與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因及其應用的製作方法
2023-10-31 02:31:57
專利名稱：與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因及其應用。
背景技術：
世界人口不斷增長，預期到2050年結束，世界人口可達到60億。另一方面，世 界20%的可耕土地嚴重的鹽漬化，嚴重影響了糧食的產量。糧食作物的供給正受到土 地鹽漬化的威脅。理解生物抗鹽機制對於利用育種和基因工程的方法改良作物耐鹽性 是十分重要的。
甘油是重要的輕化工原料，甘油市場供不應求。隨著石油能源和可耕土地不斷的 減少，化學法生產甘油遭遇瓶頸，產量亦不斷減少。化學合成法生產甘油(丙三醇) 的經濟效益不斷下降。因此發酵法生產甘油的競爭力不斷突出。發酵法具有安全性好， 原料豐富易得，設備要求簡單的優點。因此利用改良發酵菌株提高甘油產量具有重要 的經濟價值。
鹽藻(D,"fe/to)廣泛分布於鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環境中，尤其在高 鹽水域中是主要種群。鹽藻是最耐鹽的真核生物，具有十分驚人的滲透調節能力，能 在低至50mM高至接近飽和的鹽濃度的環境下生存，可以一次性耐受3-4倍的滲透壓 變化。
鹽藻能通過調節細胞內甘油的濃度來維持細胞內外的滲透壓平衡以抵抗環境中 的鹽脅迫。通常情況下，甘油是鹽藻體內唯一的滲透劑。鹽藻體內的甘油濃度是隨著 細胞外的鹽濃度呈正相關變化。當鹽藻細胞受到高鹽脅迫震蕩的瞬間，細胞迅速啟動 甘油合成途徑合成甘油以維持細胞內外的滲透壓的平衡，並在90min內就可以完成調 節。鹽藻體內積累大量的甘油，並且在極高的鹽濃度(>3.5MNaCl)時，細胞內甘 油的濃度可以高達50%。
鹽藻甘油代謝途徑調控機制的研究是理解鹽藻獨特的耐鹽能力的關鍵之一。鹽藻 甘油合成主要場所是葉綠體。已知鹽藻細胞甘油合成途徑是磷酸二羥丙酮(DHAP) 催化生成甘油的途徑。兩個酶參與催化DHAP向甘油的轉化，即DHAP首先通過甘 油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)催化轉化為甘油-3-磷酸(G3P)， G3P再通過磷酸甘油磷 酸酶(GPP)的催化轉化成為甘油。
在酵母中的研究證實，GPDH是甘油合成過程中的關鍵酶。鹽藻中研究發現鹽藻中甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)同樣是控制DHAP轉化為甘油的關鍵酶，並且GPDH 活性是鹽藻調控甘油合成途徑的靶點。因此克隆分析鹽藻中GPDH基因是深入理解 鹽藻抗鹽機制和高積累甘油能力的關鍵，同時也會為生物耐鹽基因工程和通過發酵法 生產甘油提供重要的基因資源。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因。
本發明的目的之二在於提供該基因的編碼蛋白。
本發明的目的之三在於提供包含該基因的重組載體。
本發明的目的之四在於提供包含該基因的轉化體。
本發明的目的之五在於提供該基因在提高甘油合成能力中的應用。
本發明的目的之六在於提供該基因在提高耐鹽能力中的應用。
為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
一種與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因，其特徵在於該基因具有下列核 苷酸序列之一
(1) .具有SEQ N0 1—2所示的DNA序列；
(2) .與序列表中序列1-2限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同 功能蛋白質的DNA序列。
上述的與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的編碼蛋白，其特徵在於該編 碼蛋白具有序列表中序列3-4的胺基酸殘基序列或者是將序列3-4的胺基酸殘基序 列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列3-4的胺基酸殘 基序列相同活性的由序列3-4衍生的蛋白質。 一種含有上述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的重組載體。 一種含有上述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的轉化子。 一種上述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因在提高甘油合成能力中的應用。
一種上述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因在提高耐鹽能力中的應用。
本發明首次從鹽藻(D^aZ/e/k WnW&)中分離到兩個甘油合成的關鍵基因 DvGPDHl和DvGPDH2，並首次通過轉化酵母細胞證明了這兩個基因的功能及其在 提高生物體耐鹽能力和甘油合成方面的應用價值，這兩個基因在基因工程改良和工業 生產甘油中具有很好的應用前景。
圖1為本發明的甘油-3-磷酸脫氫酶基因DvG屍//7和DvG戶D//2的編碼蛋白 具有SERB-GPDH雙結構域，並且含有保守的葉綠體轉移肽。
圖2為本發明的甘油-3-磷酸脫氫酶基因iX7屍//7和Z)vG戶Z)//2基因同源性 分析。其中A是GPDH同源基因分析圖，B是SERB同源基因分析圖。
圖3為本發明的甘油-3-磷酸脫氫酶基因DvG戶/W和DvGPD/K基因在酵母 突變體g/^/z/中的功能分析。其中A的功能分析使用了酵母表達載體pAJ401， B的功能分析使用了酵母表達載體pYES2。
圖4為本發明的甘油-3-磷酸脫氫酶基因和DvG戶D//2基因在不同 鹽脅迫下的表達模式。其中A為鹽藻在鹽振蕩下體內甘油合成的模式，B為穩定 生長在不同鹽濃度環境下的鹽藻體內DvGP//7和DvGPZ)i/2的表達模式，C為 DvOP//7和Zh;G/lD//2在經鹽振蕩處理後鹽藻體內的表達模式。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本 發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方 法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳法實驗指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述條件，或按照製造廠商所建議的條件。 實施例一DvC^D/O和DvG戶DH2全長編碼區的克隆與分析
提取鹽藻總RNA，反轉錄cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，通過PCR， 利用引物GPDH15'p禾卩GPDH13'p克隆到DvOPD7W，通過引物GPDH25，p禾口 GPDH23'p克隆到DvOPD//2。為了進一步在酵母中證明這兩個基因的功能及應 用(實施例三)，通過引物GPDH15'p和GPDH25'p在基因5'端加入克隆酶點五coi /和真核翻譯保守序列Kozak;通過引物GPDH13'p和GPDH23'p在基因3'端加 入克隆酶點^w /。
引物序列如下 (1)GPDH15'p (引入五coRI酶切位點和Kozak序歹U):
5'-AGAATTCAGCATGGTCCTAGGGTCATCACC-3， 粗體為￡coR I識別位點，下 劃線所示為Kozak序列(2) GPDH13'p (引入，ol酶切位點)5，-ATCTCGAGCCAGTGCATGCTCTTTAAATGAC-3，粗體為^ w I識別位點；(3) GPDH25，p (引入￡coR I酶切位點和Kozak序歹!j):5 ， - AG AATTC AC AATGGTTCTC AAGGG AGGGAG-3 ，粗體為￡coR I識別位點，下 劃線所示為Kozak序列；(4) GPDH23 'p (引入屈o I酶切位點)5，-ATCTCGAGTGTTCAAATTGCTTAAATGCAC-3，粗體為I識別位點；對獲得的基因進行分析DvOP//7的cDNA全長2525bp，其中ORF為2088bp， 73nt處是ATG， 2158nt處是終止子TAG。 Vector NTI9丄0軟體的分析結果顯示 最長讀碼框編碼了一個含695個胺基酸的蛋白，蛋白分子量大小為76.2kDa，等 電點為6.42。DvOP/Z2的cDNA全長2759bp，其中ORF為2106bp， 74nt處是ATG， 2177nt處是終止子TAA，最長讀碼框編碼了一個含701個胺基酸的蛋白，蛋白分 子量大小為77.2kDa，等電點為6.73。在Z)vG屍D//2上遊59nt處有一個與預測蛋 白序讀碼框同框的終止子TGA。通過同源比對分析(圖2)顯示本實驗獲得了 Z)vG戶D/W全長編碼序列。實施例二 DvGPDHl和DvGPDH2蛋白結構及同源分析利用NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/stmcture/cdd/cdd.shtml)保守結構域分析 系統對DvOPZ)//7和DvGPA/K所編碼的蛋白進行分析，結果顯示兩個基因編碼的蛋 白具有獨特的SERB-GPDH雙結構域(圖1)。 DvGPDHl和DvGPDH2在C端有大 約400個胺基酸的GPDH結構域，而相比動植物中同源的GPDH蛋白結構，它們在 N端還具有一個額外的長度為300個胺基酸的SERB結構域。利用Vector NTI9.1.0程序對DvGPHl和DvGPDH2進行同源比對分析。分析結 果顯示，它們與藻類中的同源基因具有較高的同源性，如和衣藻CrGPDHl同源性 分別是45.7%和45.3%。與動物或高等植物中的同源性則比較低，如酵母ScGpdlp 同源性分別是19.8%和20.8%，並且同源區段位於DvGPHl禾P DvGPDH2的C端。 DvGPHl和DvGPDH2具有保守的類GXGXXG基序(motif)，該基序是GPDH的輔 酶NADH的結合位點(圖2A用方框所示)。另外DvGi3//7和i^OPD//2編碼的蛋白 和絲氨酸磷酸酯酶(SERB/PSP)具有一定的同源性，如人源磷酸絲氨酸酯酶HsPSP 同源性分別為24.4%和26.6%，並且同源區段位於DvGPHl和DvGPDH2的N端(圖 .2B)。 DvGPHl和DvGPDH2具有保守的類DXDX(T/V、基序(motif)，該SJS是SERB催化反應中磷醯基中間體形成的活性位點(圖2B用方框所示)。蛋白信號肽預測(h加:〃www.cbs.dtu.dk/services/)揭示了 DvGPDHl在位於氨 基酸約1-47位處和DvGPDH2在位於胺基酸約1-30位處有保守的葉綠體轉移肽序列 特徵。進一歩的蛋白定位預領U丄http:〃wolfpsort.org/2結果表明DvGPDHl和DvGPDH2 蛋白定位於細胞的葉綠體中。這兩個預測結果顯示了 DvGPDHl和DvGPDH2是鹽藻 的兩個葉綠體型的GPDH。實施例三Z)vG^"W7和ZXWW2在酵母突變體中的功能分析(一) 酵母表達載體的構建將實施例一克隆到的DvOPZ)/W和DvOPD/K利用引入的克隆酶點￡coR I和o I分別構建到酵母表達載體pAJ401 (組成型強表達載體)或pYES2 (半乳糖誘導型表 達載體)中。另外我們還分別構建了只含有GPDH結構域區段(分別命名為 DvGPD/HzlW禾B DvaPDH2ZW)的載體克隆，分析該基因缺失SERB區段後的功 能。DvGPDi7/Z\W由引物GPDHl-GPD5'p和GPDH13'p進行擴增；DvGPDH2ZliV 由引物GPDH2-GPD5'p禾卩GPDH23'p進行擴增。利用引物GPDHl-GPD5'p禾口 GPDH2-GPD5'p在目的基因5'端加入克隆酶點￡coi /和真核翻譯保守序列Kozak; 引物GPDH13'p和GPDH23'p在目的基因3'端加入克隆酶點lo I。將PCR擴增得到 產物利用酶位點五coRI和^oI分別定向克隆至酵母表達載體pAJ401或pYES2中。引物序列如下(1) GPDHl-GPD5'p (引入￡coR I酶切位點和Kozak序歹U):5，-AGAATTCACAATGGTGAAGCGTTACAAGGT墨3，粗體為五coRI識別位點，下劃 線所示為Kozak序列；(2) GPDH2-GPD5，p (引入￡coR I酶切位點和Kozak序歹ij):5, - AG AATTC AC A ATGGGCTAC A AGGTGACC A-3,粗體為￡coR I識別位點，下劃 線所示為Kozak序列。GPDH13'p和GPDH23'p的引物見實施例一。(二) 轉化酵母使用LiAc熱激轉化法將含有Z>OP￡)///、 DvGP"//2、 Z)vGi^OWZiiV、的克隆轉化到酵母鹽敏感突變體a^/j中。(三) 酵母轉化子的表型鑑定所用基本培養基為AP，並加入所需fiSM^^M記為尿嘧啶營養缺陷。 載體為pAJ401的轉化子表型鑑定培養基添加2%的葡萄糖作為碳源。轉入載體為 pYES2的轉化子表型鑑定培養基添加2%的棉子糖作為碳源。所用表型展示培養基以不含NaCl的AP培養基為對照生長條件，含700mMNaCl 的AP培養基為抗鹽表型分析生長條件。若使用表達載體pYES2則另外加入2%半乳 糖做為誘導劑誘導外源基因的表達。首先將酵母轉化子在AP培養基中培養至OD6Q=0.6，以5pL為一個滴度，並以 五倍稀釋度為系列稀釋滴度，在表型展示培養基上展示酵母轉化子抗鹽表型。結果如 圖3所示1)在pAJ401中的組成型強表達啟動子(屍G尺啟動子)驅動下，DvGi^7/八 "vG/^D/K、 DvG/^/Z/ZliV、 DvG戶Z)/^Zi7V都能提高酵母g/^"細胞的耐鹽能力，這 表明全長或缺失型DvG屍D歷和ZM 屍D//2基因能夠增加酵母細胞內的甘油合成，進 而提高酵母細胞的耐鹽能力(圖3A)，因此所<^/)//7和/)^ /^//2在通過基因工程 提高酵母等生物體內的甘油合成量及增強這些生物的耐鹽能力方面具有很好的應用 價值。2)在pYES2中誘導型啟動子(041/啟動子)驅動下，DvOPDi/7ZW和 DVGi^//2ZW比它們柏應的全長基因能更大程度地提高酵母細胞的耐鹽能力，表明 ZM7屍D歷ZW和ZM 屍D/72^V比全長基因具有更強的甘油-3-磷酸脫氫酶的酶活(圖 3B)，能夠更大程度的增加酵母細胞內的甘油合成，從而更大地提高酵母細胞的耐 鹽能力，因此缺失型的"vOPD/WZiV和DvOPDi^z^V在上述的應用領域具有更好 的應用前景。實施例四通過Realtime-PCR方法分析鹽藻Z vG屍DH/和"vGP"好2的在不同 鹽脅迫下的表達模式(一)引物設計用Primer Premier軟體在DvG屍D///和DvOPD/f2的3'UTR區域設計合適的特 異性引物用於Realtime-PCR檢測。檢測ZM 屍D扭的表達所用引物為DvGPDHlRTF 禾口 DvGPDHlRTR;檢領U DvG屍D//2的表達所用引物為DvGPDH2RTF和 DvGPDH2RTR ;持家基因i)vJC777V為內參，所用引物為DvACTINRTF和 DvACTINRTR。引物序列如下(1) DvGPDHlRTF: 5'-GTGGCGTTGCTGATGTGA-3'(2) DvGPDHlRTR: 5'-CTCGCGGAACCTGAGAAT-3，G) DvGPDH2RTF: 5'-CAGCATAAGGCAAGGAGATAG-3，(4) DvGPDH2RTR: 5，-TCTTCACAAACCACCACCC-3，(5) DvACTINRTF: 5'-GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC-3'(6) DvACTINRTR: 5'-CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA-3'(二) 模板的製備我們抽取了長期生長在不同NaCl濃度培養條件下的鹽藻細胞總RNA以及經受 0.5M NaCl—1.5M NaCl高鹽震蕩後不同時間點的鹽藻細胞總RNA，將抽提的總RNA 反轉錄為cDNA。以這些cDNA為模板進行Real-time PCR分析。(三) Real-time PCR法檢測DvOPD/W和DvOPZ)//2表達模式Real-time PCR分析使用SYBR Green染料法，DNA Engine Option2 System (MJ Research)分析系統，標準曲線法定量分析。高鹽震蕩環境下，鹽藻通過胞內快速積累甘油來平衡細胞內外滲透勢差別(圖 4A)。通過Real-time PCR方法分析DvGilD//7和DvGPD/K在不同鹽脅迫下在轉 錄水平調控甘油合成的模式。首先分析了在不同鹽濃度(0.5M、 1M、 2M、 3M、 4M、 5MNaCl)穩定生長條件下基因的轉錄水平(圖4B)，發現0.5M至2M NaCl生長 環境下，隨著鹽濃度的提高和細胞所需甘油量的增加，基因的mRNA表達水平量隨 之上升；當環境中NaCl濃度高於3M時，基因的mRNA表達水平受到了產物甘油 的反饋抑制調控，出現了一定程度的下降。我們同時發現在高濃度的NaCl環境下， ZM 屍Dffi比Z)vGPZ)/W對於甘油反饋抑制調控表現的更為不敏感。然後我們又分 析了 0.5M—1.5M鹽震蕩條件下不同時間段基因表達的變化模式(圖4C):DvOPD/^ 禾口DvOPD/^基因的表達短期內("vG屍DT^在lhr， "vG屍D/i2在1.5hr)受到高鹽 誘導，中期則受到產物甘油的反饋抑制，後期(72hr後)開始恢復上調。同樣我們 發現，DvG戶Di^比LM^PD/W對於甘油反饋抑制調控表現的更為不敏感。基因的 表達分析顯示DvGPD/f7和DvOPD/K調控了甘油的合成；DvOPD//2具有對甘油 反饋抑制調控不敏感的特徵，這種特性對於細胞積累大量的甘油是有利的。本發明通過定向克隆將這兩個基因構建到酵母通用表達載體pAJ401及pYES2 中，轉化酵母突變體g;^7A該突變體不能合成足量的甘油作為胞內滲透調節物，導 致它不能在高鹽環境中生長。將得到的酵母轉化子在含700 mMNaCl培養基上分析 其耐鹽能力，結果顯示酵母細胞的耐鹽能力得到明顯提高(圖3)。該實驗驗證了 Z)VGP//7和DvG屍Z)/K的功能，並證明這兩個基因能夠提高酵母等生物合成甘油的能 力及耐鹽的能力，同時也證明這兩個基因在通過基因工程提高生物的甘油合成產量以及耐鹽能力方面具有應用價值。本發明還通過分析兩個基因所編碼蛋白質的保守結構 域，發現他們具有SERB-GPDH雙結構域(圖1);並進一步通過功能域缺失對兩個 基因進行改造，即移除SERB結構域區段後，獲得的兩個基因的衍生物能更大的提高 酵母體內的甘油合成量及對外界鹽脅迫的耐受能力，這表明這兩個基因衍生物的蛋白產物具有更強的酶活，因此也具有更好的應用前景。本發明還測量了鹽藻在鹽振蕩條件下甘油積累的模式，並利用real-time PCR技 術分析鹽藻中Di;G屍/^和DvGPDi/2在不同鹽脅迫下的轉錄模式，揭示這兩個基因 在鹽藻快速大量合成甘油抵抗高鹽脅迫過程中的基因表達調控模式(圖4)，為通過 提高這兩個基因的轉錄提高生物體內的甘油合成及提高生物體的耐鹽能力提供了理 論依據。 上海大學與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因及其應用 16 1 2525 DNA 鹽藻屬(Z)w""//e//a v/rWs)〈400〉 1161 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 薩 1141GCAAGACCAA GCATGATCCT AGGGTCATCA CCCACACTCC CTCACGCATC GCACCCTGCCAGCAGTGTCA CCCGCGTCCT TCAGCCCCTG CGAGCTGCGT CCCTGGAGCA GGGAGTCACGATGAACCTGC CTGATACAAT GGCCGAGCGT CTTGCCATCA TGAACTGCTC CCCAGAAGACCTGGTGAGTG CCCTGCGCAC CAGGGGCAAA GAGGTGTTTT TGACGGGTGG TTTCAGGGAACACGATGTGG111201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2皿 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521GGCATCTGCA AGCAGCTGGC AGCAGCTCGC GTGGTCAAAC GGGACGCCAA GGCCATCAGCCGTGAAGAGC TTTCGGAGGC TGTGGTGGCG TACTCCAGCC GCGATGCCGG CATCCTCTGGGCTGATGTGA TCGCGTCTAG CTATGGCGGC CGCAACAGGC GTGTGTCAGA GGCGTGGTGCCTTGATTGAG CCATGGAGAAGTCTCTCCAG ACATGATTCT CAGGTTCCGC GAGGCAGTTT CAATGAAGTC ATTAAAGTAGTGCCCAGAGG AGAGCTGTAT GCACAGGTTC TGTATGATTA GTGGCTTTCG TCCAGCAGCT GCAGCACTGG GTTTCATCAT TGCATGTGGG GCCTGGTGGT GAGGCTCAGA TGAACTACCAAAAAA<210〉 2 2759 DNA 鹽藻屬(Dw朋/Ze〃a w'nD 2421 CTTCGATGTG GACCGCACTG TGACCACGGA CGCTTCCGTG GGCCTGCTGG CCAAGTTCAT661 AGCACTGAAG GCACGCGGCG TGGAGGTGTT CCTGATCTCC GGTGGCTTCA GGGAGATGGC1021 GGCAGACTGG TTCATTCGCT CATACGACGA GCTCATGAAG AGCCTGAAGC GCTACAAGGT1081 GACCATGGTG GGCTCTGGCG CATGGGCATG CACTGCAGTC CGCATGGTGG GACAGAGCAC1321 GGCGTGCAAG GACGCTGACC TGCTCATCTT CTGCGCCCCC CACCAGTTCA TGCACGGCAT1621 GCTGTTCCAG CGCCCCTACT TTGCCATCAA CCTGCTGGCA GATGTGCCTG GCGCTGAGAT1801 1861 1921 簡 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701AAGGAACGAG GGCGATGAGG TCGTGACCTT CGAGACCCTT GAGAGGGACA TGCTGTCCGGTGGTTGATGC CAGACCTCGA TTGCGCACTG AGCTGTATTT CTAGCAGAAC TGCTGTTCAACAATTTGAAC AGCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 3 695 PRT 鹽藻屬(Dw朋/Ze〃a 361 SNPRFSSSSN SSTSSSSSVT RVLQPLRAAS LEQGVTAPLP PRPQGPTDTV LELWQAADAV 121 VFDVDSTITR DDTLDSLGKF MGLKDEVLRH EAMDGTMNLP DTMAERLAIM NCSPEDIQQF 181 LLEHPPKERL VPGVEELVSA LRTRGKEVFL TGGFREVVLP IAEHLGIPAK NVFANSMSWE 241 LDDKGQPVRL KEFDMTHPAT HSQGKPQALA RIRRQYPYNN VVMIGDGISD LEAVNTTGGA361 ASRSPASSFV KDVTMWVHEE KHSGRNLTEY INEHHDNPIY LPGVSLGENV VA剛NLIDAA421 RDADLLIFCA PHQFMHGICK QLAAARVVKR DAKAISLTKG MRVRAEGPQL ISQMISRILG 481 IDCSVLMGAN IAADIGREEL SEAVVAYSSR DAGILWQQLF QRPYFAINLL PDVPGAEISG 541 601661 LDFPLFTTIH RIIHGEVSPD MILRFREAVS MKSLK* 4 701 PRT 鹽藻屬 (Z)w"a//e〃(3 w>)〈400〉 41 MLLKGGSVNP LPCAPQRPRA AAAQPRAACR AVGRPQAPLL GARKQLLSSP CFAKEQSPLL 61 RSGQQHARGD ALVAHAAEVG QRPTIPAGDS WANHPPPPTT PSEQVLDLWQ QADAVCFDVD 121 181241301 FICFGGVMER PAVASQADWF IRSYDELMKS LKRYKVTMVG SGAWACTAVR MVGQSTAEAS 361 421481 CSVLMGANIA GDIAREELSE AVIAYANRES GLLWQQLFQR PYFAINLLAD VPGAEMCGTL 541 KNIVAVGAGM GDGLGCGSNS KASILRQGLS EMRKFCKFIS PTVRDDTFFE SCGVADLIAS 601 SYGGRNRKVA EEWARR脂EG DEVVTFETLE RDMLSGQKLQ GVLTSDEVQE ILHARGWELE 661 FPLFTTINRI IHGEVPVNML LRYREACKMP GSKKKRQASP A* 5 30 DNA 鹽藻屬 (Dw"a//e〃a<400〉 5AGAATTCAGCATGGTCCTAGGGTCATCACC 6 31 DNA 鹽藻屬(D朋(2/z'e〃a 6ATCTCGAGCCAGTGCATGCTCTTTAAATGAC 7 30 DNA 鹽藻屬(Z),afe〃wW血) 7AGAATTCACAATGGTGAAGCGTTACAAGGT 8 30 DNA 鹽藻屬(D,a/Ze〃(3 v/".cfo)〈400> 8AGAATTCACAATGGTTCTCAAGGGAGGGAG 9 30 DNA 鹽藻屬(Dw朋"e〃a Wr/tfo)〈400〉 9ATCTCGAGTGTTCAAATTGCTTAAATGCAC 10 29 DNA 鹽藻屬(Z)w"a/Ze〃a 〈400〉 10AGAATTCACAATGGGCTACAAGGTGACCA 11 18 DNA 鹽藻屬(Dw"a/z.e〃a Wr/cfo )〈400〉 11GTGGCGTTGCTGATGTGA 12 18 DNA 鹽藻屬 W"'cfo)〈400〉 12CTCGCGGAACCTGAGAAT 13 21 DNA 鹽藻屬(Dw"a/z'e〃a wW血)<400〉 13CAGCATAAGGCAAGGAGATAG 14 19 DNA 鹽藻屬(D皿a/!W/a〈400〉 14TCTTCACAAACCACCACCC 15 21 DNA 鹽藻屬(Z)w"a//e〃<3 v/"'tfo)〈400〉 15GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC 16 22 DNA 鹽藻屬(Dw"""e〃a WrzD 〈400〉 16CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA
權利要求
1.一種與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因，其特徵在於該基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1-2所示的DNA序列；(2).與序列表中序列1-2限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2. —種根據權利要求1所述的與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的編碼 蛋白，其特徵在於該編碼蛋白具有序列表中序列3-4的胺基酸殘基序列或者是 將序列3-4的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加 且具有與序列3-4的胺基酸殘基序列相同活性的由序列3-4衍生的蛋白質。
3. —種含有根據權利要求1所述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的重組載體。
4. 一種含有根據權利要求1所述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因的轉化子。
5. —種根據權利要求1所述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因在提高甘油合成能力中的 應用。
6. —種根據權利要求1所述的甘油-3-磷酸脫氫酶基因在提高耐鹽能力中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種與甘油合成有關的甘油-3-磷酸脫氫酶基因DvGPH1和DvGPDH2的cDNA序列及所編碼蛋白質的胺基酸序列。本發明涉及DvGPH1或DvGPDH2基因的表達載體轉入酵母gpd1Δ細胞中，該酵母細胞在含鹽的培養基上表現出耐鹽表型，從而證明了這兩個基因能夠增加酵母細胞內的甘油合成並提高酵母細胞的耐鹽能力，同時也證明了這兩個基因在通過基因工程手段提高酵母等生物體內的甘油合成量及增強這些生物的耐鹽能力方面具有很好的應用價值。本發明通過缺失DvGPH1或DvGPDH2基因的部分序列，進一步提高了這兩個基因產物的甘油-3-磷酸脫氫酶活性和催化合成甘油的能力以及相應酵母轉化子的耐鹽能力，因此這兩個缺失型的基因衍生物在上述應用領域具有更好的應用前景。此外，本發明證明了DvGPH1和DvGPDH2基因在鹽藻體內的表達受鹽脅迫的誘導，表明這兩個基因是鹽藻合成甘油的關鍵酶，為將這兩個基因應用於上述領域進一步提供了理論依據。
文檔編號C12N1/19GK101319221SQ20081004001
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月1日 優先權日2008年7月1日
發明者何雲霞, 孟祥宗, 宋仁濤, 男 張, 許政暟 申請人:上海大學