細胞色素c氧化酶複合體的製作方法

2023-10-31 01:37:32

專利名稱：細胞色素c氧化酶複合體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種2-酮基-L-古洛糖酸的重組生產及其中有用的生物材料。
細胞色素C氧化酶(細胞色素aa3；EC1.9.3.1)是在線粒體及許多細菌中的有氧呼吸電子傳遞系統中一種末端氧化酶。該酶是一種跨細胞質膜複合體，其催化最終的電子傳出；周質表面的亞鐵細胞色素C(電子供體)的再氧化/細胞質表面的分子氧(電子受體)向水的還原。這些反應與質子跨膜排出偶連，且這種偶連對於由底物氧化的生物能量儲存是必不可少的。
不同類型的細胞色素複合體，例如，aa3,a1,caa3,o,bo,co,bd-型，已經被證實其具有末端氧化酶的功能；已經報導了一些末端氧化酶的純化及表徵。Matsushita等報導了醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)IFO3283含有兩個末端氧化酶，細胞色素a1及o，並且對細胞色素a1進行了純化及表徵(美國國家科學院院報97:9863,1990；細菌學雜誌174:122,1992)。Matsushita等同時也報導了從葡糖桿菌屬(Gluconobacter)中分離純化細胞色素o(生物化學生物物理學通報，894:304,1987)。Tayama等也揭示了醋化醋桿菌(A.aceti)中的末端氧化酶(細胞色素a1)基因(JP93-317054)；他們純化的氧化酶包括四個亞基(其分子量分別為72,34,21及13kDa)，且含有血紅素a及b。醋桿菌屬及葡糖桿菌屬中的氧化酶同屬醌醇氧化酶。細胞色素aa3(細胞色素C氧化酶)已從牛心，酵母，及包括脫氮副球菌(Paracoccousdenitrificans)(Solioz等，生物學化學雜誌，257:1579-1582,1982)及類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler等，生物學化學雜誌.,267:24264-24272,1992)的細菌中純化。
哺乳動物(線粒體)細胞色素C氧化酶(aa3型)複合體含有13種不同的亞基；三種核心亞基Ⅰ,Ⅱ及Ⅲ(COⅠ,Ⅱ及Ⅲ)由線粒體DNA編碼，而其餘的10種為核來源。細菌aa3型細胞色素C氧化酶也含有3種核心亞基，其與線粒體核心亞基同源。然而，據報導，純化時COⅢ容易丟失，結果導致製品中只含有COⅠ及COⅡ(Ludwig等，美國國家科學院院報，77:196-200,1980)。隨著電化學質子梯度的產生，含有2種亞基(COⅠ及COⅡ)的細胞色素C氧化酶複合體顯示出一種氧化還原活性。在使用脫氮副球菌(Haltia等，歐洲分子生物學雜誌，10:2015-2021,1991)及類球紅細菌(Cao等，基因，101:133-137,1991)的情況中，兩亞基型(COⅠ/COⅡ)型及三亞基型(COⅠ/Ⅱ/Ⅲ)複合體分別由不同的純化方法分離。從遺傳學角度來講，編碼COⅡ及Ⅲ的基因位於操縱子中，而編碼COⅠ的基因位於獨立位點(Raitio等，歐洲分子生物學雜誌，9:2825-2833,1987；Shapleigh等，美國國家科學院院報，89:4786-4790,1992)。
如上所述末端氧化酶在有氧條件下的生長中在還原分子氧過程中起到關鍵作用，在有氧發酵時，含有末端氧化酶的呼吸鏈對於完成底物氧化以產生氧化產物發揮了作用，在本申請中，其對於提高呼吸鏈的效率以有效氧化發酵至關重要。
氧化葡糖桿菌DSM4025由L-山梨糖經L-山梨酮產生的2-酮基-L-古洛糖酸(以下稱2KGA)，是L-抗壞血酸生產工藝過程中的一個重要的中間產物(T.Hoshino等，EP 0366922 A)。底物L-山梨糖至2KGA的氧化被認為是通過呼吸電子傳遞鏈完成的。催化最終電子排至分子氧的末端氧化酶很可能是在2KGA生產系統及其他氧化還原組份中的一個動力學速率限制步驟。
負責從L-山梨糖形成2KGA的原初脫氫酶已被分離(T.Hoshino等，EP606621 A)，然後該基因被克隆及測序；發現了四個同工酶(T.Hoshino等，EP832974 A)，且他們的直接電子受體細胞色素c551被純化，其基因被克隆(T.Hoshino等，EP 0869175 A)。然而，末端氧化酶卻未分離，其基因未克隆。
本發明的目的就是提供一種物質，其可以提高細胞色素C氧化酶的數量及質量，且改善在使新的細胞色素C氧化酶的基因可得的情況下由細胞色素C氧化酶完成的氧化發酵。保藏號為No.DSM4025的微生物氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)，其為一個來源優選實例，其提供了本發明的新的細胞色素C氧化酶及其遺傳物質。
本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶複合體，其從自然界進行分離或用遺傳工程手段製備。這樣一種具有細胞色素C氧化酶活性的酶複合體是可獲得的，或者得自起源於被鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的生物學或遺傳物質，或者得自具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。這樣本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶複合體，其用做呼吸鏈中介導電子傳遞的關鍵成分。
這裡作為例證的一種細胞色素氧化酶C複合體顯示出如下的物理化學特性(ⅰ)顯示出至少兩種核心亞基Ⅰ(coⅠ)及Ⅱ(CoⅡ)的存在，其中使用SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅠ的表觀分子量大約是43+/-10kDa；COⅡ的表觀分子量大約是36+/-10kDa，且(ⅱ)吸收光譜顯示出aa3-型細胞色素C氧化酶；其在還原型減去氧化型的差別光譜上表現為605+/-1nm峰。這樣一種細胞色素C氧化酶複合體可以被提供為基本上均質的分離物，它來自鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的培養物，或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
本發明的一種新的細胞色素C氧化酶複合體同樣可以以一種重組酶的形式提供，其可以包括一個重組多肽作為核心亞基Ⅰ(COⅠ)，其中的重組多肽可以選自含有具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列的多肽，及那些具有與所述序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。更進一步講，其它兩個亞基Ⅱ(COⅡ)及Ⅲ(COⅢ)可以為重組多肽，其選自含有如SEQ ID NOs:4,6和/或8所示的胺基酸序列的多肽，及那些含有具有與所述任一種胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。
作為本發明的另一方面，各自核心亞基，即COⅠ,COⅡ及COⅢ可以以重組多肽形式提供，其用於本發明的新的細胞色素C氧化酶複合體的組份。
這裡作為例證的COⅠ為一重組多肽，其包含於細胞色素C氧化酶複合體，其中多肽包含有如SEQ lD No:2所示的胺基酸序列，或者該多肽具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。一個重組的COⅠ可以為能夠為如本發明所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID No:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID No:2所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
這裡同樣作為例證的COⅡ為重組多肽，其包含於本發明的細胞色素C氧化酶複合體，其中多肽包含如SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列，或者該多肽具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。重組的COⅡ可以為能夠向如本發明所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這裡作為例證的COⅢ為重組多肽，其包含於本發明的細胞色素C氧化酶複合體。這類多肽包含有如SEQ ID NOs:6及8中任一個或兩者所示的胺基酸序列，或者該多肽具有與上述SEQ ID No6和8的胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。一個重組的COⅢ可以為能夠向如本發明所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
作為本發明的又一方面，提供了用遺傳工程手段製備各個核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ有用的重組DNA片段。這些重組多肽對於包含在本發明的新細胞色素C氧化酶複合體的組份是非常有用的。正如如上解釋的那樣，這些多肽應該能夠為本發明的複合體提供細胞色素C氧化酶活性。
這兒例證的COⅠ的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述的DNA序列(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
這裡同樣作為例證的COⅡ的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這裡同樣作為例證的COⅢ的重組DNA片段是一種編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽的DNA片段，且包括一種或多種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:7所示DNA序列或，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
此外，作為本發明的另一方面，其提供了一種含有一種或多種上述重組DNA片段的表達載體，其中載體對於在生物體如原核或真核宿主細胞中進行表達是適宜的。
更進一步說，提供一個重組生物體是本發明的另一方面，所述生物體導入了上述表達載體。本發明的這樣一個重組生物體對於本發明的重組細胞色素C氧化酶複合體的遺傳製備是非常有用的，且可用於在合適的培養基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇製備2KGA的工藝。本發明所述重組生物體的宿主細胞可以是真核來源的，最好是哺乳動物或植物細胞，也可以是原核來源的。這些宿主細胞特別是可以從細菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
本發明也可直接用於生產細胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養基中培養上述本發明重組生物體，特別是含有這裡所例證的優選DNA序列的重組生物體，且從培養基中回收細胞色素C氧化酶。
更進一步，本發明也可直接用於從L-山梨糖或D-山梨糖醇中製備2KGA的工藝，其包括在合適的培養基中培養上述本發明的重組生物體，且從培養物中回收2KGA。
下述圖及詳細說明可以進一步闡述本發明。


圖1顯示的是氧化葡糖桿菌DSM4025的aa3型細胞色素C氧化酶的吸收光譜圖。在室溫下蛋白質濃度為0.08mg/ml的含有0.5％蔗糖單月桂酸及5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)中記錄光譜。[A]顯示的是氧化型的光譜，[B]顯示的是還原型的光譜，[C]顯示的是還原型減去氧化型的差異光譜。
圖2顯示的是通過SDS-PAGE分析的純化的氧化葡糖桿菌DSM4025的細胞色素C氧化酶aa3。通過與2％SDS,50mM二硫赤蘚糖醇，62.5mMTris-HCl(pH6.8)及10％甘油在37℃下孵育5小時變性該純化酶(在0.5mg/ml蛋白質濃度下)。按照Laemmli(自然，227:680-685,1970)的方法在12.5％丙烯醯胺濃度下進行電泳，使用的緩衝液含有25mM Tris,0.192M甘氨酸，及0.1％SDS。A和B分別是6及3微克純化酶，C是低分子量預染色的SDS-PAGE標準液(Bio-Rad實驗室，CA，美國)。
圖3顯示的是來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅠ的部分胺基酸序列與來自其它生物的序列之對比。
圖4顯示的是來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅡ的部分胺基酸序列與來自其它生物的序列之對比。
圖5顯示的是來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅢ的部分胺基酸序列與來自其他生物的序列之對比。
圖6顯示的是來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的細胞色素C氧化酶複合體的部分COⅠ,Ⅱ及Ⅲ基因的PCR擴增的引物。
圖7顯示的是分別含有"COⅠ"及"COⅡ及Ⅲ"基因的8.0kb PstⅠ及9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜。
圖8顯示的是來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的完整的COⅠ胺基酸序列與來自其他生物的序列之對比。
圖9顯示的是用於表達來自於氧化葡糖桿菌DSM4025的細胞色素C氧化酶複合體的基因的pVKcoxes的遺傳圖譜。
本發明的新型細胞色素C氧化酶複合體屬於這樣的蛋白質家族，其功能為一個末端氧化酶及其基因。更為確切的講，本發明的新型細胞色素C氧化酶可用作一個末端氧化酶氧化細胞色素C，脫氫酶的電子受體例如乙醇及乙醛脫氫酶(AADH)，因此在呼吸鏈中可用作介導電子轉移的核心成份。本發明的細胞色素C氧化酶複合體可以是從自然界進行分離的，或者藉助遺傳工程的方式製備的。這樣的一個具有細胞色素C氧化酶活性的酶複合體可從起源於鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的生物材料獲得，或者從具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源培養物獲得。
正如這兒所使用術語「具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物」指的是一種具有氧化葡糖桿菌DSM4025的下述14種特徵中至少12種特徵的微生物(a)從L-山梨糖生產2-KGA；(b)將乙醇氧化成乙酸；(c)將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸及2-酮基-D-葡糖酸；(d)顯示多元醇的生酮作用；(e)在pH為4及5甘露醇肉湯培養基中顯示出菌膜及菌環生長(24小時培養)，而且，在pH為4.5葡萄糖肉湯培養基中表現出菌膜生長，(f)基本上不氧化甘油成二羥丙酮，(g)從山梨糖醇及葡糖二酸生產2-酮基-D-葡糖二酸，而不能從葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、甘露醇或者2-酮基-D-葡糖酸生產，(h)呈多態狀，無明顯的緶毛，(i)從果糖中產生褐色色素，(j)當與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或其細胞提取液共同培養時表現出好的長勢，(k)對於鏈黴素敏感，(l)具有圓形末端的杆狀，(m)平均細胞直徑大約為0.3-0.6毫米，(n)平均細胞長度大約為1-1.5毫米，且如HPLC所測，該微生物用HPLC進行測量在培養基中以至少0.01g/L的2-KGA水平從L-山梨糖生產2-KGA。除此之外，詞組「具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學上和/或分類學上同源的培養物」應該被理解為涵蓋一種包含這樣的多核苷酸序列的微生物，該多核苷酸序列在高度嚴格的條件下可與另一編碼選自SEQ ID NO:2,4,6，及8的多肽之多核苷酸序列進行雜交，正如本領域技術人員熟知的那樣，基於胺基酸序列的同源性就可鑑別該微生物。本發明的細胞色素C氧化酶複合體顯示出下列物理-化學特徵該複合體顯示出aa3型細胞色素C氧化酶在還原型減去氧化型差別光譜上的吸收波長，在605+/-1nm的吸收峰；在SDS-PAGE上，包含在細胞色素C氧化酶複合體的兩個多肽的表觀分子量大約為43+/-10kDa及36+/-10kDa。
本發明的一個新的重組酶複合體可以使用遺傳物質進行製備，所述遺傳物質即起源於鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的生物學上和/或分類學上同源的微生物的培養物的重組DNA片段。這樣一種新的細胞色素C氧化酶複合體可以包含至少一種重組多肽作為核心亞基之一。作為所述複合體核心亞基Ⅰ的重組多肽可以選自如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，和那些具有與上述序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。同樣，另外的核心亞基Ⅱ(COⅡ)及Ⅲ(COⅢ)之一或者二者均可為重組多肽。COⅡ可以選自有如SEQ ID NO:4所示部分胺基酸序列的重組多肽，和那些具有與上述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。COⅢ可以選自含有如SEQ IDNO:6和8所示的部分胺基酸序列，和那些具有與各胺基酸序列有85％或者更高相同性的部分胺基酸序列的多肽，只要這些重組多肽能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。
術語「相同性」優選地是指出現在各自位置的胺基酸不僅在其特性上相似，而且事實上也是相同的。在一個優選實施例中胺基酸序列的比較是以最佳模式進行的。
本發明也涉及包含在所述細胞色素C氧化酶複合體的多肽。包含在所述細胞色素C氧化酶複合體的多肽和描述於SEQ ID NOs:2,4,6及8的胺基酸序列最多與包含在其他細胞色素氧化酶的多肽及相應的部分胺基酸序列顯示出50-82％的同源性。例如，本發明的COⅠ多肽(SEQ ID NO:2)與來自於脫氮副球菌的COⅠα(登記號No.P08305)和COⅠβ(登記號No.P98002)，及與來自於類球紅細菌的COⅠ(登記號No.P33517)分別顯示出77％，81％及79％的同源性。本發明的部分的COⅡ多肽(SEQ ID NO:4)與分別來自於脫氮副球菌及類球紅細菌的COⅡ多肽顯示出73％及68％的同源性。本發明的部分COⅢ多肽(SEQ ID NO:6)與來自於脫氮副球菌的COⅢ多肽顯示出54％的同源性。另一種多肽(SEQ ID NO:8)與分別來自於脫氮副球菌及類球紅細菌的COⅢ多肽顯示出71％及63％的同源性。這些同源性檢索可以通過電腦程式來進行，例如通過這樣的程序"SearchHomology",Genetyx-SVIRC版本3.2.0(Genetyx軟體發展公司，東京，日本)。
這樣，各個核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ可以以重組多肽提供，這些多肽可用作本發明的新的細胞色素C氧化酶複合體的組份。
複合體中的亞基COⅠ可以是包含在本發明的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，或者該多肽包含與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供如上所述的細胞色素C氧化酶活性。重組的COⅠ也可以是能夠為本發明的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽，其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
同樣，亞基COⅡ可以是包含在本發明的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列，或者該多肽包含與所述胺基酸序列有85％或者更高的相同性的胺基酸序列且能夠為所述複合體提供如上所述的細胞色素C氧化酶活性。重組的COⅡ也可以是能夠為本發明的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步說，亞基COⅢ可以為包含在本發明的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，其中多肽分別包含有如SEQ ID NO:6及8任一或兩者所示的胺基酸序列，或者具有與SEQ ID NO:6和8各個胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列，只要所述重組多肽能夠為所述複合體提供細胞色素C氧化酶活性。重組的COⅢ可以為能夠向本發明所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的重組多肽，其被包含一種或多種選自如下的DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步講，本發明還包括上述重組多肽的功能性衍生物。這些功能性衍生物是基於本發明的胺基酸序列確定的，其可以通過增加，插入，刪除，和/或置換該序列的一個或多個胺基酸殘基來進行，其中包含有這種衍生物的細胞色素C氧化酶複合體仍然具有可以通過本領域普通技術人員周知的檢定方法或者此處描述的具體技術所測量的細胞色素C氧化酶活性。這些功能性衍生物可通過化學肽合成或者基於本領域業已周知和公開的手段如Sambrook等的方法(出處同上)(「分子克隆」二版，冷泉港實驗室出版1989，紐約)製備。一般來說不改變該分子活性的蛋白質及肽中的胺基酸交換是本技術領域的公知常識，例如H.Neurath及R.L.Hill在「蛋白質」(學院出版社，紐約，1979，特別參見圖6,14頁)中所述。最常發生的交換為Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly，反過來也成立。
本發明涉及重組DNA片段，其編碼包含在所述細胞色素C氧化酶複合體的重組多肽，該複合體是呼吸鏈中介導電子傳遞的必須組分之一。
提供了可用於通過遺傳工程手段製備各個核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ的重組DNA片段。這類重組多肽可用於包含在本發明所述的新的細胞色素C氧化酶複合體的組份。
COⅠ的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
COⅡ的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
更進一步說，COⅢ的重組DNA片段可以是編碼包含在細胞色素C氧化酶複合體的多肽且含有一種或多種選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列，或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
本發明的重組DNA片段也可以包括一種DNA序列，其在下文將給出更詳盡論述的標準嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:1,3,5或7所示序列進行雜交。
「標準條件」對於雜交來說意味著本領域普通技術人員用於檢測特定雜交信息及如Sambrook等(出處同上)所描述的條件，或最好稱為嚴格雜交及非嚴格清洗條件，或更優選稱為中度嚴格條件，甚至更優選嚴格雜交條件及嚴格清洗條件，這些對於本領域普通技術人員都是熟知的，也是為如Sambrook等(出處同上)所描述過的。
本發明同時也提供了一種表達載體，其含有一種或多種上述重組DNA片段，其中載體對於在生物體如原核或真核宿主細胞中進行表達是適宜的。這樣的表達載體可以通過將一種或多種上述重組DNA片段插入到可能攜帶有本領域所熟知的表達調控元件的合適的載體中進行構建。
此外，本發明的重組生物體可以通過將上述表達載體引入一個合適的宿主細胞進行製備。本發明的該重組生物體對於遺傳製備本發明的重組細胞色素C氧化酶複合體是非常有用的，其同樣適用於在合適的培養基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇製備2KGA的工藝。本發明的重組生物體的宿主細胞可以是真核來源的，最好是哺乳動物或植物細胞，但也可以是原核來源的。這些宿主細胞尤其可以從細菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學上和/或分類學上同源的培養物。此外，宿主細胞也可以選自下述細菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌(Acetobacterhansenii)，及氧化葡糖桿菌。
此外，本發明的另一目的是提供一種生產細胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養基中培育上述定義的重組宿主細胞，且從該培養基中回收細胞色素C氧化酶。
本發明的細胞色素C氧化酶複合體同樣適用於改進從L-山梨糖或D-山梨糖醇製備2KGA，此外，也適用於(不管是體內還是體外)在有醇及醛脫氫酶存在下從相應底物中生產醛類、碳酸類及酮類。
化合物2KGA是生產L-抗壞血酸的重要的中間物質，其可按照著名的Reichstein方法進行轉化。通過發酵從L-山梨糖或D-山梨糖醇中製備2KGA的工藝已經已知[T.Hoshino等，EP 88116156 A]。已知葡糖桿菌屬菌株可以經過山梨糖及山梨酮脫氫酶催化的反應來生產2KGA，正如農業生物化學，54(5),1211-1218,1990[T.Hoshino等]及在EP606621 A[T.Hoshino等]中揭示的那樣。負責從L-山梨糖或D-山梨糖醇製備2KGA的原初脫氫酶基因已經獲得[T.Hoshino等，EP 832974 A]。此外，作為來自原初脫氫酶的電子受體的細胞色素C其基因同樣也已經被分離[T.Hoshino等，EP 869175 A]。這些脫氫酶及細胞色素C已經被用於體外生產2KGA。其基因已被用於構造從L-山梨糖和D-山梨糖醇中製備2KGA的重組生物體，例如，攜帶有醇/醛脫氫酶(AADH)基因的惡臭假單胞菌與細胞色素C一起可從L-山梨糖製備2KGA。
因此，本發明的細胞色素C氧化酶用於生產2KGA的用途也是本發明的一個目的。
本發明的細胞色素C氧化酶複合體的末端氧化酶活性可以通過使用TMPD(N,N,N′,N′-四甲基-對-苯二胺二鹽酸鹽)進行分光光度法測量。TMPD作為人工底物(電子供體)。反應混合物例如，含有2.5mM TMPD,0.05％Tween-20及0.1M 3(N-嗎啉)丙磺酸鈉(Na-MOPS)(pH6.5)。TMPD氧化酶活性可以通過增加520nm的吸光值進行測量，TMPD的摩爾係數認為是6.1/mM/cm。一單位酶活性被定義為在室溫下每分鐘氧化1微摩爾的TMPD。
使用還原型減去氧化型的差別光譜通過檢測在605nm峰周圍的特徵性陽性峰進行a-型血紅素的分光光度鑑定和定量。每一樣品的還原可以通過添加微量連二亞硫酸鈉，氧化可以加入過硫酸銨。a-型血紅素的摩爾係數峰(605nm-630nm)認為在11.7/mM/cm。
在以更詳盡的方式描述本發明之前，先來描述一下由獲自氧化葡糖桿菌DSM4025的亞基COⅠ及COⅡ組成的純化的細胞色素C氧化酶的物理化學特性。
(1)吸收光譜細胞色素C氧化酶複合體在還原型減去氧化型差別光譜的吸收圖譜顯示於
圖1。
(2)分子量SDS-PAGE分析顯示，細胞色素C氧化酶的亞基COⅠ及COⅡ的表觀分子量分別為大約43+/-10及36+/-10Kda，顯示於圖2。
(3)COⅠ及COⅡ的胺基酸序列使用製備型圓盤SDS-PAGE(NA-1800,Nippon Eido Co,.)將純化的細胞色素C氧化酶複合體分解為COⅠ及Ⅱ兩個亞基。經過未鑑定的修飾封閉兩個N-末端α-胺基酸殘基。然後部分消化的肽片段(15-45KDa MW.)經過賴氨醯內肽酶處理獲得，用從15％SDS-PAGE板上提取的條帶進行分離，然後在Centricon-10(Amicon)中用15％甲醇及0.1％SDS洗，加入測序儀。分別從COⅠ及COⅡ獲得「KDIGLLYLVAAGVVGF」(SEQ ID NO:11)及「KASQFTHNTPLEIVWTIVPV」(SEQ ID NO:14)序列。
用於分離本發明的細胞色素C氧化酶的多肽及基因的優選菌種為氧化葡糖桿菌菌株，其已按布達佩斯條約於1987年3月17日被保藏於德意志微生物保藏中心，Gottingen(德國)，保藏號為DSM4025。而且，該菌株的傳代培養物也按布達佩斯條約被保藏於工業科技代理處，發酵研究所，日本，保藏號為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)FERM BP-3812(保藏日期1992年3月30日)。此外，EP278447也揭示了該菌株的特徵。功能等同物，傳代培養物，及所述微生物的變種及突變體也可用於本發明。具有菌株DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學或分類學上同源的培養物也可被用作本發明所述細胞色素C氧化酶的多肽及基因的來源。
本發明所提供的細胞色素C氧化酶可以如此製備，方法是通過培養一合適的生物體，破壞細胞，將其從破壞的細胞的無細胞提取物中分離，純化，最好從生物體的可溶級分中分離並純化。
生物體可在有氧條件下培養在補充合適的營養成分的含水的培養基中，在pH4～9之間進行培養，優選在含水的培養基中6～8之間進行培養。培養期的變化依賴於pH，溫度及所使用的培養基，通常2～6天就會出現有利的結果。實施該培養的優選溫度範圍為約13℃到36℃，最好為約18℃到33℃。
一般情況下要求培養基含有下述營養組份可同化的碳源，可消化的氮源，及無機物質，維生素，微量元素及其它生長促進因子。作為可同化的碳源，甘油，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯醇，L-山梨糖，D-山梨醇及其類似物可使用。
不同的有機或無機物也可用作氮源，可使用例如酵母提取液，肉膏提取物，蛋白腖，酪蛋白，玉米浸出液，尿素，胺基酸，硝酸鹽，銨鹽及其類似物。作為無機物，硫酸鎂，磷酸鉀，氯化鐵和氯化亞鐵，碳酸鈣及其類似物。
下面將要詳細描述經過培養從生物體中分離及純化細胞色素C氧化酶及克隆基因/DNA序列的實施例。
(1)經過離心或過濾從發酵肉湯中收穫細胞。
(2)細胞懸於緩衝液中，且用勻漿器、超聲波儀處理或者用溶菌酶及其類似物處理得到細胞的裂解液。
(3)使用常用的蛋白質純化法例如硫酸銨沉澱法，透析法，離子交換色譜法，凝膠過濾色譜法及親和色譜法從生物體的破裂細胞的無細胞提取液中，優選地可溶性級分中分離和純化細胞色素C氧化酶。
本發明所提供的細胞色素C氧化酶用作末端氧化酶氧化細胞色素C，來自屬於脫氫酶的酶之電子受體，用於從醇類及醛類生產醛類，羧酸類及酮類，尤其是從L-山梨糖或D-山梨糖醇經過L-山梨酮(L-sorbosone)來生產2KGA。
簡單來講，本發明所用的細胞色素C氧化酶基因、DNA序列、重組表達載體及重組生物體(也可稱為轉化宿主細胞)均可以通過下述步驟獲得(1)從發明所述的能夠提供細胞色素C氧化酶的重組生物體中分離染色體DNA，然後在大腸桿菌中構建染色體DNA基因文庫。
(2)通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法，PCR克隆法(聚合酶鏈式反應)或Western-blot分析法或類似方法；(3)由常用方法確定如上述所得細胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列，以挑選含有所述細胞色素C氧化酶基因的重組DNA片段；且構建其中細胞色素C氧化酶基因可充分表達的表達載體。
(4)通過轉化、轉導、轉接合及電穿孔技術構建攜帶有細胞色素C氧化酶基因的重組生物體。
用於本發明上述方面的材料和技術下面將詳細例證說明總染色體DNA可以被本領域貫知技術純化。通過下述方法，從總染色體DNA將編碼細胞色素C氧化酶的基因克隆於質粒或噬菌體載體中(ⅰ)經過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳從凝膠中分離整個蛋白質或肽酶處理的多肽片段，並且將其應用於蛋白質測序儀，例如應用生物系統自動氣相測序儀470A(Perkin Elmer Corp.,Norwalk,Conn.,美國)確定來自於純化的細胞色素C氧化酶亞基的部分胺基酸序列，使用DNA合成儀例如應用生物系統自動DNA測序儀381A(Perkin Elmer)按照上述獲得的胺基酸序列來合成寡核苷酸探針，從帶有目的基因的該菌株基因文庫中分離攜帶有目的基因的克隆，方法是使用寡聚核苷酸探針通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法；(ⅱ)使用免疫學方法用針對細胞色素C氧化酶亞基的抗體，從基因文庫中挑選表達細胞色素C氧化酶亞基的克隆；或者(ⅲ)使用兩個寡聚核苷酸(按照上述確定的胺基酸序列合成)，使用PCR方法從總染色體DNA中擴增DNA，然後通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法用由此獲得的PCR產物作為探針，從構建於大腸桿菌的基因文庫中分離攜帶有細胞色素C氧化酶亞基的完整基因的克隆。上述作用於細胞色素C氧化酶亞基的抗體可以通過使用純化的細胞色素C氧化酶亞基的蛋白質或者其片段使用如酶學方法，73卷，46頁，1981所述方法獲得。
細胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列可以通過大家熟知的雙脫氧鏈終止法使用M13噬菌體確定(Sanger F.等，美國國家科學院院報，74:5463-5467,1977)。
為了表達細胞色素C氧化酶複合體亞基的基因，可以使用多種啟動子；例如最初的位於所述細胞色素C氧化酶亞基的基因上遊的啟動子，抗生素抗性基因的啟動子，例如Tn5卡那黴素抗性基因(Berg,D.E.,和C.M.Berg.1983。生物/技術1:417-435)，pBR322氨苄青黴素抗性基因，及大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lac),trp-、tac-、trc-啟動子，λ-噬菌體啟動子，及其它在宿主中(包括這樣的生物體，如細菌，諸如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌，特別是氧化葡糖桿菌DSM4025，和哺乳動物細胞及植物細胞)有功能的啟動子。
為了上述目的，在編碼序列導入的宿主細胞中為可操縱的其他一些調控元件如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主細胞中可操作的天然或合成序列)及轉錄終止子(反向重複結構，包括在宿主細胞中可操作的天然或合成序列)將被導入且與上述啟動子一起使用。
宿主/克隆載體組合的廣泛多樣性可被應用於克隆雙鏈DNA。克隆載體一般地說是質粒或噬菌體，其含有複製起點，調控元件，包含有多重克隆位點及選擇標誌如抗生素抗性基因(如氨苄青黴素，四環素，卡那黴素，鏈黴素，慶大黴素，壯觀黴素等抗性基因)的克隆位點。
在大腸桿菌中表達目的基因的優選載體可從例如pBR322或其衍生物包括pUC18及pBluescriptⅡ,pACYC177,pACYC184[細菌學雜誌，134:1141-1156,1978]或其衍生物等一般用於大腸桿菌的載體中的任一個選擇，也可從寬宿主範圍質粒如RK2及RSF1010中選擇。在包括氧化葡糖桿菌DSM4025的葡糖桿菌屬及惡臭假單胞菌中表達目的基因的優選載體可從在葡糖桿菌屬和/或惡臭假單胞菌中，以及在優選的克隆生物(如大腸桿菌)中可複製的任何載體中選擇。優選載體是寬宿主範圍載體，如粘粒載體(如pVK102)及其衍生物，和RSF1010及其衍生物，以及這樣的載體，其含有在葡糖桿菌屬中有功能的複製起點及另一個在大腸桿菌中有功能的複製起點。為了穩定和有效表達克隆基因及有效培養攜帶有該克隆基因的宿主細胞，應仔細考慮該載體的拷貝數量及其穩定程度。含有轉座因子如Tn5的DNA序列也可被用作載體，以將目的基因引入適宜的宿主細胞中去尤其是其染色體中去。含有從優選宿主細胞中分離出來的任一DNA的DNA序列與目的基因一起對於在優選宿主尤其是染色體上引入目的DNA序列是非常有用的。該DNA序列可以通過轉化、轉導、轉接合或者電穿孔技術轉移進入優選宿主。
可以作為宿主的有原核或真核起源的，且可包括生物體，哺乳動物細胞和植物細胞等。作為優選的生物體，這兒可能提到的細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，氧化葡糖桿菌，及其他任何可以生產重組細胞色素C氧化酶的革蘭氏陰性菌。功能等同物，傳代培養物，突變體，及所述生物體的變異體也可被用於本發明。優選的菌株為大腸桿菌K12及其衍生物，惡臭假單胞菌或者氧化葡糖桿菌DSM4025及具有菌株DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學或分類學上的同源培養物。
由本技術領域所熟知的方法，將編碼本發明細胞色素C氧化酶的DNA序列連接到含有控制區域如啟動子和核糖體接合位點及轉錄終止子的適宜載體中，所述控制區域在上述宿主細胞中可操作以產生表達載體。
為了構建攜帶有表達載體的宿主細胞，可使用多種DNA轉移方法，包括轉化，轉導，接合交配(14及15章，普通及分子細菌學方法，Philipp Gerhardt等編，美國微生物學會，1994)，及電穿孔技術。構建轉化宿主細胞的方法可以從分子細菌學領域熟知的方法中進行選擇。一般的轉化系統可用於大腸桿菌，假單胞菌屬及醋桿菌屬，轉導系統可同樣用於大腸桿菌接合轉移系統，接合交配系統被廣泛用於革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。在WO89106688已描述了優選的接合交配方法。接合可發生在液體介質或固體表面，生產細胞色素C氧化酶的優選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。生產2KGA的優選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌，其可以用適宜重組表達載體產生活性的AADH及細胞色素C。生產2KGA的優選受體是氧化葡糖桿菌DSM4025。對於接合交配受體，經常增加一個選擇性標記，例如，萘啶酮酸或利福平抗性被經常用到。
下述實施例進一步證明了本發明，但並不作為對本發明的任何限制。
氧化葡糖桿菌DSM4025 30℃下有氧培養在5升FYC培養基中27小時，培養基組成為10％L-山梨糖(分別消毒)，0.05％甘油，1.6％尿素(分別消毒)，0.25％MgSO4×7H2O,6.25％麵包酵母細胞，1.5％CaCO3(生產級，nacalai tesque,Kyoto，日本)及3.0％玉米漿，pH7.5(滅菌前)經過培養，固體物質如CaCO3及酵母細胞用低速離心進行沉澱並棄去(1,000rpm,5分鐘)。存留在培養液上清液中的氧化葡糖桿菌DSM4025細胞在8,000rpm下離心20分鐘收集，並用含有0.25M NaCl及2mM MgCl2的25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺酸]鈉(Na-HEPES)(pH7.5)進行一次清洗。
最終的細胞(大約35g溼重)懸於大約200ml的含有0.5mM乙二氨四乙酸(EDTA)，0.5mM乙二醇-雙-β-氨基乙醚(EGTA)，0.5mM苯甲基磺醯氟(PMSF),1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素，10微克/毫升DNaseI及10微克/毫升RNaseA的25mM Na-HEPES(pH7.5)中。懸浮細胞用French細胞壓碎勻漿器在1500kg/cm2下處理兩次。所得懸浮液在10,000rpm下離心10分鐘以去除細胞碎片，收集上清液作為無細胞抽提液(424.0mg蛋白)。無細胞抽提液在55000rpm下進行超速離心1小時，以回收粗膜級分沉澱。粗膜級分在含有1.2％Tween20,0.25M NaCl,2mM MgCl2,0.5mM PMSF,1微克/毫升抑肽素A,1微克/毫升亮肽素的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中重懸浮，孵育1小時後洗去細胞膜。級分再一次在55000rpm下進行超速離心1小時以回收洗過的膜級分沉澱物質。洗過的膜級分在含有1.5％單月桂酸蔗糖(DOJIN Laboratories,Kumamoto，日本)，2mM EDTA及5％甘油的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中孵育1小時，以溶解膜結合蛋白，所得的懸浮液在55000rpm下進行超速離心1小時，以獲得溶解的膜級分之上清液(50ml)。溶解膜級分的還原型減去氧化型差別光譜在605nm附近處顯示出特徵性正峰；該峰對應於每毫克粗蛋白內容物0.41nmole的a-型血紅素。然後，溶解的膜級分中的膜結合蛋白被上樣到DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH,Tokyo，日本)柱(ID2.2×5cm)中，其已經用含有0.5％單月桂酸蔗糖及5％甘油的25mM Na-HEPES進行平衡。用相同的緩衝液條件中線性梯度為0-0.35M的NaCl進行分級分離。顯示a-型血紅素光譜的級分(在還原型減去氧化型差別光譜上的605nm周圍的正峰)及TMPD氧化酶活性在大約0.28M濃度的NaCl處洗脫。然後收集這些級分(64ml)，用含有45mM NaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的45mM磷酸鉀緩衝液[KPB](pH7.6)進行透析，酶溶液上樣到羥基磷灰石(TONEN Co.,Tokyo，日本)柱(ID1.5×6cm)，其已用相同的緩衝液進行平衡。柱子用相同的緩衝液洗滌，然後用含有500mMNaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的500mM KPB(pH7.6)洗滌，活性級分用含有900mM NaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的900mM KPB(pH7.6)進行洗脫且收集。來自羥基磷灰石柱的該級分(8.6mg蛋白)用含有0.5％單月桂酸蔗糖和5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)進行透析，使用YM-30膜(Amicon Inc.,MA，美國)經超濾濃縮，且以純化蛋白儲於-30℃。
在0.5％單月桂酸蔗糖存在下，該純化蛋白用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)進行分析，該蛋白顯示出一條呈綠色的可見條帶(不經過蛋白染色)，其相應於單一的蛋白帶(經過蛋白染色)。純化蛋白具有2.6單位/毫克的TMPD氧化酶活性，且顯示出aa3型細胞色素C氧化酶的典型的吸收光譜譜型(圖.1)。a-型血紅素的量估計為19.2nmole/mg純化蛋白。就來自於洗滌膜的a-型血紅素含量而言純化倍數大約為100倍，回收率90％。這些結果表明純化蛋白是在氧化葡糖桿菌DSM4025中具有TMPD-氧化酶活性的主要成分(其可作為呼吸系統中的末端氧化酶)。在SDS-PAGE分析中，純化蛋白被分解為兩個蛋白組份一條顯示出一個寬帶，其表觀分子量大約為43,000(命名為COⅠ)，另一條顯示出一條窄帶，其表觀分子量大約為36,000(命名為COⅡ)(圖.2)。
根據脫氮副球菌，類球紅細菌及牛線粒體的總胺基酸序列對比以及純化的COⅠ及COⅡ多肽的胺基酸序列(SEQ ID NOs:11和14)，選擇下述胺基酸序列用於PCR引物以擴增COⅠ及COⅡ基因的部分DNA序列SEQ IDNO:9及SEQ ID NO:10用於COⅠ基因；SEQ ID NO:15及SEQ IDNO:16用於COⅡ基因。已被報導包括在細胞色素C氧化酶複合體中的第三種組份(COⅢ)並不存在於從氧化葡糖桿菌DSM4025中純化的製品中；不存在的原因似乎是因為在純化過程中已解離。為了證實且擴增編碼推定的氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅢ基因的部分DNA序列(如果存在的話)，選擇在脫氮副球菌、類球紅細菌及牛線粒體的三個COⅢ基因編碼的多肽中保守的兩個胺基酸序列(圖5.)SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18用於COⅢ基因。設計COⅠ,COⅡ或COⅢ各自的引物對(圖6)。使用GeneAmpTMDNA擴增試劑盒(Takara Shuzo,Kyoto，日本)且按照供應商的建議使用Parkin-Elmer Cetus Instruments熱循環儀進行PCR反應，反應包括30個這樣的循環1)在94攝氏度下熱變性一分鐘；2)在42或者50攝氏度下退火兩分鐘；及3)在72攝氏度下合成3分鐘。反應混合物(100微升)包含有200微摩爾的dNTP,2.9微摩爾(用於32簡併性)或5.8微摩爾的(用於64簡併性)的各引物，2.2ng氧化葡糖桿菌DSM4025的染色體DNA及25單位在提供的緩衝液中的Taq聚合酶。用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)通過使用溴化乙錠染色來檢測PCR產物。結果，擴增了具有期望長度的DNA片段(COⅠ為大約180bp,COⅡ為大約180bp,COⅢ為大約300bp)。(2)PCR擴增DNA片段的克隆和核苷酸測序從瓊脂糖凝膠中純化PCR擴增的DNA片段，且被直接克隆進入pCRTMⅡ載體中(Invitrogen公司，美國)，DNA序列按照供應商的提示測定。由PCR產物的核苷酸序列推導出來的胺基酸序列與序列對比中目標位置的序列顯示出很大的同源性(圖3至圖5)。編碼COⅠ,COⅡ及COⅢ的部分胺基酸序列的PCR產物用32P進行標記，以分別獲得探針Pco1,Pco2，及Pco3。這些探針被用於Southern-或者集落雜交以檢測完整的COⅠ,COⅡ，及COⅢ基因。(3)使用PCR產物作為探針進行氧化葡糖桿菌DSM4025染色體DNA的Southern-印跡分析用多種限制性內切核酸酶消化的氧化葡糖桿菌DSM4025染色體DNA通過使用探針進行Southern雜交。探針Pcol雜交於PstⅠ片段(8.0kb)，探針Pco2及Pco3雜交於EcoRⅠ片段上(9.3kb)。(4)在8.0kb PstⅠ片段(COⅠ)及9.3kb EcoRⅠ片段(COⅡ及COⅢ)中克隆完整的細胞色素C氧化酶基因氧化葡糖桿菌DSM4025的染色體DNA用PstⅠ或者ECoRⅠ完全消化，對所得的片段進行瓊脂糖凝膠電泳。切出大約9.3kb(7-12kb)的EcoRⅠ消化產物和大約8kb(6-10kb)的PstⅠ-消化產物，從凝膠中洗脫出來。回收的DNA片段與用PstⅠ或者EcoRⅠ消化的pUC19載體進行連接以轉化大腸桿菌JM109。大約獲得了1,000個轉化子作為PstⅠ-或EcoRⅠ-文庫。用探針Pco1對PstⅠ文庫進行集落雜交，且對EcoRⅠ文庫用探針Pco2及Pco3雜交。從每一文庫中，獲得幾個陽性克隆。從克隆中抽提質粒DNA，且用PstⅠ或者EcoRⅠ進行消化；8.0kb PstⅠ片段與探針Pco1顯示出強的信號，9.3kb EcoRⅠ片段與探針Pco2及Pco3均顯示出強的信號。含有8.0kb PstⅠ片段的質粒命名為pUCO01，含有9.3kb的EcoRⅠ片段的質粒命名為pUCO23。(5)8.0kb PstⅠ和9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜8.0kb PstⅠ及9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜可以通過使用探針Pco1,Pco2及Pco3對多種限制性內切核酸酶消化的片段進行Southern雜交分析來構建。編碼9.3kb EcoRⅠ片段的COⅡ及COⅢ基因的方向與距離可以用來自於部分核苷酸序列的引物(圖7)通過PCR方法來確定。(6)完整的COⅠ基因的核苷酸測序pUCO01上的COⅠ基因的核苷酸序列可以通過雙脫氧鏈終止法進行測定。如圖7所示，一個來自於HindⅢ位點的上遊的2.9kb的片段被測序，並在該片段上發現了一個開放閱讀框(1,674bp的CDS，存在於如SEQ ID NO:1所示的序列中)。該ORF編碼558個胺基酸序列的蛋白(序列表SEQ ID NO:2)，其包含一個與來自於純化的COⅠ的多肽片段的胺基酸序列(SEQ ID NO:11)，及從COⅠ的大約180bp的PCR產物[參見3-(1)]之DNA序列推斷的胺基酸序列(SEQ ID NO:13)相一致的區段。氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅠ胺基酸序列與類球紅細菌，脫氮副球菌及牛線粒體相比較，分別顯示出78.7％,76.0％及53.3％的同源性(圖8)(7)編碼全部COⅠ,COⅡ，及COⅢ基因的表達質粒的構建經過完全的HindⅢ及部分的EcoRⅠ消化以一個3.5kb的片段從在pUCO0l的8.0kb PstⅠ片段中分離COⅠ基因(圖7)。按照pUCO23上的9.3kbECORⅠ片段的物理圖譜，COⅡ及COⅢ基因經過完全的KpnⅠ消化及部分Psd消化以產生一個串聯形式的6.0kb的片段(圖7)。每一片段亞克隆進pBluescriptⅡ SK+載體以獲得含有COⅠ基因的3.5kb片段的質粒pBCO01及含有COⅡ和COⅢ基因的6.0kb片段的質粒pBCO23。
正如圖9所示，含有COI基因的3.5kb片段及含有COⅡ及COⅢ基因的6.0kb片段被共同整合入一個表達載體中去，用於功能性表達細胞色素C氧化酶複合體(COⅠ,COⅡ，及COⅢ)的基因。首先，通過平端連接，將含有來自於pBCO23的COⅡ及COⅢ基因的6.0kb XbaⅠ-KpnⅠ片段插入質粒載體pVK101的EcORⅠ位點。然後，將含有來自於pBCO01的COⅠ基因的3.5kbXbaⅠ-HindⅢ片段插入具有6.0kb的XbaⅠ-KpnⅠ片段的pVK1O1的BglⅡ位點。所得質粒載體被命名為pVKcoxes。
培養所得的轉接合子GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK1O2)，兩種轉接合子細胞按照實施例1的方法製備。通過下列實驗測定，GOS2RPM(pVKcoxes)中的細胞色素C氧化酶水平類似於GOS2RPM(pVK1O2)。從這兩個菌株中，溶解的細胞膜級分按照實施例1的方法製備。首先，通過還原型減去氧化型差別光譜法(實施例1)，對應於GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK1O2)a-型血紅素含量分別為0.031及0.022nmole/毫克細胞蛋白。其次，測量細胞色素C(購買於Sigma，馬心臟Ⅵ型)比氧化速率。還原型的細胞色素C以連二亞硫酸鈉作為還原劑製備，過量的還原劑由PD-10柱(Pharmacia)處理兩次去除。反應混合物由33mM還原型細胞色素C,25mM Na-HEPES(pH7.2),2％蔗糖單月桂酸及0.5mM EDTA組成。還原型細胞色素C的氧化速率由在550nm處吸收峰的減少來進行測量，摩爾係數認為是21.1/mM/cm。分別對應於GOS2RPM(pVK102)及GOS2R(pVKcoxes)的還原型細胞色素C的比氧化速率分別為1.58及2.00nmole/毫克細胞蛋白每分鐘。第三，COⅠ及COⅡ組份的含量通過針對組份COⅠ或COⅡ的抗體之Western-blot分析比較獲得。在GOS2RPM(pVKcoxes)上可以觀察到更強的條帶強度(使用CCD照相機，對於COⅠ增加60％，對於COⅡ增加41％)。這些結果提示，引入pVKcoxes導致在產生2KGA的氧化葡糖桿菌DSM4025衍生物中細胞色素C氧化酶複合體水平的功能性擴增。
序列表110F.HOFFMANN-LA ROCHE AG120細胞色素C氧化酶及其基因130細胞色素C氧化酶及其基因14014116018170PatentIn Ver.2.021012111674212DNA213氧化葡糖桿菌220221CDS222(1)..(1674)4001atg gca gac gcc gcc att cac ggc cat gac cac cat gag aag caa ggc 48Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15ttc ttc acg cgc tgg ttc atg tcg acc aac cac aaa gac atc ggt ctg 96Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30cta tac ctt gta gcg gct ggt gtt gtt ggt ttc att tcc gtc ctg ttc 144Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45acc gtc tac atg cgc ctt gag ctg atg gat ccg ggt gtt cag tac atg 192Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60tgc ctt gaa ggc gca cgt ctg atc gcg gat gcc tcg cag aca tgt acg 240Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 75 80gcg aac gga cac ctg tgg aac gtc atg gtt acc tac cat ggt att ctg 288Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile Leu85 90 95atg atg ttc ttt gtg ggt atc 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1．具有細胞色素C氧化酶活性的細胞色素C氧化酶複合體，它可獲自來源於鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物的生物學或遺傳材料。
2．如權利要求1所述的細胞色素C氧化酶複合體，其顯示如下的物理化學特性(ⅰ)顯示出存在至少兩種核心亞基Ⅰ(COⅠ)及Ⅱ(COⅡ)，其中使用SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅠ的表觀分子量大約是43+/-10kDa；以SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅡ的表觀分子量大約是36+/-10kDa，且(ⅱ)吸收光譜顯示出aa3-型細胞色素C氧化酶；其在還原型減去氧化型的差別光譜上表現為605+/-1nm峰。
3．如權利要求1或2所述的細胞色素C氧化酶複合體，它是從鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的培養物或具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物衍生的基本上同源的分離物。
4．如權利要求1-3之一所述的細胞色素C氧化酶複合體，它是重組酶。
5．如權利要求4所述的細胞色素C氧化酶複合體，它包含的重組多肽選自具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列的多肽，及那些與所述序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列並能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。
6．如權利要求4或5所述的細胞色素C氧化酶複合體，它含有至少一種重組多肽，該多肽選自含有由SEQ ID NO:4、6和/或8所示的胺基酸序列的多肽，及那些含有與所述胺基酸序列中的任意一個有85％或者更高相同性的胺基酸序列並能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽。
7．包含在如權利要求1-6之一所述的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，該多肽包含由SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，或該多肽包含與所述的胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列並能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。
8．能夠為如權利要求1-6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的權利要求7所述的重組多肽，它由含有選自如下DNA序列的重組DNA片段編碼(a)由SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有由SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
9．包含在權利要求1-6之一所述的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，該多肽含有由SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列，或者該多肽含有與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為複合體提供細胞色素C氧化酶活性。
10．能夠為權利要求1-6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的如權利要求9所列舉的重組多肽，該多肽由含有選自如下DNA序列的重組DNA片段編碼(a)由SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有由SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
11．包含在權利要求1-6之一所述的細胞色素C氧化酶複合體中的重組多肽，該多肽含有由SEQ ID NO:6或8所示的胺基酸序列，或者該多肽具有與SEQ ID NO:6和8的任一個所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列且能夠為所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性。
12．能夠為如權利要求1-6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的如權利要求11所示的重組多肽，該多肽由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段所編碼(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，以及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
13．一種重組DNA片段，其含有一種如權利要求8所述的DNA序列且它編碼一種能夠為如權利要求1-6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽的胺基酸序列，其中所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示胺基酸序列或者與所述胺基酸序列具有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
14．一種重組DNA片段，其含有一種如權利要求10所述的DNA序列且其編碼一種包含於能夠為如權利要求1-6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽的胺基酸序列，其中，所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
15．一種重組DNA片段，其含有一種如權利要求12所述的DNA序列且其編碼一種包含於能夠為如權利要求1～6之一所述的複合體提供細胞色素C氧化酶活性的多肽的胺基酸序列，其中，所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示胺基酸序列或者具有與所述胺基酸序列有85％或者更高相同性的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
16．一種含有選自如權利要求13,14及15所述片段的一種或多種重組DNA片段的表達載體，其中該表達載體適宜於在生物體中進行表達。
17．如權利要求16所述的表達載體，其中，該生物體是一種微生物，其選自下述細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
18．如權利要求16所述的表達載體，其中該生物體是一種鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
19．一種導入了由權利要求16-18中任一項所述的表達載體的重組生物體。
20．如權利要求18所述的重組生物體，其中，該重組生物體攜帶有一種或多種選自權利要求13,14及15所述的已整合進其基因組中的DNA片段。
21．如權利要求19或20所述的重組生物體，其中宿主生物體是一種微生物，其選自下列細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
22．如權利要求19或20所述的重組生物體，其中該宿主生物體是一種鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
23．一種生產細胞色素C氧化酶複合體的方法，其包括在合適的培養基中培養如權利要求19-22之一所限定的重組生物體，且從培養物中回收細胞色素C氧化酶。
24．如權利要求23所述的生產方法，其中宿主生物體是微生物，其選自下列細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
25．如權利要求23所述的生產方法，其中該宿主生物體是一種鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑定特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
26．一種從L-山梨糖或D-山梨糖醇中製備2-酮基-L-古洛糖酸的方法，其包括在合適的培養基中培養如權利要求19-22中所述的重組生物體，及從培養物中回收2-酮基-L-古洛糖酸。
27．如權利要求26所述的方法，其中宿主生物體是一種微生物，其選自下列細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
28．如權利要求26所述的方法，其中該宿主生物體是鑑定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑑別特徵的微生物的生物學和/或分類學上同源的培養物。
全文摘要
本發明提供了一種新的細胞色素C氧化酶複合體,用於製備所述複合體的遺傳材料,例如包含在細胞色素C氧化酶複合體的重組多肽,重組DNA片段,表達載體,重組生物體及其類似物。這種新的細胞色素C氧化酶複合體及遺傳材料可起源於具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑑定特徵的微生物。本發明同樣也提供了一種製備所述新的重組細胞色素C氧化酶複合體的方法及一種生產2－酮基－L－古洛糖酸(2KGA)的方法。
文檔編號C12P7/60GK1303928SQ0013804
公開日2001年7月18日 申請日期2000年11月17日 優先權日1999年11月17日
發明者淺倉昭, 星野長尾, 真城正子 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司