減少分析裝置中的鉤狀效應的製作方法

2023-10-29 11:42:37 2

專利名稱：減少分析裝置中的鉤狀效應的製作方法
背景技術：
多種分析方法和裝置通常用於流過式分析，以確定可能存在於試樣中的被分析物的存在和/或濃度。例如，免疫測定利用免疫系統的機理，其中響應對生物體來說具有致病性或為外源的抗原的存在產生抗體。這些抗體和抗原，即免疫反應物，能夠彼此結合，從而產生可以用來確定生物試樣中特定抗原的存在或濃度的高度特異性反應機理。
存在幾種公知的免疫測定方法，使用標記有可檢測成分的免疫反應物，使得可以分析檢測被分析物。例如，「夾層型」分析通常包括混合試樣和可檢測探針例如染色膠乳或放射性同位素，所述探針與用於被分析物的特異性結合元件綴合。該綴合探針與被分析物形成絡合物。然後這些絡合物到達其中抗體和被分析物之間結合形成三元「夾層絡合物」的固定抗體區(zone)。夾層絡合物被局限在該區以檢測被分析物。該技術可以用於獲得定量或半定量結果。該夾層型分析的一些實例描述於Grubb等人的美國專利號4,168,146和Tom等人的美國專利號4,366,241。
然而，許多常規的「夾層型」分析模式當暴露至較高的被分析物濃度時遇到明顯錯誤。具體地，當被分析物以高濃度出現時，試樣中相當大部分的被分析物不能與綴合的探針形成絡合物。因此，到達檢測區時，未絡合被分析物與絡合的被分析物競爭接合點。因為未絡合被分析物沒有用探針標記，因此它不能被檢測。因此，如果很多接合點被未絡合被分析物佔據，那麼該分析可能顯示出「假陰性」。該問題通常稱為「鉤狀效應(hook effect)」。
已經提出多種用於減少免疫測定中「鉤狀效應」的技術。例如，Neumann等人的美國專利號6,184,042描述了用於減少夾層分析中鉤狀效應的技術。該技術包括在固相存在下培養樣品和至少兩種能夠與被分析物結合的受體。第一種受體是選自抗體、抗體片段和其混合物的結合分子的低聚物。第二種受體結合至固相，或能夠結合至固相。使用可溶低聚物抗體據說減少「鉤狀效應」。
然而，現在仍然需要以簡單有效和相對便宜的方式減少「鉤狀效應」的改進技術。
發明概述根據本發明的一個實施方案，公開了檢測試樣中被分析物的存在或量的方法。該方法包括i)提供一種流過式分析裝置，該裝置包括與能夠產生檢測信號的檢測探針聯繫的多孔膜，檢測探針與被分析物的特異性結合元件綴合，多孔膜限定接受材料被固定其中的檢測區；ii)使包含被分析物的試樣與綴合的檢測探針接觸，以便形成被分析物/探針絡合物和未絡合被分析物；iii)令未絡合被分析物經歷非特異性結合；和iv)在被分析物/探針絡合物和檢測區內的接受材料之間形成三元絡合物，其中接受材料保持相對不含未絡合被分析物。
例如在一個實施方案中，未絡合被分析物非特異地結合至存在於至少一部分綴合檢測探針上的域(domain)上。在這種情況下，包含該域的綴合檢測探針可以單獨地限定構成約20％至約100％被探針佔據的空間體積的中空內部。這些「中空」探針可以具有內表面和外表面，其中內表面包括所述域。一個實施方案中，所述域是疏水性的。
根據本發明的另一個實施方案，公開了一種用於檢測試樣中被分析物的存在或量的流過式分析裝置。該流過式分析裝置包括與能夠產生檢測信號的檢測探針聯繫的多孔膜。檢測探針與被分析物的特異性結合元件綴合，並當接觸試樣中被分析物時與其結合，以便形成被分析物/探針絡合物和未絡合被分析物。綴合檢測探針還包含能夠非特異結合至未絡合被分析物的域。多孔膜還限定接受材料被固定於其中的檢測區，該區配置為結合至被分析物/探針絡合物。該綴合檢測探針能夠在檢測區內部產生檢測信號，以便可根據所述檢測信號測定試樣內被分析物的量。
在下文中更詳細地討論本發明的其它特徵和方面。
附圖簡述參考附圖，說明書的其餘部分更特別地列出針對本領域普通技術人員的本發明完整和能夠實現的公開內容，包括其最佳方式，在附圖中

圖1是本發明流過式分析裝置的一個實施方案的透視圖；圖2圖解說明了共價綴合抗體至中空探針的一個實施方案；圖3是本發明流過式分析裝置的一個實施方案的示意圖；圖4是實施例3結果的圖解圖；圖5是實施例4結果的圖解圖；和圖6是實施例1中使用的中空顆粒的SEM照片(放大倍數為100倍)。
本說明書和附圖中重複使用的參考符號用來表示本發明相同或類似的特徵或元件。
代表性實施方案的詳細說明定義在這裡使用的術語「被分析物」通常是指待檢測的物質。例如，被分析物可以包括抗原物質、半抗原、抗體和其組合。被分析物包括但是不局限於毒素、有機化合物、蛋白質、肽、微生物、胺基酸、核酸、荷爾蒙、類固醇、維生素、藥物(包括給藥用於治療用途的以及給藥用於不正當用途的)、藥物中間體或副產物、細菌、病毒顆粒和任何上述物質的代謝物或抗體。一些被分析物的具體實例包括鐵蛋白；肌酸酐激酶MIB(CK-MB)；異羥基洋地黃毒苷；二苯乙內醯脲；苯巴比妥；醯胺咪嗪；萬古黴素；慶大黴素；茶鹼；丙戊酸；奎尼丁；促黃體生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、孕酮；C-反應蛋白；脂肪分解酶(lipocalins)；免疫球蛋白E抗體；維生素B2微球蛋白；糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，Gly.Hb)；氫化可的松；洋地黃毒苷；N-乙醯基普魯卡因醯胺(NAPA)；普魯卡因醯胺；風疹抗體，例如風疹免疫球蛋白G和風疹免疫球蛋白M；弓形體病抗體，例如弓形體病免疫球蛋白G(Toxo-Ig G)和弓形體病免疫球蛋白M(Toxo-Ig M)；睪丸激素；水楊酸酯；退熱淨；B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；B型肝炎核心抗原抗體，例如抗B型肝炎核心抗原免疫球蛋白G和免疫球蛋白M(Anti-HBC)；人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T細胞白血病毒1和2(HTLV)；B型肝炎e抗原(HBeAg)；B型肝炎e抗原抗體(Anti-HBe)；流感病毒；促甲狀腺激素(TSH)；甲狀腺素(T4)；全部的三碘甲腺原氨酸(Total T3)；自由三碘甲腺原氨酸(Free T3)；癌胚抗原(CEA)；甲胎蛋白(AFP)。濫用藥物和受控物質包括，但是不限於安非他明；脫氧麻黃鹼；巴比妥酸鹽，例如異戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯並二氮雜，例如利眠寧和安定；大麻，例如大麻麻醉劑和大麻；古柯鹼；芬太奴；LSD；甲苯喹唑酮；鴉片製劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、氫嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、氧可酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯西克定；和丙氧芬(propoxyhene)。其它可能的被分析物描述於Everhart等人的美國專利號6,436,651和Tom等人的美國專利號4,366,241。
在這裡使用的術語「試樣」泛指懷疑包含被分析物的材料。可以直接使用從來源獲得的試樣或先進行樣品性質改性預處理。試樣可以衍生自任何生物來源，例如生理性液體，包括血液、組織液、唾液、眼球晶狀體液、腦脊液、汗水、尿、牛奶、腹水液體、沙啞、滑膜液、腹膜液、陰道液體、羊水等。可以在使用前預先處理試樣，例如從血液製備血漿、稀釋粘性流體等。處理方法可以包括過濾、沉澱、稀釋、蒸餾、混合、濃縮、幹擾成分的滅活和加入試劑。除生理性液體之外，可以使用其它液體樣品例如水、食品等用於環境分析或食品生產分析。此外，可以使用懷疑包含被分析物的固體材料作為試樣。在有些情況下，改性固體試樣以形成液體介質或釋放被分析物可解是有益的。
詳細說明現在將詳細描述本發明的多個實施方案，以下說明其中的一個或多個實施例。每個實施例是為說明本發明提供的，不限制本發明。實際上，對於本技術領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本發明的範圍或精神的情況下，在本發明中能夠進行各種改進和變化。例如，作為一個實施方案的部分而圖解或描述的特徵，可以用於另一個實施方案以產生更多實施方案。因此，本發明擬覆蓋所附權利要求和其同等物範圍內的這種改變和變化。
通常，本發明涉及檢測試樣中被分析物的存在或量的基於膜的分析設備。該設備利用綴合探針，該探針包含所關心的被分析物的特異性結合元件。特異性結合元件優選當和試樣接觸時與試樣內的被分析物絡合。未與特異性結合元件絡合的過量被分析物可以經歷非特異性的結合，例如與域(例如表面、分子等)結合。結果，限制了未絡合被分析物與設備檢測區中的絡合被分析物競爭的能力。因此，以簡單、有效和相對便宜的方式限制「假陰性」的發生率。
例如，參考圖1，現在將更詳細地描述一個可以根據本發明形成的流過式分析裝置20的實施方案。如圖所示，裝置20包含任選被剛性材料21支撐的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由試樣能夠通過的多種材料中的任何一種製成。例如，用於形成多孔膜23的材料可以包括但是不局限於天然、合成或合成改性的天然存在的材料，例如多糖(例如纖維素材料如紙和纖維素衍生物，例如醋酸纖維素和硝化纖維素)；聚醚碸；尼龍膜；二氧化矽；無機材料，例如鈍化礬土、硅藻土、MgSO4，或其它均勻分散在多孔聚合物基體中的無機細分散材料，和聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布料，包括天然存在的(例如棉花)和合成的(例如尼龍或人造絲)；多孔凝膠，例如矽膠、瓊脂糖、右旋糖酐和明膠；聚合物薄膜，例如聚丙烯醯胺等。在一個特定的實施方案中，多孔膜23由硝化纖維素和/或聚酯碸材料形成。應當理解術語「硝化纖維素」是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨的硝化纖維素，或硝酸和其它酸的混合酯，例如具有1至7個碳原子的脂族羧酸。
裝置20還可以包含毛細墊28。毛細墊28通常接受已經遷移通過整個多孔膜23的流體。如本領域眾所周知，毛細墊28可能有助於促進毛細作用和流體流過式膜23。
為了開始檢測試樣內部被分析物，使用者可以直接施加試樣至一部分多孔膜23，然後該試樣可以通過其運行。或者，試樣可以首先施加至樣品襯墊(沒有顯示)，其與多孔膜23保持流體聯繫。一些可以用於形成樣品襯墊的合適材料包括但是不局限於硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯襯墊和玻璃纖維過濾紙。如果需要，樣品襯墊還可以包含一種或更多種分析預處理試劑，分散或非分散地與其相連接。
在舉例說明的實施方案中，試樣從樣品襯墊(沒有顯示)行進至與樣品襯墊一端聯繫的綴合墊22。綴合墊22由試樣能夠通過的材料形成。例如，在一個實施方案中，綴合墊22由玻璃纖維形成。雖然僅顯示了一個綴合墊22，應當理解在本發明中還可以使用其它綴合墊。
為了促進精確檢測試樣內部是否存在被分析物，在裝置20的不同位置上施加探針以便檢測和/或標定。在下文中將更詳細地描述，探針通常包含標記有信號產生物質的顆粒或珠子。例如，多種合適的標記物包括但是不局限於生色團；催化劑；螢光化合物；化學發光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接可見標記物，包括膠態金屬(例如金)和非金屬物質顆粒，染色顆粒、酶或底物、或有機聚合物膠乳顆粒；脂質體或包含信號產生物質的其它囊泡等。例如，Litman等人的美國專利號4,275,149中公開了一些適合用作探針的酶，其中內容在這裡全部引入作為各方面參考。酶/底物體系的一個實例是酶鹼性磷酸酶和底物硝基藍四唑鎓-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，或其衍生物或類似物，或底物4-甲基傘形酮醯-磷酸酯。其它合適的標記物可以描述於Jou等人的美國專利號5,670,381和Tarcha等人的美國專利號5,252,459，其中全部公開內容此處引入作為參考。
一些實施方案中，標記物可以包含產生可檢測信號的螢光化合物。螢光化合物可以是螢光分子、聚合物、樹枝狀聚合物、顆粒等。合適的螢光分子的一些實例例如包括但是不局限於螢光黃、銪螯合物、藻膽蛋白、若丹明和其衍生物和類似物。視覺上可檢測的有色化合物也可以用作標記物，從而提供樣品中被分析物的存在或濃度的直接染色讀數，不需要其它的信號產生試劑。
通常，用感興趣的被分析物的特異性結合元件修飾探針顆粒以形成綴合探針。特異性結合元件是指特異結合對的成員，所述特異結合對即兩種不同的分子，其中一種分子化學和/或物理結合至第二種分子。例如，免疫活性特異結合元件可以包括抗原、半抗原、適配子(aptamers)、抗體、和其絡合物，包括由重組DNA方法或肽合成形成的。抗體可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白質或其混合物(一種或多種)或片段(一種或多種)，以及抗體和其它特異性結合元件的混合物。該抗體的製備細節和其用作特異性結合元件的適合性是本領域熟練技術人員公知的。其它常見特異性結合對包括但是不局限於生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和植物血凝素、互補核苷酸序列(包括探針和DNA雜交分析中使用的用於檢測目標核酸序列的捕獲核酸序列)、互補肽序列，包括由重組方法形成的、效應物和受體分子、荷爾蒙和荷爾蒙結合蛋白、酶輔因子和酶、酶抑制劑和酶等。此外，特異結合對可以包括原始特異性結合元件的類似物。例如，可以使用被分析物的衍生物或片段即被分析物類似物，只要它具有至少一種與被分析物相同的表位。
可以使用多種公知的技術中的任何一種連接該特異性結合元件至顆粒。例如，可以使用羧基、氨基、醛基、溴乙醯基、碘乙醯基、硫醇、環氧基和其它反應性或連接官能團，以及殘留自由基和自由基陽離子，共價連接特異性結合元件至顆粒，通過其可以完成蛋白質偶聯反應。還可以加入表面官能團作為官能化共單體，因為顆粒表面可以包含相對高表面濃度的極性基團。此外，雖然經常在合成後官能化顆粒，但在某些情況下，例如聚(硫苯酚)，該顆粒能夠直接和蛋白質共價連結，不需要進一步改性。例如，參考圖2，舉例說明了一個共價綴合顆粒的本發明實施方案。如圖所示，綴合的第一步是使用碳化二亞胺活化顆粒表面上的羧基。第二步驟中，活化羧酸基與抗體的氨基反應形成醯胺鍵。活化和/或抗體偶聯可以在緩衝劑例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(例如，pH＝7.2)或2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH＝5.3)中進行。如圖所示，然後例如可以用乙醇胺封端得到的中空顆粒，以封閉任何留下的活化點。總之，該方法形成綴合物，其中抗體共價連接至顆粒。除共價鍵之外，其它連接技術，例如物理吸附，也可以用於本發明。
再次參考圖1，分析裝置20還可以包含檢測區31，在其上固定能夠結合至綴合探針的接受材料。例如，在一些實施方案中，接受材料可以是生物學接受材料。該生物學接受材料是本領域熟知的，可以包括但是不局限於抗原、半抗原、抗體、蛋白質A或G，抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、二級抗體和其絡合物。有時候，期望生物學接受材料能夠結合至探針上存在的特異性結合元件(例如抗體)。此外，還期望它可以利用多種非生物材料用於接受材料。例如，在一些實施方案中，接受材料可以包括聚合電解質。聚合電解質可以具有淨正電荷或負電荷，以及通常中性的淨電荷。例如，一些具有淨正電荷的聚合電解質的合適實例包括但是不局限於聚賴氨酸(可從Sigma-Aldrich Chemi cal Co.，Inc of St.Louis，MO.商購)，聚乙烯亞胺；環氧氯丙烷-官能化多胺和/或聚醯氨基胺，例如聚(二甲胺-共-環氧氯丙烷)；聚二烯丙基二甲基氯化銨；陽離子纖維素衍生物，例如纖維素共聚物或接枝有季銨水溶性單體的纖維素衍生物等。在一個特定的實施方案中，可以使用CelQuatSC-230M或H-100(可從National StarchChemical，Inc.得到)，其是包含季銨水溶性單體的纖維素衍生物。此外，一些具有淨負電荷的聚合電解質合適實例包括但是不局限於聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，鈉鹽)等。還應該理解也可以使用其它聚合電解質，例如兩性聚合電解質(即具有極性和非極性部分)。例如，一些合適的兩性聚合電解質實例包括但是不局限於聚(苯乙烯基-b-N-甲基2-乙烯基吡啶鎓碘化物)和聚(苯乙烯基-b-丙烯酸)，兩者都可以從PolymerSource，Inc of Dorval，Canada獲得。
接受材料用作被分析物/探針絡合物的靜止結合點。具體地，被分析物，例如抗體、抗原等通常具有兩個結合點。到達檢測區31時，這些結合點的一個被綴合探針的特異性結合元件佔據。然而，被分析物的自由結合點可以結合至固定的接受材料。當結合至固定接受材料時，絡合的探針形成新三元夾層絡合物。
檢測區31通常可以提供許多不同的檢測區，使得用戶可以更好地測定試樣內部特定被分析物的濃度。每個區域(region)可以包含相同的接受材料，或可以包含不同的接受材料用於捕獲多種被分析物。例如，檢測區31可以包括兩個或更多不同的檢測區(例如直線、點等)。檢測區可以在基本上垂直於試樣流過式分析裝置20的方向以線的形式布置。同樣地，在一些實施方案中，檢測區可以在基本上平行於試樣流過式分析裝置的方向以線的形式布置。
雖然檢測區31可以指示被分析物的存在，但是單獨使用檢測區31經常難於測定試樣內部被分析物的相對濃度。因此，分析裝置20還可以包括標定區32。在該實施方案中，標定區32在多孔膜23上形成，並位於檢測區31下遊。標定區32具有能夠結合至任何通過膜23長度的未捕獲探針的接受材料。在標定區32中使用的接受材料可以與檢測區31使用的接受材料相同或不同。此外，類似於檢測區31，標定區32還可以在任何方向提供任何數量的不同的校正區域，使得使用者可以更好地測定試樣內部特定被分析物的濃度。每個區域可以包含相同的接受材料，或可以包含不同的接受材料用於捕獲不同探針。
校正區域可以是預載在多孔膜23上具有不同量的接受材料，以便探針遷移時每個校正區域產生不同的信號強度。可以利用不同尺寸校正區域和/或改變每個校正區域中接受材料濃度或體積來改變每個校正區域內部結合劑的總量。如果需要，分析設備20可以使用過量探針，使得每個校正區域達到其全部和預定的信號強度潛能。也就是說，沉積在校正區域上的探針量是預定的，因為校正區域上使用的接受材料量設置在預定的已知水平。
不考慮分析設備的準確結構，綴合探針包含所關心被分析物的特異性結合元件。結果，綴合探針在接觸被分析物時能夠與被分析物絡合。不幸地，試樣中存在的被分析物量有時可能超過特異性結合元件提供的絡合位點數。通常，該未絡合被分析物將與絡合被分析物競爭位於檢測區31的接受材料。為了抑制該「鉤狀效應」，本發明利用優先的和非特異性的結合。具體地，由於其互相的高親合性，探針的特異性結合元件優先與被分析物結合。當特異性結合元件被完全佔據時，則試樣中未絡合被分析物可自由進行另外的結合。
因此，根據本發明，未絡合被分析物經歷「非特異性的」結合。「非特異性的」結合泛指被分析物與不是被分析物特異性結合元件的分子或表面的分子間吸引。非特異性的結合可以以各種方法完成。例如，在一個實施方案中，通過兩個疏水性域(例如表面、分子等)之間的吸引出現非特異性的結合。即，雖然包含被分析物的試樣可以是水基的，但被分析物本身包含疏水性域。因此，未絡合被分析物的疏水性域可以非特異地與另一個疏水性域經過疏水性吸引而結合。疏水性相互作用通常描述水性環境中非極性基團/分子/表面之間的吸引。人們相信疏水作用主要通過與從疏水性表面釋放水分子相關的自由能獲得而出現，即接觸疏水性表面的水分子處於與整體相中水分子相比自由能較差的狀態。更詳細的疏水作用論述公開於Israelachvili and Wennerstrom，Nature，1996，379，219-225；Israelachvili，Intermolecular and Surface Forces(第二版)，Academic Press，1991；Van Oss，Int erfacial Forces in AqueousMedia，Marcel Dekker，1994。除疏水作用之外，也可能出現其它非特異性的結合。例如，靜電引力例如氫鍵或離子鍵可以發生以降低鉤狀效應。
為了避免降低分析設備的準確度，通常期望使用的非特異性的結合技術能夠區分絡合和未絡合被分析物。大多數實施方案中，該區別是通過尺寸區分來完成的。例如，綴合探針可以包含孔隙，其足夠大以令更小的未絡合被分析物經過，但是足夠小以阻擋更大的絡合被分析物。例如，孔隙可以具有低於約100納米的平均尺寸，在一些實施方案中約5至約100納米，在一些實施方案中，約0.1至約60納米。通過包含某個尺寸的孔隙，綴合探針可以區分絡合和未絡合被分析物，僅令未絡合被分析物通過。
此外，在一些實施方案中，綴合探針還可以是「中空」的，即，單獨限定中空內部，其構成約20％至約100％，和在一些實施方案中，約30％至約100％的被探針佔據的空間體積。即，每個中空探針相當大的空間體積部分保留空的。存在中空內部可以提供很多好處。例如，在一些實施方案中，顆粒內表面可以是相對疏水性的。結果，當未絡合被分析物移動通過孔隙時，可以經過疏水性相互作用非特異地與疏水性內表面結合。在一個實施方案中，中空探針是膠乳基空心珠子，由聚丙烯酸殼聚合物和聚苯乙烯核聚合物形成。聚苯乙烯核聚合物形成可以非特異地與未絡合被分析物結合的疏水性內表面。雖然該吸引不如被分析物和特異性結合元件之間形成的鍵堅固，但人們相信該吸引仍然足夠強至抑制未絡合被分析物以後與檢測區的絡合被分析物競爭。然而，應該了解如果需要，內表面還可以是親水性的。
此外，有時未絡合被分析物可解被捕俘在中空探針內表面內部。該情況中，未絡合被分析物可能不與絡合被分析物競爭檢測區的結合部位，不論是否存在相當大的非特異性結合。例如，在一個實施方案中，中空探針可以包含親水性的內表面和疏水性或外表面。雖然一些未絡合被分析物將非特異地與外表面結合，但它還可以捕俘在內部親水性表面內。此外，進入探針中空區域的未絡合被分析物可以簡單地被減慢，因此它僅在絡合被分析物與其中包含的接受材料結合後，達到檢測區31。
當使用時，中空探針的形狀通常可以改變。例如，在一個特定實施方案中，中空探針是球形。然而，應當理解其它形狀也可以用於本發明，例如板、杆、盤、條、管、不規則形狀等。此外，中空探針的尺寸也可以改變。例如，中空顆粒的平均尺寸(例如直徑)可以為約0.1納米至約1,000微米，在一些實施方案中，約0.1納米至約100微米，在一些實施方案中，約1納米至約10微米。例如，通常需要「微米級」顆粒。當使用時，該「微米級」顆粒可以具有約1微米至約1,000的平均尺寸，在一些實施方案中約1微米至約100微米，在一些實施方案中，約1微米至約10微米。同樣地，還可以使用「納米級」顆粒。該「納米級」顆粒可以具有約0.1至約10納米的平均尺寸，在一些實施方案中約0.1至約5納米，在一些實施方案中，約1至約5納米。
雖然如上所述顆粒的形狀和尺寸可以改變，經常要求顆粒是「單分散的」，因為給定膠體分散體內部的顆粒具有大致相同的尺寸和/或形狀。由於其通常均勻的性質，單分散的中空探針可以提供改進的可靠性和可重現性。
除了其尺寸和形狀，形成中空探針的材料(一種或多種)也可以改變。中空探針可以例如是有機和/或無機性質，並可以是聚合物、低聚物、分子等。例如，中空顆粒可以由聚合物例如聚苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯聚合物或共聚物、偏二氯乙烯/丙烯腈共聚物等形成。其它合適的中空聚合顆粒可以描述於Kowalski等人的美國專利號4,427,836；Craig等人的US4,480,042；Mc Donald等人的US4,973,670；Choi等人的US5,618,888；Blankenship等人的美國專利號6,139,961，其全部內容在此引入作為參考。可以使用的其它中空顆粒包括無機材料例如玻璃中空顆粒。例如，ECCOSPHERES是衍生自可從Emerson and Cuming Composite Materials，Inc商購的硼矽酸鈉的中空玻璃顆粒。衍生自無機材料的其它代表性的中空顆粒包括例如得自Miyoshi Kasei，Inc商品名為「SILICA BEADS S700」的矽石中空微球體。其它中空無機顆粒的實例描述於Radin等人的美國專利號6,416,774，其中內容此處引入作為參考。
在一個特定實施方案中，中空顆粒可以由一種或多種天然或合成乳膠聚合物形成。該膠乳基中空顆粒的實例描述於Jones等的美國專利號5,663,213，其中內容此處全部引入作為參考，和可從RohmHaas of Philadelphia、賓夕法尼亞商購得到，商品名為SunSpheres。』213專利描述該膠乳基中空顆粒(一般尺寸為「微米級」)用於防護日光的能力。然而，本發明人還發現膠乳基中空顆粒在分析設備中具有出乎意外的用途。
膠乳基中空顆粒一般包含核聚合物和殼聚合物。用於形成核和殼聚合物的單體通常可以改變。例如，可以選擇殼聚合物以提供足以支持顆粒空洞的高玻璃化轉變溫度(Tg)，例如大於約50℃，在一些實施方案中大於約60℃，在一些實施方案中，大於約70℃。可以用於形成殼聚合物的合適單體實例包括但不限於非離子烯屬不飽和單體、包含至少一個羧基的單烯屬不飽和單體等。
形成核聚合物的單體可以包括一種或多種包含至少一個羧基的單烯屬不飽和單體。在一些實施方案中，例如至少約5wt％核聚合物的單烯屬不飽和單體包含至少一種羧酸，基於核單體總重量。包含至少一個羧基的合適單烯屬不飽和單體實例包括但不限於(甲基)丙烯酸、丙烯醯氧基丙酸、(甲基)丙烯醯氧基丙酸、衣康酸、烏頭酸、馬來酸或酸酐、富馬酸、巴豆酸、馬來酸單甲基酯、富馬酸單甲基酯、衣康酸單甲基酯等。在這裡使用的術語「(甲基)丙烯酸」是包括丙烯酸和甲基丙烯酸的通用表達。
在一個實施方案中，共聚合包含至少一個羧酸基團的單烯屬不飽和單體與一種或多種非離子(例如不具有可電離的基團)烯屬不飽和單體。一些合適的非離子烯屬不飽和單體包括但不限於苯乙烯、乙烯基甲苯、乙烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、丙烯腈、(甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯酸的(C1-C20)烷基或(C3-C20)鏈烯基酯，例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸苄基酯、(甲基)丙烯酸月桂基酯、(甲基)丙烯酸油基酯、(甲基)丙烯酸棕櫚基酯、(甲基)丙烯酸硬脂基酯等。
核聚合物和/或殼聚合物可以任選包含約0.1wt％至約20wt％，在一些實施方案中，約0.1wt％至約3wt％多烯屬不飽和單體，基於聚合物全部單體重量。該不飽和單體的實例包括但不限於二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、(甲基)丙烯酸烯丙基酯、二(甲基)丙烯酸1，3-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸二甘醇酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯或二乙烯基苯。如果需要，核聚合物和/或殼聚合物可以包含約0.1wt％至約60wt％丁二烯，基於聚合物全部單體重量。
為了在膠乳顆粒中產生空洞，一般用包含一種或多種揮發性組分的溶脹劑膨脹核。溶脹劑滲透殼以溶脹核。然後可以通過乾燥膠乳顆粒除去溶脹劑的揮發性組分，從而導致在膠乳顆粒內形成空洞。雖然不需要如此，但溶脹劑可以是水溶性鹼。合適的水溶性鹼實例包括但不限於氨水、氫氧化銨、鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉或揮發性胺例如三甲胺或三乙胺。還可以用其它方法除去模板核，例如在高溫鍛燒或通過使核材料溶解的化學反應。
除了核-殼中空顆粒，還可以使用其它公知的技術形成中空顆粒。例如，Caruso等人的美國專利號6,479,146描述了使用靜電力形成的中空顆粒，其中內容此處引入作為參考。特別地，使用模板靜電的層-層(「LBL」)沉積納米顆粒-聚合物多層形成中空顆粒，隨後除去模板核。模板顆粒可以例如包含有機聚合物膠乳，例如聚苯乙烯或苯乙烯共聚物膠乳。
模板顆粒交替地塗有聚電解質分子和納米顆粒。聚電解質通常是具有可離解基團的聚合物，所述基團可以是聚合物鏈的成分或取代基。納米顆粒一般是陶瓷顆粒，例如二氧化矽、二氧化鈦和二氧化鋯，任選摻雜有其它金屬氧化物；磁性顆粒，例如Fe3O4；磁光顆粒；氮化(nitridic)陶瓷顆粒，例如Si3N4，碳化(carbidic)陶瓷顆粒；金屬顆粒，例如金、銀和鈀；含硫或含硒(selene)顆粒，例如硫化鎘、硒化鎘等。
在一個實施方案中，在施加納米顆粒和聚電解質交替層或交替的納米顆粒層之前，模板顆粒首先用幾層電性相反的陽離子和陰離子聚電解質塗覆。通常，模板顆粒塗有至少兩個直至最多六個電性相反的陽離子和陰離子聚電解質的層，例如具有三個層。最外面的聚電解質層通常相對於待沉積納米顆粒具有相反的電荷。在大多數實施方案中，模板顆粒在塗布完成後至少部分解體。它們可以溶解在合適的溶劑中和/或熱溶解(例如通過煅燒至至少約500℃的溫度)。在溶解模板顆粒後，殘留的中空殼由納米顆粒材料和任選聚電解質材料組成。
如果需要，可以改性靜電形成的顆粒以便在至少一個層中含有孔隙。可以由聚電解質或納米顆粒本身形成該孔隙。例如，沉積聚電解質使用的高鹽濃度的介質可以導致殼壁的強滲透性。另一方面，用於沉積納米顆粒(例如SiO2)的高鹽濃度介質可能產生低滲透性的納米顆粒。因此，通過調節沉積介質中鹽的濃度，按照需要可以控制殼的滲透性。此外，通過選擇分解核的條件例如通過選擇煅燒過程中的溫度和加熱條件，可以改變殼的滲透性能。
通常，根據本發明可以構建多種流過式分析設備。在這方面，現在將更詳細地描述本發明的多種實施方案。然而，應該了解，以下討論的實施方案僅僅是示例性的，其它實施方案也可以用於本發明。例如，參見圖3，顯示了一個其中的檢測探針41包含中空顆粒的特定實施方案。該實施方案中，檢測探針41用於綴合墊22，因此當接觸試樣時能夠流過設備20(方向箭頭L指示)。檢測探針41與被分析物A的特異性結合元件90綴合，以致接觸被分析物A時，探針41優先與其絡合形成被分析物/探針絡合物49。此後，任何殘留被分析物進入探針41內部(未顯示)，此處它可以非特異地與探針內表面結合或捕俘於其中。
然後探針/被分析物絡合物49從綴合墊22流過多孔膜23，直至它們達到檢測區31，在此它們與接受材料91例如抗體結合，形成夾層絡合物53。因為未絡合被分析物捕俘在探針41內部，它不能與絡合被分析物競爭接受材料。因此，在檢測區31，可以根據檢測探針41的信號強度確定被分析物的量。如果需要，設備20還可以使用流向標定區32的校正探針43，其與接受材料(未顯示)例如聚電解質結合。該情況下，可以由在標定區32的校正探針43的信號強度校準檢測區31的信號強度。可以目視測量信號強度或通過設備的輔助裝置，例如螢光讀數器測量信號強度。
雖然多種設備結構的實施方案已經如上所述，但應該了解，本發明設備通常可以具有任何所需結構，並且不必包含如上所述全部成分。多種其它設備結構和/或分析格式例如描述於Lambotte等的美國專利號5,395,754；Jou等人的美國專利號5,670,381；Malick等人的美國專利號6,194,220，其中內容此處全部引入作為參考。
參考下列實施例可以更好地理解本發明。
實施例1
提供了SunSphereTM中空顆粒(可從RohmHaas獲得)。顆粒具有約26％的固體含量和300納米的平均測量尺寸(基於SEM和顆粒篩分器)。圖6中顯示出該中空顆粒的SEM照片。用2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩衝劑(MES，pH＝5.3)洗滌500微升顆粒溶液兩次，每次1毫升。向1毫升顆粒/MES緩衝溶液加入30毫克碳二亞胺(Polysciences，Inc.)。旋轉令反應進行10分鐘。
然後從反應溶液中分離中空顆粒，並用1毫升硼酸鹽緩衝劑洗滌。加入1毫克螢光染料，即(5-(和-6)-((N-(5-氨基戊基)氨基)羰基)四甲基若丹明-(四甲基若丹明屍胺)至硼酸鹽緩衝溶液。恆定旋轉下令反應進行1小時。反應完成後，排除上清液並用硼酸鹽緩衝劑洗滌中空顆粒，直到上清液變清以除去任何游離螢光染料。然後在1毫升硼酸鹽緩衝劑中再懸浮中空顆粒作為貯液。從貯備溶液中取出100微升並在500微升硼酸鹽緩衝劑中稀釋。向中空顆粒溶液加100微升單克隆抗體Mab 5811(BiosPacific，6.4毫克每毫升)，並令反應在恆定旋轉下進行超過56小時。用200微升乙醇胺結束反應，用PBS緩衝劑洗滌中空顆粒，最後保存在500毫升包含0.1摩爾PBS、0.15摩爾NaCl、1％BSA、5％丙三醇和0.1％NaN3的存儲緩衝劑中。
實施例2證明了根據本發明形成橫流式分析的能力。最初，層壓MilliporeHF120硝化纖維素膜到相應的長度大約為30釐米的支撐卡片上。將CelQuat100-H(可從National StarchChemical，Inc.獲得的纖維素聚電解質衍生物)水溶液汽提到膜上形成控制線。將C-活性蛋白的單克隆抗體Mab 5804(1毫克每毫升，從BiosPacific，Inc.獲得)固定到多孔膜樣品上以形成檢測線。然後在37℃下乾燥膜樣品1小時。在膜一端連接纖維素纖維毛細墊(Millipore Co.)並切成4mm的半試條。
將半粘試條投入各微孔中，其中混合實施例1的20微升螢光中空探針綴合物和20微升CRP抗原溶液或20微升TBS緩衝劑。包含緩衝劑的微孔作為陰性對照物，而包含CRP抗原的微孔作為陽性樣品。當分析完成時，取出半粘條，然後使用Fluorolog IIISpectrof luoremeter(SPEX Industries，Inc.Edison，NJ)以直角模式測量檢測線上的螢光強度。檢測線上的螢光強度直接與抗原的夾層絡合物的數量相關，因此直接與CRP抗原的濃度相關。
結果示於下表1中，其中「I」代表螢光中空探針的信號強度。將陰性對照物的信號強度背景，並將其從包含CRP被分析物的樣品信號強度中減去。應當注意到，甚至在5000納克每毫升的被分析物濃度下，也沒有觀察到鉤狀效應。
表I信號強度結果
實施例3為了對比，形成不利用根據本發明的非特異性結合的分析設備。最初，通過用2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩衝劑(MES，pH＝5.3)洗滌125微升藍色膠乳顆粒(可從Bangs Laboratory，Inc.獲得，10％，尺寸0.3微米)兩次(每次1毫升)，形成綴合膠乳珠粒。將膠乳顆粒再懸浮到500微升MES緩衝劑中。將50毫克碳化二亞胺溶解到500微升MES緩衝劑中，然後和500微升膠乳顆粒溶液混合。令活化反應進行30分鐘。從反應溶液分離顆粒後，用硼酸鹽緩衝劑洗滌兩次。將顆粒再懸浮到1毫升硼酸鹽緩衝劑中，加入45微升單克隆CRP抗體Mab 5811，並進行反應2.5小時。用1毫升乙醇胺淬滅膠乳顆粒30分鐘，此外用PBS緩衝劑洗滌兩次，最後保存在1毫升儲存緩衝劑中。
為了形成該分析設備，將Millipore HF120硝化纖維素膜層壓到長度大約為30釐米的相應支撐卡片上。將CelQuat100-H(可從National StarchChemical，Inc.獲得的纖維素聚電解質衍生物)水溶液汽提到膜上形成控制線。將C-活性蛋白的單克隆抗體Mab5804(1毫克每毫升，從BiosPacific，Inc獲得)固定到多孔膜樣品上以形成檢測線。然後在37℃下乾燥膜樣品1小時。在膜一端連接纖維素纖維毛細墊(Millipore Co.)並切成4mm的半試條。將半粘試條投入各微孔，其中混合19微升2％Tween 20溶液和1微升綴合膠乳珠粒及20微升CRP抗原溶液或20微升TBS緩衝劑。包含緩衝劑的微孔作為陰性對照物，同時包含CRP抗原的微孔作為陽性樣品。
當分析完成時，取出半粘條，並用基於反射比的讀數器測量檢測線上的強度。結果顯示於圖4，其中顯示出強度(檢測線範圍內的像素)對被分析物濃度。如圖所示，「鉤狀效應」出現在低CRP濃度，即約250至500納克每毫升。
實施例4為了對比，形成不利用根據本發明的非特異性結合的分析設備。最初，通過綴合尺寸為40納米的金顆粒(在530納米波長，吸收率＝1)和單克隆抗體Mab 5811形成探針。為了形成該分析設備，將MilliporeHF120硝化纖維素膜層壓到長度大約為30釐米的相應支撐卡片上。將CelQuat100-H(可從National StarchChemical，Inc.獲得的纖維素聚電解質衍生物)水溶液汽提到膜上形成控制線。將C-活性蛋白的單克隆抗體Mab 5804(1毫克每毫升，從BiosPacific，Inc獲得)固定到多孔膜樣品上以形成檢測線。然後在37℃下乾燥膜樣品1小時。在膜一端連接纖維素纖維毛細墊(Millipore Co)並切成4mm的半試條。將半粘試條投入各微孔，其中混合19微升2％Tween 20溶液和1微升綴合金顆粒及20微升CRP抗原溶液或20微升TBS緩衝劑。包含緩衝劑的微孔作為陰性對照物，同時包含CRP抗原的微孔作為陽性樣品。
當分析完成時，取出半粘條，並用基於反射比的讀數器測量檢測線上的強度。結果顯示於圖5，其中顯示出強度(檢測線範圍內的像素)對被分析物濃度。如圖所示，「鉤狀效應」出現在低CRP濃度，即約250至500納克每毫升。
雖然本發明已經參考其特定實施方案進行了詳細描述，但本領域技術人員在理解上述內容後，可以容易地想出上述實施方案的各種變化及等同物。因此，本發明範圍應該由所附權利要求和其等價物確定。
權利要求
1.一種檢測試樣中被分析物的存在或量的方法，該方法包括i)提供一種流過式分析裝置，該裝置包括與能夠產生檢測信號的檢測探針聯繫的多孔膜，所述檢測探針與被分析物的特異性結合元件綴合，所述多孔膜限定接受材料被固定於其中的檢測區；ii)使包含被分析物的試樣與所述綴合的檢測探針接觸，以便形成被分析物/探針絡合物和未絡合被分析物；iii)令所述未絡合被分析物經歷非特異性結合；和iv)在所述被分析物/探針絡合物和所述檢測區內的所述接受材料之間形成三元絡合物，其中所述接受材料保持相對不含所述未絡合被分析物。
2.權利要求1的方法，其中所述未絡合被分析物非特異地結合至存在於所述綴合檢測探針的至少一部分上的域上。
3.權利要求2的方法，其中包含所述域的綴合檢測探針單獨限定中空的內部，其構成約20％至約100％被所述探針佔據的空間體積，所述探針具有內表面和外表面。
4.權利要求3的方法，其中所述內表面包括所述域。
5.權利要求3的方法，其中所述綴合檢測探針具有球形。
6.權利要求3的方法，其中所述綴合檢測探針由核聚合物和殼聚合物形成。
7.權利要求3的方法，其中通過靜電層沉積形成所述綴合檢測探針。
8.權利要求2的方法，其中所述域是疏水性的。
9.權利要求1的方法，其中所述綴合檢測探針限定了平均尺寸小於約100納米的孔隙。
10.權利要求1的方法，其中所述綴合檢測探針的平均尺寸為約0.1納米至約100微米。
11.權利要求1的方法，其中所述綴合檢測探針包含選自生色團、催化劑、螢光化合物、化學發光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接可見標籤、脂質體和其組合的物質。
12.一種檢測試樣中被分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供一種流過式分析裝置，該裝置包括與能夠產生檢測信號的檢測探針聯繫的多孔膜，所述檢測探針與被分析物的特異性結合元件綴合併單獨限定中空的內部，其構成約20％至約100％被所述探針佔據的空間體積，所述探針具有內表面和外表面，所述多孔膜限定接受材料被固定於其中的檢測區；ii)使包含被分析物的試樣與所述綴合的檢測探針接觸，以便形成被分析物/探針絡合物和未絡合被分析物；iii)令所述未絡合被分析物非特異地結合至所述綴合檢測探針的內表面；和iv)在所述檢測區內在所述被分析物/探針絡合物和所述接受材料之間形成三元絡合物，其中所述接受材料保持相對不含所述未絡合被分析物。
13.權利要求12的方法，其中至少一部分所述內表面是疏水性的。
14.權利要求12的方法，其中所述綴合檢測探針限定了平均尺寸小於約100納米的孔隙。
15.權利要求12的方法，其中所述綴合檢測探針具有球形。
16.權利要求12的方法，其中所述綴合檢測探針由核聚合物和殼聚合物形成。
17.權利要求12的方法，其中通過靜電層沉積形成所述綴合檢測探針。
18.權利要求12的方法，其中所述綴合檢測探針的平均尺寸為約0.1納米至約100微米。
19.一種用於檢測試樣中被分析物的存在或量的流過式分析裝置，所述流過式分析裝置包括與能夠產生檢測信號的檢測探針聯繫的多孔膜，所述檢測探針和被分析物的特異性結合元件綴合，並被配置為當與試樣中的被分析物接觸時與其結合，以便形成被分析物/探針絡合物和未絡合被分析物，所述綴合檢測探針進一步包含能夠非特異結合至所述未絡合被分析物的域，所述多孔膜限定接受材料被固定於其中的檢測區，其被配置為結合至所述被分析物/探針絡合物，其中所述綴合檢測探針能夠在所述檢測區內產生檢測信號，以便根據所述檢測信號確定試樣內被分析物的量。
20.權利要求19的流過式分析裝置，其中包含所述域的所述綴合檢測探針單獨限定中空的內部，其構成約20％至約100％被所述探針佔據的空間體積，所述探針具有內表面和外表面。
21.權利要求20的流過式分析裝置，其中所述內表面包括所述域。
22.權利要求20的流過式分析裝置，其中所述綴合檢測探針具有球形。
23.權利要求20的流過式分析裝置，其中所述綴合檢測探針由核聚合物和殼聚合物形成。
24.權利要求20的流過式分析裝置，其中通過靜電層沉積形成所述綴合檢測探針。
25.權利要求19的流過式分析裝置，其中所述域是疏水性的。
26.權利要求19的流過式分析裝置，其中所述綴合檢測探針限定了平均尺寸小於約100納米的孔隙。
27.權利要求19的流過式分析裝置，其中所述綴合檢測探針的平均尺寸為約0.1納米至約100微米。
28.權利要求19的流過式分析裝置，其中所述綴合檢測探針包含選自生色團、催化劑、螢光化合物、化學發光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接可見標籤、脂質體和其組合的物質。
全文摘要
提供了檢測試樣中被分析物的存在或量的基於膜的分析裝置。該裝置利用包含所感興趣的被分析物的特異性結合元件的綴合探針。當互相接觸時，該特異性結合元件優先與試樣內的被分析物絡合。保持與特異性結合元件未絡合的過量被分析物經歷非特異結合例如至疏水性域。結果，未絡合被分析物與裝置檢測區中的絡合被分析物的競爭能力受到限制。因此，以簡單、有效和相對便宜的方式控制「假陰性」的發生率。
文檔編號G01N33/543GK1761880SQ200480007328
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月3日 優先權日2003年4月3日
發明者衛寧, 黃延賓, 楊開元 申請人:金伯利-克拉克環球有限公司