一種實時螢光pcr方法及用途的製作方法

2023-10-11 03:20:44 1

專利名稱：一種實時螢光pcr方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種PCR方法，尤其涉及一種實時螢光PCR方法。
背景技術：
自1985年聚合酶鏈式反應(PCR)提出以來，其以驚人的速度發展，目前，PCR技術無論在生命科學基礎研究還是在臨床診斷中都已得到極其廣泛的應用。依賴PCR的檢測技術主要分為兩類，一類是異相檢測技術，另一類是均相檢測技術。異相檢測技術包括瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳、晶片雜交等檢測方法，均相檢測技術主要是指實時螢光檢測技術。 實時螢光PCR檢測技術是在PCR擴增過程中實時監測產物的形成情況，無需開管操作，快速方便，且可以獲取模板的初始拷貝數信息。實時螢光PCR按採用的螢光技術分為兩類一類為螢光染料法，另一類為螢光探針法。螢光染料不能分辨特異及非特異產物，故特異性不佳；螢光探針特異識別待檢測的目標序列，與之雜交並釋放螢光信號，特異性高。目前常見的螢光檢測探針有Tapman探針、分子信標、雙雜交探針、Scorpion探針等。Taqman探針是最早提出並應用於實時PCR體系中的檢測探針，也稱水解探針，在 PCR的退火階段雜交於特異的目標序列並在其後的引物延伸過程中被Taq聚合酶水解使其兩端的螢光基團和淬滅基團分離從而釋放螢光信號。Taqman探針設計簡單，檢測體系易於優化，但其螢光背景信號較高，且Taqman探針的單鹼基區分能力有限，在SNP分型中經常會出現非特異檢測信號。分子信標是具有頸環(Stem-loop)結構的一種雙標記探針，無目標序列存在時，其自身會摺疊成頸環結構從而使兩端的螢光基團和淬滅基團相互接觸淬滅螢光信號，當目標序列存在時，其會優先雜交於特異靶序列，兩端基團分開釋放螢光信號。分子信標特異性更高、單鹼基區分能力強，背景螢光低，但其設計有一定的難度，且純化較困難。雙雜交探針由兩條相鄰的標記探針所組成，同時雜交於靶序列上相鄰的位置，雜交後可通過螢光能量共振轉移實現螢光信號的釋放且可在PCR後進行熔解分析。PCR過程中兩條探針與模板的雜交對聚合酶的延伸起到較大的阻礙作用，擴增效率降低，不利於定量實驗， 此外，兩條探針同時雜交於靶序列需要較長的時間形成三聚體結構，退火時間較長，不利於進行快速PCR。korpion探針是在分子信標的3』端經「連接臂」連接一段引物形成的特異檢測探針，因PCR延伸反應時不能延伸至分子信標，所以非特異擴增產物便無螢光信號。包含髮夾結構的PCR產物在退火時形成分子內雜交，髮夾結構被破壞，從而釋放螢光信號。這種方法反應速度快、信噪比高，但&0印1011探針設計及合成複雜，成本較高。CN101033486B公布一種螢光PCR檢測方法，採用上下遊引物和一條探針進行檢測，該探針設計上與上遊引物互補，無擴增產物出現時，上遊引物上的螢光基團與探針上的淬滅基團靠近螢光被淬滅，擴增產物出現時，上遊引物上的螢光基團與探針上的淬滅基團分開釋放螢光信號，從而實現實時螢光PCR，該方法的特異性差，出現非特異擴增時，仍然能檢測到螢光信號。發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種特異性好，選擇性強的實時螢光PCR檢測方法。 為解決上述問題，本發明提供一種實時螢光PCR檢測方法，採用上遊引物15、下遊引物6和一條檢測探針16進行檢測，其特徵在於，上遊引物15的序列為修飾基團1 一附加序列13 和特異檢測序列2 —特異引物序列3，所述特異引物序列3為與模板上目標序列10反向互補的序列，所述特異檢測序列2為序列11的反向互補序列，其中序列11與序列17反向互補，所述附加序列13為任意的不與模板雜交的核酸附加序列，所述修飾基團1為螢光基團或者淬滅基團或者供體螢光基團或者受體螢光基團；所述檢測探針16為修飾基團4 一特異檢測序列5，所述特異檢測序列5為序列12的反向互補序列，其中序列12與序列18反向互補，序列17為模板上目標序列10的延伸序列並遠離模板的3』端，序列18為模板上序列17 的延伸序列並遠離目標序列10的一端，所述修飾基團4為淬滅基團或者螢光基團或者受體螢光基團或者供體螢光基團。目標序列10與序列17之間相隔0-150個鹼基，優選間隔為0_50個鹼基；序列17 與序列18之間相隔0 — 10個鹼基，優選間隔為0-6個鹼基。上遊引物的設計原理是依一般的引物設計原則設計模板的上遊普通引物序列為上遊引物的特異引物序列，選擇上遊引物的延伸序列，設計適當Tm值的反向互補序列即為特異檢測序列，該序列需滿足以下條件1.與延伸產物形成唯一的頸環結構；2.該頸環結構的Tm值為50-72度，具體Tm值範圍為55-65度(定量檢測實驗中)或50-72度(SNP分型或突變檢測實驗中)；3.該頸環結構的環不宜過大，最好選擇150個鹼基內，並在上遊引物的5』端加入一段附加序列。所述上遊引物的延伸序列即為在本發明模板下，進行PCR擴增時，上遊引物擴增過程中的延伸序列。檢測探針序列設計原則為1.雜交於所述頸環結構的相鄰位置，優選相鄰0-10個鹼基，更優選0 — 6個鹼基；2.雜交Tm值適中，主要依檢測目的而定。比如定量檢測實驗中，其Tm值範圍為55-65度，分型或突變檢測實驗中，其Tm值範圍為50-72度，SNP、突變位點最好位於檢測探針雜交的中間位置。附加序列為額外的一段序列，其為任意的不與相鄰於序列11並遠離目標序列10 的鹼基互補的序列，即引物延伸且分子內形成頸環結構後，其5端游離的未雜交序列。附加序列的加入有利於避免分子內的擴增(下遊引物擴增產物的3端雖然也形成頸環結構，但3 端最末端的2-4個鹼基未雜交，從而避免分子內擴增)。在SNP或突變檢測實驗時，序列11或者12包括了 SNP或突變位點。本發明還涉及一種試劑盒，包括採用上述設計原理製備的上遊引物15和檢測探針16。本發明還涉及所述實時螢光PCR檢測方法的用途。該用途為用於實時監測擴增產物量實現目標序列的定性及定量分析的用途；用於熔解分析的用途，優選為用於檢測SNP或突變位點的用途。所述試劑盒的用途。包括用於實時監測擴增產物量實現目標序列的定性及定量分析的用途；用於熔解分析的用途，優選為用於檢測SNP或突變位點的用途。本發明還涉及一種實時螢光PCR上遊引物和探針製備方法，其步驟為，選定模板的目標序列10，序列11，序列12，一段不與模板雜交的核酸附加序列13，上遊引物的理論序列即為修飾基團1 一附加序列13和序列11的反向互補序列2 -目標序列10的反向互補序列3，所述修飾基團1為螢光基團或者淬滅基團或者供體螢光基團或者受體螢光基團；所述檢測探針序列的理論序列為修飾基團4 一序列12的反向互補序列5，其中序列12與序列18反向互補，序列17為模板上目標序列10的延伸序列並遠離模板的3』端，序列18為模板上序列17的延伸序列並遠離目標序列10的一端，根據所述的上遊引物的理論序列和探針引物的理論序列合成即可；所述修飾基團4為淬滅基團或者螢光基團或者受體螢光基團或者供體螢光基團；
其中目標序列10與序列17之間相隔0-150個鹼基，優選間隔為0-50個鹼基；延伸序列11與延伸序列12之間相隔0 — 10個鹼基，優選間隔為0-6個鹼基。所述試劑盒的製備方法主要是製備上遊引物15和檢測探針16，製備方法同上。本發明是一種基於螢光能量共振轉移的檢測技術，不僅可以通過螢光擴增曲線進行實時定性及定量檢測，而且可通過熔解分析進行分型檢測實驗。該技術僅需要一對引物 (其中上遊引物進行單標記)和一條單標記檢測探針即可，上遊引物包含三個區域，特異引物序列3、特異檢測序列2及附加序列13。特異檢測序列2由於與序列11反向互補，在PCR 反應時，變性退火後特異檢測序列2調轉過來與序列11互補，附加序列13由於不與模板互補，所以游離出來。上遊引物延伸產物經變性退火後形成自身摺疊結構，該結構由特異檢測序列引導形成，同時檢測探針雜交於相鄰位置(圖1)，在螢光能量共振轉移作用下產生信號從而實現實時監測擴增產物量並可在擴增後進行熔解分析。具體為PCR反應的第一個循環退火階段，上遊特異引物雜交序列3雜交於目標序列10的位置，下遊引物6雜交於目標序列14的位置，延伸階段，引物發生延伸反應得到兩條延伸產物(序列8與序列9)。PCR反應的第二個循環退火階段，上遊引物特異檢測序列2與延伸序列11雜交，形成分子內頸環狀結構，特異引物雜交序列3位於環狀結構內，檢測探針序列5雜交於延伸序列12的位置 (兩修飾基團相鄰，雜交後即發生螢光能量共振轉移，產生信號的變化)。本發明一種情況為當上遊引物的修飾基團為淬滅基團或螢光基團，探針為螢光基團或淬滅基團時，隨著反應的進行，PCR產物的增多，螢光信號越來越弱。上遊引物的修飾基團為螢光基團，探針為淬滅基團時，本底較高，增加了背景，結果信噪比差，不利於獲取精確的實驗結果；但是相反，上遊引物的修飾基團為淬滅基團，探針為螢光基團時，結果信噪比高，檢測結果更精確。故這種情況下的優選方案是上遊引物的修飾基團為淬滅基團，探針為螢光基團。另一種情況為當上遊引物的修飾基團為供體螢光基團或受體螢光基團，檢測探針為受體螢光基團或供體螢光基團，隨著反應的進行，PCR產物的增多，螢光信號越來越強。以上兩種情況就是螢光能量共振轉移(FRET)現象1.當螢光基團與淬滅基團靠近時，其直觀表現為螢光基團的螢光信號被淬滅，較其單獨存在時信號大大降低；2.當兩種不同的螢光基團離的較近，且其中一種基團(供體)的發射譜與另一種基團(受體)的激發譜有相當程度的重疊時，當供體被激發時，受體會因供體激發能的轉移而被激發，其直觀表現就是供體產生的螢光強度較其單獨存在時要低的多，而受體發射的螢光卻大大增強。本發明的下遊引物遵循一般PCR引物設計原則，比如設計方法參照《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社。本發明的有益效果和優點在於1.探針和引物只需要單標記，且不需要額外封閉基團的修飾，易於純化，產率高；
2.只有當PCR產物形成正確的二級結構且檢測探針特異雜交時才能出現信號，故其特異性高，選擇性好；
3.能量限制型的PCR產物與檢測探針相互作用釋放或催滅螢光信號，區分單鹼基差異的能力強；
4.可用於熔解分析，據熔解曲線檢測突變、SNP位點等；
5.引物及檢測探針設計簡單靈活，可按照實驗要求設計不同方案的引物及檢測探針；
6.本技術可靈活使用各種催滅及螢光基團，從而形成「倒置」及「正常」的擴增曲線。


圖1為實時螢光PCR擴增原理其中1為修飾基團，2為特異檢測序列，13為附加序列，3為特異引物序列，4為修飾基團，5為檢測探針序列，10為模板上的目標序列，11為上遊引物的延伸序列，12為11之後的延伸序列，6為下遊引物序列，7為模板，14為下遊引物對應模板上的目標序列，15為上遊引物，16為檢測探針，8為單標記引物延伸產物經變性退火後形成自身頸環結構，9為下遊引物延伸產物經變性退火後形成自身頸環結構。圖2A為三份樣本的原始擴增曲線圖。圖2B為三份樣本的數據處理後的擴增曲線圖。圖3A為三份基因組DNA樣本SNP基因分型檢測熔解曲線原始圖。圖;3B為數據處理後的熔解曲線圖。圖4A為梯度稀釋DNA樣本的擴增曲線。圖4B為標準曲線。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例中使用儀器實時螢光PCR儀(Rotor-gene 6000，德國QIAGEN公司)，紫外可見分光光度計(ND-1000，美國NanoDrop公司)，臺式微量離心機(德國Eppendorf公司)， 本專利實施例中所有序列合成均來自生工生物工程(上海)有限公司。所使用的基因組DNA 樣本來源於正常人的外周血提取，均採用Qiagen公司的DNeasy Blood Kit並遵照其說明書的提取方式提取獲得。外周血樣品由廈門市婦幼保健院提供。標本的使用均獲得當事人或其監護人的許可。實施例1 選擇人SODl基因(Gene ID: 6647)，依據說明書中所述原則，設計相應的引物及探針，序列如下
上遊引物TMR-TTTGCTGCTGTGCCTGAAGACAGCCGTGTTATGAA (SEQ ID N0:1) 下遊引物TCTATCTGTGCCCTTTACTTGGT(SEQ ID NO :2) 檢測探針CATTCCAACTGTATCCTGTGTAGAAG(SEQ ID NO:3)-FAM其中上遊引物中雙下劃線為附加序列13，單下劃線為特異檢測序列2，單下劃波浪線為特異引物序列3。體系中的上遊引物5端標記淬滅基團TMR，檢測探針3端標記FAM基團，在退火階段，標記TMR引物的延伸產物與檢測探針形成雜交複合體，複合體形成後即發生接觸淬滅 (屬於FRET的範疇)，螢光信號減弱。隨著PCR循環數的增加，體系中的螢光信號逐漸降低形成一條「倒置」的實時擴增曲線。25 μ L PCR 反應體系內含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0， 20 mmol/L (NH4) 2S04,0. 01% Tween 20，50 mmol/L KCl, 1 U Ti^ 酶，3.5 mmol/L Mg2+，0· 2 ymol/L標記探針，0.4μπιΟ1/1上遊標記引物，0.08 ymol/下遊引物。PCR反應程序為 950C 3分鐘；95°C 15秒，58°C 20秒，72°C 20秒，50個循環；58°C退火階段採集螢光信號。該方法的原始擴增曲線不同於傳統的實時擴增曲線，呈現「倒置」的曲線圖，即隨著PCR循環數的增加，本底期(在PCR反應早期，此時擴增產生的螢光信號不能與背景信號明顯地區別，故稱為本底期)之後的螢光值逐漸減弱，通過數據處理獲取正常的擴增曲線圖，從而實現檢測，結果見附圖2A和2B。19A、20A為兩份DNA樣本的擴增曲線，模板用量分別為500ng和50ng。原始擴增曲線(圖2A)及經過實時PCR儀自動數據處理後的擴增曲線 (圖2B)中，19A的螢光信號在循環數約為19時開始變化，20A的螢光信號在循環數約為22 時開始變化。可以看出，同一反應條件下，模板用量越大，螢光值越早發生變化，反之亦然； 21A為陰性對照ddH20，沒有模板的存在，無特異產物的擴增，故檢測不到信號的變化。該技術採用分析螢光信號有無變化(亦即特異性螢光信號是否出現)實現目標序列「有無」的定性分析。實施例2 選擇人基因組中一 SNP位點(rsl3182883)，依據說明書中所述原則，設計分型引物及探針，序列如下
上遊引物TMR-GGATGCTCACTGCCTAGTAGAGGGCCTGGCCT (SEQ ID N0:4) 下遊引物CAGGCTCTCCGTTACTTTCTTC (SEQ ID N0:5) 檢測探針ACCCTGTTCCTCGAGGATTTGA (SEQ ID NO:6) -FAM
其中上遊引物中雙下劃線為附加序列13，單下劃線為特異檢測序列2，單下劃波浪線為特異引物序列3。體系中的上遊引物5端標記淬滅基團TMR，檢測探針3端標記螢光基團FAM，設計的檢測探針「覆蓋」待檢測的SNP位點，擴增出的標記產物鏈形成的內部二級結構Tm值(理論值為66度)> 單標記檢測探針Tm值(理論值為62度)，PCR擴增後經熔解分析實現SNP分型。25 μ L PCR 反應體系內含 5μ L 人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L(NH4)2S04,0. 01% Tween 20,50 mmol/L KCl, 1 U 7 《酶，3 mmol/L Mg2+, 0. 2 μ mol/ L標記探針，0.4 μ mol/L上遊引物，0.04 μ mol/下遊引物。PCR反應程序為95°C 3分鐘; 950C 15秒，55°C 20秒，72°C 20秒，50個循環；55°C退火階段採集螢光信號。熔解分析程序為95°C 1分鐘；40°C 2分鐘；40°C升溫至90°C並在升溫過程中採集FAM螢光信號。用量為20ng的三份樣本(22A、23A和24A)及陰性對照(25A)的原始熔解曲線(圖 3A)和其對應的處理後的熔解曲線(圖;3B):樣本22A的熔解曲線熔解Tm值較低，是一份AA 純合的標本；樣本24A的熔解曲線熔解Tm值較高，是一份GG純合的標本；樣本23A的熔解曲線是一條雙Tm值曲線，每個Tm值對應一種基因型，故是一份AG雜合的標本，陰性對照 25A的熔解曲線無特異Tm值出現。實施例3 選擇人SODl基因，依據說明書中所述原則，設計相應的引物及探針，序列如下
上遊引物:FAM~TTCCTCGACAGCACTGAAGACAGCCGTGTTATGAA (SEQ ID NO:7) 下遊引物TCTATCTGTGCCCTTTACTTGGT_￡SEQ ID NO:2)
檢測探針ACCAGGGGATGACATTCACAGA (SEQ ID NO:8)-ROX其中上遊中雙下劃線為附加序列13，單下劃線為特異檢測序列2，單下劃波浪線為特異引物序列3。體系中的上遊引物5端標記FAM (供體)螢光基團，檢測探針3端標記ROX (受體) 螢光基團，它們與擴增產物雜交形成複合體，複合體形成後發生螢光能量共振轉移從而達到實時監測產物形成的目的，隨著PCR循環數的增加，體系中的螢光信號逐漸增強形成擴增曲線。選擇用量為200ng、50ng、12. 5ng、3. 125ng、0. 78ng(四倍梯度稀釋)的人基因組 DNA作為反應模板。25 μ L PCR反應體系內含5μ L人基因組模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20 mmol/L (NH4)2SO4,0. 01% Tween 20,50 mmol/L KCl, 1 U 7 《酶，3.5 mmol/L Mg2+, 0.2 ymol/L標記探針，0. 4ymol/L上遊標記引物，0. 08 μ mol/ L下遊引物。PCR反應程序為95°C 3分鐘；95°C 15秒，58°C 20秒，72°C 20秒，50個循環；58°C退火階段採集螢光信號。四倍梯度稀釋樣本的擴增曲線26A體現較好的梯度，27A (陰性對照，沒有模板的存在，即為ddH20)無特異產物的擴增，故檢測不到特異信號(圖4A)。200ng模板用量的反應管的Ct值為24. 30 (Ct值的含義是每個反應管內的螢光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。)、50ng模板用量的反應管的Ct值為26. 00、12. 5ng模板用量的反應管的Ct值為 28. 07,3. 125ng模板用量的反應管的Ct值為30. 18,0. 78ng模板用量的反應管的Ct值為 32. 21，可見，相鄰梯度模板用量的Ct值差約為2 (理論上，擴增效率為100%時，模板用量差異四倍時Ct值差為2)，結果表明該體系具有較高的反應效率。梯度樣本擴增曲線的Ct值與其DNA起始拷貝數的對數有很好的線性關係(R2=O. 9986)，體現該技術較強的定量檢測能力(圖4B)。
權利要求
1.一種實時螢光PCR檢測方法，採用上遊引物15、下遊引物6和一條檢測探針16進行檢測，其特徵在於，上遊引物15的序列為修飾基團1 一附加序列13和特異檢測序列2 -特異引物序列3，所述特異引物序列3為與模板上目標序列10反向互補的序列，所述特異檢測序列2為序列11的反向互補序列，其中序列11與序列17互補雜交，所述附加序列13為任意的不與模板雜交的核酸附加序列，所述修飾基團1為螢光基團或者淬滅基團或者供體螢光基團或者受體螢光基團；所述檢測探針16為修飾基團4 一特異檢測序列5，所述特異檢測序列5為序列12的反向互補序列，其中序列12與序列18反向互補，序列17為模板上目標序列10的延伸序列並遠離模板的3』端，序列18為模板上序列17的延伸序列並遠離目標序列10的一端，所述修飾基團4為淬滅基團或者螢光基團或者受體螢光基團或者供體螢光基團。
2.權利要求1所述的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，特異檢測序列2與上遊引物延伸序列形成唯一的頸環結構且該頸環結構的Tm值範圍為50-72度，優選所述頸環結構環的鹼基數在150鹼基內；檢測探針16雜交於所述頸環結構的相鄰位置，優選相鄰0-10個鹼基，雜交Tm值適中。
3.權利要求1或2所述的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，序列11或者12包括了 SNP或突變位點。
4.權利要求1所述的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，目標序列10與序列17之間相隔0-150個鹼基，優選間隔為0-50個鹼基；序列17與序列18之間相隔0 — 10個鹼基， 優選間隔為0-6個鹼基。
5.一個試劑盒，包括權利要求1至4任一所述的上遊引物15和檢測探針16。
6.權利要求1至4任一所述的實時螢光PCR檢測方法的用途。
7.權利要求6所述的用途為用於實時監測擴增產物量實現目標序列的定性及定量分析的用途。
8.權利要求6所述的用途為用於熔解分析的用途，優選為用於檢測SNP或突變位點的用途。
9.一種實時螢光PCR上遊引物和探針製備方法，其步驟為，選定模板的目標序列10，序列11，序列12，一段不與模板雜交的核酸附加序列13，上遊引物的理論序列即為修飾基團 1 一附加序列13和序列11的反向互補序列2 —目標序列10的反向互補序列3，所述修飾基團1為螢光基團或者淬滅基團或者供體螢光基團或者受體螢光基團；所述檢測探針序列的理論序列為修飾基團4 一序列12的反向互補序列5，其中序列12與序列18反向互補，序列17為模板上目標序列10的延伸序列並遠離模板的3』端，序列18為模板上序列17的延伸序列並遠離目標序列10的一端，所述修飾基團4為淬滅基團或者螢光基團或者受體螢光基團或者供體螢光基團；根據所述的上遊引物的理論序列和檢測探針引物的理論序列合成即可。
10.權利要求9中的實時螢光PCR上遊引物和探針製備方法，其特徵在於目標序列10 與序列17之間相隔0-150個鹼基，優選間隔為0-50個鹼基；延伸序列11與延伸序列12之間相隔0 — 10個鹼基，優選間隔為0-6個鹼基。
全文摘要
本發明涉及一種實時螢光PCR方法及用途，該方法僅需要一對上下遊引物和一條檢測探針即可，其中上遊引物和檢測探針分別進行單標記。上遊引物包含三個區域，特異引物序列3、特異檢測序列2及附加序列13；下遊引物按照一般的引物設計原則設計即可；檢測探針包括特異檢測序列5。特異檢測序列2與上遊引物的延伸序列形成唯一的頸環結構，該結構由特異檢測序列2引導形成，同時檢測探針雜交於相鄰位置。本方法的特異性好，選擇性強，探針和引物設計簡單靈活，易於純化，產率高，可用於實時監測擴增產物量實現目標序列的定性及定量分析，且可進行熔解曲線分析，特別適用於檢測SNP或突變位點，區分單鹼基差異能力強。
文檔編號C12Q1/68GK102321765SQ20111029914
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月8日
發明者王小波 申請人:廈門基科生物科技有限公司