非人類四元轉基因動物的製作方法

2023-10-27 13:10:47

專利名稱：非人類四元轉基因動物的製作方法
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阿爾茨海默病(AD)是神經退行性疾病，其特徵在於記憶喪失和認知功能降低。在 超過65歲後AD患病率每五年大約增加一倍。整體上，大約5-10 %的這些65歲以上人群 被影響到。臨床診斷AD僅限於排除診斷。只有在死亡之後，通過腦顯微檢查含有澱粉樣 蛋白β (Α-β)肽的纖維的胞外斑塊和含有多聚化、磷酸化Tau蛋白的胞內糾結的存在才 能確診。在多數病例中，AD發病較晚且屬於偶發病例。早期發病的家族型AD代表了一小 部分病例，但它們對於增進對疾病機理的理解具有極端重要性。已知的突變是瑞典突變 型(Swedish Mutation) (SFAD)，其影響密碼子 670/671 (K670+N 和 M671+L)，和倫敦突變型 (London Mutation)，其影響APP的密碼子717。所有這些突變均影響APP的蛋白裂解加工， 產生更多澱粉樣蛋白生成肽。APP能被至少3種分泌酶(α -、β -和、-分泌酶)加工。β -分泌酶通過在甲硫 氨酸671 (ΑΡΡ770編號)後切割APP起始了 A-β肽產生，所述切割導致了 12kd仍保留在膜 上的羧末端片段。12kd片段然後遭受Y-分泌酶在疏水跨膜結構域內的切割，釋放了 40、42 或43殘基Α-β (SeubertP, Vigo-Pelfrey C,Esch F,Lee Μ,Dovey H,Davis D, Sinha S, Schlossmacher Μ,Whaley J,Swindlehurst C. Isolation and quantificationof soluble Alzheimer' s beta-peptide from biological fluids. Nature. 1992. 359 :325_7)。當前的AD治療僅能提供一般症狀緩解。對減緩該病病程並阻止或延緩易感個體 中該病的疾病改良劑高度存在尚未滿足的醫學需求。開發這樣的藥劑需要對該病分子基礎 的理解和動物模型的開發的進展等等。已知大量過表達與AD相關蛋白的轉基因品系，例如過表達APP倫敦突變型和β 分泌酶的二元轉基因小鼠。本發明提供非人類轉基因動物，其基因組包含a)編碼包含與阿爾茨海默病(AD) 或AD型病理學相關的突變的人APP蛋白的第一轉基因DNA序列，其中所述第一轉基因DNA 序列被有效地連接到第一啟動子；b)編碼包含與阿爾茨海默病(AD)或AD型病理學相關突 變的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列，其中所述第二轉基因DNA序列被有效連接到第 二啟動子；c)編碼定向抗澱粉樣蛋白肽的人抗體輕鏈的第三轉基因DNA序列，其中所述第 三轉基因DNA序列被有效連接到第三啟動子；及編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA 序列，其中所述第四轉基因DNA序列被有效連接到第四啟動子或第三啟動子。術語「阿爾茨海默病(AD)病理學」指AD患者中的病理改變，例如喪失神經元突觸 密度和突觸數目，認知能力降低和記憶喪失。它們也包括腦中彌散性和神經性斑塊，其主要 由澱粉樣蛋白β肽、神經元和/或神經膠質包涵物或不可溶沉積物組成，其用抗A β抗體 染色呈陽性。特別地，本發明提供了非人類轉基因動物，其基因組包含a)編碼人APP瑞典突變型或人APP倫敦突變型蛋白的第一轉基因DNA序列，其中 所述第一轉基因DNA序列被有效地連接到第一啟動子；b)編碼包含N141I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列，其中所述第二轉基因DNA序列被有效連接到第二啟動子；C)編碼定向抗人澱粉樣蛋白肽的人抗體的輕鏈的第三轉基因DNA序列，其中所述 第三轉基因DNA序列被有效連接到第三啟動子；及d)編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列，其中所述第四轉基因DNA序列 被有效連接到第三啟動子或第四啟動子。本發明也涉及如本發明所提供的非人類轉基因動物的後代，通過與相同或其他基 因型動物繁殖而獲得。優選地，該後代通過與相同基因型動物繁殖而獲得。所述後代包含 與如上所述四元非人類動物的轉基因DNA序列相同的轉基因DNA序列。此外，本發明涉及源自如上所述的四元非人類轉基因動物或其後代的細胞系或原 代細胞培養物。此外，本發明也提供源自如上所述的四元非人類轉基因動物或其後代的組織或器 官外植體或其培養物。本發明也提供源自如上所述的非人類轉基因動物或其後代的組織或細胞提取物。本發明也提供產生非人類轉基因動物的方法，所述轉基因動物的基因組包含編碼 人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、包含N141I取代的人早老蛋白2和定向抗β澱粉樣 蛋白肽的人抗體的重鏈和輕鏈的轉基因DNA，所述方法包括a)共注射包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型的所述第一轉基因DNA序 列的遺傳構建體和包含編碼具有W41I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列的遺傳 構建體到非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞，並從所述受精卵或胚胎幹細胞產生二元非人 類轉基因動物；b)共注射包含第三轉基因DNA序列(編碼定向抗澱粉樣蛋白肽的人抗體的輕鏈) 的遺傳構建體和包含編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列的遺傳構建體到非人 類受精卵或非人類胚胎幹細胞，並從所述受精卵或胚胎幹細胞產生二元非人類轉基因動 物，c)將a)和b)的轉基因動物進行交配並因而產生四元非人類轉基因動物，其基因 組包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、包含N141I取代的人早老蛋白2、定向抗 β澱粉樣蛋白肽的人抗體的重鏈和輕鏈的轉基因DNA。可選地，在上述方法的步驟c)中，第三和第四轉基因DNA序列可位於相同的構建 體上。本發明也提供產生非人類轉基因動物的方法，該動物表達人APP瑞典突變型或 APP倫敦突變型、包含N141I取代的人早老蛋白2和定向抗β澱粉樣蛋白肽的人抗體的重 鏈和輕鏈，所述方法包括a)共注射包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型的所述第一轉基因DNA序 列的遺傳構建體，其中所述第一轉基因DNA序列被有效連接到第一啟動子，和包含編碼具 有W41I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列的遺傳構建體到非人類受精卵或非人 類胚胎幹細胞中，其中所述第二轉基因DNA序列被有效連接到第二啟動子，並從所述受精 卵或胚胎幹細胞產生二元非人類轉基因動物；b)共注射包含第三轉基因DNA序列(其編碼定向抗人澱粉樣蛋白肽的人抗體的輕 鏈)的遺傳構建體，其中所述第三轉基因DNA序列被有效連接到第三啟動子，和包含編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列的遺傳構建體到非人類受精卵或非人類胚胎幹細 胞，其中所述第四轉基因DNA序列被有效連接到第四啟動子，並從所述受精卵或胚胎幹細 胞產生二元非人類轉基因動物，c)將a)和b)的轉基因動物進行交配並因而產生四元非人類轉基因動物，其表達 人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、包含m41I取代的人早老蛋白2、定向抗β澱粉樣蛋 白肽的人抗體的重鏈和輕鏈。可選地，在上述方法的步驟c)中，第三和第四轉基因DNA序列可位於相同的構建 體上，且有效連接到第三啟動子。本發明進一步提供上述方法產生的四元非人類轉基因動物。APPAPP指澱粉樣蛋白前體蛋白。已經鑑定了大量APP的cDNA形式，其中編碼了三種最 豐富的同種型APP695、APP751和APP770。這些形式通過不同的拼接從一條前體RNA而來。 該基因長度超過 175kb，具有 18 個外顯子(Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomicorganization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87(2) 257-63) 0 APP含有胞外結構域、跨膜區和胞質結構域。A-β由恰好位 於疏水跨膜結構域外的至多28個胺基酸和該跨膜結構域的至多15個胺基酸組成。因此， A-β是源自APP的切割產物，其在腦和其他組織如心臟、腎臟和脾臟中正常發現。然而，通 常僅可在腦中見到大量的A-β沉積物。較大的APP替代形式(ΑΡΡ751、ΑΡΡ770)由ΑΡΡ695 及一個或兩個其他結構域組成。ΑΡΡ751由ΑΡΡ695的所有695個胺基酸及其他56個與絲 氨酸蛋白酶抑制劑的Kunitz家族(KPI)具有同一性的胺基酸組成(Tanzi RE,McClatchey Al, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursormRNA associated with Alzheimer ' s disease.Nature. 1988. 331:528_30 ；Weidemann A,Konig G, Bunke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors ofAlzheimer' s disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7 ；57 (1) 115-26. Kitaguchi N,Takahashi Y,Tokushima Y,Shiojiri S,Ito H. Novel precursorof Alzheimer ' s disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 1988. Feb 11 ；331 (6156) 530-2. ；Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey ALConneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer ' s diseaseis not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329(6135) :156_7)。APP770 含有 APP751 的所 有751個胺基酸及其他19個與神經元細胞表面抗原0X-2同源的胺基酸結構域(Weidemarm 等人，1989 ；Kitaguchi等人，1988)。除非另外指明，本文所提及的胺基酸位置是當它們出 現在APP770中時的位置。由於缺少0X-2和KPI結構域，在APP695和APP751中同等位置 的胺基酸編號在某些情況下不同。按照慣例，所有形式APP的胺基酸位置以等同於APP770 形式的位置提及。除非另外指明，本文遵循該慣例。除非另外指明，本文提及的所有形式的 APP和APP片段，包括所有形式的A-β，基於人APP胺基酸序列。APP通過移除引導序列和 加上硫酸及糖基而被翻譯後修飾。術語「ΑΡΡ」也包括突變的APP^f^n APP瑞典突變型和 APP倫敦突變型。
包含與阿爾茨海默病(AD)或AD型病理學相關突變的人APP蛋白優選是APP瑞典 突變型和APP倫敦突變型。如本文所用，術語「APP瑞典突變型」指如上所定義包含K670N/M671L取代的APP 同種型。優選地，人APP瑞典突變型由SEQ ID NO :1所編碼。 如本文所用，術語「APP倫敦突變型」指如上所定義包含一個或多個天然或人工突 變的APP同種型，所述突變影響澱粉樣蛋白肽的生產傾向於Α-β 42肽生產的特異性增加。 優選的是圍繞Y "分泌酶切割位點與病理學相關的天然APP突變，包括-Τ7141 (Kumar-Singh S 等人 Hum Mol Genet. 2000 Nov 1 ；9 (18) :2589_98·)-V715M(Ancolio K,等人，Proc Natl Acad Sci U S Α. 1999 Mar30 ；96 (7) 4119-24.)-I716V(Eckman CB，等人，Hum Mol Genet. 1997 Nov ；6(12) :2087_9·)-V717F(Murrell J, et al, Science. 1991 Oct 4 ；254(5028) :97_9·)-V717G (Chart i er-Har 1 in MC，等人，Nature. 19910ct 31 ；353(6347) :844_6·)-V717I(Goate A，等人，Nature. 1991 Feb 21 ；349 (6311) 704-6)-V717L (Murrell JR，等人，Arch Neurol. 2000 Jun ；57 (6) :885_7·)-L723P (Kwok JB，等人，Ann Neurol. 2000Feb ；47 (2) :249_53·)也優選人工突變(在A-β結構域外跨膜區中所有殘基的取代)，其例子和其關於 Y-分泌酶切割的後果由Lichtenthaler和其合作者描述(Lichtenthaler SF, et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar16 ；96 (6) :3053_8)。更優選地，人APP倫敦突變型是包含天然V717F突變的人APP倫敦突變型。最優 選地，人APP倫敦突變型由SEQ ID NO 3所編碼。優選地，第一轉基因DNA序列編碼人APP瑞典突變型。早老蛋白2(PS2)早老蛋白2 (PS)是γ -分泌酶複合物的一個蛋白。在APP的加工中涉及、~分泌 酶(參見圖1)。如本文所用，術語「編碼早老蛋白2的DNA序列」或「PS2基因」指在1995年6月 28日申請的美國專利申請序號08/496，841中第一次披露和公開並在稍後由Rogaev等人 (Nature. 1995 ；376 (6543) :775_8)和 LevyLahad 等人(Ann Neurol. 1995 ；38 (4) :678_80) 描述的哺乳動物基因，包括任何等位變體和異種特異性哺乳動物類似物。在本文中公開了 一條人早老蛋白_2(hPS2)cDNA序列，其序列如SEQ ID NO 9所示。術語「早老蛋白-2基因」或「PS2基因」主要涉及編碼序列，但也能包括某些或所 有位於兩端的調節區和/或內含子。特別地，術語PS2基因包括從cDNA或基因組DNA創製 的人工或重組基因，包括基於拼接變體的重組基因。早老蛋白_2基因也被稱為E5-1基因。包含與阿爾茨海默病(AD)或AD型病理學相關突變的人早老蛋白2優選是具有 N141I、T122P、M239V 或 M239I 取代的人 PS2(Shen 等人，PNAS,2007,104(2) 403-409)。更 優選地，包含與阿爾茨海默病(AD)或AD型病理學相關突變的人早老蛋白2是具有N141I 取代的人PS2。因此，第二轉基因DNA序列優選編碼具有N141I取代的人PS2。最優選的是編碼 SEQ ID NO 19 的 DNA 序列。
抗體抗體是「Y」形分子並由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。存在重鏈和輕鏈的不同類型和 亞型。每一條重鏈和每一條輕鏈均具有恆定區和可變區，其中重鏈的恆定區大小更大。術語「恆定區」或「C區」指這樣發抗體分子區域，其與相同物種生物產生的具有不 同特異性的抗體的相應區域基本相同。恆定部分在相同抗體類別(同種型)內不可變，起 特定免疫球蛋白亞類的效應物功能。Fc片段是通過用木瓜蛋白酶切割抗體而產生並包含恆 定區的絕大部分的抗體片段。如本文所用，術語「可變區」指結合特異性抗原的抗體分子區域。它由重鏈和輕鏈 的抗原結合位點的組合所組成。它在不同B細胞的免疫球蛋白間不同，但在相同B細胞產 生的所有免疫球蛋白間相同。可變區經由B細胞成熟過程中發生的基因重組過程而在體內 產生。正是該重排的過程產生了結合任何給定抗原所需的無數多樣性並因此使免疫系統能 識別和中和無數外源和病理結構所賦予的抗原負擔。作為結果，抗體庫由攜帶不同V區的 巨大的所有組成部分並同時有相同Fc部分的免疫球蛋白組成。術語「抗原結合片段」或「Fab片段」是包括可變的、抗原結合區且用木瓜蛋白酶切 割抗體而產生的抗體片段。如本文所用，術語「獨特型區」指對每一種抗體類型獨特的抗體可變區部分。第三轉基因核苷酸序列編碼定向抗β澱粉樣蛋白肽的抗體的輕鏈。優選地，所述 抗體是人、人源化或嵌合抗體。更優選地，所述抗體是免疫球蛋白Y (IgG)。最優選地，所述 抗體是治療性抗體Mabll(W0 03/070760)。第四轉基因核苷酸序列編碼定向抗β澱粉樣蛋白肽的抗體的重鏈。優選地，所述 抗體是人、人源化或嵌合抗體。更優選地，所述抗體是免疫球蛋白Y (IgG)。最優選地，所述 抗體是治療性抗體Mabll(W0 03/070760)。術語「β澱粉樣蛋白肽」或「Α-β 」指通過用β-分泌酶和Y-分泌酶切割APP生 產的肽。該肽具有39-43個胺基酸。它是阿爾茨海默病患者腦澱粉樣蛋白斑塊的主要組成 成分。優選地，澱粉樣蛋白肽是人澱粉樣蛋白肽。優選地，第四轉基因核苷酸序列編碼分泌型抗體的重鏈。這樣的優選DNA序列缺 少編碼跨膜結構域的序列。第三和第四轉基因DNA序列可與一個啟動子有效連接(即與第三啟動子連接)或 它們可分別與單獨的啟動子有效連接(即第三轉基因DNA序列與第三啟動子有效連接，第 四DNA序列與第四啟動子有效連接)。啟動子如本文所用，術語「有效連接」指，當合適的轉錄激活子蛋白被結合到調控序列上 時，DNA序列和調控序列以允許基因表達的方式連接。如本文所用，術語「調控序列」指這樣的核苷酸序列，其是調控蛋白質表達的蛋白 質結合位點。調控序列的例子如啟動子或增強子。如本文所用，術語「啟動子」指結合RNA聚合酶和轉錄因子以啟動轉錄的基因區 域。如本文所用，術語「增強子」指通過增加位於同一 DNA分子上最接近的啟動子的活 性而增加遺傳轉錄速度的核苷酸序列。
第一啟動子可以是在神經元中表達有效連接的DNA的任何啟動子。第一啟動子可 以是遍在型啟動子。優選地，第一啟動子是神經元啟動子。更優選地，第一啟動子是腦特異 的啟動子。術語「組織特異性啟動子」指以組織特異性方式調控和指導基因表達的啟動子，例 如在腦組織、肌肉組織、肝臟組織、腎臟組織等中調控和指導基因表達。腦特異性啟動子是 在腦組織中調控和指導基因表達的啟動子。最優選地，第一啟動子是朊病毒基因的啟動子。第一啟動子也可以是可控啟動子。可控啟動子可以是任何控制轉基因以可調控和 /或可誘導方式表達的啟動子，例如通過加入特異性誘導劑或抑制劑底物。本領域已知多個 可誘導細菌啟動子(Schultze N,Burki Y,Lang Y,Certa U,Bluethmann H ；Nat Biotechnol 1996 ； 14(4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption !applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71(1) :19-27 ；Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines. Biotechniques. 1998 ；24 (4) :624_8，630—2)。第二啟動子可以是任何使有效連接的DNA在神經元中表達的啟動子。第一啟動子 可以是遍在型啟動子。優選地，第二啟動子是神經元啟動子。更優選地，第二啟動子是腦特 異性啟動子。術語「組織特異性啟動子」指以組織特異性方式調控和指導基因表達的啟動子，例 如在腦組織、肌肉組織、肝臟組織、腎臟組織等中調控和指導基因表達。腦特異性啟動子是 在腦組織中調控和指導基因表達的啟動子。最優選地，第二啟動子是Thyl. 2糖蛋白啟動 子。第二啟動子也可以是可控啟動子。可控啟動子可以是任何以可調控和/或可 誘導方式調控轉基因表達的啟動子，例如通過加入特異性誘導劑或抑制劑底物。本領域 已知多個可誘導細菌啟動子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630-2)。第三啟動子可以是遍在型啟動子或淋巴組織特異性啟動子。優選地，第三啟動子是I型MHC基因的啟動子。同樣優選地，第三轉基因DNA序列 與增強子有效連接。更優選地，增強子是IgH增強子。第三啟動子也可以是可控啟動子。可控啟動子可以是任何以可調控和/或可 誘導方式調控轉基因表達的啟動子，例如通過加入特異性誘導劑或抑制劑底物。本領域 已知多個可誘導細菌啟動子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian celllines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630—2)。第四啟動子可以是遍在型啟動子或淋巴組織特異性啟動子。優選地，第四啟動子 是I型MHC基因啟動子。同樣優選地，第四轉基因DNA序列與增強子有效偶聯。更優選地，增強子是IgH增強子。第四啟動子也可以是可控啟動子。可控啟動子可以是任何以可調控和/或可 誘導方式調控轉基因表達的啟動子，例如通過加入特異性誘導劑或抑制劑底物。本領域 已知多個可誘導細菌啟動子(Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H ； Nat Biotechnol 1996 ； 14 (4) 499-503 ；van derNeut R ；Targeted gene disruption applications in neurobiology ；JNeurosci Methods 1997 ；71 (1) 19-27 ；Liu HS, Lee CH,Lee CF,Su IJ,Chang TY ；Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines.Biotechniques. 1998 ；24(4) :624_8，630-2)。由於非人類轉基因動物也生產其自己的抗體，人重鏈和輕鏈可能會與內源重鏈和 輕鏈混合，從而形成混合的內源/轉基因抗體。在是小鼠的情況下，可形成混合的小鼠/人 抗體。假如人重鏈和輕鏈在淋巴組織外生產，將不會有內源重鏈和輕鏈存在，因此可形成純 的轉基因抗體。因此，有效連接到第三和第四轉基因DNA序列的啟動子優選是既在淋巴組 織又在非淋巴組織中表達的啟動子。轉基因動物/轉基因的整合轉基因DNA序列被整合入所有或部分動物細胞，特別是生殖細胞中。整合入基因 組可以是暫時的或穩定的。優選地，整合是穩定的。轉基因動物的第一、第二、第三和第四轉基因DNA序列可以是雜合的或純合的。轉 基因動物的某些轉基因DNA序列可以是雜合的(例如第一和第二轉基因DNA序列)，而另外 的可以是純合的(例如第三和第四DNA序列)。優選地，轉基因動物的至少一條轉基因DNA 序列是純合的。轉基因動物可以是任何非人類動物。優選地，非人類轉基因動物是哺乳動物，更 優選地，非人類轉基因動物是嚙齒類動物如大鼠或小鼠，最優選地，非人類轉基因動物是小 鼠°轉基因動物的生產非人類轉基因動物可以是任何非人類動物。優選的非人類轉基因動物是哺乳動 物。更優選地，非人類動物是嚙齒類動物如小鼠或大鼠。生產非人類轉基因動物的方法 是本領域公知的。合適的方法公開在即Hogan B.，Beddington R.，Costantini F. & Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual.第二版(1994). Cold Spring Harbor LaboratoryPress.中。轉基因蛋白可以是遍在表達的。優選地，第一和第二轉基因DNA序列編碼的蛋白 質在神經元中表達。更優選地，第一和第二轉基因DNA序列編碼的蛋白質在腦組織中表達。 優選地，第三和第四轉基因DNA序列編碼的蛋白質在淋巴組織中表達，更優選地，第三和第 四轉基因DNA序列編碼的蛋白質既在淋巴組織又在非淋巴組織中表達。對上述非人類轉基因動物進行遺傳、分子和行為方式的分析。用途如上所述的四元轉基因小鼠能用作治療阿爾茨海默病的模型或用作預防AD的模 型。它允許研究人抗_Αβ抗體對鼠類AD模型中Αβ澱粉狀蛋白病的發病和發展的效果。 由於轉基因動物對轉基因人mAbll抗體是免疫耐受的，用治療性抗體如Mabll進行慢性治 療的效果可以被測定。同時，可追蹤對可溶性Αβ水平和血管澱粉狀蛋白病的發展和動力學的效果。此外，如上所述的非人類四元轉基因動物是測定用人抗體預防性治療阿爾茨海默 病的功效和結果的有意義的工具。現在已經概括性地公開了本發明，參照特定的實施例及下述附圖能更好地理解本 發明，包括在本文中的所述實施例僅是為了說明的目的，其並不意味著是對本發明的限制。


圖1 顯示了 APP加工的示意圖。A)澱粉樣蛋白前體蛋白。標明了三種分泌酶的 切割位點(α :α分泌酶，β 分泌酶，γ γ分泌酶)。圖2 顯示了澱粉樣蛋白前體蛋白(APP)加工的示意圖。APP能經歷經由2途徑的 蛋白水解加工。α-分泌酶的切割發生在Α-β結構域內並產生了大的可溶N-末端APP α 和非澱粉樣蛋白生成的C-末端片段。g_分泌酶介導的該片段進一步的蛋白水解產生了非 澱粉樣蛋白生成肽P3。備選地，分泌酶介導的APP切割在A β結構域的開頭發生並產 生了較短的可溶N-末端，ΑΡΡβ，及澱粉樣蛋白生成的C-末端片段(C99)。該C-末端片段 經由Y-分泌酶而進行的進一步切割產生了 Αβ。Y-分泌酶或多個Y-分泌酶的切割能 導致A β的C-末端異質性而產生A β 40和A β 42。圓細胞膜；_ APP β，■ A β，_ CTF圖3 顯示了遺傳構建體的示意圖。Α)包含植入在小鼠Thy 1. 2糖蛋白基因(MThy 1. 2)中的編碼具有Κ60Ν、M671L 取代的人βΑΡΡ751(人0APP751-SFAD)的DNA的構建體。KPI :Kunitz蛋白酶抑制劑結 構域；Αβ β澱粉樣蛋白肽；EI 外顯子I ；EII 外顯子II ；EIV 外顯子IV ；ATG 起始密碼 子；TAG 終止密碼子。B)包含植入在小鼠朊病毒(pPrPHG)中的編碼具有N141I取代的突變人早老蛋白 2(hPS2-N141I)的DNA的構建體。EI 外顯子I ；E2 外顯子2 ；UTR 非翻譯區；ATG 起始密 碼子；TAG 終止密碼子。C)包含編碼定向抗β _澱粉樣蛋白肽的人抗體IgGl. 1 (Mabll)重鏈的DNA的構建 體。MHC-I :H-2k啟動子區，VH:抗體重鏈的可變區，CH1-CH2-CH3 抗體重鏈的恆定區，IgH 增強子鼠IgH基因的轉錄增強子元件。D)包含編碼定向抗β _澱粉樣蛋白肽的人抗體IgGl. 1 (Mabll)輕鏈的DNA的構建 體。MHC-I :H-2k啟動子區，VL 抗體輕鏈的可變區，CL 抗體輕鏈的恆定區，IgH增強子鼠 IgH基因的轉錄增強子元件。圖4:顯示了對人Αβ特異的人Ig Yl基因的完整編碼序列(SEQ ID Ν0:10)，其被 克隆入用於轉基因表達的表達載體PHSE3』中。在PCR擴增中使用的引物的位置和名稱在 相應序列的上部或下部進行了顯示。終止密碼子顯示為粗體。引導序列顯示為粗體並加下 劃線。圖5 顯示了對人A β特異的人IgK基因的完整編碼序列(SEQ ID NO :11)，其被 克隆入用於轉基因表達的表達載體PHSE3』中。在PCR擴增中使用的引物的位置和名稱在 相應序列的上部或下部進行了顯示。起始密碼子和終止密碼子顯示為粗體。圖6 顯示了檢測Β6. MabllxB6. PS2APP小鼠後代中的四元轉基因的PCR電泳凝膠照片。泳道1 分子量標記，泳道2到7 :B6. Mabl 1χΒ6. PS2APP小鼠的後代小鼠。IgH :IgH特 異性PCR片段；IgL =IgL特異性PCR片段。PSEN2 :PS(N41I)特異性PCR片段。圖7 顯示了來源於B6.MAB11、B6. 152和B6. MAB11. 152小鼠的用於探測APP的腦 勻漿物的Western Blot。B6. MABll 轉基因了 MABll重鏈和輕鏈的小鼠。B 6. 152 轉基因了 PS2 (N141I) / APP瑞典突變型的小鼠。B 6· MAB11. 152 轉基因了 MABll重鏈和輕鏈以及PS2 (附411)/APP 瑞典突變型的小鼠。APP:澱粉樣蛋白前體蛋白，CTF :C-末端片段，Αβ 澱粉樣蛋白肽。圖8 顯示了野生型、Mabll 轉基因小鼠(Β6. MABl 1)、PS2 (Ν1411)/APPsw 二元轉基 因小鼠(Β6. 152)和轉基因了 MABll重鏈和輕鏈以及PS2(N141I)/APP瑞典(B6.MAB11. 152) 的四元小鼠額皮質組織切片的螢光顯微照片。小鼠為8月齡，切片用鼠抗-Ab單克隆抗體 (BAP2/Alexa 555綴合物)染色。MABll在四元轉基因小鼠中的轉基因表達徹底阻止了斑 塊形成。圖9 顯示了野生型、Mabll 轉基因小鼠(B6. MABl 1)、PS2 (N1411)/APPsw 二元轉 基因小鼠(B6. 152)和轉基因了 MABll重鏈和輕鏈以及PS2 (W41I)/APP瑞典突變型(B6. MAB11. 152)的四元小鼠額皮質組織切片的螢光顯微照片。小鼠為8月齡，切片用硫代黃素 染色。MABll在四元轉基因小鼠中的表達徹底阻止了斑塊形成。圖10 顯示了代表來源於Mabll轉基因小鼠(A)和四元轉基因小鼠(B6. MAB11. 152)⑶血漿的人IgG(即MAB11)的經測定水平的圖。比較了不同的獨立方法，⑴ Αβ抗原捕獲且用Fc特異性檢測抗體檢測的人IgG—會一 ，(ii)抗人IgG(H+L)捕獲且 用(H+L)特異性檢測抗體檢測的人IgG+及(iii)抗人IgG(H+L)捕獲且用Fc特異性檢 測抗體檢測的人IgG+。圖11 顯示了用針對人IgG Mabll的探針檢測來源於四元轉基因小鼠 B6.MAB11. 152、Mabll轉基因小鼠B6. MABll的腦勻漿物相對於非轉基因背景(C57B1/6)的 Western Blot。為了測定可測量的Mabll最低量，以不同濃度(10、3、1、0· 3,0. 1和0. 03 μ g/ ml)將抗體加到非轉基因小鼠B6(C57Bl/6)的腦勻漿物中。來自於非轉基因小鼠的血漿是 外周中Mabll的對照。圖12 顯示了用Αβ探針檢測16月齡小鼠腦勻漿物的western blot。腦取自非 轉基因野生型C57B1/6小鼠、四元轉基因小鼠B6. MABl 1. 152和PS2 (N141I) /APPsff 二元轉基 因小鼠B6. 152。在第一泳道中，將MABll加入到沒有腦勻漿物的樣品緩衝液中作為陰性對 照。圖13 顯示了 Αβ在Β6. 152和Β6. ΜΑΒ11. 152小鼠腦勻漿物中分離後測量的不可 溶Αβ (Αβ40和42)的圖(以ng/mg腦表示)。1-4 :PS2(N141I)/APPsw:元轉基因小鼠(B6. 152) 1 = 4 月齡；2 = 8 月齡，3 = 12月齡，4 = 16月齡；5-8 四元轉基因小鼠(B6.MAB11. 152) 5 = 4 月齡，6 = 8 月齡，7 = 12 月齡，8 = 16月齡。A)在雌性小鼠中測量的Αβ42，B)在雄性小鼠中測量的Αβ 42，C)在雌性小鼠中測量的Αβ 40，
D)在雄性小鼠中測量的Αβ 40。圖14:顯示了取自血管澱粉樣蛋白沉積物和內皮細胞二重免疫染色的 Β6.ΜΑΒ11. 152皮質切片的以最大強度投射觀察到的共聚焦掃描顯微圖像。圖14Α和D分 別顯示了在低放大倍數和高放大倍數染色的澱粉樣蛋白沉積物的ΒΑΡ2染色。為了比較，圖 14Β和E分別顯示了在低放大倍數和高放大倍數利用⑶31 (內皮細胞標記物)染色的毛細 血管的分布。圖14C和F顯示了兩種染色的疊加圖像。圖15 顯示了以高解析度取自二元轉基因Β6. 152小鼠的、以最大強度投射觀察到 的共聚焦掃描顯微圖像(Α到C)和取自四元轉基因Β6.ΜΑΒ11. 152的皮質毛細血管的單個 共聚焦平面圖像(D到F)。圖15Α和D顯示了澱粉樣蛋白沉積物的ΒΑΡ2染色。圖14Β和E 顯示了⑶31 (內皮細胞標記物)染色。圖14C和F顯示了兩種染色的疊加圖像。
實施例除非另外指明，根據廠商說明書使用在實施例中提及的可商購的試劑。實施例1 轉基因構建體(圖1)APPSwe構建體編碼人β ΑΡΡ751的cDNA由D. Goldgaber教授惠贈。通過定 點誘變引入瑞典家族性AD雙突變(AFAD，K670N, M671L取代)。通過將大約2. 4kbp的 hu3 APP751SFAD cDNA 片段(SEQ ID NO :1，AC :X06989 的核苷酸 32-2369)插入到含有小 鼠Thy-L 2糖蛋白基因和啟動子(SEQ ID NO :2，AC :M12379)的表達載體的XhoI位點而 產生Thyl. 2-hu0APP751SFAD轉基因。該表達載體具有包含小鼠Thyl. 2基因的6. 8kbp NotI 片段(Andra K 等人，(1996)Expression of APP intransgenic mice -.a comparison of neuron-specific promoters. NeurobiolAging 17 183-190 ；Vidal M 等人』 (1990) Tissue-specific control elements ofthe Thy-lgene. EMBO J 9 :833_840)，其中位於外 顯子2和4上的1. 5kbpBamHI-XhoI片段被XhoI克隆位點置換。在SEQ ID NO 4中給出 了該構建體的部分序列(核苷酸1-2602，MMTHYGP, AC :M12379(在27. 4. 1993時)，小鼠 Thy-L 2 糖蛋白基因(XbaI-BanI)，核苷酸 2603-4982，hp APP751SFAD(SmaI/HindIII-平末 端化，2400bp)，AC :Χ06989 (在 09. 01. 2003 時)，(nt 32-2400)具有 K670N, M671L,核苷酸 4983-6112，MMTHYGP, AC :M12379(在 27. 4. 1993 時)，XhoI-PolyA 位點(外顯子 IV)PSEN2mut 構建體將 FAD 突變 N141I 引入人 PSEN2 cDNA (SEQ IDNO :9，AC L43964)。為了在轉基因小鼠中表達，使用了基於小鼠朊病毒基因的載體(pPrPHG) (Fischer 等人，1996 ；Borchelt等人，1996)。包括朊病毒基因編碼區的KpnI-NarI片段被刪除並用 唯一的SceI位點代替。以平末端連接方式插入早老蛋白2編碼序列並通過插入位點的測 序進行證實。Mabll構建體使用了具有針對人Ab肽特異性的編碼同種型Yl的免疫球蛋白 (Ig)重鏈(H)的 cDNA(SEQ ID NO 10)和編碼同種型 κ 的輕鏈(L)的 cDNA(SEQ ID NO 11) [Bardroff, M. et. al.，Anti-amyloid betaantibodies and their use. W003070760]。 ffl 過使用表1中的引物在PCR反應中擴增cDNA。為了定向插入到pHSE3』載體中，5』弓丨物含 有SalI (或適合的XhoI)位點，5』引物含有BamHI (或適合的BglII)位點[Pircher,H.，等 人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8. Ichain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27. ]。PCR 擴增的 cDNA 首先以兩種限制酶SalI和BamHI進行酶切，然後分別插入到載體pHSE3，的相應位點。Ig cDNA在pHSE3，中的 表達被鼠I型MHC基因H-2K的啟動子驅動並被位於克隆基因3』的鼠Ig H基因增強子增強 [Pircher, H.等人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chaintransgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27.]。該表達載體保證了 相應的插入基因產物在轉基因小鼠T和B淋巴細胞中的高水平生產([Pircher，H.等人， T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.Ichain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3) :p. 719-27.])。然後將包括(從 5，到 3，)H_2K 啟動 子、插入的cDNA、poly-A和拼接位點以及Ig H基因增強子元件的完整表達框利用XhoI限制 性酶切從載體上切除並進行瓊脂糖凝膠純化，再製備成用以微注射到受精小鼠卵母細胞中 的合適濃度(2μ g/ml，於IOmM Tris HC1/0. ImM EDTA，pH 7中)。通過測序編碼抗_Αβ Ig H和L基因的完整cDNA證實cDNA的編碼可能性。
引物名稱序列限制性位點(粗體)SEQ. ID No:Gl.IlSalfor (5'IgH)5-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG-3'Sail (GTCGAC)12Gl.llBamrev (3'IgH)5 '-ACGTGG ATCCTC ATTTACCCGG AG AC AG-3 『BamHI (GGATCC)13K. IlXhofor (5'IgL)5ACGTCTCG AGGCCGCC ACC ATGGTGTTGC AG-3XhoI (CTCGAG)14ICllBglrev (3'IgL)5-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG-3'BglII (AGATCT)15表1.克隆引物的序列實施例2.轉基因小鼠的產生B6. PS2APP轉基因小鼠(品系B6. 152)的產生基本按照先前公開的方法產生轉 基因動物(Hogan CF,禾口 Lyacy E. 1995. Manipulating themouse embryo a laboratory manual. Ed 2. Plainview, NY :Cold SpringHarbor Laboratory)。攜帶 Thy_l_huAPP751SFAD 或Prp-hUPsen2(N141I)構建體的不含載體的線性片段以1 1比率混合併顯微注射到 C57B1/6受精卵的雄性前核。在顯微注射後，有活力的受精卵被植入假孕的B6CBAF1代孕母 鼠輸卵管。種系中轉基因的整合在Fl後代中通過PCR檢測轉基因進行檢查。據通常的假 設，共注射的轉基因整合到相同的染色體位點(Overbeek PA, Aguilar-Cordova E，Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM,禾口 Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1，31—37)。B6Mabll (抗-Αβ IgGl轉基因小鼠)的產生按照先前公開在ΕΡ_Α_1748294中的 方法產生轉基因動物。將先前部分(Mabll構建體)中描述的編碼IgH和L基因的XhoI純 化片段以1 1混合併顯微注射獲自C57BL/6雌性供體的受精卵母細胞以獲得B6.Mabll動 物。在顯微注射後，將有活力的受精卵植入假孕的B6CBAF1代孕母鼠輸卵管。種系中轉基因 的整合在Fl後代中通過PCR檢測轉基因進行檢查。據通常的假設，共注射的轉基因整合到 相同的染色體位點(Overbeek PA, Aguilar-Cordova Ε, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM,禾口Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identificationof transgenic mice. Transgenic Res. 1,31-37) 整個地，產生並繁殖了攜帶轉基因 IgH 和L基因二者的5隻二元轉基因小鼠和僅攜帶IgH基因的1隻一元轉基因小鼠。B6. Mabll. PS2APP轉基因小鼠(品系B6. Mabll. 152)的產生具有Mabll轉基因 和人PSEN2mut及APPSw轉基因二者的轉基因小鼠通過雜交Mabll轉基因的雄性雜合子和 huPSEN2mut和huAPPSw轉基因的雌性純合子而產生。產生的後代要麼是所有轉基因的雜合 子要麼僅是huAPPSw和huPSEN2的雜合子。實施例3:PCR分析通過使用從取自10日齡小鼠組織生檢樣品分離的基因組DNA進行PCR分析檢測 了轉基因的存在。擴增片段對轉基因特異並且不與內源性DNA序列交叉反應。B6. PS2APP小鼠(ΑΡΡ^λ突變型_PS2mut 二元轉基因小鼠)使用引物5，-AAG TAT GTC CGC GCA GAA CAG AAG G_3』 (SEQ ID NO 5)禾口 5』 -CTG AGA TAT TTG AAG GAC TTG GGG AG-3，(SEQ. ID NO 6)擴增重疊huAPP和huThyl序列的932bp片段。相似地，使用 引物 5，-TCATTG GCT TGT GTC TGA CCC T—3，(SEQ. ID NO 7)禾口 5，-GCT TTCAAC GTC AGT AGG ACA A-3，(SEQ. ID NO 8)擴增重疊 huPSEN2mut 和朊病毒序列的 327bp 片段。huPSEN2 和huAPPSw轉基因總是共分離。通過使用1 μ 1 (大約IOOng)自趾修剪組織獲得的總DNA 進行了 PCR反應，PCR反應條件如下95°C 3分鐘，[95°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 1分鐘]35 個循環，72 °C 5分鐘。在1. 8%瓊脂糖凝膠中觀察了對應於huAPP轉基因的932bp和對應於 huPS2轉基因的327bp的PCR擴增DNA片段。B6.Mabll小鼠(Mabll 二元轉基因小鼠)通過使用特異性引物擴增製備自尾部活 檢樣品的基因組DNA篩選出生自這些經顯微注射的胚胎的小鼠中轉基因的存在。在表2中 列出了使用的引物。通過使用1 μ 1 (大約IOOng)自尾部活檢獲得的總DNA進行了 PCR反 應，PCR反應條件如下90°C 1分鐘，[94°C 10秒，64°C 30秒，72°C 90秒]30個循環，72°C 7 分鐘。最後在1. 5%瓊脂糖凝膠中分別觀察了對應於轉基因IgH和L基因的1270bp和660bp 的PCR擴增DNA片段。 表2.用於檢測轉基因的引物序列。MAB11. PS2APP小鼠(圖2)將特異於MHC啟動子區的引物5，-ATG
AAT TCA CAG TTT CAC TTC TGC ACC-3，(SEQ. ID NO 16)和分別特異於 Y 鏈和 κ 鏈的引物 5，-TGT ACT CCT TGC CAT TCA GC-3，(SEQ. ID NO 17)和 5，-GCT CAT CAG ATG GCG GGA AG-3，(SEQ. ID NO 18)加入多重 PCR 反應中的 huPSEN2 引物(SEQ. ID NO 7 和8)中。在存在所有轉基因的情況下，擴增了具有不同大小的3個PCR產物分別對應於 huPSEN2,Hu Ig重鏈和hu Ig輕鏈轉基因的327bp、600bp和1200bp的片段。通過使用1. 5 μ 1 (大約150ng)自趾修剪組織獲得的總DNA進行了 PCR反應，PCR 反應條件如下95°C 1分鐘，[95°C 30秒，62°C 40秒，72°C 80秒]30個循環，72°C 7分鐘。 在1. 5%瓊脂糖凝膠中觀察了分別對應於huPS2、IgH和L轉基因的327bp、大約660bp和 1200bp的PCR擴增DNA片段。實施例4:免疫組化將氟烷κ-麻醉的8月齡小鼠(野生型小鼠(C57B1/6)，Mab 11轉基因小鼠， PS2 (Ν141Ι) /APPsw 二元轉基因小鼠和PS2 (Ν141Ι) /APPsw/Mabll四元轉基因小鼠)斷頭、 均分腦並在乾冰中速凍。根據Paxinos和Franklin的方法，在_18°C使用Leica CM3050 S恆冷切片機以20微米額定厚度切割側向 1. 92和1. 2mm間的旁矢狀面恆冷箱切片，在 Superfrost Plus 玻片上包埋並保存在_20°C。澱粉樣蛋白斑塊的染色利用(by state of) 本領域的免疫螢光染色方法或用硫代黃素-S染色完成，硫代黃素是澱粉樣蛋白斑塊特異 性的染料。簡言之，在PBS中水合切片並以在-20°C預冷的100%丙酮處理2分鐘。以PBS 洗滌2次，每次2分鐘，然後在溶於PBS的2%牛血清白蛋白和2%卵清蛋白中孵育15分鐘 以封閉非特異性結合位點，然後用PBS進行洗滌並與高親合力的0. 5mg/ml鼠單克隆抗體 (BAP-2)在室溫孵育1小時，所述抗體被偶聯到Alexa488螢光基團(Molecular Probes) W0 在乙醇/PBS (40/60體積％)中以0.0125%濃度進行硫代黃素-S染色。在雙蒸水中漂洗玻 片後，使用螢光包埋介質(S3023，DAK0)包埋蓋玻片。在圖8(BAP_2)和圖9(硫代黃素-S) 中顯示了以同胞仔做對照的8月齡B6.MAB11. 152和B6. 152的結果，證實在B6.MAB11. 152 小鼠中澱粉樣蛋白沉積物徹底缺失。按照上述8月齡動物的方法製備來源於B6. MAB11. 152 (20月齡)小鼠和 B6. 152(20月齡)皮質和近海馬的組織玻片。以下述方法將組織玻片進行染色1.大鼠 /L抗-小鼠 CD31，10. 0 μ g/ml (Serotec, ID 1102) PBS溶液(ρΗ7· 4) +power Block (Ix)+10%山羊血清(pH7. 4)，在室溫孵育1小時，以DakoCytomation Wash緩衝液 (Tris緩衝氯化鈉溶液+吐溫20)漂洗3次2.山羊 / 抗大鼠 IgG (H+L) ALEXA 488，1 100 (Molecular Probes, ID 1254) PBS 溶液(pH 7. 4)+10%山羊血清(ρΗ7· 4)，在室溫孵育1小時，以DakoCytomation Wash緩衝 液(Tris緩衝氯化鈉溶液+吐溫20)漂洗3次3.小鼠 /BAP-2a ALEXA 555,5. O μ g/ml (EM Labor, ID 1296) PBS 溶液(pH 7. 4) +power Block (Ix)+10 % 山羊血清(pH7. 4)，在室溫孵育 1 小時，以 DakoCytomation Wash緩衝液(Tris緩衝氯化鈉溶液+吐溫20)漂洗3次用DAPI將玻片染色5分鐘，然後用DakoCytomation Wash緩衝液漂洗2次，然後 用50mM CH3COONH4中的4mM CuSO4. 5H20(pH5. 0)孵育30分鐘。在雙蒸水中漂洗玻片後，使 用螢光包埋介質(S3023，DAK0)包埋蓋玻片。結果顯示在圖14到15中。在B6.MAB11. 152小鼠的皮層中，在細毛細血管中偶爾
16有血管澱粉樣蛋白沉積物。然而，同樣鼠齡的B6. 152小鼠在皮質毛細血管周圍未顯示任何 澱粉樣蛋白。在更大的血管，如腦膜血管和心室血管，在B. MAB11. 152和B6. 152小鼠間觀 察的血管澱粉狀蛋白病的程度沒有明顯區別。實施例5 =Western-Blot分析和A β測量Western-Blot 分析用SDS-PAGE分離15 μ g總蛋白抽提物，隨後轉移到硝酸纖維素膜(Amersham， Hybond)。對於A β檢測，在PBS (8. ImM磷酸氫二鈉、1. 5mM磷酸二氫鉀、137mM氯化鈉、2. 7mM 氯化鉀)中95°C加熱膜5分鐘以增加表位變性和表位提呈，用溶於PBST (PBS和0.05% (ν/ ν)吐溫20)的5% (w/v)脫脂奶粉封閉，以第一抗體在4°C孵育過夜。對於APP檢測，以 1μ g/ml 的濃度使用第一抗體 W0-2(Ida 等人，J Biol Chem. 1996，271 (37) :22908_1)。對 於早老蛋白2檢測，使用了檢測氨末端片段的單克隆抗體PST-20(LOetSCher等人J Biol Chem. 1997 Aug 15 ；272 (33) :20655_9)，對於 tau 抗體，Tau-5 (Invitrogen)，對於總 APP 抗 APP-CT20抗體(Calbiochem)，對於人APP，對人APP特異的抗體W0_2(Ida等人，J Biol Chem. 1996,271(37) :22908_1)。在4°C以PBST進行所有的洗滌步驟。按照廠商說明書 (Amersham)以偶聯辣根過氧化物酶的抗-IgG抗體(Amersham)及隨後的ECL檢測系統檢測 第一抗體的結合。A β 測量在10倍體積的含蛋白酶抑制劑混合物(Complete ，RocheDiagnostics GmbH，德 國曼海姆)的9M尿素、50mM Tris-HCl pH7. 4溶液中勻漿一個腦半球。通過在4°C以1500g 離心5分鐘移除細胞碎片。使用BCA蛋白檢測方法(Pierce，美國)測量上清中的蛋白濃度。按Czech等人描述的方法(J Neurochem, 2007. 101(4) :929_36)，通過使用液相電 化學發光法(LPECL)測定腦勻漿物中Αβ 40和Αβ 42的水平。簡言之，用測試緩衝液(50mM Tris, 60mM NaCl，0· 5% BSA，1 %吐溫 20，pH 7. 4)稀釋M-280 順磁珠(Bioveris)。將終體積 250 μ 1的50 μ 1腦抽提物與50 μ 1珠子和25 μ 1標記的抗體(檢測A β 1-40用6E10_bio 和BAP24-tag，檢測Αβ 1-42用6E10_bio和BAP24-TAG)在室溫下輕輕晃動3小時進行孵 育。使用M-Series M8分析儀(Bioveris)定量ECL。測量以測試緩衝液稀釋的不同稀釋 度的腦勻漿物以保證線性信號反應並與合成的標準Aβ 1-40和Αβ 1-42肽(Bachem)進行 比較。以lmg/ml的濃度將Αβ肽溶解在DMSO中，分成小份並在-80°C冷凍保存。分別參 考Αβ 1-40和Αβ 1-42的標準曲線，以ng/mg腦勻漿物的形式表述結果。每個樣品稀釋度 雙份進行測量並重複至少兩次。實施例6 :B6. mabll. 152 小鼠中 mabll 的 qRT-PCR通過過70 μ M細胞濾網從切碎的整個脾臟分離脾細胞，連續稀釋用於RNS抽提。用 雷射顯微切割從皮層獲取腦樣品，提供了收集到RNAlater 中的小腦和下拖。使用Qiagen 的 RNAeasy 試劑盒抽提 RNA。用 QuantiTectProbe RT-PCR 試劑盒(Qiagen)進行 PCR。根據 廠商說明書進行 TaqMan Assay (Applied Biosystems Inc)。探針為 muIGH6_Mm01718956_ 1111(18]\1 = 8-細胞標記物)，1111^ Mm00431827_ml (腦參考基因)，huHC_ 客戶(基於 mabll IgGl const由ABI為客戶定製)和huLC_客戶(基於mabll Ig κ const由ABI為客戶定 制)。
在LC480 (Roche Diagnostics)上進行PCR。利用Δ Ct法進行靶RNA的相對定量。 來自於非轉基因小鼠的腦顯微切割物未給出Mabll IgH和IgK RNA的陽性信號。在表3和 5中給出了 B6.mabll. 152小鼠的結果。ave Δ CpSDΔΔAPP的百分比
dlgHCX4.171. 320.0555. 5
dlgKCx2.410. 580.18818. 8
dlgHCb4.230. 750.0535. 3
dlgKCb2.930. 690.13113. 1
dlgHSub4.321. 120.0505. 0
dlgKSub2.711. 320.15315. 3表3 :huIgH和hulgK在B6.mabll. 152小鼠腦中的表達內源參考基因IgM和⑶20在野生型和轉基因小鼠中的表達為細胞數目依賴性的。 只有在轉基因小鼠中才能發現hulg的強烈且細胞數目依賴性的信號。在野生型小鼠中，與 實驗背景相比，沒有信號被檢測到(參見表4和5)。細胞數IGH6_55 IGH6_56 CD20 hu IgHGl hulgKC10000 22. 2 25.0 24.9 29.024.41000 25. 5 28.0 28.0 32. 227. 3100 28.6 31.5 30.8 35.130.810 31. 2 34. 7 32.8 37.934.6132. 7 38. 1 33. 138. 0表4 :B6. mabll. 152 小鼠的 Ct。IGH6_55, IGH6_56 =內源 IgM 參考，CD20 =內源 ⑶20參考，hulgHGl，hulgKC =轉基因特異性探針。細胞數IGH6_55 IGH6_56 CD20 hulgHGl hulgKC10000 20.823. 3 23. 2 44. 5 38.41000 24. 026. 4 26. 4100 27.229.7 29.6 38.5 36.310 30. 133. 5 32. 2 38. 1131. 936. 5 33. 5表5 野生型 C57B1/6 的 Ct。IGH6_55，IGH6_56 =內源 IgM 參考，CD20 =內源 CD20 參考，hulgHGl, hulgKC =轉基因特異性探針。
權利要求
一種非人類轉基因動物，其基因組包含a)編碼人APP瑞典突變型或人APP倫敦突變型蛋白的第一轉基因DNA序列，其中所述第一轉基因DNA序列有效連接到第一啟動子；b)編碼含有N141I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列，其中所述第二轉基因DNA序列有效連接到第二啟動子；c)編碼定向抗澱粉樣蛋白肽的抗體的輕鏈的第三轉基因DNA序列，其中所述第三轉基因DNA序列有效連接到第三啟動子；d)編碼所述抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列，其中所述第四轉基因有效連接到第三啟動子或第四啟動子。
2.根據權利要求1所述的轉基因動物，其中第三和第四轉基因DNA序列編碼抗Αβ抗 體Mab 11的輕鏈和重鏈。
3.根據權利要求1到2任一項所述的轉基因動物，其中第一和第二啟動子是神經元啟 動子。
4.根據權利要求1到2任一項所述的轉基因動物，其中第一和第二啟動子是腦特異性 啟動子。
5.根據權利要求1到4任一項所述的轉基因動物，其中第三和/或第四啟動子是I型 MHC基因的啟動子。
6.根據權利要求1到5任一項所述的轉基因動物，其中第三和/或第四啟動子與IgH 增強子聯合。
7.根據權利要求1到6任一項所述的轉基因動物，其中動物對至少一種轉基因DNA序 列是純合的。
8.根據權利要求1到7任一項所述的轉基因動物，其中動物是非人類哺乳動物。
9.根據權利要求1到8任一項所述的轉基因動物，其中動物是小鼠。
10.根據權利要求1到9任一項所述的非人類轉基因動物的後代，通過與相同或其他基 因型的動物繁殖獲得。
11.源自根據權利要求1到9任一項所述的非人類轉基因動物或其根據權利要求10的 後代的細胞系或原代細胞培養物。
12.源自根據權利要求1到9任一項所述的非人類轉基因動物或其根據權利要求10的 後代的組織或器官外植體或其培養物。
13.源自根據權利要求1到9任一項所述的非人類轉基因動物或其根據權利要求10的 後代的組織或細胞抽提物。
14.產生非人類轉基因動物的方法，其基因組包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突 變型、包含W41I取代的人早老蛋白2和定向抗β澱粉樣蛋白肽的人類抗體的重鏈和輕鏈 的轉基因DNA，所述方法包含a)共注射包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型的所述第一轉基因DNA序列的 遺傳構建體和包含編碼具有W41I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列的遺傳構建 體到非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞中，並從所述受精卵或胚胎幹細胞產生非人類二元 轉基因動物；b)共注射包含第三轉基因DNA序列的遺傳構建體，其中所述DNA序列編碼定向抗澱粉樣蛋白肽的人抗體的輕鏈，和包含編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列的遺傳構 建體到非人類受精卵或非人類胚胎幹細胞中，並從所述受精卵或胚胎幹細胞產生非人類二 元轉基因動物，c)將a)和b)的轉基因動物進行交配並由此產生非人類四元轉基因動物，其基因組包 含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、包含W41I取代的人早老蛋白2、定向抗β澱 粉樣蛋白肽的人抗體的重鏈和輕鏈的轉基因DNA。
15.產生非人類轉基因動物的方法，該動物表達人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、 包含Ν141Ι取代的人早老蛋白2和定向抗(人)β澱粉樣蛋白肽的人抗體的重鏈和輕鏈， 所述方法包括a)共注射包含編碼人APP瑞典突變型或APP倫敦突變型的所述第一轉基因DNA序列的 遺傳構建體，其中所述第一轉基因DNA序列有效連接到第一啟動子，和包含編碼具有N141I 取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列的遺傳構建體到非人類受精卵或非人類胚胎幹 細胞中，其中所述第二轉基因DNA序列有效連接到第二啟動子，並從所述受精卵或胚胎幹 細胞產生非人類二元轉基因動物；b)共注射包含第三轉基因DNA序列的遺傳構建體，其中所述第三轉基因DNA序列編碼 定向抗人澱粉樣蛋白肽的人抗體的輕鏈，所述第三轉基因DNA序列被有效連接到第三啟動 子，和包含編碼所述人抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列的遺傳構建體到非人類受精卵或 非人類胚胎幹細胞中，其中所述第四轉基因DNA序列有效連接到第四啟動子，並從所述受 精卵或胚胎幹細胞產生非人類二元轉基因動物，c)將a)和b)的轉基因動物進行交配並由此產生非人類四元轉基因動物，其表達人 APP瑞典突變型或APP倫敦突變型、包含N141I取代的人早老蛋白2、定向抗β澱粉樣蛋白 肽的人抗體的重鏈和輕鏈。
16.根據權利要求15所述的產生方法，其中第一和第二啟動子是神經元啟動子。
17.根據權利要求15所述的產生方法，其中第一和第二啟動子是腦特異性啟動子。
18.根據權利要求14到17任一項所述的產生方法，其中第三和第四轉基因DNA序列編 碼抗A β抗體Mab 11的輕鏈和重鏈。
19.根據權利要求14到18任一項所述的產生方法，其中第一啟動子是Thyl.2糖蛋白 啟動子。
20.根據權利要求14到19任一項所述的產生方法，其中第二啟動子是朊病毒基因。
21.根據權利要求14到20任一項所述的產生方法，其中第三和/或第四啟動子是I型 MHC基因啟動子。
22.根據權利要求14到21任一項所述的方法產生的非人類四元轉基因動物。
23.根據權利要求1到9和22任一項所述的非人類四元轉基因動物作為阿爾茨海默病 治療模型的用途。
24.根據權利要求1到9和22任一項所述的非人類四元轉基因動物作為預防阿爾茨海 默病模型的用途。
全文摘要
本發明涉及非人類轉基因動物，其基因組包含a)編碼人APP瑞典突變型或人APP倫敦突變型蛋白的第一轉基因DNA序列，其中所述第一轉基因DNA序列有效連接到第一啟動子；b)編碼包含N141I取代的人早老蛋白2的第二轉基因DNA序列，其中所述第二轉基因DNA序列有效連接到第二啟動子；c)編碼定向抗澱粉樣蛋白肽的抗體的輕鏈的第三轉基因DNA序列，其中所述第三轉基因DNA序列有效連接到第三啟動子及；d)編碼所述抗體的重鏈的第四轉基因DNA序列，其中所述第四轉基因有效連接到第三啟動子或第四啟動子，以及產生所述動物的方法。
文檔編號C12N15/85GK101918564SQ200880113928
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年11月1日
發明者A·伊格萊希亞斯, B·波爾曼, H·羅特施赫 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司