類桿菌信號分子微生態製劑及其製備方法

2023-10-11 20:23:54

專利名稱：：類桿菌信號分子微生態製劑及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及來源於微生物材料的醫藥配製品的領域，特別是來源於細菌的醫藥製品。技術背景益生菌製品(Probiolics)的生產技術已經經過了第一代產品和第二代產品兩個時代發展。第一代產品是活菌製品，第二代產品是死菌製品。這兩個時代己經過了半個世紀的過程。第一代產品主要是利用雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lacticacidbacteri)的活菌。其作用機理是調整腸菌群失調(Dysbacteriosis),補充有益菌抑制有害菌保持微生態平衡(Eubiosis)就利於人體健康。作為一種微生態調節劑，益生菌的活菌製品在全世界範圍內已廣泛用於人類的保健和預防疾病的有效方法。但這種製品有著嚴格的要求，首先要有足夠的活菌數，其次要有一定時間的活存期("。這對生產上和銷售提出了嚴格的要求，因而也限制這類保健品的發展。在實際上，生產界為了克服上述兩個限制活菌數，活菌期又提出了用死菌體作為本類製品有效成分，從而避免了生產和銷售的瓶頸效應。死菌體就是第二代產品。第二代產品雖然避免了活菌數和活存期兩個瓶頸限制，但也有致命的缺點。這就是死菌體很難量化，不利於質量控制，實際上很難成為合格的產品。第二代產品出現較晚，國內只有少數企業報批第二代產品，由於質量不易控制，國家審批機關尚在考慮之中。第一、二代產品，其療效是肯定的。經過近半個世紀的實踐，在歐洲、北美、日本和中國都在普遍應用此類微生態調節劑，作為酸奶發酵菌飲料、保健食品和藥品(主要在中國)的功能因子，已是普遍公認的現實。但是，由於第一代產品活菌數及活存期的限制和第二代產品質量控制(死菌體自溶)很難實施。這就導致第三代產品的應運而生。第三代產品是將益生菌的菌體裂解或破碎，使用菌體重要成分作為檢測指標，有利於定性、定量的質量控制和產品的應用與推廣。經過近五年來的最新研究成果發現，益生菌的作用是其菌體內所含有的信號分子(Signalmolecular)。這種信號分子是當代細胞通訊(cdltocellcammunication)系統中的重要組成部分(2)。類桿菌是類杆屬(Bacteroides)內的3個亞類的一類。這類菌叫作脆弱類桿菌(Bacteroidesflagilis,veillon及zuber)。脆弱類桿菌下分5個亞種其中一個種叫多形脆弱類桿菌(B.flagilissubsp.thitaiotamicron)。多形脆弱類桿菌是革蘭氏陰性多形態或形態一致的桿菌不運動或用邊鞭毛運動，非生孢子型桿菌，專性厭氧菌。該菌主要存在於動物腸腔內。該菌能從蛋白質、葡萄糖發酵產生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、丁酸或葉酸。pH7.0、37'C條件下生長最適。標準菌株為ATCC8492其G+C百分比為39.6-45%(3)。類桿菌是人類或哺乳動物腸內的最多益生菌。類桿菌佔第一位，消化球菌佔第二位，而雙歧桿菌佔第三類。長期的實踐證明，雙歧桿菌和乳桿菌對人畜有益，而類桿菌未被列入益生菌製劑的生產菌種，學術界一直感到遺憾，因為在許多腹部感染中類桿菌常常成為一個"病原菌"，這個病原菌不是偶然進入，而是感染的結果。在病灶中雖然能檢査出類桿菌，但該菌並無毒性。有報告指出，感染有雙相性，感染伊始是需氧菌(大腸桿菌、葡萄球菌等)，而後需氧菌消耗氧氣，創造了厭氧環境，利於厭氧的類桿菌被動的生長，因為腸道內類桿菌佔絕對優勢。我們認為類桿菌實際上並無引起感染的作用，只是因為被動地進入病灶而被誤解。現在是該平反的時候了。在過去半個世紀，因為其易引起"感染"而未被列入益生菌，應當予以糾正。在上個世紀90年代，國內就有人用類桿菌活菌做成益生菌製品(<)，其應用效果是很好的，並且是安全的，但因未得到國家有關管理部門的批准而終止了生產。類桿菌是人、動物腸道內的最多的正常菌群成員，其數量每克腸內溶物在10'2以上，與腸黏膜密切接觸，腸黏膜的面積如展開一個平面，有一個籃球場那麼大(260-300m2),並且與腸黏膜上皮細胞直接相接觸，其生理作用是最明顯的。通過無菌小鼠接種多形類桿菌、雙歧桿菌及大腸桿菌的比較，已經證實多形類桿菌生理效應是最強的。多形類桿菌引起迴腸中的Na+葡萄糖共價蛋白(Co.transpor,SGLT-1)mRNA水平提高，宿主類脂吸收機制中的多個信號(Signal)增加，包括脂肪酶蛋白2(PLRP-2)、"〗輔脂酶(Co-lipase)、脂脂酸結合蛋白(L-FABP)和阿樸脂蛋白(Apolipoprotein)的增加。輔脂肪酶是胰外胰分泌細胞產生的，輔脂肪酶在小鼠迴腸隱窩上皮細胞中也有表達，當接種多形類桿菌後，其表達提高了10倍。輔脂肪酶通過刺激胰腺甘油三脂酶和胰腺脂肪酶相關蛋白-2(PRLP-2)的活性，在脂肪代謝中起關鍵作用。脂肪代謝紊亂是肥胖症的根本原因。近60年來由於抗生素的應用，破壞腸菌群平衡，減少了類桿菌的數量很可能是肥胖症流行的原因之一。包括類桿菌在內正常腸菌群具有特異性的配體(信號分子)與上皮細胞上的特異性受體(Receptor)相結合即可產生一系列細胞生理的調節作用。宿主上皮細胞上的受體都含有胞外的配體結合區、具有疏水性的跨膜區和具有酪氨酸激酶活性胞質區三個區域。其中EGFR家族受體能與多種包括EGF、TGF-a及HB-EGF(肝素結合素因子)等配體結合觸發了胞內的信號級聯反應，將信號傳遞至核內引起一系列生物學反應調節細胞的生理機制。目前已知信號傳導系統有環核苷酸系統、鈣調蛋白系統、磷酸肌醇系統和酪氨酸激酶系統。細胞的生物學反應表現在細胞的有絲分裂、凋亡、運動性、血管形成和分化調節等方面。因此調節信號轉導通路，以信號轉導中的一些關鍵的信號分子作為調整腸菌群的一個新的手段，必將成第三代益生菌的生理作用的熱點。近年來對Toll-UkeReceptor,(TLR)受體研究已經證明，革蘭氏陽性的LTA(脂磷壁酸)和革蘭氏陰性的LPS(脂多糖)是一個各種細菌信號分子，能引起細胞內的信號發射流程(Signallingcascade),調節細胞生理活性。TLRs是高度特異性的細菌受體，對致病菌的反應，已做了深入的研究，但對生理性細菌的研究現在還是剛開始(6'"。這就是把信號分子作為益製劑的耙點的重要機遇。近年來發現葉酸在信號分子傳遞方面有重要作用。葉酸是B族維生素之一，由蝶啶、氨基苯甲酸和一個或穀氨酸結合而成8]。葉酸是宿細胞內的信號傳遞的重要因子，它能調節遺傳信息轉導，調節DNA或RNA的正常運轉。結構基因5，端附近高含CPG二聯核苷區稱為CPG島(CPGislands),基因調控元件所含的CPG轉錄因子複合體引起甲基化。DNA甲基化與基因沉默(genesilence)相聯繫，非基因甲基化(nonmethglation)與基因活化相聯繫。因此，葉酸特別是四氫葉酸是調節基因轉導和信號發射流程有重要關係^。葉酸有食物來源和腸菌群來源，而後者具有更高的生物學活性和可利用性。類桿菌是重要的葉酸來源。綜上所述，儘管對正常腸菌群含有的信號分子與體細胞之間轉遞各種生理調節信息的實驗研究和理論探討有了很大的進展並取得確實有效的成績，但尚未有可提供實際應用的有效產品出現。參考文獻(1)康白主編《微生態學原理》大連出版社20&215，2002。(2)康白"迎接徼生態學細胞通訊新時代的到來"《中國微生態學雜誌》18[1]:1-5,2002。(3)R.E.布坎南，NE吉本斯'伯傑《細菌鑑定手冊》，科學出版社535-536，1984。(4)張季階擬桿菌微生態製劑的製備方法ZL卯10284719950927。(5)HooperLV,Melissa,H.肌dH咖onL.:MolecularAnalysisofcommensalHost-microbialRelashionshipsinthelntestinem,Science291,5505(2001)881-884，2001。(6)YardenY,SliwskiMX:untanglingtheErbBsignallingnetwork,NatRER，Mol,CellBiol，2(2):127-137,2001。(7)O'Nell,LA，Fuzgerald，KAandDowic，AG,TrendsImmaol，24(6):286-290,2003。(8)Thomas,T,Weeler助dkylineAH:theMammaU旭InnateImmuneSystem:PotentialTargetsfordrugDevelopment,ImmuneEndocrineandMefabolicDisorder,5:237-2472005。(9)Geim旭,TM,RobertsonKD:ChromatinremodelinghistoneModificationandDNAMethylationhowdoesitallfitcogetherJCellBiochem87(2)117-125200
發明內容針對現有技術存在的缺陷，把類桿菌信號分子作為第三代益生菌製品不僅有創新性，而且具有充分的理論和實驗根據。本項發明旨在開發一個新的類桿菌信號分子製品及製備工藝(ProbioticsofBacteroidessignalmole-sular)。提出一個類桿菌分子微生態製劑及工藝製備方法，以便使類桿菌信號分子微生態製劑的研究開發進入實際應用階段。本發明是將類桿菌作為第三代益生菌製品研發。是將類桿菌菌體經細胞破壁、酶解、粗提、乾燥和粉碎而成，因為將類桿菌體裂解物作為信號分子載體，不會引起所謂的"感染"。其中的WPG、DNA含有多種類桿菌信號分子。本發明類桿菌信號分子製品的製備工藝包括1、類桿菌發酵其菌體濃縮將類桿菌種子液接入已經滅菌後的含有重量比為蛋白腖1,5~2%、大豆蛋白腖0.5%、葡萄糖0.5%、磷酸氫二鈉0.4%、磷酸二氨鉀0.1°/。、牛肉膏0.2°/。、酵母浸膏1%、氯化鈉0.3%、可溶性澱粉0.5°/。的培養液基中，經3538'C厭氧發酵後，再經離心濃縮即獲得類桿菌菌體濃縮物。2、細胞破壁將該類桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1:31:5),使用高壓細胞破碎機操作壓力100MPa左右以高壓破碎菌體細胞壁。3、酶解分別加入胰蛋白酶(l2mg/ml)、糜蛋白酶(l2mg/ml)和胃蛋白酶(l2mg/ml)及鹽酸(使其濃度為0.01M/1),水解1224小時，離心、水洗，獲得細胞壁粗提物。4、乾燥細胞提取物於4070"C減壓乾燥。或將本製品進行冷凍乾燥。獲得的乾燥物經研磨、過篩，即得類桿菌分子信號分子製劑原粉。製劑原粉是白灰白色粉末，可在水中快速溶解，在常溫下和冷藏條件下穩定。本類桿菌信號分子製品的檢測項目及指標特徵是1)細胞壁糖檢查，稱取原粉0.Olg加15%正丁醇水溶液各配製成10mg/ml溶液。吸取0.5ml於試管中，滴加0.05%葸兩硫酸試劑l.Oml，搖勻即呈藍綠色。2)細胞壁內消旋二氨基庚二酸檢查。採用紙層析-顯色法，應顯出特有的橄欖綠色斑點，褪色後變黃色。3)外觀應為白色粉末。4)乾燥失重檢査，減失重量應不高於5%。多形脆弱類桿菌分子微生態製劑原粉加入相應的輔料可以製成各種劑型例如取該製劑原粉50200g，加入葡甘露聚糖或其它低聚糖、乳糖870g,硬脂酸鎂30g,分裝膠囊，製成保健品膠囊，口服使用；同樣加入乳糖鄰0g,硬脂酸鎂3g,羥丙纖維素40g，微晶纖維素150g,檸檬酸2g，10%聚乙烯吡烙烷酮80g,經混合、造粒或壓片而製成類桿菌分子微生態製劑顆粒劑、片劑；同樣加入角鯊烯、甘露醇、聚山梨醇酯80和無菌水等合計100升，以超聲波乳化成均勻的白色混懸液，經除菌過濾後供灌裝，製成雙歧桿菌分子微生態製劑口服液。本發明的類桿菌信號分子製品對動物進行了關於動物急性毒性試驗、對小鼠自發活動次數的影響、對大鼠血壓及呼吸的影響、自動過敏實驗，證實無急性毒性，對動物的自發活動次數、血壓及呼吸的無影響，對動物不會引起過敏反應。動物實驗還證明本製品具有調整血脂代謝、減少脂肪累積，減肥的功效；同時通過調整基因表達，調節免疫功能，起到提髙免疫力及抗腫癯作用。與現有技術相比，本發明特徵在於1)、作為類桿菌細胞壁內容物(信號分子)製劑應用本發明的類桿菌分子微生態製劑的作用主體是宿主細胞，類桿菌信號分子只是向宿主細胞提供健康信號，使宿主細胞產生相應的生理作用和健康表現。信號分子引起宿主細胞基因表達，在核糖體(Ribosome)合成相應的功能酶，通過功能酶發揮其生理作用。2)類桿菌活菌作為益生菌製劑目前還受到限制，而將其細胞內容物作為產品開發可以消除人們對類桿菌活菌製劑可能會導致厭氧菌感染的顧慮。3)、通常活菌體製劑由於活菌體受溫度、氧氣及本身遺傳規律的制約，製品只能在低溫下保藏，菌體死亡率髙，產品貨架期非常短；而死菌製劑有其功效因子不明確，難於鑑定和檢測，此類製品市場上很少見。本發明的類桿菌分子微生態製劑其功效因子明確，易於檢測，製品可進行工業化生產。產品可在常溫下保藏，具有產品穩定、貨架期長等特點。具體實施例方式實施例一、類桿菌信號分子製品製備工藝如下-將多形脆弱類桿菌DM訴08(A_/7agi7i>"fop.77i加oto加,crow)菌株種子液接入已經滅菌後的含有重量比為蛋白腖1.5~2%、大豆蛋白腖0.5%、葡萄糖0.5%、磷酸氫二鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、牛肉膏0.2%、酵母浸膏1%、氯化鈉0.3%、可溶性澱粉0.5%。培養液基經35~38'C厭氧發酵後，經離心濃縮後獲得類桿菌菌體濃縮物。將該類桿菌菌體濃縮物加生理鹽水，以高壓破碎法菌體細胞壁。分別加胰蛋白斷l2mg/ml)、糜蛋白酶(lSmg/ml)和胃蛋白嗨(12mg/ml)及鹽酸(使其濃度為0.01M/1),水解1224小時，離心、水洗，獲得細胞壁粗提物。將本製品進行冷凍乾躁。獲得的乾燥物於研缽中研細、過篩，即得類桿菌分子微生態製劑原粉。本脆弱類桿菌信號分子製品的檢測項目及指標特徵是l)細胞壁糖檢査，稱取原粉0.01g加15。/。正丁醇水溶液各配製成l0mg/ml溶液。吸取0.5ml於試管中，滴加0.05%惠兩硫酸試劑l.Orn!，搖勻即呈藍綠色。2)細胞壁內消旋二氨基庚二酸檢査。採用紙層析-顯色法，應顯出特有的橄槐綠色斑點，褪色後變黃色。3)外觀應為白色粉末。4)乾燥失重檢査，減失重量應不高於5%。實施例二、將多形脆弱類桿菌普通亞種DM9707(及yflg沾,幼fep.v"/伊/us)菌株種子液接入已經滅菌後的含有重量比為蛋白腖1.5~2%、大豆蛋白腖0.5%、葡萄糖0.5%、磷酸氫二鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、牛肉膏0.2%、酵母浸膏1%、氯化鈉0.3%、可溶性澱粉0.5%。培養液基經353『C厭氧發酵後，經離心濃縮後獲得類桿菌菌體濃縮物。將該類桿菌菌體濃縮物加生理鹽水，以高壓破碎法菌體細胞壁。分別加胰蛋白酶(l2mg/ml)、糜蛋白酶(l2mg/ml)和胃蛋白酶(l2mg/ml)及鹽酸(使其濃度為0.01M/1),水解12~24小時，離心、水洗，獲得細胞壁粗提物。將本製品進行冷凍乾躁。獲得的乾燥物於研缽中研細、過篩，即得類桿菌分子微生態製劑原粉。本脆弱類桿菌信號分子製品的檢測項目及指標特徵是l)細胞壁糖檢査，稱取原粉0.01g加15%正丁醇水溶液各配製成10mg/ml溶液。吸取0.5ml於試管中，滴加0.05。/。葸酮硫酸試劑l.Oml,搖勻即呈藍綠色。2)細胞壁內消旋二氨基庚二酸檢查。採用紙層析-顯色法，應顯出特有的橄欖綠色斑點，褪色後變黃色。3)外觀應為白色粉末。4)乾燥失重檢査，減失重量應不高於5%。實施例三、將產黑色素類桿菌(及^flgi'/J5加e/flnm'nog抓cus)菌株種子液接入已經滅菌後的含有重量比為蛋白腖1.5~2%、大豆蛋白腖0.5%、葡萄糖0.5%、磷酸氫二鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、牛肉膏0.2%、酵母浸膏1%、氯化鈉0.3%、可溶性澱粉0.5%。培養液基經35~38'C厭氧發酵後，經離心濃縮後獲得類桿菌菌體濃縮物。將該類桿菌菌體濃縮物加生理鹽水，以高壓破碎法菌體細胞壁。分別加胰蛋白酶(l2mg/ml)、糜蛋白酶(l2mg/ml)和胃蛋白酶(12mg/ml)及鹽酸(使其濃度為0.01M/1),水解1224小時，離心、水洗，獲得細胞壁粗提物。將本製品進行冷凍乾躁。獲得的乾燥物於研缽中研細、過篩，即得類桿菌分子微生態製劑原粉。本脆弱類桿菌信號分子製品的檢測項目及指標特徵是l)細胞壁糖檢査，稱取原粉0.01g加15%正丁醇水溶液各配製成10mg/ml溶液。吸取0.5ml於試管中，滴加0.05%葸酮硫酸試劑l.OmI,搖勻即呈藍綠色。2)細胞壁內消旋二氨基庚二酸檢査。採用紙層析-顯色法，應顯出特有的橄欖綠色斑點，褪色後變黃色。3)外觀應為白色粉末。4)乾燥失重檢查，減失重量應不高於5%。實施例四、多形脆弱類桿菌t)M訴08信號分子製品原粉製造同實施例一。取該製劑進行如下實驗1、動物毒性試驗採用昆明種小鼠,共20隻,分為兩組，試驗組注射量相當5g/kg.d，給藥後連續觀察3d,與對照組小鼠比較，進食、活動、大便、皮毛及各種反射均無異常，兩組小鼠無一死亡，體重增長組間比較亦無明顯差異。提示該藥無明顯急性毒性作用，臨床擬用量安全。2、對小鼠自發活動次數的影響昆明種小鼠,體重20土2g,雌雄兼用，共75隻,隨機分成5個劑量組,每組15隻。將5個實驗組的小鼠分別注射生理鹽水、0.25%苯甲酸鈉咖啡因、0.075%氯丙嗪、10mg/ml和40mg/ml類桿菌份子微生態製劑，注射劑量都是O.lml/10g。分別在0-15分鐘和15-30分鐘內觀察記錄小鼠自發活動次數。結果見表1。表l類桿菌信號分子製品對小鼠自發活動影響(*P<0.01,**P<0.001)藥物劑量—丄、Wr動物數用藥後小鼠自發活動數(X土SD)0-15min15-30min生理鹽水0.lml/10g1540.15±11.426.0±11.20.25%苯甲酸鈉咖啡因0.lml/10g15107.7±24.3林89.4±18.l林0.075%氯丙嗪0.lml/10g1511.9±6.4**1.7±0.8林10mg/ml類桿菌分子製劑0.lml/10g1536.6±22.521.6±9.830mg/ral類桿菌分子製劑0.lral/10g1544.1±10.329.2±8.7結果顯示，與生理鹽水比較，多形脆弱類桿菌DM9808分子微生態製劑對小鼠自發活動此無明顯影響。3、對大鼠血壓及呼吸的影響採用Wistar大鼠,體重範圍150g-200g,雌雄兼用，共48隻,隨機分成4個劑量組,每組12隻。將4個組的大鼠現腹腔注射2(m烏拉坦lg/kg麻醉。麻醉後，固定，剪去頸部毛，正中切開頸部皮膚，在側部頸動脈插上預先灌有肝素鹽水的動脈套管，記錄藥前血壓正常值。待血壓平穩後，分別腹腔注射生理鹽水、10mg/ml多形脆弱類桿菌分子微生態製劑生理鹽水、30mg/ml多形脆弱類桿菌分子微生態製劑，注射劑量都是O.2ml/100g。在注射後5分鐘、10分鐘和15分鐘，分別觀察記錄小鼠血壓情況。實驗結果見表2表2多形脆弱類桿菌信號分子製品對大鼠血壓影響tableseeoriginaldocumentpage9結果表明小劑量組合大劑量組對大鼠血壓及呼吸均沒有任何影響.提示類桿菌信號分子製品在實驗劑量內靜脈注射，對大鼠無明顯不良反應。4、自動過敏實驗豚鼠5隻，由大連醫科大學實驗動物中心提供，體重350土50g,雌雄兼用。本實驗室檢淵多形脆弱類桿菌分子微生態製劑對豚鼠經皮下注射的自動過敏性。實驗前用生理鹽稀釋本製劑為30mg/ml。經皮下注射致敏。注射量為O.5ml/kg。IO天后再經心臟注射，注射量為10ml/kg。觀察動物有無過敏反應。結果顯示，全部5隻動物均未出現過敏症狀，解剖後未發現異常。由此得出結論，多形脆弱類桿菌信號分子製品不會引起過敏反應。實施例五、多形脆弱類桿菌DM9808信號分子製品原粉製造同實施例一。取該製劑進行如下實驗1、抑瘤試驗取體重為18-20gBALB/c小鼠，試驗組和對照組各10隻，抽取S180腹水癯，計數後稀釋成2X107個細||&/ml,將本製劑溶於生理氯化鈉溶液，配製成2000ug/ml。取l.Oml瘤細胞與l.OmlN-CWS溶液混合均勻，作為試驗組樣品。同時取l.Oml角鯊烯、甘露醇和聚山梨酵酯80的混合液(與配製半成品時相同的濃度和比例)與l.Oml瘤細胞混合作為對照組注射用。分別對小鼠皮下注射，每隻0,2ml(200ug本製劑/只)，接種後14天解剖動物，取瘤並稱瘤重，計算抑癯率。計算公式為抑瘤率(％)-(對照組平均癯重一試驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重X100。/。。抑瘤率不低於50%。實施樹六、多形脆弱類桿菌信號分子製品原粉製造同實施例一。取該製劑進行如下調血脂實驗取體重150"-200克的二級wistar雄性大鼠，飼以含1。/o膽固醇，5%豬油和0.2%膽鹽的高脂飼料，分為四組，實驗組分為高中低劑量組，給予多形脆弱類桿菌信號分子製品分別為2、1、0.5mg/kg.bw/d,採用生理鹽水稀釋後，每日分別灌胃2ml。稱體重，取尾血測定血脂指標，用酶聯試劑盒測定血清膽固醇(TC)、血清甘油三脂(TG)和血清高密度脂蛋白(HDL-C)。實驗結果顯示①第15、30天分別測定大鼠血清膽固醇實驗組中高中低劑量組分別是66.4±6.8,62.1±6.6,62.9±4.8;71.4±4.4,67.2±4.3,71.9±4.7，而對照組則為51.4±10.7,110.5±274(mg/<U),實驗組血清膽固醇濃度比對照組低(p0.05)。實驗組動物與對照組相比各組大鼠的體重無顯著性差異(p>0.05)。本實驗結果表明與飼以高脂飼料的對照組大鼠相比，在實驗的第15、30天分別測定大鼠血清TC濃度低與對照組，並有顯著性差異(p<0.05)。通過計算顯示高中劑量組HDL/TC比值高與對照組、動脈硬化指數低與對照組並有顯著性差異(p<0.05)。根據《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》的判定標準，可以認為類桿菌信號分子製品具有調節大鼠血脂的作用。實旌例七、多形脆弱類桿菌DM9808信號分子製品原粉製造同實施例一。取該製劑進行免疫調節作用研究樣品採用多形脆弱類桿菌分子微生態製劑，按人體推薦量為每人每日60mg(2、1、0.5mg/kg.bw/d)。用生理鹽水配製各劑量濃度。實驗動物二級昆明種雌性小白鼠，體重18—22克。試驗方法按上述劑量各組每天灌胃一次，連續30天後對動物進行各項免疫指標測定，方法如下1、小鼠遲髮型變態反應(DTH):灌胃第26天給小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞(8腿00.2\117隻，於免疫後第四天小鼠左後足蹠部皮下注射2。/。SRBC(20UL/只)進行攻擊前和攻擊後24小時、48小時分別測量小鼠左後足蹠同一部位厚度，計算攻擊前、後的差值，結果進行差分析。結果如表3表明中劑量組用SRBC攻擊前後(間隔24h)足蹠厚度差與對照組間差異有顯著性(P<0.05),高、低劑量組小鼠差與對照組差異無顯著性(P〉0.05)。表3類桿菌信號分子製品對小鼠DTH反應結果PO.01組別mg/kg-bw/d動物數(只)足蹠厚度差值(ram)(24h)(Z土S)足蹠厚度差值(mm)(48h)(I土S)2100.070土0.0110.0432±0.1511100.072±0.0120.0454±0.0060.5100.069±0.0060.0441±0.005對照100.066±0.0050.0434±0.0052、ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗(MTT):對各組小鼠無菌取脾，制脾細胞懸液，用RPMT1640完全培養液調整脾細胞濃度為2X10S個/mJ，按照程序中MTT法進行淋巴細胞增殖反應，最後在752~C紫外可見分光光度計570nm波長處測其光密度值(OD),計算ConA+與ConA-各孔的光密度值差，結果進行方差分析。表4結果顯示各劑量組小鼠ConA+與ConA-OD差值對照組間差異均無顯著性(p〈0.05)。表4類桿菌信號分子製品對小鼠脾淋巴細胞轉化試驗(MTT)結果(p<0.05)tableseeoriginaldocumentpage113、小鼠腹腔巨嗛細胞吞敏雞紅細胞試驗於末次給予受試物後各組小鼠均腹腔注射20%雞紅細胞懸液化lml/只，間隔30分鐘處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2ml/只，振搖一分鐘後取腹腔洗液製片，37"溫育30分鐘，漂洗、固定染色鏡檢。計數吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數和巨噬細胞吞噬雞紅細胞數，以吞噬率和吞噬指數進行方差分析。表5顯示各劑量組小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬率、吞噬指數與對照組間差異均無顯著性(p<0.05)表5類桿菌信號分子製品對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結果_tableseeoriginaldocumentpage114、抗體生成細胞檢獮(PFC):於灌胃第25天給小鼠腹腔注射2%8肪<:0.21111/只，於免疫後第5天處死,解剖取脾制細胞懸液，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為5X106個/ml，按程序方法製備瓊脂糖玻片，在二氧化碳培養箱中溫育1.5小時後加補體，再溫育1.5小時.計數每張瓊脂薄層板上形成的溶血空斑數，結果進行方差分析。表6結果顯示各劑量組溶血空斑數均高於對照組，其中高劑量組小鼠溶血空斑數與對照組間差異有顯著性(p<0.05),中、低劑量組小鼠溶血空斑數與對照組間差異均無顯著性(p0.05)。表6類桿菌信號分子製品對小鼠抗體生成細胞試驗結果tableseeoriginaldocumentpage110.510813.0±331.4對照10698.2±306.55、血清溶血素獮定於灌胃第25天給小鼠腹腔注射2c/。SRBC(0.2ml/只)，於免疫後第5天摘眼球取血，分離血清並在微量血凝板上進行血清溶血素測定。37t:孵肓3小時後，統計血球凝集度，計算相應抗體積數，結果進行方差分析。表7顯示高、中劑量組抗體積數與對照組間差異均有髙度顯著性(p<0.01)。表7類桿菌信號分子製品對小鼠血清溶血素測定結果組別動物數抗體積數mg/kg-bw/d(只)(±s)210205.45±32.31110189.32±42.430.510179.23±38.42對照10135.7±34.21免疫調節實驗表明細胞免疫功能測定小鼠遲發變態反應(DTH)結果和ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗(MTT)均為陽性；體液免疫功能測定抗體生成細胞檢測(PFC)結果和血清溶血素測定結果均為陽性；單核-巨噬細胞功能測定小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結果為陰性。本次實驗觀察到類桿菌信號分子製品對小鼠細胞免疫和體液免疫功能試驗結果均為陽性，說明類桿菌信號分子製劑具有免疫調節作用。實施例八、多形脆弱類桿菌分子微生態製劑原粉製造同實施例一。取該製劑50-200g加入葡甘露聚糖或其它低聚糖、乳糖870g,硬脂酸鎂30g，分裝O號膠囊，製成保健食品，口服使用。實施例九、多形脆弱類桿菌分子微生態製劑原粉製造同實施例一。取原凍乾粉50-200g，加入乳糖400g，硬脂酸鎂3g，羥丙纖維素40g,微晶纖維素150g，檸檬酸2g,10%聚乙烯吡烙垸酮80g，混合，制粒，製成類桿菌分子微生態製劑顆粒劑。或壓片，製成類桿菌分子微生態製劑片劑。實施例十、多形脆弱類桿菌分子微生態製劑原粉製造同實施例一。取該製劑50-200g加入角鯊烯、甘露醇、聚山梨酵酯80和無菌水等合計100升，以超聲波乳化成均勻的白色混懸液，經除菌過濾後供灌裝，製成雙歧桿菌分子微生態製劑口服。權利要求1.類桿菌信號分子微生態製劑，其特徵在於將類桿菌經厭氧發酵、細胞破壁、酶解、粗提、乾燥和粉碎而成的製劑原粉；其為白~灰白色粉末，可在水中快速溶解，在常溫下和冷藏條件下穩定，其中的WPG、DNA含有多種類桿菌信號分子；產品特徵是1)細胞壁糖檢查中將其配製成10mg/ml15％正丁醇水溶液滴加0.05％蒽酮硫酸試劑1.0ml時即呈藍綠色；2)細胞壁內消旋二氨基庚二酸檢查採用紙層析-顯色法，應顯出特有的橄欖綠色斑點，褪色後變黃色；3)外觀應為白色粉末；4)乾燥失重檢查，減失重量應不高於5％；所述類桿菌為脆弱類桿菌。2.根據權利要求1所述類桿菌信號分子微生態製劑，其特徵在於所述微生態製劑為口服膠囊，其中含微生態製劑原粉5(T200g，加入葡甘露聚糖或其它低聚糖870g,硬脂酸鎂30g，分裝O號膠囊。3.根據權利要求1所述類桿菌信號分子微生態製劑，其特徵在於所述微生態製劑為口服粒劑或片劑，其中含微生態製劑原粉5(T200g，加入乳糖400g，硬脂酸鎂3g,羥丙纖維素40g,微晶纖維素150g,檸檬酸2g,lW聚乙烯吡烙烷酮80g,混合，制粒或壓片。4.根據權利要求1所述雙歧桿菌信號分子微生態製劑，其特徵在於所述微生態製劑為口服液，10升口服液中含類桿菌分子微生態製劑原粉50200g,還含有通常量的角鯊烯、甘露醇、聚山梨醇酯。5.類桿菌信號分子微生態製劑的製法，其特徵在於其工藝步驟為l)類桿菌發酵其菌體濃縮將類桿菌菌種子液接入已經滅菌後的含有重量比為蛋白腖1.5~2%、大豆蛋白腖0.5%、葡萄糖0.5%、磷酸氫二鈉0.4%、磷酸二氫鉀O.1%、牛肉膏0.2%、酵母浸膏1%、氯化鈉0.3%、可溶性澱粉0.5%的培養液基中，經3538'C厭氧發酵後，再經離心濃縮後獲得類桿菌菌體濃縮物；2)細胞破壁將該類桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水，類桿菌菌體濃縮物蒸餾水或生理鹽水-1:3-1:5，使用高壓細胞破碎機以100MPa左右高壓破碎菌體細胞壁；3)酶解-分別加l2mg/ml的胰蛋白酶、12mg/ml的糜蛋白酶和12鵬/ml胃蛋白酶及鹽酸-使其濃度為0.01M/1，水解1224小時，離心、水洗，獲得細胞壁粗提物；4)乾燥細胞提取物於4070'C減壓千燥至無溶劑味為止。6.根據權利要求5所述類桿菌信號分子微生態製劑的製法，其特徵在於其工藝步驟中的千燥步驟為加入100200mM/L的海藻糖進行冷凍乾躁。全文摘要類桿菌信號分子微生態製劑，是將類桿菌菌種接種在培養液基經35~38℃厭氧發酵後，離心濃縮獲得類桿菌菌體濃縮物；再經高壓破碎菌體細胞壁；進而經胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶酶解，溶劑抽提，減壓乾燥而得製劑原粉。以製劑原粉為主料加入其他輔料可以製成口服膠囊、片劑、顆粒劑、口服液等製劑。本發明的類桿菌信號分子製品對動物進行了實驗，證實無急性毒性，對動物的自發活動次數、血壓及呼吸無影響，對動物不會引起過敏反應。動物實驗還證明本製品具有調整血脂代謝、減少脂肪累積，減肥的功效；同時通過調整基因表達，調節免疫功能，起到提高免疫力及抗腫瘤作用。文檔編號A61P37/00GK101125151SQ20061011585公開日2008年2月20日申請日期2006年8月16日優先權日2006年8月16日發明者白康,偉所,袁傑力申請人:大連森佰澳科技有限公司