黑青斑河魨幹擾素IFNγ2及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-11 09:41:29 2

專利名稱：黑青斑河魨幹擾素IFNγ2及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種黑青斑河飩II型幹擾素IFNY2的編碼基因、蛋白及其製備方法和應用。
背景技術：
細胞免疫因子Y幹擾素(IFN Y)，作為幹擾素系統中重要的II型IFN，是主要的巨噬細胞刺激因子和調控免疫反應的關鍵信號分子，能激活效應細胞，提高自然殺傷細胞 (NK)和巨噬細胞活性，促進免疫球蛋白的轉換，具有抗腫瘤、抗病毒、調節和增強機體免疫功能等作用。幹擾素IFNyI和IFNY2基因是魚類IFNY基因的兩個亞型，其胺基酸序列的特徵是含有兩個保守結構，包括胺基酸序列中的6個α-螺旋和在靠近其胺基酸序列C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]這個保守結構，這與已研究過的其他區中的IFNy 二級結構類似。IFNY具有廣泛的生物學活性。目前已知幹擾素作為細胞因子的重要類型，是細胞和機體受到病毒感染或受核酸、細菌內毒素等誘導時，由受體細胞分泌的一種具有廣譜抗病毒活性的糖蛋白，能誘導細胞進入抗病毒狀態。IFNy是由Thl細胞產生的細胞因子。 它主要通過與其受體結合，活化JAK-STAT信號通路，激活下遊基因的轉錄，包括相關轉錄因子和免疫分子，如STATl、IRFl、ICSBP和MHC II等，從而誘導巨噬細胞產生毒性物質消滅胞內細菌，誘導宿主內一些抗病毒蛋白的合成，調節T細胞的增殖和分化以及增強抗原提呈作用，達到保護宿主的目的。IFNy抗病毒機理主要是能提高細胞表面MHC類分子表達，有助於向細胞毒性T 細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，此外還可以通過下遊基因的轉錄及抗病毒效應基因表達而達到抗病毒作用。對於表達MHC I類抗原的細胞，IFN γ可以誘導I類抗原以更高的水平表達；對於無法檢測到的I類抗原基本表達水平的細胞，IFNy也可以誘導I類抗原的表達，且一般比I型幹擾素IFNa/β具有更強的作用。在體注射IFNY可以導致許多組織中I類抗原表達水平的廣泛增高。IFNy對MHC II類分子表達的調節作用MHC II類分子僅存在於專職的抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞及B細胞)，其他細胞中MHC II類分子均可由IFNy 誘導產生。II類抗原呈遞途徑的所有關鍵基因的正常表達都是必需的，它們受一個單一的受IFNy誘導的轉錄因子II類反式激活蛋白(c II TA)的調節。IFNy能夠激活吞噬細胞的殺菌活性。活化的巨噬細胞表現最突出的是對許多細胞內的和吞噬的生物體如分支桿菌、剛地弓形蟲、錐蟲和利什曼原蟲的殺菌活性大大增強。與哺乳動物相似，魚類IFN γ重組蛋白能夠影響刺激免疫細胞的增殖，增加IFN γ 自身的基因表達，以及誘導下遊免疫基因，如MHC II和Mx基因的表達。Mx是IFN系統中熟為人知的抗病毒蛋白，作為一種GTP酶，它主要通過幹擾病毒的聚合酶來抑制RNA的複製， 從而發揮抗病毒的作用。它主要受I型IFN誘導大量表達發揮其作用，II型IFN對其有一定的誘導作用。重組的IFNy可影響魚類的細胞免疫反應。初步研究的結果表明，一定濃度的重組虹鱒IFNy在RTS-Il cells中會促進下遊免疫基因IPlO和MHC II β的表達。
近年來魚類病害發生頻繁，其中某些疾病給水產養殖業造成災難性的危害，這就使得免疫防治技術在魚病防治中呈現出日趨廣闊的應用前景。IFNy由於其抗腫瘤、抗病毒、調節和增強機體免疫功能等作用在哺乳動物中的應用已非常廣泛，對人的臨床應用治療疾病方面也已很普遍。而其在魚類的研究與應用才開始起步，可以預測其具有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的在於根據現有技術中魚類免疫防治中沒有IFNy的缺陷，提供一種黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2。本發明的另一目的是提供黑青斑河飩幹擾素IFNY2的編碼基因。本發明的又一目的是提供黑青斑河飩幹擾素IFNY2的製備方法。本發明的再一目的是提供黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的應用。、 本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，共188個胺基酸； 等電點為10. 131，分子量為21. 55千道爾頓。黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2胺基酸編碼序列含有一段N段信號肽序列，使用Jpred方法預測其蛋白的二級結構，發現它含有6個α-螺旋結構，且在靠近其胺基酸序列C端的F螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[ IV]這個保守結構，這與其他已鑑定的IFNy —樣。此外，對IFN γ 2進行糖基化位點的預測發現其含有一個糖基化位點。同時，通過對胺基酸序列的C末端進行分析，發現在黑青斑河飩IFN γ 2胺基酸序列的C末端具有類似核定位序列(NLS)的RRRR序列。上述黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。上述黑青斑河飩幹擾素IFNY2的編碼基因的製備方法，其特徵在於以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO: 3為引物，進行反轉錄，得到cDNA ； 再以cDNA為模板，設計上遊引物SEQ ID N0:4，下遊引物SEQ ID NO: 5，進行PCR，得到黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的編碼基因。黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2可以通過表達載體在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達，具體製備方法是將黑青斑河飩IFN γ 2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質粒，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌，經誘導後收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2ο所述表達載體為大腸桿菌表達載體pET3h，重組表達質粒的構建包括以下步驟以含黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2編碼基因的質粒為模板，設計含有ife H
I酶切位點的上遊引物SEQ ID N0:6，含歷idIII酶切位點的下遊引物SEQ ID N0:7進行PCR，
PCR產物克隆到原核融合表達載體pET3h上，得到重組表達質粒，該質粒含有6 XHis親和標記位點。該表達載體是以T7為啟動子，獲得的蛋白的C端有6XHis結構，便於利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所述培養轉化的大腸桿菌的培養條件為接單菌落至含氨苄青黴素LB液體培養基中，37°C，250 rpm，振蕩培養過夜，按1: 50體積比接種到37°C預熱的含氨苄青黴素TB液體培養基中，37 °C，250 rpm，培養至0D600達到0. 6。大腸桿菌優選BL21 (DE3)。
所述誘導為加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，經誘導後收集菌體。誘導時間優選為7小時，可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。所述純化是將總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用Native Binding Buffer重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。所述酶切是用rEK酶，上述步驟獲得的重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，根據融合蛋白上含有S-tag標籤，可以結合到S-protein Agarose上，而目的蛋白IFN γ 2不結合，可被洗脫，在經過EKapture Agarose去除目的蛋白中的rEK酶，可得到單一的IFN γ 2重組目的蛋白。通過對培養時間、誘導時間和溫度等條件的摸索和優化，使得到的融合蛋白的表達量較高，IFNY2大部分處於可溶狀態；優化了重組蛋白的純化條件後，表達產物的超聲裂解液經固定化金屬配體親和層析，得到的蛋白純度在90%以上。黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2在製備魚類免疫調節添加劑或魚類免疫佐劑中的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明利用黑青斑河飩基因組資料庫結合分子生物學方法設計了特異性引物，PCR擴增克隆得到IFN γ 2基因的ORF序列，並構建表達載體，轉化到大腸桿菌中培養，可大量表達黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2基因所編碼的蛋白。本發明黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2基因所編碼的蛋白能夠誘導河飩頭腎細胞中的MX和ISG15基因的表達，豐富了魚類幹擾素系統信號通路的理論，並能有效促進疫苗產生的免疫佐劑，還可作為增強魚類免疫的餌料添加劑。


圖1.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2胺基酸序列與部分脊椎動物IFN γ胺基酸序列的比較結果圖，其中，在比較中採用空格以獲得最大的同源性序列，「——」表示此位置無此
胺基酸；
圖2.黑青斑河飩幹擾素IFNY2成熟肽編碼序列PCR擴增產物電泳結果，其中，M為 100 bp DNA Marker, NC為陰性對照，1為帶有酶切位點的IFN γ 2核苷酸目的片段； 圖3.基因IFN γ 2的重組表達質粒構建圖4.在N端含有Trx融合蛋白的黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2重組蛋白表達和純化的 SDS-PAGE (A)及Western雜交(B)分析圖，其中，M為蛋白質分子量標準，1為未誘導總菌蛋白，2為誘導後總菌蛋白，3為經純化脫鹽後的蛋白樣品；
圖5.切除黑青斑河飩幹擾素IFNY2重組蛋白上的Trx融合蛋白後的IFNY2的 SDS-PAGE分析圖，M為蛋白質分子量標準，1為IFN γ 2，2為Trx融合蛋白；
圖6.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2對頭腎免疫細胞中ISG15和MX基因表達的影響，A為 IFN γ 2對ISG15基因表達的影響，B為IFN γ 2對MX基因表達的影響，*表示與對照組有顯著差異(Ρ<0. 05)。
具體實施例方式實施例1.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2編碼基因的製備1.黑青斑河飩頭腎總RNA的提取
取健康黑青斑河飩(Tfeiraoi/o/ nigriviridis、八救物3 5cm，體重約4 6g，以20 300C循環過濾的水飼養，每天以赤蟲餵食一次。馴養2周後取健康的魚進行實驗。以冰浴麻醉約2 min後，殺魚取樣，分離出肝、脾、腸、頭腎、腮、心臟、皮膚及肌肉，存放於-80°C 冰箱備用。採用Trizol試劑法提取獲得黑青斑河飩頭腎總RNA，其OD26W = 1.85。2. cDNA第一鏈的合成
取5 μ g黑青斑河飩頭腎總RNA樣品進行DNA酶處理以去除基因組DNA的汙染，與RNA Oligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，進行反轉錄，所得產物置於-20°C保存備用。3.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2基因cDNA全序列的克隆
根據^isembl及NCBI的Tetraodon nigriviridis基因組資料庫中的數據，在 IFNy開放讀碼框兩端設計特異引物，上遊引物序列如SEQ ID NO:4，下遊引物序列如SEQ ID NO: 5，以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段大小為567 bp。所得PCR產物上樣至1. 8%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產物。將純化後的目的產物連接至PTZ57 R/T載體轉化DH5ci大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。Blast同源分析表明，目的產物為幹擾素IFN γ 2基因的cDNA序列片段。實施例2黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的製備 1.重組表達質粒的構建
根據幹擾素IFN γ 2重組蛋白編碼基因的兩端序列合成一對引物，上遊引物含有ife H I切割位點，序列如SEQ ID NO:6所示，下遊引物含有歷·/ d III切割位點，其序列如SEQ ID NO:7所示。以含有幹擾素IFN γ 2編碼基因的pTZ57R/T質粒為模板，進行PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產物大小在570 bp左右，電泳結果如圖2。將PCR擴增產物克隆至原核表達載體pET22b上，得到重組表達載體(其構建過程如圖3所示)。表達載體中的外源基因序列經測序鑑定正確。2.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2重組蛋白基因的表達
將步驟1中所構建的質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。基因工程菌超聲裂解上清經 SDS-PAGE電泳分析表明，工程菌在受IPTG誘導後與無IPTG誘導的總菌蛋白相比在約35 kDa的地方出現一條蛋白條帶，與軟體估算的含有Trx融合蛋白的IFN γ 2重組蛋白分子量大小相近(圖4)。經rEK酶切除1Trx融合蛋白後，SDS-PAGE電泳分析表明，IFN γ 2重組目的蛋白約在18.0—25.0 kDa之間的地方出現一條蛋白條帶，與軟體估算的重組IFN γ 2蛋白分子量大小相近(圖5)。對培養時間，誘導濃度，溫度等條件的優化得出基因工程菌的最佳培養條件為接單菌落至5 ml的含氨苄青黴素LB加富液體培養基中，37°C，250 rpm，振蕩培養過夜；按1 50體積比接種到200 ml 37°C預熱的含氨苄青黴素TB液體培養基中，37°C，250 rpm，培養至0D600達到0. 6 ；在30°C，加入IPTG至終濃度0. 5mM,對IFN γ 2蛋白表達工程菌誘導7h， 可獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。3.重組黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的純化
將IFN γ 2蛋白表達工程菌總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用結合緩衝液重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達和層析的結果。從SDS-PAGE結果可以得出6 XHis-黑青斑河飩幹擾素IFNY2重組蛋白基因編碼的蛋白能被固定化鎳金屬親和層析柱所吸附， 用洗脫緩衝液洗鎳層析柱時，能把目的蛋白洗下(如圖4中3)。IFNY2重組蛋白的洗脫峰經過G25凝膠柱更換緩衝液，去除所含咪唑。獲得的IFN γ 2重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，經rEK酶切除融合蛋白後，獲得單一的IFNY2目的蛋白(圖5中1)。實施例3.黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2對免疫相關基因表達影響的活性分析
用剪刀分離黑青斑河飩的頭腎組織，用烘好的磨砂玻片磨砂面進行研磨，磨至末狀; 將磨好的細胞與培養基一起過細胞濾網(BD Falcon, 70 μ m，Nylon)轉移至50 ml離心管中；洗滌、離心後使用完全培養基(RPMI 1640含2 mM L-glutamine, 10% FBS和1% penicillin /streptomycin)2 ml重懸細胞，計數後將細胞數調整至1 X IO7 /mL，分別向 6孔培養板各孔中加入2 mL上述細胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mLIFN γ 2重組蛋白的完全培養基2 mL，並設置陰性對照組(細胞懸浮液和完全培養基各2 mL)。將細胞培養板置於27°C，5% CO2培養箱中培養，孵育4 h後收集各孔細胞，Real Time-PCR檢測重組蛋白對ISG15和MX基因表達的影響。其中ISG15基因表達所用引物上遊引物序列如SEQ ID NO: 10，下遊引物序列如SEQ ID NO: 11 ;MX基因表達所用引物上遊引物序列如SEQ ID NO: 12，下遊引物序列如SEQ ID N0:13。18s rRNA作為內參基因來調節各樣品模板cDNA量，反映重組蛋白的活化能力及對下遊基因表達的影響。18s rRNA基因的上遊引物序列如SEQ ID N0:8，下遊引物序列如SEQ ID N0:9。每組六個重複， 數據用平均值士標準誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P<0. 05)，結果如圖6所示。結果表明，在頭腎細胞中，10 ng/ml的重組IFN γ 2孵育頭腎細胞4小時後能顯著上調ISG15 mRNA水平，而高濃度的重組蛋白則對ISG15轉錄本沒有顯著影響。對於I型IFN的標誌性因子MX基因，與之前研究相似，與其他物種II型IFN同源性較高的IFN γ 2對該基因無顯著性影響。
權利要求
1.一種黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.權利要求1所述黑青斑河飩幹擾素IFNY2的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.權利要求2所述黑青斑河飩幹擾素IFNγ 2的編碼基因的製備方法，其特徵在於以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3為引物，進行反轉錄，得到cDNA ；再以cDNA為模板，設計上遊引物SEQ ID N0:4，下遊引物SEQ ID N0:5，進行PCR， 得到權利要求2所述黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2的編碼基因。
4.權利要求1所述黑青斑河飩幹擾素IFNγ 2的製備方法，是將黑青斑河飩幹擾素 IFN γ 2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質粒，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌，經誘導後收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩幹擾素IFN γ 2。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述表達載體為大腸桿菌表達載體 pET3h，重組表達質粒的構建包括以下步驟以含黑青斑河飩幹擾素IFNY2編碼基因的質粒為模板，設計上遊引物SEQ ID N0:6，下遊引物SEQ ID NO: 7進行PCR，PCR產物克隆到 pET32a上，得到重組表達質粒。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述培養轉化的大腸桿菌的培養條件為含氨苄青黴素LB液體培養基，300C，250rpm振蕩培養過夜，再接種到37°C預熱的含氨苄青黴素TB液體培養基中，培養至0D600達到0. 6。
7.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述誘導為加入IPTG至終濃度為 0. 5mmol/L，誘導時間為7小時。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述純化是將總菌體用Native Binding Buffer洗滌，再用Native Binding Buffer重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
9.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述酶切是用rEK酶。
10.權利要求1所述黑青斑河飩幹擾素IFNγ 2在製備魚類免疫調節添加劑或魚類免疫佐劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種黑青斑河魨幹擾素蛋白IFNγ2，其胺基酸序列如SEQIDNO:1所示，該蛋白的編碼基因，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，編碼基因的製備方法，是用序列用SEQIDNO:4和SEQIDNO:5序列為引物克隆得到幹擾素蛋白IFNγ2的編碼基因；同時還公開了幹擾素蛋白IFNγ2的製備方法，是將黑青斑河魨幹擾素IFNγ2的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質粒，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌，經誘導後收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河魨幹擾素IFNγ2。本發明的黑青斑河魨幹擾素IFNγ2可以用於製備魚類免疫調節添加劑或免疫佐劑，具有誘導魚類免疫基因表達的作用。
文檔編號C12R1/19GK102180961SQ20111006444
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月17日 優先權日2011年3月17日
發明者盧丹琪, 張勇, 張旭, 林浩然, 汪婷, 貝錦新, 陳潔琳 申請人:中山大學