一種乾酪乳桿菌來源的L‑乳酸脫氫酶及其應用的製作方法
2023-10-11 02:38:04
本發明涉及一種乾酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應用，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
苯乳酸(phenyllactateacid，pla)，系統名為2-羥基-3-苯基丙酸，是一種高值有機酸，其具有兩種對映異構體：l-pla和d-pla。pla的分子式為c9h10o3，相對分子質量為166.17，其性質穩定，熔點為121～125℃；pla在水中溶解度較好，並且其在水溶液中有較好的熱穩定性。l-pla和d-pla都具有廣譜抑菌效果，可作為天然抑菌劑，替代化學合成的防腐劑，而且可經聚合反應合成聚苯乳酸新型高分子材料，替代聚乳酸高分子材料。因此，苯乳酸在化工、製藥、生物、材料和食品等領域有廣闊的應用前景。
pla可由多種微生物代謝產生，是菌體在代謝途徑中一個副產物，如大多數的乳酸菌如植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)等，也有一些真菌如白地黴(geotrichumcandidum)，螢光維克酵母(wickerhamiafluorescens)tk1可產pla，但現有的野生菌株自產pla的濃度很低。目前，pla可以通過化學和生物的方法合成，但由於化學方法苛刻的反應條件、複雜的技術路線、副產物多不易分離，尤其對環境造成汙染等缺點，生物合成法因其高效性，反應條件溫和等優點，近年來受到廣大研究者的青睞。
已有研究表明，微生物中多種l-乳酸脫氫酶可不對稱還原苯丙酮酸生成l-pla，但是不同l-ldh不對稱還原苯丙酮酸的能力存在明顯差異，如賈江花等克隆表達了來源於植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)中的l1-ldh和l2-ldh基因，重組l1-ldh對苯丙酮酸的比活力為71.06u/mg，而重組l2-ldh對苯丙酮酸的比活力僅為0.06u/mg，並未測定其對映體純度。王穎等克隆了來源於bacillusmegateriumz2013513的ldhl基因並在大腸桿菌中實現表達，測得粗酶液對苯丙酮酸的酶活力為3.4u/mg。在37℃、200r/min條件下，25g/l(乾重)重組菌經60min將70.32mmol/l苯丙酮酸全細胞轉化合成50.59mmol/ll-pla，eep為96.89％，底物摩爾轉化率僅為71.94％。因此，利用分子生物學手段不斷挖掘出性狀優良的l-ldh，對於獲得高純度，高產量的l-pla具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種來源於乾酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶，lcldh1，其胺基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)胺基酸序列如seqidno.2所示；
(b)在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。
本發明的第二個目的是提供編碼所述l-乳酸脫氫酶的基因。
在本發明的一種實施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。
本發明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.1所示的l-乳酸脫氫酶基因。
在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pet-22b(+)為載體。
在本發明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。
本發明的第四個目的是提供構建所述基因工程菌的方法，是將seqidno.1所示基因與載體連接，轉化至大腸桿菌細胞中。
在本發明的一種實施方式中，所述載體為pet-22b(+)。
在本發明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21(de3)。
本發明的第五個目的是提供生產所述乳酸脫氫酶的方法，是將所述基因工程菌接種至lb培養基中，培養至od600＝0.6～0.8，加入終濃度為0.3～0.5mmol/l的iptg誘導6～10h。
在本發明的一種實施方式中，所述誘導是在18～22℃進行誘導。
本發明的第六個目的是提供所述l-乳酸脫氫酶的應用。
在本發明的一種實施方式中，所述應用是以苯丙酮酸為底物，加入所述l-乳酸脫氫酶，轉化生產l-苯乳酸。
在本發明的一種實施實施方式中，所述應用是向每1mmol/l苯丙酮酸中加入3mg含所述乳酸脫氫酶的重組溼菌體，於30～37℃200～220rpm條件下反應30～120min。
本發明的有益效果：來源於乾酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶基因序列克隆，l-乳酸脫氫酶工程菌的構建以及重組l-乳酸脫氫酶的異源表達和活性測定的方法。本發明構建的重組菌株e.coli/lcldh1在反應80min後可不對稱還原10mmol/l苯丙酮酸生成8.59mmol/l的l-苯乳酸，產率為85.9％，對映體過量值(eep)>99％。純化的lcldh1對苯丙酮酸的比活性為294.2u/mg。
附圖說明
圖1為重組lcldh1的sds-page分析；其中，m:proteinmarker；1:e.coli/pet22b全細胞(對照菌)；2:e.coli/lcldh1全細胞；3純化後的lcldh1。
具體實施方式
lcldh1的活性測定：總反應體系，包括50mmol/l乙酸鈉緩衝液(ph5.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，對照組中不含nadh，其他成分相同。混勻後於30℃保溫5min，加入適量的酶液。檢測nadh在340nm處吸收值的變化。酶活力單位(u)定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。同時，採用bradford方法測定蛋白含量。
底物和產物的檢測：反應結束後，取一定量的轉化液加入甲醇終止反應，進行反相hplc分析：色譜柱為prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流動相成分：0.05％三氟乙酸/水(a)和0.05％三氟乙酸/甲醇(b)混合液。梯度洗脫程序為：0～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫外光檢測器，柱溫：30℃；流速1ml/min。檢測波長為210nm，ppa的保留時間11.372min，pla的保留時間為12.858min。
另取一部分轉化液於1ml乙酸乙酯中進行萃取，上層有機相經無水硫酸鎂乾燥後過0.22μm有機濾膜採用正相hplc進行手性分析，色譜柱為daicelod-h(250mm×4.6mm)，分析條件為：流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速為1ml/min，檢測波長為210nm，柱溫：30℃，d-pla和l-pla的保留時間分別為33.896min，35.806min。根據實驗數據計算對映體過量值：eep＝[l-pla-d-pla/(l-pla+d-pla)]×100％。
實施例1lcldh1基因的克隆與表達質粒的構建
根據l.caseibl23的l-ldh(cap07851)對應的核苷酸序列設計如下引物：
lcldh1-f：5』-catatggtggcaagtattacggataa-3』，含ndei酶切位點。
lcldh1-r：5』-ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt-3』，含xhoi酶切位點。
提取乾酪乳桿菌的總dna，以lcldh1-f和lcldh1-r為引物進行pcr擴增，pcr條件為：94℃4min；94℃30s，51℃30s，72℃1min10s，30個循環；72℃10min。將pcr產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pucm-t載體連接(pucm-t-lcldh1)，轉化入e.colijm109中，經菌液pcr鑑定正確後送上海生工測序，得到lcldh1核苷酸序列。將測序結果正確的pucm-t-lcldh1與pet-22b(+)質粒均用ndei和xhoi進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-22b(+)-lcldh1，並對重組質粒進行序列測定。
實施例2重組菌e.coli/lcldh1的構建與誘導表達
將pet-22b(+)-lcldh1轉化入e.colibl21(de3)中，經含有amp的抗性平板篩選後，挑取陽性轉化子於2ml含amp的抗性lb液體培養基中，37℃220rpm搖床振蕩培養14～16h。按2％的接種量轉接於30ml相同培養基中，37℃220rpm搖床振蕩培養至對數生長中期(od600＝0.6～0.8)，加入iptg至終濃度為0.4mmol/l，20℃220rpm誘導培養8h。誘導結束後，離心收集菌體並用磷酸鹽緩衝液(ph＝7.0)洗滌數次，用於sds-page分析。以僅含空pet-22b(+)的菌株為對照，結果見圖1，重組菌e.coli/lcldh1(即e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1)在36.4kda處具有大小與目的酶相同的蛋白條帶，對照菌沒有條帶。利用液相色譜測定lcldh1轉化苯丙酮酸生成pla的產量及測定產物的對映選擇性。對照組分別用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導的工程菌在相同條件下培養。8000rpm，5min收集菌體。加入一定量的破碎液(20mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl)，超聲破碎後，4℃，12000rpm，10min離心取上清液即為粗酶液，經測定，其酶活為93.99u/ml。經ni-nta親和層析和凝膠過濾層析純化破碎液，測定純lcldh1的比活性。經測定，純化後的酶液的比酶活為294.2u/mg。
實施例3重組菌全細胞催化苯丙酮酸生成l-pla
於1ml離心管中加入300μl菌懸液(30mg溼菌體)和250μl磷酸鈉緩衝液(ph7.0)，37℃保溫5min，再依次加入50μl葡萄糖(終濃度50mmol/l)和400μl苯丙酮酸(終濃度10mmol/l)，反應1h後，取200μl反應液加入800μl甲醇終止反應，過0.22μm有機濾膜，進行hplc分析；另取200μl反應液，用1ml乙酸乙酯進行萃取，上層有機相經無水硫酸鈉乾燥後過0.22μm有機濾膜，進行對映選擇性分析。結果顯示，當體系反應40min後，l-pla的濃度為5.62mmol/l，產率為56.2％，eep>99％，當反應80min後，苯丙酮酸完全被消耗，產生8.59mmol/l的l-pla，產率為85.9％，eep>99％。
對照例1
具體實施方式同實施例2，區別在於，用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導的工程菌在相同條件下誘導表達，按照實施例3測得兩種工程菌催化苯丙酮酸，獲得l-pla的濃度僅為0.32mmol/l和0.46mmol/l。
對照例2
合成編碼genbank登錄號為kte98134.1l-乳酸脫氫酶的基因序列，將該基因命名為lcldh2，按照實施例1的策略克隆該基因和構建表達質粒pet22b(+)-lcldh2，引物設計為：
lcldh2-f:5′–catatgatggcaagaacaattggt–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點
lcldh2-r:5′–ctcgagcttcattttttcaaaggtatc–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。
根據實施例2的策略，將lcldh2在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coli/lcldh2。將重組菌按照實施例2的步驟進行異源表達得到lcldh2，按照實施例3將e.coli/lcldh2菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，於37℃、220r/min共同反應1h後進行液相檢測，結果產生3.5mmol/ll-pla，產率僅為35％，粗酶液的酶活力為47.3u/mg。
對照例3
合成編碼genbank登錄號為cap07856.1的基因序列，將該基因命名為lcldh3，按照實施例1的策略克隆該基因和構建表達質粒pet22b(+)-lcldh3。
lcldh3-f:5′–catatgatgcggaacaacggcaatat–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點
lcldh3-r:5′–ctcgagagcttcttgagccttcttca–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。
根據實施例2的策略，將lcldh3在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coli/lcldh3。將重組菌按照實施例2的步驟進行誘導表達得到lcldh3，按照實施例3的步驟將e.coli/lcldh3菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，於37℃、220r/min共同反應1h後進行液相檢測，結果產生2.7mmol/ll-pla，產率為27％，粗酶液的酶活力為42.5u/mg。
對照例4
按照實施例1，將lcldh1連接至pet28a(+)載體上，獲得重組質粒pet28a-lcldh1，將重組質粒導入bl21(de3)中，得到重組菌bl21/pet28a-lcldh1並進行誘導表達，按照實施例3將bl21/pet28a-lcldh1菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，於37℃、220r/min共同反應1h後進行液相檢測，發現產生l-pla的濃度和lcldh1的對映選擇性相比於e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1並沒有提高。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
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江南大學
一種乾酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應用
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