蔔之間的直接雜交，提高目標性狀的轉移和選擇效率,這種蕓薹屬內的雜交比蕓薹屬與蘿蔔屬之間的屬間雜交更容易成功；為白菜與蘿蔔的遠緣雜交提供了一條新的思路與方法，為白菜遺傳育種創造更多的遺傳變異。基因組成是純合的就可以穩定遺傳
下面結合附圖及最佳實施方式對本發明做進一步說明，以使公眾對發明內容有整體和充分的了解，而並非對本發明保護範圍的限定。前述部分已經充分公開了本發明可以實施的保護範圍，因此凡依照本發明公開內容進行的任何本領域公知的等同替換，均屬於對本發明的侵犯。
附圖說明
圖1為SSR分子鑑定圖。泳道從右到左分別是Marker，1個白菜親本，1個附加系親本，1個F1，1個BC1，其餘為BC1F2。
具體實施方式
下述實施例中所用的父本白菜可以從商業途徑獲得，獲得的含蘿蔔d染色體的白菜在形態上不是唯一的，只要具備白菜的生物學特性即可。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加繫於2010年1月27日，保藏於中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為：CGMCC No.3596，分類命名：油菜brassica napus；該附加系記載在公開號為102138515A的專利中，該專利的申請號為201010104342X，授權號為ZL201010104342X，申請日為2010.2.1。
實施例1、創製含蘿蔔染色體的白菜的育種方法
具體步驟如下：
一、雜交及F1代植株鑑定
1、雜交
第一年10月播種甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加系和白菜，11月分別定植5株苗於日光溫室。次年3月，以甘藍型油菜-蘿蔔d染色體附加係為母本，白菜(後代回交以此為輪迴親本)為父本進行雜交授粉；開花前2-3天，父母本花枝分別套袋隔離。母本蕾期去雄，取父本的花粉塗抹於母本的柱頭上，每株雜交20個蕾。6月份雜交種子成熟，得到F1代種子1000粒以上。
2、F1代植株分子鑑定
利用蘿蔔d染色體的SSR標記RSSH173-219檢測F1是否含有蘿蔔d染色體，有該標記的植株為含有蘿蔔d染色體，具體方法如下：
採用SDS法提取親本和F1植株幼苗葉片DNA，用SSR引物RSSH173進行PCR擴增。
SSR引物RSSH173序列如下，擴增片段大小為219bp：
FW-primer：5'-TGAGCAGAGAAGAGAATCTAGAGACA-3'(序列1)；
BW-primer：5'-CAATAACCATTAAATTGTAAACCGAA-3'(序列2)。
上述PCR擴增的反應體系為：8ng/μL DNA 1.6μL，5×PCR Buffer 1.2μL，10μM FW-primer 0.15μL，10μM BW-primer 0.15μL，5U Taq DNA聚合酶0.048μL，最後用ddH2O補齊6μL。
上述PCR擴增的程序為：94℃(5min)，94℃(30s)-50℃(30s)-72℃(30s)45個循環，之後72℃7min，4℃保存。
PCR產物用6％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，銀染檢測。
F1代植株的DNA用SSR引物SSH173做PCR均能擴增出如圖1所示的219bp的特異條帶，即F1代植株含有蘿蔔d染色體。
3、F1染色體鏡檢
染色體鏡檢方法：先固定F1植株幼苗根尖，取2～3mm左右根尖於飽和對二氯苯溶液中避光處理4h，後轉入現配的卡諾固定液(無水乙醇：冰醋酸以3：1混合)中固定3～24h。取固定後的根尖進行解離，先用蒸餾水漂洗根尖2～3次,然後將根尖放入已預熱的1mol/L鹽酸中60℃水浴6－8分鐘，再轉入蒸餾水中浸泡10分鐘以上。切取根尖用卡寶品紅染液染色4-6分鐘，常規壓片後在OLYMPUS BH-2顯微鏡下鏡檢染色體。結果F1根尖細胞的染色體數目是30。
選取F1代植株中分子鑑定含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞中染色體數為30的植株，命名為F1-A(基因組為AAC+d)。
二、回交及鑑定
1、回交
第二年10月播種上述一鑑定得到的F1-A和白菜，11月定植各5株。次年3月以F1-A單株作為母本，白菜為輪迴父本進行回交，每株授粉30個蕾。授粉方法同步驟一的1，得到的種子為BC1。
2、BC1分子鑑定
利用蘿蔔d染色體的SSR標記RSSH173-219檢測BC1群體各單株是否含有蘿蔔d染色體，有該標記的植株為含有蘿蔔d染色體，具體方法如上述一的2，結果供試的120株BC1中鑑定出58株帶該標記的單株，用於進一步的染色體鑑定。
3、顯微鏡鏡檢根尖細胞染色體
用顯微鏡鏡檢上述分子標記鑑定含有蘿蔔d染色體的BC1植株的根尖細胞的染色體數目，具體方法如上述一的3，結果篩選出9株根尖細胞的染色體數為21的BC1單株。
4、形態觀察
觀察BC1單株的形態，選取BC1群體中分子鑑定含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞的染色體數為21，且形態與白菜相同或接近的植株5株，命名為BC1-A(基因組為AA+d)。
三、BC1自交及鑑定
1、BC1自交
第三年10月將上述二鑑定得到的5個BC1-A單株播種定植於溫室，次年3月進行自交，即取某單株自身的花粉塗抹於自身花朵柱頭上，每株授粉30個蕾，套袋隔離，種子成熟後得到BC1F2。
2、BC1F2分子鑑定
利用蘿蔔d染色體的SSR標記RSSH173-219檢測BC1F2群體各單株是否含有蘿蔔d染色體，有該標記的植株為含有蘿蔔d染色體，具體方法如上述一的2，結果137個BC1F2單株中鑑定出92株含有蘿蔔d染色體的個體。
3、顯微鏡鏡檢根尖細胞染色體
用顯微鏡鏡檢上述分子標記鑑定含有蘿蔔d染色體的BC1F2單株根尖細胞染色體，具體方法如上述一的3，選擇根尖細胞的染色體數為22的BC1F2單株23株。
4、形態觀察
觀察BC1F2單株的形態，選取BC1F2單株中分子鑑定含有蘿蔔d染色體，且根尖細胞的染色體數為22，且形態與白菜相同或接近的植株，即為目的選育植株，命名為攜帶有蘿蔔d染色體的白菜(基因組為AA+dd)。
序列表
北京市農林科學院
一種創製能穩定遺傳的攜帶蘿蔔染色體的白菜種質的方法
2
PatentIn version 3.5
1
26
DNA
人工序列
1
tgagcagaga agagaatcta gagaca 26
2
26
DNA
人工序列
2
caataaccat taaattgtaa accgaa 26