被子植物花部器官的線粒體螢光標記方法

2023-10-28 03:19:02

被子植物花部器官的線粒體螢光標記方法
【專利摘要】本發明公開了被子植物花部器官的線粒體螢光標記方法。本發明提供的方法，包括如下步驟：將處理後的被子植物花部器官在含有Mitotracker?Red?CMXRos的緩衝液中染色，實現螢光標記被子植物花部器官線粒體。本發明的實驗證明，本發明提供了一種被子植物花被片線粒體螢光標記的方法，有以下優點：1)標記效果好，可在雷射共聚焦顯微鏡下觀察到線粒體均勻的分布在細胞周圍；2)用Mitotracker標記後的裝片經固定液固定後，可製成永久製片觀察；3)簡單、快捷並迅速的標記花部器官中的線粒體；為花部器官線粒體分布及位移的研究奠定基礎，實際應用價值高。
【專利說明】被子植物花部器官的線粒體螢光標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及被子植物花部器官的線粒體螢光標記方法。【背景技術】
[0002]花作為植物的繁殖器官，由萼片、花瓣、雄蕊群和雌蕊群組成，承擔植物傳粉、受精及結實的全部過程，因此成為植物學領域研究的重點對象。植物為響應外界環境變化，進化出多種響應機制，如植物的開花生熱，自交不親和現象，花柱引導組織分泌物質引導花粉管生長的等機制，對保證植物的生殖過程起著至關重要的作用。線粒體作為能量代謝的重要細胞器，能夠響應細胞事件，進行運動及位移。花部器官為生殖生長的重要場所，代謝活動旺盛，是研究線粒體分布，位移的重要部位。
[0003]目前，對於線粒體分布，運動及位移的研究集中在根尖、裸子植物花粉管和葉片上表皮等部位。研究對象也均為擬南芥、洋蔥及菸草等模式生物。迄今為止，在非模式生物花部器官中線粒體的螢光標記未見報導，從而導致對花部器官線粒體的研究比較滯後。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種被子植物花部器官線粒體的螢光標記方法。
[0005]本發明提供的方法，包括如下步驟:
[0006]將處理後的被子植物花部器官在含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液中染色，實現螢光標記被子植物花部器官線粒體。
[0007]上述方法中，MitotrackerRed CMXRos 購於 Molecular Probes,產品目錄號M7512，其分子式為C32H32Cl2N2O,化學結構式為式I所示:
[0008]
CH2Cl
[0009]式I。
[0010]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液中Mitotracker RedCMXRos 的終濃度為 50nM-200nM。
[0011]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液中Mitotracker RedCMXRos 的終濃度為 50nM、IOOnM 或 200nM Jitotracker Red CMXRos 染色濃度在 50nM_200nM之間均可，但以染色濃度為IOOnM最佳。Mitotracker濃度為200nM，花被片細胞易發生質壁分離。由於花柱切片並非單層細胞，所以染色濃度可為200nM，並適當延長染色時間，質壁分離現象不明顯，染色效果好，花柱切片的最佳染色時間為20min。
[0012]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液由Mitotracker RedCMXRos、蔗糖、硼酸和水組成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述緩衝液中的終濃度為50nM、100nM或200nM,所述鹿糖在所述緩衝液中的質量百分含量為2%,所述硼酸在所述緩衝液中的質量百分含量為0.01% ；
[0013]對於質壁分離嚴重的植物材料，可用蒸餾水代替緩衝液，但會一定程度上影響線粒體活性；所述含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液可以由Mitotracker Red CMXRos和水組成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述緩衝液中的終濃度為50nM、IOOnM或200nM。
[0014]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的緩衝液的pH值為6.5-7.0。
[0015]上述方法中，所述染色的溫度為23-28°C，所述染色的時間為15-20min。花被片最佳染色時間為15_17min，時間過短，不容易成功標記，而時間過長，細胞壁易被染成厚重紅色，不易觀察。
[0016]所述染色的時間具體為15min、17min或20min。
[0017]上述方法中，所述被子植物花部器官為花被片或雌蕊，所述雌蕊具體為花柱。
[0018]上述方法中，所述處理後的花被片按照如下方法製備:收集花被片上表皮細胞，得到處理後的花被片；
[0019]所述處理後的花柱按照如下方法製備:將花柱切片，得到處理後的花柱。
[0020]上述方法中，所述花被片上表皮細胞為單層細胞，且其面積為3.5-4.5mm2，其面積具體為4mm2 ；
[0021 ] 所述花柱切片的厚度為75-85 μ m,其厚度具體為80 μ m。
[0022]上述方法中，所述花柱切片用Leica VT12000S震蕩切片機進行縱切，且刀片與花柱保持20-30°夾角，也可以徒手用刀片縱切，只要花柱切片的厚度為75-85 μ m即可。
[0023]上述方法中，所述被子植物為白玉蘭或杜鵑。
[0024]上述螢光標記後用Leica TCS SP5雷射共聚焦顯微鏡觀察線粒體螢光標記，激發波長為540nm，接收波長範圍為570_630nm。花被片染色後用63X水鏡觀察，花柱用40X物鏡觀察。應用雷射共聚焦顯微鏡的xyt模式，可以記錄細胞內線粒體的動態過程。
[0025]上述方法中，還包括洗滌花部器官的步驟，均採用2%蔗糖和0.01%硼酸組成的緩衝液。
[0026]本發明的實驗證明，本發明提供了 一種被子植物花被片線粒體螢光標記的方法，有以下優點:1)標記效果好，可在雷射共聚焦顯微鏡下觀察到線粒體均勻的分布在細胞周圍；2)用Mitotracker標記後的裝片經固定液固定後,可製成永久製片觀察；3)簡單、快捷並迅速的標記花部器官中的線粒體；為花部器官線粒體分布及位移的研究奠定基礎，實際應用價值高。
[0027]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為在雷射共聚焦顯微鏡下觀察到的白玉蘭花被片上表皮線粒體的分布狀態
[0029]圖2為在雷射共聚焦顯微鏡下觀察到的白玉蘭雌蕊薄層細胞線粒體分布狀態[0030]圖3為在雷射共聚焦顯微鏡下觀察到的杜鵑花花柱徒手切片線粒體分布狀態【具體實施方式】
[0031]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]Mitotracker Red CMXRos購於Molecular Probes,產品目錄號M7512,其分子式為C32H32Cl2N2O,化學結構式為式I所示:
[0034]
【權利要求】
1.一種被子植物花部器官線粒體的螢光標記方法，包括如下步驟: 將處理後的被子植物花部器官在含有MitOtracker Red CMXRos的緩衝液中染色，實現螢光標記被子植物花部器官線粒體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述含有MitotrackerRed CMXRos的緩衝液中 Mitotracker Red CMXRos 的終濃度為 50nM_200nM。
3.根據權利要求2所述的方法,其特徵在於:所述含有MitotrackerRed CMXRos的緩衝液中 Mitotracker Red CMXRos 的終濃度為 50nM、IOOnM 或 200nM。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於: 所述 Mitotracker Red CMXRos 的緩衝液由 Mitotracker Red CMXRos、鹿糖、硼酸和水組成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述緩衝液中的終濃度為IOOnM,所述鹿糖在所述緩衝液中的質量百分含量為2%，所述硼酸在所述緩衝液中的質量百分含量為0.01% ; 或所述 Mitotracker Red CMXRos 的緩衝液由 Mitotracker Red CMXRos 和水組成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述緩衝液中的終濃度為ΙΟΟηΜ。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於:所述含有MitotrackerRedCMXRos的緩衝液的pH值為6.5-7.0。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於:所述染色的溫度為23-28°C，所述染色的時間為15-20min。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法,其特徵在於: 所述被子植物花部器官為花被片或雌蕊，所述雌蕊具體為花柱。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特徵在於: 所述處理後的花被片按照如下方法製備:收集花被片上表皮細胞，得到處理後的花被片; 所述處理後的花柱按照如下方法製備:將花柱切片，得到處理後的花柱。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於: 所述花被片上表皮細胞為單層細胞，且其面積為3.5-4.5mm2，其面積具體為4mm2 ； 所述花柱切片的厚度為75-85 μ m,其厚度具體為80 μ m。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特徵在於: 所述花柱切片用Leica VT12000S震蕩切片機進行縱切，且刀片與花柱保持20-30°夾角；所述被子植物為白玉蘭或杜鵑。
【文檔編號】G01N21/64GK103983496SQ201410211027
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】王若涵, 張出蘭, 張志翔, 紀翔宇, 劉翔宇 申請人:北京林業大學