一種板藍根藥材的檢測方法
2023-10-20 00:27:02
一種板藍根藥材的檢測方法
【專利摘要】本發明屬於中藥材質量檢測領域，具體涉及一種板藍根的質量檢測方法。該方法包括對板藍根所含的尿苷、鳥苷、腺苷和總酸含量的測定以及對板藍根農藥殘留量的測定。本發明解決了傳統理化特性的鑑別方法的操作複雜和局限性以及質量難以調控的技術問題，以提供了一種準確度高，操作簡便快速，成本低廉的檢測方法，具有良好的應用前景和經濟效益。
【專利說明】一種板藍根藥材的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於中藥材質量檢測領域，具體涉及一種板藍根藥材的質量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 板藍根，常用別名靛青根、藍靛根或大青根，是一種中藥藥材。中國各地均產。板 藍根分為北板藍根和南板藍根，北板藍根來源為十字花科植物菘藍和草大青的根；南板藍 根為爵床科植物馬藍的根莖及根。具有清熱解毒、涼血消腫、利咽之功效。板藍根是一種用 量極大且長期銷售不衰的藥材，縱觀板藍根的歷史，我們可以看到其銷量在飛速增長。板藍 根含多種化學成分，主要含有尿苷、鳥苷、腺苷、總酸等。現代研究表明板藍根含有的成分具 有廣泛的生理活性作用，其含量與板藍根的清熱解毒等功效密切相關，因此其含量的多少 常作為板藍根藥材質量控制的重要指標。
[0003] 近幾年板藍根的市場需求量持續增加，野生資源逐年減少，人工栽培發展緩慢，使 得板藍根資源蘊藏量和產量都在大幅下降。導致市場上出現了很多偽品，其中不少偽品的 農藥殘留量超標爆表，給板藍根藥材的質量、用藥的安全性及有效性帶來了很大的衝擊，已 成為制約板藍根系列藥材開發的瓶頸。
[0004]目前，正品板藍根的有效檢測方法是傳統的形態特徵和理化特性的鑑別方法，具 有一定的局限性，不足以從整體上控制板藍根的質量，作為一味臨床常用中藥，其真偽優劣 受其理化指標、農藥殘留量多等諸多因素的影響，因此有必要建立一種科學的質量檢測方 法對板藍根的質量進行評價。
【發明內容】
[0005] 為此，本發明所要解決的技術問題在於現有技術中板藍根藥材檢測方法複雜，質 量難以調控的問題，進而提供一種準確度高，簡單、快速的檢測板藍根藥材的方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明是通過如下技術方案實現的：
[0007] 本發明提供了一種板藍根藥材的檢測方法，該方法包括如下有效成分含量的測定 步驟以及農藥殘留量的測定步驟，其中：
[0008]A:尿苷、鳥苷、腺苷含量的測定包括如下步驟：
[0009] (1)分別精密稱取鳥苷對照品3. 56mg、尿苷對照品4. 60mg和腺苷對照品4. 49mg， 加甲醇製成每lmL分別含22. 78yg、29. 40yg和含28. 74yg的混合對照品溶液；
[0010] (2)精密稱取板藍根藥材粉末0. 5g，精密加入水25mL，超聲40分鐘；取上清液，經 0. 45ym濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液的製備；
[0011] (3)照高效液相色譜法試驗，以十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱，以乙腈為流動相 A、以水為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫：2-20min，A:B為2%:98% - 40%:60%;控 制柱溫為30°C，流量為0? 6mL/分鐘進行檢測，檢測波長分別為：0min，254nm;7min，262nm; 8min，246nm;10min，259nm;12min，254nm;
[0012]分別取對照品溶液與供試品溶液各10yi，注入液相色譜儀，測定；
[0013] B:所述總酸含量的測定包括如下步驟：
[0014] (1)精密稱取待測板藍根藥材5g，加70%乙醇置水浴上加熱回流提取3次，每次 50ml且每次回流1. 5小時，濾過，60°C時，濾液濃縮至相對密度1. 05,濃鹽酸調pH至2?3， 用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯至幹，加70%乙醇溶解定容至25ml，得到供試品溶液；
[0015] (2)總有機酸以水楊酸計，採用直接滴定法測定其總有機酸的含量；
[0016] C:所述農藥殘留量的測定包括如下步驟：
[0017] (1)精密稱取三苯基磷酸酯適量，加丙酮製成每1ml含100yg三苯基磷酸酯的溶 液，作為內標貯備液；
[0018] 分別精密量取各農藥對照品貯備溶液1ml及所述內標貯備液1ml，加丙酮定容至 100ml，作為混合對照品貯備溶液；分別精密量取適量，加乙腈定容製成20-1000ng/ml的不 同濃度的溶液，作為混合對照品溶液；
[0019] 另取核糖酸內酯適量，加乙腈溶解製成每1ml含20mg核糖酸內酯的溶液，另取山 梨醇適量，加水溶解製成每lml含山梨醇10mg的溶液；分別精密量取上述核糖酸內酯、山梨 醇溶液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作為分析保護劑；
[0020] (2)精密稱取待測藥材細粉10g，並加入氯化鈉lg混勻，精密加入丙酮100ml，冰 浴超聲處理30分鐘，離心，將上清液迅速移入裝有lg無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30 分鐘；隨後精密量取上述溶液60ml減壓濃縮至近幹，並加入體積比為1 :1的環已烷-乙酸 乙酯溶液溶解樣品並定容至l〇ml，過濾後取濾液經GPC凝膠滲透色譜淨化，以體積比為1: 1的環已烷-乙酸乙酯溶液為流動相洗脫，收集洗脫液，移入KD瓶中，減壓濃縮至近幹；
[0021] 向上述樣品中加入體積比為1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，並轉移至 石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以體積比為1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗 脫，收集洗脫液，氮吹至近幹，隨後加入所述內標貯備液5yl，加乙腈定容至lml，作為供試 品溶液；
[0022] (3)精密量取上述各濃度混合對照品溶液及供試品溶液各400yL，並分別加入所 述分析保護劑1〇〇UL混勻，隨後分別精密吸取1yL，進行氣相色譜-質譜聯用儀測定；其 中，
[0023] 所述氣相色譜分析條件為：取規格為30mX0. 25mmX0. 25um的彈性石英毛細管柱 DB17ms，以高純氦氣為載氣，柱流速1. 3ml/分鐘，進樣量1yl，採用高壓不分流進樣，設置 進樣口溫度為230°C，升溫程序具體為：初始溫度60°C，以30°C/分鐘升至120°C、以10°C/ 分鐘升至200°C、以2°C/分鐘升至230°C、以30°C/分鐘升至300°C，並保持7分鐘；
[0024] 所述EI源質譜測定的條件為：設置電子能量70eV，離子源溫度230°C，接口溫度 250。。。
[0025] 其中，所述農藥殘留量的測定中，所述GPC凝膠滲透色譜淨化步驟的條件具體為： 填料為Bio-BeadsS-X3 200-400目，淨化柱為2. 5mmX40cm，具體洗脫參數為：淨化去雜 900s，目標物收集1200s，柱子清洗300s。
[0026]更進一步的，所述農藥殘留量的測定中，所述農藥對照品包括敵敵畏、甲胺磷、乙 醯甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、a-六六六、六六六、六六六、6-六六六、氧化樂 果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地蟲硫磷、磷胺I、樂果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死 蜱、艾氏劑、克菌丹、磷胺II、甲基對硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜靈、三唑酮、 毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、二甲戊靈、順式環氧七氯、反式環氧七氯、三唑醇A、三 唑醇B、反式氯丹、順式硫丹、順式氯丹、反式硫丹、pp' -DDE、PP' -DDD、OP' -DDT、PP' -DDT、狄 氏劑、殺撲磷、異狄氏劑、乙硫磷、三苯基磷酸酯、聯苯菊酯、硫丹硫酸酯、異菌脲、甲氰菊酯、 三氯殺蟎醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯殺蟎碸、伏殺硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、 氰戊菊酯、溴氰菊酯。
[0027] 其中，步驟B中，所述總酸含量的測定，具體步驟為：
[0028] 取供試品溶液5ml置三角瓶中，加入酚酞指示劑2滴，用標定好的0.lmol/L氫氧 化鈉滴定液滴定，滴定至溶液顯粉紅色時為終點，每lml氫氧化鈉滴定液相當於14. 088mg 的水楊酸。
[0029] 其中，步驟A中，所述板藍根甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、板藍根皂苷II、板藍根 皂苷III含量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000iim。
[0030] 步驟C中，所述農藥殘留量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000i!m。
[0031] 本發明所述方法通過對板藍根藥材所含的板藍根有效成分含量的測定以及對板 藍根藥材農藥殘留量的檢測，進行板藍根藥材真偽優劣的判定標準。並通過高效液相色譜 法測定板藍根有效成分的含量，所述方法不僅準確且簡單易行。本發明所述方法通過氣相 色譜-質譜聯用的方式檢測藥材的殘留農藥量，不僅檢測的準確度高，方法簡單、快速，而 且通過對檢測條件的特定篩選，可一次性將板藍根藥材中常見的農藥種類進行一次性的有 效檢測，所述方法準確率及實用效果均較好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實驗例並結合 附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中：
[0033] 圖1是本發明實施例1對照品的HPLC圖譜（1-鳥苷，2-尿苷，3-腺苷）；
[0034] 圖2是本發明實施例1樣品的HPLC圖譜（1-鳥苷，2-尿苷，3-腺苷）；
[0035]圖3是本發明實施例3中農藥標準品的全掃描氣相色譜圖；
[0036] 圖4是本發明實施例3中農藥標準品的0-10分鐘掃描氣相色譜圖；
[0037] 圖5是本發明實施例3中農藥標準品的10-20分鐘掃描氣相色譜圖；
[0038] 圖6是本發明實施例3中農藥標準品的20-40分鐘掃描氣相色譜圖。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1板藍根藥材中板藍根甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、板藍根皂苷II、板藍 根皂苷III含量的測定
[0040] 1?儀器與試藥
[0041] 1.1 儀器
[0042]waters2695-2998高效液相色譜儀，超聲清洗器（250W，40kHz)。
[0043] 1. 2 試藥
[0044] 鳥苷對照品（A0778,純度98.4%，天津馬克生物有限公司），尿苷對照品 (887-200001，中國藥品生物製品檢定所），腺苷對照品（110879-200202,中國食品藥品檢 定研究院）。
[0045] 甲醇、乙腈為色譜純、水為純淨水，乙醇為分析純。
[0046] 1. 3藥材樣品
[0047] 收集了各地板藍根樣品，供試藥材產地批次分別選自：隴西首陽2批次，分別標註 為1-2、甘肅隴西首陽董家堡、甘肅隴西首陽菜子坪、甘肅渭源會川、甘肅臨洮、甘肅渭源2 批次，分別標註為1-2、渭源蓮峰綻坡村3批次，分別標註為1-3、甘肅商品。
[0048] 2?方法
[0049] 2. 1對照品溶液的製備
[0050] 分別精密稱取鳥苷對照品3. 56mg、尿苷對照品4. 60mg和腺苷對照品4. 49mg，加甲 醇製成每lmL分別含22. 78yg、29. 40yg和含28. 74yg混合對照品溶液，即得對照品溶 液。
[0051] 2. 2供試品溶液的製備
[0052] 取板藍根藥材粉碎（過四號篩）約0? 5g，精密稱定，精密加入水25mL，超聲40min。 取上清液，經0. 45ym濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。
[0053] 2. 3色譜條件
[0054] 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈（A)-水（B)為流動相按下表進行梯度 洗脫（見表1);檢測波長採用多波長檢測（見表2);柱溫為30°C;流量0? 6mL/min。
[0055] 表1含量測定洗脫梯度
【權利要求】
1. 一種板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，該方法包括如下有效成分含量的測定步 驟以及農藥殘留量的測定步驟以及農藥殘留量的測定步驟，其中， A :尿苷、鳥苷、腺苷含量的測定包括如下步驟： (1) 分別精密稱取鳥苷對照品3. 56mg、尿苷對照品4. 60mg和腺苷對照品4. 49mg，加甲 醇製成每lmL分別含22. 78 y g、29. 40 y g和含28. 74 y g的混合對照品溶液； (2) 精密稱取板藍根藥材粉末0. 5g，精密加入水25mL，超聲40分鐘；取上清液，經 0. 45 y m濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液的製備； (3) 照高效液相色譜法試驗，以十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱，以乙腈為流動相A、以 水為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫：2-20min，A :B為2% :98% - 40% :60% ;控制 柱溫為30°C，流量為0? 6mL/分鐘進行檢測，檢測波長分別為：0min，254nm ;7min，262nm ; 8min,246nm ； lOmin,259nm ； 12min,254nm ； 分別取對照品溶液與供試品溶液各l〇u 1，注入液相色譜儀，測定； B :所述總酸含量的測定包括如下步驟： (1) 精密稱取待測板藍根藥材5g，加70%乙醇置水浴上加熱回流提取3次，每次50ml 且每次回流1. 5小時，濾過，60°C時，濾液濃縮至相對密度1. 05,濃鹽酸調pH至2?3,用乙 酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯至幹，加70%乙醇溶解定容至25ml，得到供試品溶液； (2) 總有機酸以水楊酸計，採用直接滴定法測定其總有機酸的含量； C :所述農藥殘留量的測定包括如下步驟： (1) 精密稱取三苯基磷酸酯適量，加丙酮製成每lml含100 y g三苯基磷酸酯的溶液，作 為內標貯備液； 分別精密量取各農藥對照品貯備溶液lml及所述內標貯備液lml，加丙酮定容至 100ml，作為混合對照品貯備溶液；分別精密量取適量，加乙腈定容製成20-1000ng/ml的不 同濃度的溶液，作為混合對照品溶液； 另取核糖酸內酯適量，加乙腈溶解製成每lml含20mg核糖酸內酯的溶液，另取山梨醇 適量，加水溶解製成每lml含山梨醇10mg的溶液；分別精密量取上述核糖酸內酯、山梨醇溶 液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作為分析保護劑； (2) 精密稱取待測藥材細粉10g，並加入氯化鈉 lg混勻，精密加入丙酮100ml，冰浴超聲 處理30分鐘，離心，將上清液迅速移入裝有lg無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30分鐘； 隨後精密量取上述溶液60ml減壓濃縮至近幹，並加入體積比為1 :1的環已烷-乙酸乙酯溶 液溶解樣品並定容至l〇ml，過濾後取濾液經GPC凝膠滲透色譜淨化，以體積比為1 :1的環 已烷-乙酸乙酯溶液為流動相洗脫，收集洗脫液，移入KD瓶中，減壓濃縮至近幹； 向上述樣品中加入體積比為1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，並轉移至石墨 碳-氨基混合固相萃取小柱上，以體積比為1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脫，收集 洗脫液，氮吹至近幹，隨後加入所述內標貯備液5iU，加乙腈定容至lml，作為供試品溶液； (3) 精密量取上述各濃度混合對照品溶液及供試品溶液各400 y L，並分別加入所述分 析保護劑1〇〇 U L混勻，隨後分別精密吸取1 y L，進行氣相色譜-質譜聯用儀測定；其中， 所述氣相色譜分析條件為：取規格為30mX0. 25mmX0. 25um的彈性石英毛細管柱 DB17ms，以高純氦氣為載氣，柱流速1.3ml/分鐘，進樣量liU，採用高壓不分流進樣，設置 進樣口溫度為230°C，升溫程序具體為：初始溫度60°C，以30°C /分鐘升至120°C、以10°C / 分鐘升至200°C、以2°C /分鐘升至230°C、以30°C /分鐘升至300°C，並保持7分鐘； 所述EI源質譜測定的條件為：設置電子能量70eV，離子源溫度230°C，接口溫度 250。。。
2. 根據權利要求1所述的板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，所述農藥殘留量的測 定中，所述GPC凝膠滲透色譜淨化步驟的條件具體為：填料為Bio-Beads S-X3 200-400 目，淨化柱為2. 5mmX 40cm，具體洗脫參數為：淨化去雜900s，目標物收集1200s，柱子清洗 300s〇
3. 根據權利要求1或2所述的板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，所述農藥殘 留量的測定中，所述農藥對照品包括敵敵畏、甲胺磷、乙醯甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、 a-六六六、￠-六六六、六六六、S-六六六、氧化樂果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、 地蟲硫磷、磷胺I、樂果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏劑、克菌丹、磷胺II、甲 基對硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜靈、三唑酮、毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、 對硫磷、二甲戊靈、順式環氧七氯、反式環氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、順式硫丹、 順式氯丹、反式硫丹、PP' _DDE、PP' -DDD、0P' -DDT、PP' -DDT、狄氏劑、殺撲磷、異狄氏劑、乙硫 磷、三苯基磷酸酯、聯苯菊酯、硫丹硫酸酯、異菌脲、甲氰菊酯、三氯殺蟎醇、氯氟氰菊酯、甲 氧DDT、三氯殺蟎碸、伏殺硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4. 根據權利要求1-3任一所述的板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，所述總酸含量 的測定，具體步驟為： 取供試品溶液5ml置三角瓶中，加入酚酞指示劑2滴，用標定好的0. lmol/L氫氧化鈉 滴定液滴定，滴定至溶液顯粉紅色時為終點，每lml氫氧化鈉滴定液相當於14. 088mg的水 楊酸。
5. 根據權利要求1-4任一所述的板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，所述板藍根甲 苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、板藍根皂苷II、板藍根皂苷III含量的測定中，所述待測藥材的粒 徑為 180-2000 ii m。
6. 根據權利要求1-5任一所述的板藍根藥材的檢測方法，其特徵在於，所述農藥殘留 量的測定中，所述待測藥材的粒徑為180-2000 y m。
【文檔編號】G01N30/02GK104458931SQ201410374924
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】宋平順, 李登鵬, 陳杰, 韓斌, 李波, 趙建邦, 李士博, 李冬華, 張明童 申請人:甘肅中天藥業有限責任公司