雙齒肽結合物的製作方法

2023-10-11 07:34:09

專利名稱：雙齒肽結合物的製作方法
雙齒肽結合物
技術領域：
本發明涉及一種雙齒肽結合物(Bipodal peptide binder)及其製造方法。背景技術：
抗體是作為B細胞所產生的一種血漿蛋白質的免疫球蛋白，其特異性地識別從外部引進的抗原的特定區而結合，從而對抗原進行鈍化或中和。通過應用這種抗原-抗體反應的特異性和高度的親和力及能夠區別數千萬種類的抗原的抗體的多樣性，當今出現了包含診斷劑和治療劑等的多種抗體產品。目前FDA認證了 21種單克隆抗體，如利妥昔單抗 (Rituximab)及赫賽汀(Here印tin)的抗體在其他治療中完全未起到效應的50%以上的患者身上產生了效果，實際上在許多研究過程中利用單克隆抗體在淋巴瘤、大腸癌或乳腺癌等方面呈現成功的臨床治療。預計治療用抗體的整體市場規模將從2004年100億美元增加到2010年的300億美元呈現年均20%的成長率，並預計其市場規模將會急劇增加。踴躍開展利用抗體的新藥開發的理由在於藥品的開發期間短，投資費用少，能夠容易預測到副作用。並且，抗體作為生藥幾乎不給人體帶來影響，並且抗體在體內的半衰期相當長，其期間相比低分子量藥品具有壓倒性的優勢，因而對患者無害。單克隆抗體儘管具有這種有用性，但是在人體內被識別為外源性抗原而會引起嚴重的變態反應或超敏反應。並且，臨床上使用這種抗癌功能的單克隆抗體時，由於生產成本高，因而具有作為治療劑的價格急劇上漲的缺點，並且由於培養抗體的方法及純化方法等廣泛領域的技術受到各種智慧財產權的保護，要支付昂貴的專利權使用費。因此，為了解決此問題，以美國為中心，歐洲聯盟處於抗體替代蛋白質開發的萌發期。抗體替代蛋白質作為如抗體一樣具有不變區和可變區的重組蛋白質，將大小較小而穩定的蛋白質的規定部分替換成隨機序列的胺基酸而構成文庫(library)，將其針對靶物質進行淘選而能夠找出具有較高的親和力和優良的特異性的物質。例如報告了抗體替代蛋白質中的高親合性多聚體(avimer)和親和體(affibody)對於靶物質具有皮摩爾(picomole) 程度的親和力的例子。報告稱這種抗體替代蛋白質由於大小較小而穩定，能夠滲透到癌細胞深處，一般很少引起免疫反應。並且，尤其是能夠擺脫廣泛的抗體專利問題，並且在細菌中能夠容易地進行大量純化，使得生產成本降低，因此經濟上相比抗體具有更大的優點。目前開發出的抗體替代蛋白質有40種，其中，在風險投資公司或跨國製藥公司正試圖商用化的抗體替代蛋白質正在利用纖維連接蛋白III型結構域、脂籠蛋白、LDLR-A結構域、結晶體、蛋白A、錨蛋白重複序列(Ankyrin repeat)以及BPTI這些蛋白質，對於靶具有皮摩爾到數納摩爾程度的親和力。其中，艾得奈可汀(Adnectin)、高親合性多聚體、庫尼茨(Kimitz) 結構域目前正處於FDA臨床實驗階段。本發明聚焦於與迄今的利用蛋白質的抗體替代蛋白質不同的基於肽的抗體替代蛋白質。肽相比抗體能夠實現適當的藥物動力學、大量生產率、低毒性、抗原性抑制以及低生產成本等，因而目前替代抗體治療劑以多種形態應用。作為治療用藥物的肽的優點在於 生產成本低，安全性及反應性高，專利稅相對低廉，不太露出在不期望的免疫系統，能夠抑制對於肽自身的抗體產生，容易而準確地進行通過合成的變形。但是，由於大部分的肽相比抗體，對於特定蛋白質靶呈現低的親和力及特異性，因而具有無法使用於多種應用領域的缺點。因此，本領域中便開始湧現出關於能夠克服肽的缺點的基於新穎肽的抗體替代蛋白質開發的需求。為此，本發明人們致力於開發出能夠以高的親和性與生物學靶分子特異性地結合的肽物質。預計這將成為能夠利用對於目前許多的靶進行了報告的具有低親和力的肽來短時間內製造具有高親和性及特異性的新藥候補物質的技術。本說明書遍及其所有內容參照並引用了多個論文及專利文獻。所引用的論文及專利文獻的所有揭示內容作為參照內容編入本說明書中，由此更加明確地說明本發明所屬技術領域的水平及本發明的內容。

發明內容本發明人致力於開發出能夠以十分高的親和性(affinity)與生物學靶分子特異性地結合的肽物質。其結果表明，如果在具有比較堅固(rigid)肽骨架的結構穩定化區的兩個末端隨機(random)地結合肽，並將所述兩個肽共同結合至靶分子，則能夠獲得具有大大增大的結合能力及特異性的雙齒肽結合物，由此完成了本發明。因此，本發明的目的在於，提供一種雙齒肽結合物(bipodal-peptide binder)的製造方法。本發明的另一目的在於，提供一種與生物學靶分子結合的雙齒肽結合物。本發明的又一目的在於，提供一種對雙齒肽結合物進行編碼的核酸分子。本發明的再一目的在於，提供一種雙齒肽結合物的表達用載體。本發明的還一目的在於，提供一種包含雙齒肽結合物的表達用載體的轉化體。本發明的其他目的及優點，將通過本發明的詳細說明、權利要求書及附圖更為明確。根據本發明的一實施方式，本發明提供一種與生物學靶分子結合的雙齒肽結合物 (bipodal-peptide binder)的製造方法，該方法包含如下步驟(a)提供雙齒肽結合物的文庫的步驟，上述雙齒肽結合物包含(i)結構穩定化區 (structure stabilizing region)，其包含形成有鏈間(interstrand)非共價鍵的平行線 (parallel)、反平行線(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)胺基酸鏈，以及(ii)靴結合區 I (target binding region I)及靴結合區 II (target binding regionll)，與上述結構穩定化區的兩個末端結合，並包含隨機選擇的各η及m個胺基酸；(b)使上述文庫和靶接觸的步驟；以及(c)選擇與上述靶結合的雙齒肽結合物。根據本發明的其他實施方式，本發明提供一種特異性地與靶結合的雙齒肽結合物，該雙齒肽結合物包含(a)結構穩定化區(structure stabilizing region)，其包含形成有鏈間(interstrand)非共價鍵的平行線(parallel)、反平行線(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)胺基酸鏈；以及(b)靶結合區I (target binding region I)及靶結合區II (target binding region II)，其與上述結構穩定化區的兩個末端結合，並包含隨機選擇的各η及m個胺基酸。
本發明人等致力於開發出能夠以十分高的親和性(affinity)與生物學靶分子特異性地結合的肽物質。其結果表明，如果在具有比較堅固(rigid)肽骨架的結構穩定化區的兩個末端隨機(random)地結合肽，並將所述兩個肽共同結合至靶分子，則能夠獲得具有大大增大的結合能力及特異性的雙齒肽結合物。本發明的基本策略在於，在堅固的肽骨架的兩個末端連接與靶結合的肽。此時，堅固的肽骨架起著對雙齒肽結合物的整體結構進行穩定化的作用，並加強靶結合區I及靶結合區II與靶分子結合。本發明中能利用的結構穩定化區包含平行線、反平行線或平行和反平行胺基酸鍵，並包含將形成基於鏈間(interstrand)氫鍵、基於靜電相互作用、疏水性相互作用、範德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合的非共價鍵的蛋白質結構基序。將基於鏈間氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、範德瓦爾斯相互作用、
相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合形成的非共價鍵有助於結構穩定化區的堅固性(rigidity)。根據本發明的優選實施例，在結構穩定化區上的鏈間(interstrand)非共價鍵包含氫鍵、疏水性相互作用、範德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用或它們的組合。選擇性地，在結構穩定化區可能有共價鍵。例如在結構穩定化區形成二硫鍵，由此能夠更加增強結構穩定化區的堅固性。鑑於對雙齒肽結合物的靶的特異性及親和力，增強基於這種共價鍵的堅固性。根據本發明的優選實施例，結構穩定化區的各胺基酸鏈通過連接物連接。在本說明書中談及鏈時所用的術語「連接物」是指用於連接物與鏈之間的物質。例如將髮夾用作結構穩定化區時，位於髮夾的換向序列起著連接物的作用，將亮氨酸拉鏈用作結構穩定化區時，用於連接亮氨酸拉鏈的兩個C-末端的物質(例如肽連接物)起著連接物的作用。連接物用於連接平行線、反平行線或平行和反平行胺基酸鏈。例如該連接物連接以平行方式排序的最小2個鏈(優選為2個鏈)、以反平行方式排序的最小2個鏈(優選為 2個鏈)、以平行及反平行方式排序的最小3個鏈(優選為3個鏈)。根據本發明的優選實施例，連接物是換向序列或肽連接物。根據本發明的優選實施例，上述換向序列是β-換向、Y-換向、α-換向、Ji-換向或 ω-環形(ω-loop) (Venkatachalam CM(1968)，Biopolymers，6，1425-1436 ；Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules,5,755-758 ；Lewis PN et al. , (1973), Biochim.Biophys. Acta,303,211-229 ；Toniolo C. (1980)CRC Crit. Rev. Biochem. ,9, 1-44 ；Richardson JS. (1981),Adv. Protein Chem.，34，167—339 ；Rose GD et al.，(1985)， Adv. Protein Chem.，37，1-109 ；Milner-ffhite EJ and Poet R. (1987)，TIBS，12，189-192 ; Wilmot CMand Thornton JM. (1988), J.Mol.Biol. ,203,221-232 ；MiIner-ffhiteEJ. (1990)，J. Mol.Biol.，216，385-397 ；Pavone V et al. (1996)，Biopolymers,38,705-721 ； Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci.，5，932-946)。最優選地，本發明中所利用的換向序列為β-換向。將β-換向用作換向序列時，優選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型、III型或ΙΙΓ型換向序列，更優選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型換向序列，進而優選為Γ型或II'型換向序列，最優選為 Γ 型換向序列(B. L. Sibanda et al. , J. Mol. Biol. , 1989, 206,4, 759-777 ； B. L.Sibanda et al.，Methods Enzymol.，1991，202，59-82)。根據本發明的另一優選實施例，能夠在本發明中用作換向序列的已在H. Jane Dyson et al.，Eur. J. Biochem. 255 :462-471 (1998)中公開，上述文獻作為參照內容編入本說明書中。能夠用作換向序列的包含以下胺基酸序列=X-Pro-Gly-Glu-Val ； Ala-X-Gly-Glu-Val (X 選自 20 個胺基酸)。根據本發明的一實施例，將摺疊或亮氨酸拉鏈用作結構穩定化區時，優選地通過肽連接物來連接以平行方式排序的2個鏈或以反平行方向排序的2個鏈。肽連接物只要是在本領域中公開的能夠利用任何一個。適合的肽連接物的序列能夠鑑於如下的因素而選擇(a)能夠適用於柔性延伸構象(flexible extended conformation)的能力；(b)不生成與生物學靶分子相互作用的二級結構的能力；以及(c) 與生物學靶分子相互作用的疏水性殘基或帶有電荷的殘基的部件。優選的肽連接物包含 Gly、Asn及Ser殘基。諸如Thr及Ala的其他中性胺基酸也能包含於連接物序列。適合於連接物的胺基酸序列已在 Maratea et al.，Gene40 :39-46(1985) ；Murphy et al.，Proc. Natl. Acad Sci. USA83 :8258-8562 (1986)；美國專利第 4，935，233 號、第 4，751，180 號及第 5，990，275號中公開。肽連接物序列能夠由1-50胺基酸殘基構成。根據本發明的優選實施例，結構穩定化區是髮夾、通過連接物連接的摺疊或通過連接物連接的亮氨酸拉鏈，更優選地，結構穩定化區是β-髮夾或通過連接物連接的β-摺疊，最優選為β-髮夾。本說明書中，術語「β_髮夾」是指包含兩個β鏈的最簡單的蛋白質基序，這兩個 β鏈呈現相互反平行的排序。該β-髮夾中的兩個β鏈一般通過換向序列相連接。優選地，適用於β-髮夾的換向序列是I型、Γ型、II型、ΙΓ型、III型或ΙΙΓ 型換向序列，更優選為I型、Γ型、II型、ΙΓ型換向序列，進而優選為Γ型或II'型換向序列，最優選為I'型換向序列。並且，由X-Pro-Gly-Glu-Val ；或Ala-X-Gly-Glu-Val (X 選自20個胺基酸中)表示的換向序列也能利用於β-髮夾。根據本發明的例示性的實施例，I型換向序列為Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr， I 『 型換向序列是Glu-Asn-Gly-Lys，II型換向序列為X-Pro-Gly-Glu-Val或 Ala-X-Gly-Glu-Val (X選自20個胺基酸中)，11'型換向序列為Glu-Gly-Asn-Lys或 Glu-D-Pro-Asn-Lys。具有β-髮夾構象的肽已為本領域所熟知。例如熟知的有在美國專利第 6,914，123 號及 Andrea G. Cochran et al.，PNAS，98(10) :5578-5583)中公開的色氨酸拉鏈、在WO 2005/047503中公開的被鑄型固定的β -髮夾模擬體、在美國專利第5，807，979號中公開的各β-髮夾變形體。此外，具有β-髮夾構象的肽公開在 Smith&Regiin (1995) Science 270 :980-982 ；Chou&Fassmiin (1978) Armu. Rev. Biochem. 47 251-276 ；Kim&Berg(1993)Nature 362 :267-270 ；Minor&Kim(1994)Nature 367 :660-663 ； Minor&Kim(1993)Nature 371 :264-267 ；Smith et al.Biochemistry(1994) 33 :5510-5517 ； Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2 :999-1006 ；Haque&Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119 :2303-2304 ；Blanco et al. (1993)J.Am. Chem. Soc. 115:5887-5888 ；de Alba et al. (1996)Fold. Des. 1 :133-144 ；de Alba et al. (1997)Protein Sci. 6 :2548-2560 ;Ramirez-Alvarado et al. (1996)Nat. Struct. Biol. 3 :604-612 ；Stanger&Gellman(1998) J.Am. Chem. Soc. 120 :4236-4237 ；Maynard&Searle(1997)Chem. Commun. 1297-1298 ； Griffiths-Jones et al. (1998)Chem. Commun. 789-790 ；Maynard et al. (1998)J. Am. Chem. Soc. 120 :1996-2007 ；及 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1 :584-590 中，上述文獻作為參照內容編入本說明書中。將具有β -髮夾構象的肽用作結構穩定化區時，最優選為利用色氨酸拉鏈。根據本發明的優選實施例，本發明中所利用的色氨酸拉鏈由以下通式I表示通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X 『 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-Glu, X2 及 X' 2 相互獨立地為 Thr、His、Val、lie、Phe 或 Tyr, X3 為Trp或Tyr，)(4為I型、Γ型、II型、ΙΓ型或III型或ΙΙΓ型換向序列，)(5為Trp或 Phe，X6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。更優選地，在上述通式I中，&為Ser或Gly-Glu，&及X' 2相互獨立地為Thr、 His或ValJ3* Trp或TyrJ4為I型、I'型、II型或II'型換向序列，&為Trp或Phe， X6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。進而優選地，在通式I中，&為Ser或Gly-GluJ2及X' 2相互獨立地為Thr、His 或ValJ3* TrpJ4為I型、Γ型、II型或ΙΓ型換向序列，&為Trp，)(6為Trp，X7為Lys 或 Ilir-Glu。再而優選地，在通式I中，&為^^，)(2及父'2 SThrJ3STrpJ4S I'型或II' 型換向序列，X5為Trp, X6為Trp, X7為Lys0最優選地，在通式1中，)(1為^^，)(2及)('2為1111~，)(3為^1)，)(4為Γ型換向序列(ENGK)或 ΙΓ 型換向序列(EGNK)，X5 為 Trp，X6 為 Trp，X7 為 Lys0適合於本發明的色氨酸拉鏈的例示性胺基酸序列記載於序列目錄第1序列至第3 序列以及第5序列至第10序列。在本發明中，能夠用作結構穩定化區的β -髮夾肽是來源於蛋白質G的Bl域的肽，即為GBl肽。在本發明中利用GBl肽時，優選地，結構穩定化區由以下通式II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgAGly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或III型或III'型換向序列，)(4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu。更優選地，通式II的結構穩定化區由以下通式ΙΓ表示通式IIX1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3^C1SGly-Glu 或 Lys-LysJ2* I 型、Γ 型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或 ΙΙΓ 型換向序列，X3 為 Thr-Glu 或 Gln-Glu。適合於本發明的GBl β -髮夾的例示性胺基酸序列記載於序列目錄第4序列以及第14序列至第15序列。在本發明中，能夠用作結構穩定化區的髮夾肽是HP肽。本發明中利用HP肽時，優選地，結構穩定化區由以下通式III表示通式IIIX1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、 II'型或 III 型或 III'型換向序列，或 AlaJ6STrp 或 Val，X7*Glu 或 Gln-Glu。在本發明中，能夠用作結構穩定化區的其他β-髮夾肽由以下通式IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1 為 Lys-Thr 或 Gly, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或Iir型換向序列，& SThr-GlU或Gly。通式III及通式IV的β -髮夾的例示性胺基酸序列記載於序列目錄第11序列至第12序列、第15序列以及第16序列至第19序列。根據本發明，能夠將通過連接物連接的β -摺疊用作結構穩定化區。在β -摺疊結構中，在摺疊結構中，平行或反平行的、優選為反平行的兩個胺基酸鏈形成為延伸結構(extended form)，在胺基酸鏈之間形成氫鍵。在β-摺疊結構中，兩個胺基酸鏈的相鄰的兩個末端通過連接物相連接。作為連接物能夠利用上述多種換向-序列或肽連接物。將換向-序列用作連接物時，最優選為 β-換向序列。根據本發明的另一變形例，能夠將亮氨酸拉鏈或通過連接物連接的亮氨酸拉鏈用作結構穩定化區。亮氨酸拉鏈是引起平行的2個α-鏈的二聚化的保存性肽結構域，一般是從參與基因表達的蛋白質發現的二聚化結構域(「Leucine scissors" . Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London Portland Press ；Landschulz WH, et al. (1988) kience240 :1759-1764)。亮氨酸拉鏈一般包含七肽(heptad)重複序列，亮氨酸殘基位於第4或第5位置。例如能夠利用於本發明的亮氨酸拉鏈包含 LEALKEK、LKALEKE、LKKLVGE、LEDKVEE、LENEVAR 或 LLSKNYH 的胺基酸序列。 本發明中所利用的亮氨酸拉鏈的具體例子記載於序列目錄第39序列。亮氨酸拉鏈的各一半由較短的α-鏈組成，亮氨酸直接接觸於α-鏈之間。轉錄因子的亮氨酸拉鏈一般由疏水性亮氨酸拉鏈區及鹼性區(是與DNA分子的主溝槽相互作用的區)構成。本發明中利用亮氨酸拉鏈時，並非必然需要鹼性區。亮氨酸拉鏈結構中兩個胺基酸鏈(即，兩個α-鏈) 的相鄰的兩個末端能夠通過連接物相連接。作為連接物能夠利用上述的多種換向-序列或肽連接物，優選地利用不影響亮氨酸拉鏈的結構的肽連接物。在上述的結構穩定化區的兩個末端將結合隨機胺基酸序列。上述隨機胺基酸序列形成靶結合區I及靶結合區II。本發明的一個最大的特徵在於在結構穩定化區的兩側末端連接靶結合區I及靶結合區II，而以雙齒方式製造肽結合物。靶結合區I及靶結合區II 相互配合地(cooperatively)與靶結合，從而大大地增加對於靶的親和力。靶結合區I的胺基酸數量η不受特殊限制，優選為2-100的整數，更優選為2_50 的整數，進而優選為2-20的整數，最優選為3-10的整數。靶結合區II的胺基酸數量m不受特殊限制，優選為2-100的整數，更優選為2_50 的整數，進而優選為2-20的整數，最優選為3-10的整數。
靶結合區I及靶結合區II中能夠包含數量相互不同或相同的胺基酸殘基。靶結合區I及靶結合區11中能夠包含相互不同或相同的胺基酸序列，優選為包含相互不同的胺基酸序列。包含於靶結合區I和/或靶結合區II的胺基酸序列是線性型胺基酸序列或環狀型胺基酸序列。為了增加靶結合區的肽序列的穩定性，在包含於靶結合區I和/或靶結合區 II的胺基酸序列中至少一個胺基酸殘基能夠變形為乙醯基、芴甲氧羰醯基、甲酸基、棕櫚醯基、肉豆蔻基、硬脂醯基或聚乙二醇(PEG)。與生物學靶分子結合的本發明的雙齒肽結合物能夠利用於生體內生理學反應的調節、生體內物質的檢測、體內分子成像、體外細胞成像以及藥物傳遞用靶向，並能夠用作保護分子。根據本發明的優選實施例，在結構穩定化區、靶結合區I或靶結合區II (更優選為結構穩定化區，進而優選為結構穩定化區的連接物)追加結合有功能性分子。上述功能性分子的例子包含產生能夠檢測的信號的標記物、化學藥物、生物藥物、細胞穿透肽(CPP)或納米粒子，但不限於此。上述產生能夠檢測的信號的標記物包含Tl造影物質(例如Gd螯合物)、T2造影物質(例如超順磁性物質(例磁鐵礦、狗304、^-狗203、錳鐵氧體、鈷鐵氧體以及鎳鐵氧體))、 放射性同位素(例如 11C、150、13N、P32、S35、4你c、45Ti、1181、136La、198Tl、200Tl、205Bi 以及206Bi)、螢光物質(螢光素(fluorescein)、藻紅素(phycoerythrin)、羅丹明、麗絲胺 (Iissamine)以及Cy3和Cy5)、化學發光團、磁性顆粒、大量標誌或密電子顆粒，但不限於此。上述化學藥物例如包含抗炎劑、鎮痛劑、抗風溼劑、鎮痙劑、抗抑鬱劑、抗精神病藥物、鎮靜劑、抗焦慮劑、抗麻醉劑、抗帕金森病藥物、膽鹼能激動劑、抗癌劑、抗血管生成抑制劑、免疫抑制劑、抗病毒劑、抗生素、厭食劑、鎮痛劑、抗膽鹼能藥物、抗組胺劑、抗偏頭痛藥物、激素藥、冠狀血管、腦血管或周圍血管擴張藥、避孕藥、抗血栓劑、利尿劑、抗高血壓藥、 心血管病治療劑、美容成分(例如皺紋改善劑、皮膚老化抑制劑以及皮膚美白劑)等，但不限於此。上述生物藥物能夠是胰島素、IGF-l(insulin-likegrowth factorl)、 生長激素、紅細胞生成素、G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors) > GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors) > i)t M ~ a ^ i)t 素-β、幹擾素-Y、白細胞介素-Ia及β、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-6、白細胞介素-2、EGFskpidermal growth factors 表皮生長因子)、降血鈣素 (calcitonin)、ACTH(adrenocorticotropic hormone 促腎上腺皮質素)、TNF (tumor necrosis factor 月中瘤壞死因子)、阿託西班(atosiban)、布舍瑞林(buserelin)、 西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、去氛力口壓素(desmopressin)、強啡肽 A(dynorphin A) (1-13)、依降鈣素(elcatonin)、章魚唾腺精(eledoisin)、依替巴月太(eptifibatide) > GHRH-II (growth hormone releasing hormone-II 生長素釋放激素-Π)、戈那瑞林(gonadorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、組氨瑞林(histrelin)、 亮丙瑞林(Ieuprorelin)、賴氨加壓素(Iypressin)、奧曲肽(octreotide)、催產素 (oxytocin)、加壓素(pitressin)、分泌素(secretin)、辛卡利特(sincalide)、特利加壓素(terlipressin)、胸腺噴丁 (thymopentin)、胸腺素(thymosine) α 、曲普瑞林 (triptorelin)、比伐盧定(bivalirudin)、卡貝縮官素(carbetocin)、環孢黴素、艾可西定(exedine)、蘭樂妝(Ianreotide)、LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone 黃體生成素釋放激素)、納發阮林(nafarelin)、甲狀旁腺素、普蘭林肽(pramlintide)、 T-20(enfuvirtide)、胸腺法新(thymalfasin)、齊考諾肽、RNA、DNA、cDNA、反義寡核苷酸以及siRNA，但不限於此。靶結合區I和/或靶結合區II能夠包含與多種靶結合的胺基酸序列。能夠被本發明的雙齒肽結合物進行靶向的是生化物質、肽、多肽、核酸、碳水化合物、脂質、諸如細胞及組織的生物學靶、化合物、金屬或非金屬物質，優選為生物學靶。由靶結合區結合的生物學靶優選為生化物質、肽、多肽、糖蛋白、核酸、碳水化合物、蛋白聚糖、脂質或糖脂。例如由靶結合區結合的生化物質包含多種生體內代謝產物(例如ATP、NADH、 NADPH、碳水化合物代謝產物、脂質代謝產物以及胺基酸代謝產物)。由靶結合區結合的例示性肽或多肽包含酶、配位體、受體、生物標誌、激素、轉錄因子、生長因素、免疫球蛋白、信號轉導蛋白質、結合蛋白質、離子通道、抗原、粘附蛋白、結構蛋白質、調節蛋白質、毒蛋白質、細胞因子以及凝血因子，但不限於此。更詳細地，雙齒肽結合物的革巴包含 Fibronectin extra domain B (ED-B) >VEGF(vascular endothelial growth factor) >VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)>VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1)、nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)、HAS (Human serum albumin)>MyD88>EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)>HER2/neu>CD20>CD33XD52> EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)> TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α ), IgE(Immunoglobul in E)、CDlIA ( α-chain of lymphocyte function-associated antigen 1)、CD3、CD25、Glycoprotein Ilb/IIIa、整合素、AFP(Alpha-fetoprotein)、 β 2M(Beta2-microglobulin) > BTA(Bladder Tumor Antigens) > NMP22> Cancer Antigen 125、Cancer Antigen 15-3、降血 丐素、Carcinoembryonic Antigen、Chromogranin A、 : #、 ￥ : #、Human Chorionic Gonadotrop in、Neuron-Specific Enolase、PSA (Prostate-Specific Antigen)、PAP (Prostatic Acid Phosphatase)以及 Thyroglobulin，但不限於此。由靴結合區結合的例示性核酸分子包含gDNA、mRNA、cDNA、rRNA(ribosomal RNA)、 rDNA(ribosomal DNA)以及tRNA，但不限於此。由靶結合區結合的例示性碳水化合物是生體內碳水化合物，其包含單糖、雙糖、三糖以及多糖，但不限於此。由靶結合區結合的例示性脂質包含脂肪酸、三脂醯甘油、鞘脂、神經節苷脂以及膽固醇，但不限於此。本發明的雙齒肽結合物能夠與露出在細胞表面的生體分子(例如蛋白質)結合， 但也能與細胞內的生體分子(例如蛋白質)結合，由此能夠調節生體分子的活性。優選地，雙齒肽結合物對細胞內的蛋白質進行靶向時，雙齒肽結合物還包含細胞穿膜肽(CPP)。上述CPP包含本領域中公開的多種CPP，例如包含HIV-ITat蛋白質、Tat肽類似物(例如寡聚精氨酸)、ANTP肽、HSV VP22轉錄調控蛋白質、來源於vFGF的MTS肽、 Penetratin, Transportan或P^-I肽，但不限於此。將上述CPP與雙齒肽結合的方法有多種方法，例如使位於雙齒肽的結構穩定化區的環形部分的賴氨酸殘基與CPP進行共價鍵合。細胞內有著對生理活性起著重要作用的很多靶蛋白，結合有CPP的雙齒肽結合物流入到細胞內與該靶蛋白結合而調節(例如抑制)活性。以下實施例19表示雙齒肽結合物對細胞內蛋白質進行的靶向的具體例子。MyD88被廣知為與TLR 4、白細胞介素1受體、 RACUIRAK2以及IRAKI相互作用的細胞內蛋白質。由於對MyD88有著結合特異性的CPP-雙齒肽結合物進入到細胞內抑制MyD88的功能，從而有效地阻斷MMP-13的表達。如上所述，本發明的雙齒肽結合物具有典型的「N-靶結合區I-結構穩定化區的一個鏈-連接物-結構穩定化區的另一鏈-靶結合區II-C」組織。根據本發明的優選實施例，本發明的雙齒肽結合物中靶結合區I和結構穩定化區的一個鏈之間和/或結構穩定化區的另一鏈-靶結合區II之間包含阻斷靶結合區與結構穩定化區之間的相互結構性影響的結構影響抑制區(structure influence inhibiting region) 0肽分子中φ和Ψ的旋轉比較自由的胺基酸位於旋轉區。φ和Ψ的旋轉比較自由的胺基酸優選為甘氨酸、丙氨酸及絲氨酸。在結構影響抑制區能夠具有1-10個胺基酸殘基，優選為1-8個，更優選為1-3個。具有上述組織的本發明的雙齒肽結合物的文庫能夠通過本領域中所公知的多種方法而獲得。在該文庫中雙齒肽結合物具有隨機序列，這意味著在靶結合區I和/或靶結合區II的任何位置上均無順序偏好(sequence preference)或指定(或固定)的胺基酸殘基。例如雙齒肽結合物的文庫能夠根據在固相載體(例如聚苯乙烯或聚丙烯醯胺樹脂)上實施的均分合成法(Lam et al. (1991)Nature354 :82 ；WO 92/00091)而構建。根據本發明的優選實施例，雙齒肽結合物的文庫以細胞表面展示(cell surface display)方式(例如噬菌體展示、細菌展示或酵母展示)構建。優選地，雙齒肽結合物的文庫能夠通過基於質粒、細菌噬菌體、噬菌粒、酵母、細菌、mRNA或核糖體的展示方式生成。噬菌體展示是以與噬菌體表面上的外殼蛋白融合的蛋白質形態展示各種多肽的技術(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249 386 ；Sambrook, J. et al.， Molecular Cloning. A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004)) 。
(例如M13)的基因III或基因VIII融合所要表達的基因而展示隨機肽。噬菌體展示中能夠利用噬菌粒。噬菌粒是具有細菌的複製起點(例如ColEl)及細菌噬菌體的基因間(intergenic)區的一副本的質粒載體。克隆在該噬菌粒的DNA片段如質粒一樣增殖。以噬菌體展示的方式構建雙齒肽結合物的文庫時，本發明的優選實施例包含如下步驟(i)製造表達載體文庫的步驟，該文庫包含由對噬菌體外殼蛋白質(例如如M13的絲狀噬菌體的基因III或基因VIII的外殼蛋白質)進行編碼的基因和對雙齒肽結合物進行編碼的基因融合的融合基因；以及與上述融合基因操作性地結合的轉錄調節序列(例如 Iac啟動子)；(ii)將上述表達載體的文庫導入至適合的宿主細胞的步驟；(iii)培養上述宿主細胞，形成重組噬菌體或噬菌粒病毒粒子，使得融合蛋白質展示在表面上的步驟；(iv) 使生物學靶分子與上述病毒粒子接觸，而使粒子與靶分子結合的步驟；以及(ν)分離不與靶分子結合的粒子的步驟。利用噬菌體展示來構建肽文庫，在美國專利第5，723，286號、第5，432，018號、 第 5，580，717 號、第 5，427，908 號、第 5，498，530 號、第 5，770，434 號、第 5，734，018 號、第 5，698，426號、第5，763，192號及第5，723，323號中公開了對這些文庫進行淘選的方法。包含雙齒肽結合物基因的表達載體的製造方法能夠根據本領域中公知的方法而實施。例如能夠在公知的噬菌粒或吞噬載體(例如PIGT2、fUSE5、fAFFl、fd-CATU m663、 fdtetDOG、pHENl、pComb3、pComb8、pCANTAB 5E (Pharmacia)、LamdaSurfZap、pIF4、PM48、 PM52、PM54, fdH及p8V5)插入雙齒肽結合物基因而製造表達載體。雖然大部分噬菌體展示方式利用絲狀噬菌體來實施，但λ噬菌體展示(W0 95/34683 ；美國專利第 5，627，024 號)、Τ4 噬菌體展示(Renet al. (1998)Gene 215 :439 ； Zhu(1997)CAN 33 :534)及T7噬菌體展示(美國專利第5，766，905號)也能利用於雙齒肽結合物的文庫構建。將載體文庫導入至適當的宿主細胞的方法能根據多種轉化方法而實施，最優選地，根據電穿孔(electroporation)法而實施(參照美國專利第5，186，800號、第 5，422，272號、第5，750，373號)。適合於本發明的宿主細胞是如E. coli的革蘭氏陰性菌細胞，適合的 E. coli 宿主細胞包含 JM101、E. coli K12 strain 294,Ε. coli strain W3110 以及Ε. coli XL-IBlue (Mratagene)，但不限於此。宿主細胞優選在轉化之前準備為感受態 MM (Sambrook, J. et al. ,Molecular Cloning. ALaboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) 0對於轉化的細胞的淘選一般在包含抗生素(例如四環素及氨苄青黴素)的培養基中培養該細胞而實施。在存在輔助噬菌體的情況下追加培養經過淘選的轉化細胞而生成重組噬菌體或噬菌體病毒粒子。適合用作上述輔助噬菌體的包含Ex輔助噬菌體、M13-K07、M13-VCS以及R408，但不限於此。與生物學靶分子結合的病毒粒子的淘選通常能夠通過生物淘選過程而實施 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001) ；Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004))ο本發明的雙齒肽結合物的具體例子記載於序列目錄第20序列-第38序列及第40 序列-第41序列。根據本發明的另一實施方式，本發明提供一種對上述雙齒肽結合物進行編碼的核酸分子。根據本發明的還一實施方式，本發明提供一種包含對雙齒肽結合物進行編碼的核酸分子的雙齒肽結合物的表達載體。根據本發明的再一實施方式，本發明提供一種包含雙齒肽結合物的表達用載體的轉化體。本說明書中的術語「核酸分子」具有總括DNA (gDNA及cDNA)及RNA分子的意思，作為核酸分子的基本結構單位的核苷酸不僅包含天然的核苷酸，還包含由糖基或鹼基區變形 i^MU^ (analogue) (Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley,New York(1980) ；Uhlman R Peyman, Chemical Reviews, 90 :543-584(1990))。根據本發明的優選實施例，本發明的載體除了對雙齒肽結合物進行編碼的核酸分子以外還包含能夠對上述核酸分子進行轉錄的強效啟動子(例如tac啟動子、Iac啟動子、 lacUV5啟動子、Ipp啟動子、pLX啟動子、pRX啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子及T7啟動子等)、用於開始翻譯的核糖體結合位點及轉錄/ 翻譯終結序列。根據本發明的優選實施例，本發明的載體還能夠在對雙齒肽結合物進行編碼的核酸分子的5『_方向側包含信號序列(例如pelB)。而且，根據本發明的優選實施例，本發明的載體還能夠包含用於確認雙齒肽結合物在噬菌體表面上是否表達好的標記序列(例如 myc tag) 0根據本發明的優選實施例，本發明的載體包含對噬菌體外殼蛋白質，優選為如Ml3 的絲狀噬菌體的基因III或基因VIII的外殼蛋白質進行編碼的基因。根據本發明的優選實施例，本發明的載體包含細菌的複製起點(例如ColEl)和/或細菌噬菌體的複製起點。 另一方面，本發明的載體作為選擇標誌能夠包含通常利用於本領域中的抗生素抗性基因， 例如能夠包含對氨苄青黴素、慶大黴素、羧苄青黴素、氯黴素、鏈黴素、卡那黴素、遺傳黴素、 新黴素以及四環素的抗性基因。本發明的轉化體優選為如E. coli的革蘭氏陰性菌細胞，適合的E. coli 宿主細胞包含 JM101、E. coli K12 strain 294, Ε. coli strainW3110 及 Ε. coli XL-IBlue(Stratagene)，但不限於此。將本發明的載體運送到宿主細胞內的方法能夠通過 CaC12法(Cohen, S. N. et al. ,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9 :2110-2114 (1973))、Hanahan方法(Cohen, S. N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9 :2110-2114(1973)；以及 Hanahan，D.， J. Mol.Biol.，166 :557-580(1983))及電穿孔法(美國專利第 5，186,800 號、第 5,422, 272 號、第5，750，373號)等而實施。本發明的雙齒肽結合物提供一種表現出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數)，而對生物學靶分子表現出十分高的親和力的肽。如以下實施例所述，與以單齒 (monopodal)方式製造的結合物進行比較時，雙齒肽結合物表現出高達約102-105倍(優選為約103-104倍)的高親和力。本發明的雙齒肽結合物不僅具有醫藥用途，同時還能用於生物體內物質檢測、體內分子成像、體外細胞成像以及藥物傳遞用靶向，並且用作保護分子也非常有效。歸納本發明的特徵及優點為如下(i)本發明提供一種具有新型組織的雙齒肽結合物。(ii)本發明的雙齒肽結合物中結合在結構穩定化區的兩個末端的末梢的 (distal)兩個靶結合區相互配合地(cooperatively)、協同地(synergetically)與靶結合。(iii)因此，本發明的雙齒肽結合物表現出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數)，對靶分子表現出十分高的親和力。(iv)本發明的雙齒肽結合物不僅具有醫藥用途，還能用於生物體內物質檢測、體內分子成像、體外細胞成像以及藥物傳遞用靶向，並且用作保護分子也非常有效。

圖Ia表示包含作為結構穩定化區的β-髮夾(hairpin)的雙齒肽結合物(bipodal-peptide binder)的不意圖。圖Ib表示包含作為結構穩定化區的通過連接物連接的β -摺疊的雙齒肽結合物 (bipodal-peptide binder)的不意圖。圖Ic表示包含作為結構穩定化區的通過連接物連接的亮氨酸拉鏈的雙齒肽結合物(bipodal-peptide binder)的示意圖。圖Id表示包含作為結構穩定化區的通過連接物連接的富亮氨酸基序 (leucine-rich motif)的雙齒肽結合物(bipodal-p印tide binder)的示意圖。圖2表示用於克隆雙齒肽結合物文庫的策略。在PIGT2噬菌粒載體圖中，pelB信號序列、myc tag是用於確認靶基因在噬菌體表面上是否表達好的標記序列。將Iac啟動子用作了啟動子。圖3表示纖維連接蛋白ED-B生物淘選過程中對於輸入的噬菌體(Input phage) 的ED-B、鏈黴親和素以及BSA的生物淘選結果。圖4表示纖維連接蛋白ED-B生物淘選過程中對於在雙齒肽結合物文庫的生物淘選的第三步驟中回收的60種重組噬菌體的ED-B及BSA的ELISA結果。圖fe表示與纖維連接蛋白ED-B蛋白質結合的特定雙齒肽結合物的親和力的測定結果。圖恥表示與VEGF結合的特定雙齒肽結合物的親和力的測定結果。圖5c表示與VCAMl結合的特定雙齒肽結合物的親和力的測定結果。圖 5d 表示與 nAchR(Nicotinic acetylcholine rec印tor)結合的特定雙齒肽結合物的親和力的測定結果。圖&表示與HAS (Human Serum Albumin)結合的特定雙齒肽結合物的親和力的測
定結果。圖6a表示為了檢測纖維連接蛋白ED-B的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。從左側條開始是關於鏈黴親和素、 ED-B、乙醯膽鹼α l、BSA、VCAM、TNF-a、凝血酶、肌紅蛋白、溶菌酶及內臟脂肪素的結果。圖6b表示為了檢測VEGF的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。圖6c表示為了檢測VCAMl的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。圖6d表示為了檢測nAchR片段肽的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。圖6e表示為了檢測HSA的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。圖6f表示為了檢測MyD88的特異性，將具有雙齒肽結合物的重組噬菌體針對各種蛋白質進行ELISA而測定吸光度的結果。圖7表示用於證明雙齒肽結合物的共同作用效果的親和力的測定結果。圖8表示在雙齒肽結合物中將結構穩定化區的色氨酸拉鏈替代為各種β-髮夾基序而測定雙齒肽結合物的親和力的結果。圖9表示在雙齒肽結合物中將結構穩定化區的色氨酸拉鏈替代為亮氨酸拉鏈而測定雙齒肽結合物的親和力的結果。圖10表示對作為癌症生物標記物的纖維連接蛋白ED-B顯現特異性的雙齒肽結合物的癌症靶向結果。隨著時間的經過能夠觀察到雙齒肽結合物蓄積在癌細胞上。當分離各器官而測定螢光時，也能觀察到雙齒肽結合物大量蓄積在癌細胞上。圖11表示對存在於細胞內的抑制MyD88活性的特異性雙齒肽結合物的效果進行了證明的結果。
具體實施方式
下面，通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例只是為了更具體地說明本發明而提出的，根據本發明的原理，很顯然對於本領域的普通技術人員來說，本發明的技術領域不由這些實施例決定。實施例實驗材料與實驗方法實施例1文庫的製造雙齒肽結合物基因製造及向噬菌粒載體的插入合成了 2 個寡核苷酸 Beta-Fl (5 『 -TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK) 6GGATCTTGGACA TGGGAAAACGGAAAA-3『)及 Beta-Bl(5『 -AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)6TCCCTTC CATGTCCATTTTCCGTT-3 『 ) (N 為 A、T、G 或 C ;K 為 G 或 T ;M 為 C 或 A)。為了製造雙鏈，混合 Beta-Fl 4 μ M、Beta_B14 μ Μ、2· 5mM dNTP 混合液 4 μ 1、ExTaq DNA 聚合酶 1 μ 1 (Takara 公司，首爾，韓國)及10XPCR緩衝液5μ 1後添加蒸餾水使其總量為50 μ 1而製造了 25種混合液。使該混合液進行PCR反應(在94°C條件下進行5分鐘，60周期在30°C條件下進行30秒，在72°C條件下進行30秒，以及在72°C條件下進行7分鐘)而製造成雙鏈後，利用 PCR純化試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)進行純化而得到雙齒肽結合物基因。為了將待插入於雙齒肽結合物的基因與PIGT2噬菌粒載體(Igtherapy，春川，韓國)連接，用限制酶對插入基因與PIGT2噬菌粒載體進行處理。對約Ilyg的插入DNA用SfiI (New England Biolabs (NEB, Ipswich)及NotI (NEB，Ipswich)分別進行4小時的反應之後利用PCR純化試劑盒進行純化。而且，對約40 μ g的pIGT2噬菌粒載體用SfiI及NotI分別進行4個小時的反應之後，投入 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)而進行1小時的反應之後利用PCR純化試劑盒進行純化。用UV-可見光分光光度計(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)對其進行定量後，利用T4 DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)使2. 9 μ g的插入基因與pIGT2噬菌粒載體12 μ g，在18°C條件下連接15小時後， 用乙醇進行沉澱，用TE緩衝液100 μ 1溶解DNA。準備感受態細胞在LB 瓊脂平板上劃線塗抹 Ε. coli XLl-BLUE 細胞(American Type Culture Collection公司，馬納薩斯，美國)。將在瓊脂平板培養基生長的群落接種到5ml的LB培養基後，在37°C條件下以200rpm的速度進行混合而培養一天。將培養的IOml的各細胞接種到21的LB培養基後，以相同的方式進行培養，直至吸光度在600nm的波長中達到0. 3-0. 4 為止。將培養的燒瓶在冰上放置30分鐘後，在4°C條件下以4，OOOXg進行離心分離20分鐘，由此去除除了沉澱的細胞以外的所有上清液，並且用11的經冷卻的滅菌蒸餾水進行懸浮。以相同的方法重新對其進行離心分離去除上清液後，用11的經冷卻的滅菌蒸餾水重新進行懸浮，並以相同的方式用10%的甘油溶液40ml反覆清洗而離心分離後，每一次分注 200 μ 1而在液態氮的條件下進行冷凍後，在-80°C條件下保管。電穿孔法將在噬菌粒載體12 μ g和雙齒肽結合物中使2. 9 μ g的插入DNA進行連接反應的 100 μ 1的反應溶液分注為25份進行電穿孔法。在冰上解凍感受態細胞，將200 μ 1的感受態細胞與經過連接反應的4μ 1溶液混合後進行冷卻而放入到準備好的0. 2cm試管中，然後在冰上放置1分鐘。在200 Ω條件下，以25yF及2. 5kV的條件，對電穿孔儀(BioRad， Hercules, CA)進行程序設定後，去除準備好的試管上的水分，並將其定位於電穿孔儀之後施加脈衝(時間常數為4.5-5mSec)。而後立即將其放入到準備好的37°C的包含20mM葡萄糖的Iml的LB液體培養基，將得到的總共為25ml的細胞轉移到IOOml試管中。在37°C條件下，以200rpm混合而培養一小時後，為了測定文庫的數量稀釋10 μ 1而塗抹在氨苄青黴素瓊脂培養基上。將剩下的細胞放入到11的LB，其中放入20mM葡萄糖及50 μ g/ml的氨苄青黴素，在30°C條件下培養一天。在4°C條件下，以4，OOOXg進行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉澱的各細胞以外的所有上清液，並且用40ml的LB重新進行懸浮後放入達到最終濃度20 %以上的甘油，並在-80 V條件下保管。文庫中重組噬菌體的生產和PEG的沉澱在_80°C條件下貯存的雙齒肽結合物文庫中生產重組噬菌體。在500ml燒瓶中放入添加了氨苄青黴素(50 μ g/ml)及20mM葡萄糖的IOOml的LB液體培養基後，填加在_80°C條件下貯存的文庫1ml，並在37°C條件下，以150rpm混合而培養一小時。其中放入 IX IO11Pfu的Ex輔助噬菌體(Ig therapy，春川，韓國)以相同的條件重新培養一小時。以 1，000 Xg進行10分鐘的離心分離，由此去除上清液，向此放入包含氨苄青黴素(50 μ g/ml) 及卡那黴素(25 μ g/ml)的LB液體培養基IOOml之後培養一天，從而生產重組噬菌體。在以3，OOOXg對培養液進行10分鐘的離心分離而得到的IOOml上清液中混合25ml的PEG/ NaCl，然後在冰上放置1小時後，在4°C條件下，以10，000 X g進行20分鐘的離心分離，由此謹慎地去除上清液，並用2ml的PBS(pH 7. 4)重新對顆粒進行懸浮。實施例2:準備蛋白質如下地準備了將在實施例中用到的纖維連接蛋白(Fibronectin) ED-B, VEGF(vascular endothelial growth factor)> VCAMl(vascular cell adhesion molecule-1)、nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)、HSA(Human serum albumin) 及 MyD88。纖維連接蛋白ED-B基因製造及向表達載體的插入從韓國生命工程研究院中接收了部分人體纖維連接蛋白ED-B(ID = KU017225)基因。通過合成弓丨物 EDB_F1 (5 『 -TTCATAACATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3 『)及 EDB_B1 (5 『 -A TTGGATCCTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGGGGCACTCTCGCCGCCATTAATGAGAGTGATMCGCTGATATCA TAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3 『)，製造了混合 EDB-F1 20pmol、EDB-B1 20pmol、2. 5mM dNTP混合液4 μ UExTaq DNA聚合酶1 μ 1 (10U)及10 X PCR緩衝液5 μ 1後添加蒸餾水使其總量為50 μ 1的混合液。對該混合液進行PCR反應(在94°C條件下5分鐘，30周期在55°C 條件下30秒，在72°C條件下1分鐘以及在94°C條件下30秒)而製造EDB插入基因後，利用PCR純化試劑盒進行純化。為了將EDB插入基因與pET28b原核表達載體(Novagen)進行連接，用限制酶對EDB插入基因及ρΕΤ2^3原核表達載體進行處理。用BamHI (NEB, Ipswich) 及NdeI (NEB, Ipswich)對約2 μ g的插入DNA分別進行4小時的反應後，利用PCR純化試劑盒進行純化。而且，使約2 μ g的pIGT2噬菌粒載體分別與BamHI和NdeI反應3小時後，放入CIAP反應一小時後，利用PCR純化試劑盒進行純化。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時，並轉化到XL-I感受態細胞後，塗抹在包含卡那黴素的瓊脂培養基上。將生長在瓊脂平板培養基的群落接種到5ml的LB培養基後，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天後，利用質粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質粒進行純化，通過測序確認克隆是否成功。VEGF121基因製造及向表達載體的插入從細胞因子庫(全州，韓國)中接收了部分人體VEGF(ID = G157)基因。通過合成引物 VEGF_F1 (5 『 -ATAGAATTCGCACCCATGGCAGAA-3 『)及 VEGF_B1 (5 『 -ATTAAGCTTTCACC GCCTCGGCTTGTCACAATTTTCTTGTCTTGC-3')，製造了混合 VEGF-F1 20pmol、VEGF_Bl 20pmol、 2. 5mM dNTP混合液4 μ 1、ExTaq DNA聚合酶1 μ 1 (IOU)及IOXPCR緩衝液5 μ 1後添加蒸餾水使其總量為50μ1的混合液。對該混合液進行PCR反應(在94°C條件下5分鐘，30 周期在55°C條件下30秒，在72°C條件下1分鐘以及在94°C條件下30秒)而製造VEGF 插入基因後，利用PCR純化試劑盒進行純化。為了將VEGF插入基因與pET3h原核表達載體(Novagen)進行連接，用限制酶對VEGF插入基因及pET3h原核表達載體進行處理。用 EcoRI (NEB, Ipswich)與 HindIII (NEB, Ipswich)對約 2 μ g 的插入 DNA 分別進行 4 小時的反應後，利用PCR純化試劑盒進行純化。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶(Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時，並轉化到XL-I感受態細胞後，塗抹在包含氨苄青黴素的瓊脂培養基上。將生長在瓊脂平板培養基的群落接種到5ml的LB培養基後，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天後，利用質粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質粒進行純化，通過測序確認克隆是否成功。VCAM1基因製造及向表達載體的插入從韓國生命工程研究院中接收了人體VCAMl基因。為了將VCAMl插入基因與 pET32a原核表達載體進行連接，用限制酶對VCAMl插入基因及pET3h原核表達載體進行處理。對其添加載體與插入基因至載體與插入基因的摩爾比約為1 3，利用T4DNA連接酶 (Bioneer公司，大田，韓國)，在18°C條件下連接10小時，並轉化到XL-I感受態細胞後，塗抹在包含氨苄青黴素(ampicillin)的瓊脂培養基上。將生長在瓊脂平板培養基的群落接種在5ml的LB培養基後，在37 °C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天後，利用質粒提取試劑盒(GeneAll公司，首爾，韓國)對質粒進行純化，通過測序確認克隆是否成功。纖維連接蛋白ED-B的表達及純化對纖維連接蛋白ED-B進行克隆的pET28b原核表達載體轉化到BL21細胞後，將其塗抹在包含卡那黴素的瓊脂培養基上。將生長在瓊脂平板培養基的群落接種到包含卡那黴素(25 μ g/ml)的5ml的LB培養基後，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天後，轉移到包含卡那黴素(25 μ g/ml)的50ml的LB培養基中培養3小時。將培養的E. coli接種到包含卡那黴素(25 μ g/ml)的21的LB而培養至OD = 0. 6-0. 8。之後放入ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養8小時。 以4，OOOXg進行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉澱的細胞以外的所有上清液，並用裂解緩衝液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及5mM的咪唑)進行懸浮。在_80°C 條件下保管一天後，利用超聲波破碎儀溶解Ε. coli後，以15，000Xg進行一小時的離心分離，由此使上清液與Ni-NTA親和樹脂(Elpisbio公司，大田，韓國)結合。用裂解緩衝液清洗樹脂後，利用洗脫緩衝液(50mM的磷酸鈉(pH8. 0)、300mM的NaCl及300mM的咪唑)洗脫而獲得 N-末端 His-tagED-B 蛋白質。利用 Superdex75 色譜柱(GE Healthcare,United Kingdom)及PBS(pH 7. 4)緩衝液通過凝膠過濾法(gel filtration)獲得高純度ED-B蛋白質。為了進行生物淘選，將生物素與ED-B蛋白質連接。在常溫下，在存在0. IM磷酸鈉的條件下，使 6mg 的生物素標記試劑(Sulfo-NHS-SS-Biotin) (PIERCE, Illinois, USA)及 1. 5mg 的 ED-B蛋白質反應2小時，為了去除未反應的生物素標記試劑，利用SuperdeX75色譜柱(GE Healthcare, United Kingdom)及 PBS(pH 7.4)緩衝液通過凝膠過濾法(gel filtration) 對生物素-EDB蛋白質進行純化。VEGF121與VCAMl-iTrx的表達及純化將對VEGF121與VCAMl進行克隆的pET3h原核表達載體分別轉化到AD494細胞之後塗抹在包含氨苄青黴素的瓊脂培養基上。將在瓊脂平板培養基生長的群落接種到包含氨苄青黴素(25 μ g/ml)的5ml的LB培養基後，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天後，轉移到包含氨苄青黴素(25 μ g/ml)的50ml的LB培養基中培養3小時。將培養的E. coli接種到包含氨苄青黴素(25 μ g/ml)的21的LB而培養至OD = 0. 6-0. 8。之後放入ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養8小時。以4，OOOXg進行20分鐘的離心分離，由此去除除了沉澱的細胞以外的所有上清液，並用裂解緩衝液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及5mM的咪唑)進行懸浮。在-80 0C條件下保管一天後，利用超聲波破碎儀溶解E. C01 i後，以15，000 X g進行一小時的離心分離，由此將上清液與Ni-NTA親和樹脂(Elpisbio公司，大田，韓國)結合。用裂解緩衝液清洗樹脂後，利用洗脫緩衝液(50mM的磷酸鈉(pH 8. 0)、300mM的NaCl及300mM 的咪唑)洗脫而獲得iTrx-VEGFUl蛋白質。利用Superdex75色譜柱(GE Healthcare，英國)及PBS(pH 7.4)緩衝液，並通過凝膠過濾法(gel filtration)獲得高純度VEGF-Trx 及VCAMl-Trx蛋白質。為了獲得純粹的VEGF，用凝血酶切斷VEGF與Trx之間而獲得了 VEGF121。另一方面，HAS是從 Genetex 公司(Irvine)購入使用。nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)的片段肽biotin-SGEWVIKEARGWKHWVFYSCCPTTPYLDIITH(32mer) 是在anygen(韓國，光州)合成的。Human MyD88從Santa Cruz Biotechnology (sc-4540WB) (California)購得。實施例3:生物淘選方法Biotin纖維連接蛋白(Fibronectin) ED-B蛋白質和Biotin-nAchR肽的生物淘選方法將2ml的鏈親和素(10 μ g/ml)以每孔50 μ 1的量放入到96孔ELISA板(Corning) 的40個孔，在4°C條件下放置一晚，次日僅針對其中的20個孔用0. 的PBST(tween-20)清洗3次之後，分別放入生物素ED-B和生物素IiAchRdO μ g/ml)並在常溫下放置1小時。 然後，用0. 1 % PBST清洗3次上述40個孔，通過使用用PBS稀釋的2%的BSA在常溫下封阻2小時後，倒掉全部溶液並用0. 1% PBST清洗3次。對其混合包含雙齒肽結合物重組噬菌體的溶液800μ 1及10%BSA200l·! 1，為了去除結合於鏈親和素及BSA的各噬菌體而放入到塗敷有鏈親和素及BAS的20個孔，在27°C條件下放置1小時。回收上清液並轉移至結合有ED-B和nAchR的20個孔，在27°C條件下放置45分鐘。去除20個孔的全部溶液，並使用0. 5% PBST清洗15次後，將Iml的0. 2M甘氨酸/HCl (pH 2. 2)以每孔50 μ 1的量放入到各孔，由此洗脫噬菌體20分鐘，將Iml溶液收集到管中並放入150 μ 1的2MTris-base (pH 9.0)而對溶液進行中和。為了測定每次進行生物淘選時的輸入的噬菌體及洗脫下來的噬菌體(Eluted phage)的數量，混合至OD = 0. 7的XL-1 BLUE細胞並塗抹至包含氨苄青黴素的瓊脂培養基。為了反覆進行淘選，與IOml的E. coli XLl-BLUE細胞混合而在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養1小時左右。混合氨苄青黴素(50 μ g/ml)及20mM葡萄糖後，添加2 X IOlOpfu的Ex輔助噬菌體並在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養1 小時。對培養液以1，OOOXg進行離心分離10分鐘後，去除上清液並將沉澱的細胞用包含氨苄青黴素(50 μ g/ml)及卡那黴素(25 μ g/ml)的40ml的LB液體培養基重新進行懸浮， 在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天。在4，000Xg、20分鐘及4°C條件下，對培養液進行離心分離。上清液中添加8ml的切PEG/NaCl[20% PEG(w/v)及15% NaCl (w/ ν)]後，在4°C條件下放置1小時。離心分離後徹底去除PEG溶液，用Iml的PBS溶液溶解噬菌體肽顆粒後將其用於第2輪生物淘選。各個淘選步驟均使用上述方法，只有清洗過程按不同步驟分別增加25次及35次(0. 5% PBST)。VEGF、VCAMl-I^uHumanserum albumin (HAS)以及 MyD88 的生物淘選方法將VEGF、VCAMl-trx、HAS 以及 MyD 88 (5 μ g/ml)以每孔 50 μ 1 的量放入到 96 孔 ELISA板(Corning)的10個孔，並在4°C條件下放置一晚，次日使用2% BSA在常溫下封阻2 小時後，倒掉全部溶液並用0. PBST清洗3次。對其混合包含雙齒肽結合物重組噬菌體的溶液800 μ 1及10% BSA 200 μ 1，並轉移至結合有VEGF、VCAMI-Trx以及HAS的10個孔，並在常溫下放置1小時。去除10個孔的全部溶液，使用0. 1 % PBST清洗10次後，將Iml的0. 2M 甘氨酸/HCl (pH2. 2))以每孔50 μ 1的量放入到各孔內，洗脫噬菌體20分鐘，將Iml溶液收集到管中並放入150 μ 1的2Μ Tris-base(pH 9. 0)對溶液進行中和。為了測定每進行生物淘選時的輸入的噬菌體及洗脫下來的噬菌體的數量，混合至OD = 0. 7的XL-IBLUE細胞並塗抹至包含氨苄青黴素的瓊脂培養基。為了反覆進行淘選，與IOml的E. coli XLl-BLUE細胞混合，並在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養1小時。混合氨苄青黴素(50 μ g/ ml)及20mM葡萄糖後，添加2 X liTpfu的Ex輔助噬菌體，並在37°C條件下，以200rpm的速度混合而培養1小時。對培養液以1，OOOXg進行10分鐘的離心分離後，去除上清液並將沉澱的細胞用包含氨苄青黴素(50 μ g/ml)及卡那黴素(25 μ g/ml)的40ml的LB液體培養基重新進行懸浮，在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天。在4，000X g、20分鐘及4°C條件下，對培養液進行離心分離。上清液中添加8ml的切PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 及15% NaCl(W/v)]後，在4°C條件下放置1小時。離心分離後徹底去除PEG溶液，用Iml的 PBS溶液溶解噬菌體肽顆粒後將其用於第2輪生物淘選。各個淘選步驟均使用上述方法，只有清洗過程按不同步驟分別增加20次及30次(0. 1% PBST)。
實施例4纖維連接蛋白ED-B的輸入的噬菌體的ELISA關於雙齒肽結合物文庫的各個輸入的噬菌體的ELISA，針對鏈親和素、BSA及ED-B 實施。將10 μ g/ml的鏈親和素以每孔50 μ 1的量放入到96孔ELISA板的18個孔，將10 μ g/ ml的BSA以每孔50 μ 1的量放入到9個孔，並在4°C條件下放置一晚。次日僅針對含有鏈親和素的18個孔中的9個孔用0. 的PBST(tween-20)清洗3次，放入生物素ED-B(10 μ g/ ml)並在常溫條件下放置1小時。然後，用0.1% PBST清洗3次上述全部孔，使用用PBS稀釋的2%BSA在常溫條件下封阻2小時後，倒掉全部溶液並用0. 1%PBST清洗3次。對其混合作為雙齒肽結合物重組噬菌體的第一個、第二個及第三個輸入的噬菌體800 μ 1及10% BSA 200 μ 1之後將其分注到ED-B、鏈親和素及BSA孔等三個孔內各100 μ 1，在27°C條件下放置1小時30分鐘。使用0. 1 % PBST溶液清洗10次後，以1 1，000比例稀釋HRP-綴合物抗-M13抗體(GEHealthcare)，並在27°C條件下反應1小時。使用0. 1% PBST清洗5次後，分注作為過氧化物酶的基質的四甲基聯苯胺(TMB) (BDScience)溶液100 μ 1而引發顯色反應之後，添加100 μ 1的IM HCl而中止反應。然後在450nm中測定吸光度。實施例5特異於纖維連接蛋白ED-B，VEGF, VCAMl，nAchR，HSA, MyD88蛋白質的噬菌體肽搜索(噬菌體ELISA)將在輸出的噬菌體/輸入的噬菌體比例最高的生物淘選步驟中回收的噬菌體感染至XLl-BLUE細胞後進行塗抹，使得每個板上存在100 200個噬斑。利用滅菌的吸頭將 60個噬斑接種至2ml的LB-氨苄青黴素(50 μ g/ml)培養液後，在37°C條件下進行5小時的振蕩培養，在OD = 0. 8-1時添加5 X IOi3Pfu的Ex輔助噬菌體，在37°C條件下以200rpm 的速度混合而培養1小時。對培養液以1，OOOXg進行10分鐘的離心分離後，去除上清液並用包含氨苄青黴素(50 μ g/ml)及卡那黴素(25 μ g/ml)的Iml的LB液體培養基重新對沉澱的細胞進行懸浮，在30°C條件下，以200rpm的速度混合而培養一天。在10，000X g、20 分鐘及4°C條件下，對培養液進行離心分離，回收上清液後放入2%脫脂牛奶並將其用於噬菌體肽搜索。將 5μ g/ml 的 Fibronectin ED-B、VEGF、VCAMl、Nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) >Human serum albumin 以及 MyD88 以每孑L 50 μ 1 的量放入至Ij 96 孑L ELISA 板的30個孔，將10 μ g/ml的BSA以每孔50 μ 1的量放入到30個孔並4°C條件下放置一天。 次日用0. PBST清洗3次上述全部孔，使用用PBS稀釋的2%脫脂牛奶在常溫條件下封阻2小時後，倒掉全部溶液並用0. 1% PBST清洗3次。將按照各個克隆增幅的噬菌體肽溶液分注到所有槽各100μ 1，在27°C條件下放置1小時30分鐘。使用0. 1% PBST溶液清洗 5次後，以1 1，000比例稀釋HRP-綴合物抗-Ml3抗體(GEHealthcare)並在27°C條件下反應1小時。使用0. 1% PBST清洗5次後，分注TMB溶液100 μ 1而引發顯色反應之後，添加100 μ 1的IM HCl而中止反應。然後在450nm中測定吸光度，選擇相比BSA吸光度高的各克隆。將這些克隆的噬菌體感染至XLl細胞後進行塗抹，使得每個板上存在100 200個噬斑。利用滅菌的吸頭將噬斑接種至細1的LB-氨苄青黴素(50yg/ml)培養液後，在37°C 條件下進行振蕩培養1天，利用質粒提取試劑盒對質粒進行純化並委託測序(Genotech公司，大田，韓國)。測序引物使用作為載體順序的5' -GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3『。實施例6纖維連接蛋白ED-B、VEGF, nAchR結合分析合成了特異於在DNA測序中重複出現的ED-B、VEGF, nAchR的雙齒肽結合物的肽 (Anyzen公司，韓國)。親和力的測定則採用了 BIAcore X(Biacore AB，烏普薩拉，瑞典)。ED-B與nAchR通過在鏈親和素SA晶片(Biacore)上滴落2，OOORU的生物素-EDB而進行固定。VEGF利用EDC/NHS固定於CM5晶片(Biacore)。作為電泳緩衝液使用PBS (pH 7. 4)，流量為每分鐘滴落30 μ 1並採用各種濃度測定動力學之後，通過BIAevaluation軟體(Biacore AB，烏普薩拉，瑞典)計算親和力。實施例7特異於作為癌症生物標誌物的纖維連接蛋白ED-B的雙齒肽結合物的癌症靶向在50mM硼酸鈉緩衝液(pH 9. 7)中，在常溫條件下，使Cy5. 5-NHS螢光染料 (flurorescence dye) (Amersham Pharmacia, Piscataway)與對癌症中分布較多的纖維連接蛋白ED-B進行靶向的雙齒肽結合物(肽2)反應12小時。反應後通過kphadex G25 (Pharmacia Biotech，烏普薩拉，瑞典)分離Cy5. 5和雙齒肽結合物_Cy5. 5。將Human U87MG (ATCC) 2xl06cell注入到Balb/c裸鼠的皮下組織並培養癌細胞10天之後，通過靜脈注射法注射0. 5nmol的雙齒肽結合物-Cy5. 5後，通過IVIS(Caliper Life Sience， Hopkinton)測定螢光。該實驗說明特異於作為癌症生物標誌物的纖維連接蛋白ED-B的雙齒肽結合物將蓄積在動物體內的癌細胞，同時也表示作為實際癌症診斷劑的應用性(圖 11)。實施例8特異於細胞內存在的MyD88的雙齒肽結合物的活性抑制實驗由於MyD88是存在於細胞內的蛋白質，能夠利用雙齒肽結合物的Loop的賴氨酸 (lysine)殘基，並利用 EDC/NHS (Sigma)使作為細胞穿透肽(cell penetrating peptide) 的9個精氨酸(arginine) (Anyzen，韓國)與雙齒肽結合物進行共價鍵合以實現細胞穿透。 由於MyD88的活性被激活時MMP-13的量將會增加，因而只要測定MMP-13的量就能夠判別 MyD88的活性是否被抑制。將用於激活MyD88活性的IL-Ibeta(10ng/ml) (R&D systems, Minneapolis MN)處理至軟骨細胞。然後將特異於MyD88的雙齒肽結合物(表3f的肽1)對軟骨細胞進行10 μ M處理，經過12小時後分離mRNA之後，對MMP-13和GAPDH進行RT-PCR。 並且，破壞軟骨細胞而獲得細胞內蛋白質後，利用Anti-MMP 13抗體(Abcam，ab3208, Cambridge)禾口半乾 transfer 器械(Amersham Bioscience, Piscataway)實施免疫印跡法而測定MMP-13的量。實驗結果實施例9雙齒肽結合物文庫的製造作為雙齒肽結合物的結構穩定化區採用穩定的髮夾基序。特別採用在色氨酸-色氨酸胺基酸的相互作用下能夠確保β-髮夾基序結構穩定的色氨酸拉鏈(Andrea et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :5578-5583 (2001))。在作為骨架的色氨酸拉鏈的 N-及 C-末端部分隨機排列各6個胺基酸，從而在兩個部分生成可變區(圖la)。將它命名為雙齒肽結合物，由於兩邊具有可變區，能夠協同地結合於抗原，因而具有高親和力及特異性。並且，如圖Ib至圖Ie所示，雙齒肽結合物的結構穩定化區能夠構成為各種結構。將合成的2個隨機序列寡核苷酸通過PCR反應作成雙鏈後，用作為限制酶的SfiI 及NotI切割後，將其克隆至pIGT2噬菌體載體而構建8 X IO8以上的文庫(圖2)。實施例10生物淘選結果關於雙齒肽結合物文庫，對纖維連接蛋白ED-B、VEGF、VCAMl、nAchR、HSA蛋白質實施3-5輪的生物淘選並決定在各個淘選步驟中回收的各噬菌體肽的輸出的噬菌體/輸入的噬菌體比例(表la)。表la針對纖維連接蛋白ED-B蛋白質的生物淘選結果
權利要求
1.一種與靶結合的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，包含如下步驟(a)提供一種雙齒肽結合物的文庫的步驟，上述雙齒肽結合物包含(i)結構穩定化區，其包含形成有鏈間非共價鍵的平行線、反平行線或平行和反平行胺基酸鏈，以及(ii) 靶結合區I及靶結合區II，與上述結構穩定化區的兩個末端結合，並包含隨機選擇的各η及 m個胺基酸；(b)使上述文庫和靶接觸的步驟；以及(c)選擇與上述靶結合的雙齒肽結合物的步驟。
2.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，形成於上述結構穩定化區的鏈間非共價鍵是氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、範德瓦爾斯相互作用、 n-n相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合。
3.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述結構穩定化區的各胺基酸鏈通過連接物相連接。
4.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述結構穩定化區為髮夾、通過連接物連接的摺疊、亮氨酸拉鏈、通過連接物連接的亮氨酸拉鏈、富亮氨酸基序或通過連接物連接的富亮氨酸基序。
5.根據權利要求4所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述結構穩定化區為β-髮夾。
6.根據權利要求5所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾包含選自由序列目錄第1序列至第19序列構成的組的胺基酸序列。
7.根據權利要求6所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾包含選自序列目錄第2序列、第14序列或第18序列的胺基酸序列。
8.根據權利要求5所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾以如下的通式I表示通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X 『 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-GlujX2 及 X' 2 相互獨立地為 Thr、His、Val、Ile、Phe 或 Tyr5X3 為 Trp 或TyrJ4S I型、Γ型、II型、II'型或III型或III'型換向序列，&為Trp或Wie，& 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
9.根據權利要求5所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾以如下的通式II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgjly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或III'型換向序列，X4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu0
10.根據權利要求5所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾以如下的通式III表示通式IIIX1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、II'型或111型或ΙΙΓ型換向序列，&為Trp或Ala，&為Trp或Val，X7為Glu或Gln-Glu。
11.根據權利要求5所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾以如下的通式IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1為Lys-Thr或Gly，X2為Trp或Tyr，&為I型、Γ型、II型、II 『型或III型或 Iir型換向序列，)(4為Thr-Glu或Gly。
12.根據權利要求8所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述β-髮夾在上述通式I中&為Ser或Gly-Glu，I2IV 2相互獨立地為Thr、His或Val，X3為Trp或 TyrJ4為I型、Γ型、II型或ΙΓ型序列，&為Trp或Phe，&為Trp或Val，X7為Lys或 Thr-Glu0
13.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述靶結合區I的胺基酸數量η為2-20。
14.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述靶結合區II的胺基酸數量m為2-20。
15.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述文庫由質粒、 細菌噬菌體、噬菌粒、酵母或細菌製造而成。
16.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述靶結合區I及靶結合區II協同作用於靶而進行結合。
17.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，在上述結構穩定化區、靶結合區I或靶結合區II追加結合有功能性分子。
18.根據權利要求17所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述功能性分子為產生能夠檢測的信號的標記物、化學藥物、生物藥物、細胞穿透肽(CPP)或納米粒子。
19.根據權利要求1所述的雙齒肽結合物的製造方法，其特徵在於，上述靶為生化物質、肽、多肽、核酸、碳水化合物、脂質、細胞、組織、化合物、金屬或非金屬物質。
20.一種雙齒肽結合物，特異性地與靶結合，其特徵在於，該雙齒肽結合物具有(a)結構穩定化區，其包含形成有鏈間非共價鍵的平行線、反平行線或平行和反平行胺基酸鏈；以及(b)靶結合區I及靶結合區II，與上述結構穩定化區的兩個末端結合，並包含隨機選擇的各η及m個胺基酸。
21.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，形成於上述結構穩定化區的鏈間非共價鍵是氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、範德瓦爾斯相互作用、η-η相互作用、陽離子-η相互作用或它們的組合。
22.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述結構穩定化區的各胺基酸鏈通過連接物相連接。
23.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述結構穩定化區為β-髮夾、通過連接物連接的β -摺疊、亮氨酸拉鏈或通過連接物連接的亮氨酸拉鏈、富亮氨酸基序。
24.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述結構穩定化區為β-髮夾。
25.根據權利要求M所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述髮夾選自由序列目錄第1序列至第19序列構成的組。
26.根據權利要求25所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述β-髮夾選自序列目錄第 2序列、第14序列或第18序列。
27.根據權利要求M所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述髮夾以如下的通式I 表不通式IX1-Trp (X2) X3-X4-X5 (X 『 2) X6-X7X1 為 Ser 或 Gly-GlujX2 及 X' 2 相互獨立地為 Thr、His、Val、Ile、Phe 或 Tyr5X3 為 Trp 或Tyrj4S I型、Γ型、II型、II'型或III型或III'型換向序列，&為Trp或Wie，& 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
28.根據權利要求M所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述髮夾以如下的通式 II表示通式IIX1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4X1SArgjly-Glu 或 Lys-LysJ2 SGln 或 ThrJ3* I 型、I'型、II 型、ΙΓ 型或 III 型或III'型換向序列，X4為Gin、Thr-Glu或Gln-Glu0
29.根據權利要求M所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述髮夾以如下的通式 III表示通式IIIX1-X2-X3-T Tp-X4-X5-Thr-X6-X7X1 為 Lys 或 Lys-Lys, X2 為 Trp 或 Tyr, X3 為 Val 或 Thr，X4 為 I 型、I'型、II 型、II' 型或111型或ΙΙΓ型換向序列，&為Trp或Ala，&為Trp或Val，X7為Glu或Gln-Glu。
30.根據權利要求M所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述髮夾以如下的通式 IV表示通式IVX1-X2-X3-Trp-X4X1為Lys-Thr或Gly，X2為Trp或Tyr，&為I型、Γ型、II型、II 『型或III型或 Iir型換向序列，)(4為Thr-Glu或Gly。
31.根據權利要求25所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述β-髮夾在上述通式I中 X1為Ser或Gly-GlujX2及X' 2相互獨立地為Thr,His或Val，X3為Trp或Tyr5X4為I型、 I'型、II 型或 ΙΓ 型序列，& STrp 或 Phe J6 為 Trp 或 Val，X7 為 Lys 或 Thr-Glu。
32.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述靶結合區I的胺基酸數量 η 為 2-20。
33.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述靶結合區II的胺基酸數量m為2-20。
34.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述靶結合區I及靶結合區 II協同作用於靶而進行結合。
35.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，在上述結構穩定化區、靶結合區I或靶結合區II追加結合有功能性分子。
36.根據權利要求35所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述功能性分子為產生能夠檢測的信號的標記物、化學藥物、生物藥物、細胞穿透肽(CPP)或納米粒子。
37.根據權利要求20所述的雙齒肽結合物，其特徵在於，上述靶為生化物質、肽、多肽、 核酸、碳水化合物、脂質、細胞、組織、化合物、金屬或非金屬物質。
38.一種核酸分子，其特徵在於，對上述權利要求20至37中任一項的雙齒肽結合物進行編碼。
39.一種雙齒肽結合物的表達用載體，其特徵在於，包含上述權利要求38的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及一種特異性地與靶結合的雙齒肽結合物及其製造方法，上述靶包含(a)形成鏈間非共價鍵的平行、反平行或平行和反平行胺基酸鏈的結構穩定化區；以及(b)結合至上述結構穩定化區的兩個末端，並包含隨機選擇的各n及m個胺基酸的靶結合區I及靶結合區II。本發明的雙齒肽結合物表現出極低水平(例如nM水平)的KD值(解離常數)，對靶表現出十分高的親和力。本發明的雙齒肽結合物不僅具有醫藥用途，還能用於體內分子成像、體外細胞成像以及藥物傳遞用靶向，並且用作保護分子也非常有效。
文檔編號C07K7/00GK102224162SQ200980146415
公開日2011年10月19日 申請日期2009年10月20日 優先權日2008年10月20日
發明者全相鎔, 樸世湖, 金成鉉 申請人:光州科學技術院