豬輪狀病毒疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建的製作方法

2023-10-29 15:52:52

專利名稱：豬輪狀病毒疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因領域，具體涉及豬輪狀病毒VP4、VP7疫苗候選基因的原核表 達及其真核表達載體的構建。
背景技術：
豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus, PRV)屬弧腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，是引起 仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一。PRV主要存在於病豬及帶毒豬的消化道，隨糞便排到外界環境後，汙染飼料、淨水、 墊草及土壤等，經消化道途徑使易感豬感染。排毒時間可持續數天，嚴重汙染環境，加之病 毒對外界環境有頑強的抵抗力，使輪狀病毒(Rotavirus，RV)在成豬、中豬、仔豬之間反覆 循環感染，長期紮根於豬場。因此，快速準確的診斷和有效免疫預防是本病防制的關鍵。病 毒外衣殼蛋白VP4和VP7是RV的主要免疫保護性抗原，由其刺激機體產生的抗體對中和病 毒、消除感染起主要作用；並且這兩個基因的克隆及表達，對於製備新型疫苗和特異性診斷 抗原具有重要意義。近年來，國內外眾多學者都深入開展了新型輪狀病毒疫苗的研究工作，並取得了 新的進展，但是輪狀病毒納米疫苗的研製目前還沒有報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種豬輪狀病毒VP4、VP7疫苗候選基因的原 核表達及其真核表達載體構建的方法，以克服現有技術的缺點和不足。為達到上述目的，本發明採用以下技術方案來實現所述豬輪狀病毒VP4、VP7疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建方 法，包括豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達、輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表 達載體PFastbacl重組載體的構建及轉染，以及輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl 15 表達載體PPIC9K重組載體的構建。所述豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達的方法，具體如下從豬肺中提取總RNA，根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白 VP4基因核酸序列設計引物，經RT-PCR擴增得到豬VP4基因的編碼區，插入pMD18_T載體 中；再經限制性內切酶BamHI和B10I雙酶切，將回收的片段插入原核表達載體pGEX_4T_l 中，命名為PGEX-4T-1-VP4 ；重組質粒pGEX_4T-l_VP4轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細 胞，經IPTG誘導、SDS-PAGE電泳分析，得到分子量為58KDa的重組融合蛋白；經超聲破碎 後，SDS-PAGE電泳分析其為包涵體。所述輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl重組載體的構建 及轉染方法，具體如下根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白VP4、VP7基因核酸序列設計引物，用RT-PCR方法擴增出PRV的核衣殼蛋白VP4、VP7基因；將得到的豬VP4、 VP7基因的編碼區插入pMD 18-T載體中；再經限制性內切酶EcoRI和Β ο I雙酶切，將 回收的VP4、VP7基因片段克隆到昆蟲表達載體PFastbacl上，將重組質粒分別命名為 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 ；將 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 質粒分別轉 化入DHlOBacl感受態細胞中，使其與輔助質粒發生轉座重組；通過藍白斑篩選、PCR鑑定 結果表明獲得了含有輪狀病毒基因的杆狀病毒的陽性重組子；純化該線性杆狀病毒重組子 使其轉染昆蟲細胞，3d後收穫重組病毒，根據細胞形態變化及PCR鑑定表明重組病毒轉染 sf9細胞成功；收集病毒上清，將其含有VP4、VP7病毒上清分別命名為Al、Bl ；分別將Al、 Bl代病毒接種於sf9中，待細胞大量病變後收收集細胞，PCR鑑定為陽性病毒，其上清分別 命名為A2、B2代病毒。所述輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl 15表達載體PPIC9K重組載體的構建 方法，具體如下根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白VP4、VP7基因核酸序列 設計引物，用RT-PCR方法擴增出PRV的核衣殼蛋白VP4、VP7基因片段；將得到的豬VP4、 VP7基因的編碼區插入pMD18-T載體中；再經限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切，將回收 的VP4、VP7基因片段克隆到酵母細胞表達載體PPIC9K上，將其命名為PPIC9K-3-VP4、 PPIC9K-3-VP7。所述豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達的方法在蛋白的大量純化中的應用。所述輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl重組載體的構建 及轉染方法在昆蟲細胞sf9中蛋白表達及疫苗的研製中的應用。所述輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl 15表達載體PPIC9K重組載體的構建 方法在畢赤酵母細胞中表達蛋白中的應用。本發明選取編碼VP4的基因片段，採用帶有GST標籤序列的pGEX-4T-l原核表達 載體，獲得了表達。GST促進融合蛋白的表達，使GST和VP4共同被誘導表達。在GST與VP4 蛋白之間存在凝血酶酶切位點，可以將GST從融合蛋白中切除，從而進一步純化目的蛋白， 這為下一步豬輪狀病毒疫苗研究奠定基礎。本發明所表達的目的蛋白是以包涵體的形式表達於細胞質中。這種方式可以獲得 大量目的蛋白，但是因以包涵體形式存在的目的蛋白在翻譯過程中不能正確摺疊，而且翻 譯後不能經過糖基化，故很少具有生物活性。包涵體只有在體外經過充分變性、復性重摺疊 後才能恢復正常的生物活性。蛋白經簡單變性、洗滌和復性後可作抗原用。本發明對PRVVP4、VP7基因的克隆和杆狀病毒轉染成功，為以後VP4、VP7基因在昆 蟲細胞sf9中的表達奠定了基礎。獲取的基因除了可以用於PRV基因結構和不同血清型間 基因差異的研究，還可以用於製備探針檢測PRV和進行RV分型。該基因的真核表達產物具 備天然的蛋白特性，可以作為檢側PRV特異性的診斷抗原以及多血清型基因工程疫苗的必 備成分，避免了以活病毒做抗原和疫苗的局限性和危險性。同時，VP4、VP7基因的克隆與表 達，為進一步研究PRV的分子生物學特性奠定了基礎。本發明對PRV VP4、VP7基因在PPIC9K質粒的克隆成功，為以後VP4、VP7畢赤酵母 GS15細胞中的表達奠定了基礎。目的基因在畢赤酵母GS115中表達可以克服在大腸桿菌 中表達蛋白修飾不足而影響其功能的缺陷，同時在畢赤酵母GS115中蛋白表達相對於昆蟲細胞表達等其他真核細胞表達的費用相對較低，適合大規模的發酵培養表達、生產目的 蛋白，為以後疫苗的生產開闢途徑。但其表達的蛋白在功能與在哺乳動物細胞及昆蟲細胞 表達的蛋白之間有無差距還有待於進一步研究。獲取的基因除了可以用於PRV基因結構和 不同血清型間基因差異的研究，還可以用於製備探針檢測PRV和進行RV分型。同時，VP4、 VP7基因的克隆與表達，為進一步研究PRV的分子生物學特性奠定了基礎。


圖1為PRV VP4基因PCR擴增結果，其中M :DNA marker DGL 2000，1 陰性對照， 2 :VP4基因PCR產物。圖2為PMD18-T-VP4菌落PCR篩選結果，其中M :DGL 2000，1-4 菌落PCR產物。圖 3 為 PMD18—T-VP4 測序結果。圖4為PGEX-4T-1-VP4菌落PCR篩選結果，其中M :DGL 2000，1-4 菌落PCR產物。圖5為重組載體和輪狀病毒VP4基因檢測結果，其中M Ikb DNAladder Marker, 1 :PGEX-4T-lBamH I and XhoI 酶切，2 :PGEX-4T-l_VP4BamH I and XhoI 酶切，3 :VP4PCR產 物。圖6為IPTG誘導蛋白檢測結果，其中M 低分子量標準蛋白；1 =GST, 2-3 PGEX-4T-1-VP4誘導結果；4未誘導菌。圖7為IPTG誘導蛋白檢測結果，其中M 低分子量標準蛋白；1_3分別為;3h、4hjh 誘導結果；4-5 超聲離心後沉澱和上清。圖8為PMD18-2-VP4菌落PCR篩選結果，其中M :DL 2000 ； 1-2 菌落PCR產物。圖 9 為 PMD 18-2-VP7 酶切檢測結果，其中 M :DL 2000 ；1-2 :PMD18-2_VP7EcoRI 和 XhoI酶切。圖 10 為 PFastbacl-2_VP4 菌落 PCR 篩選結果，其中 M :DL 2000 ； 1-4 菌落 PCR 產 物。圖 11 為 P! astl3acl-2-VP7 菌落 PCR 篩選結果，其中 M :DL 2000 ;1_4 菌落 PCR 產 物。圖12為重組質粒酶切檢測結果，其中M :1KB Ladder DNA Marker, 1 PFastBacl-2-VP7EcoRI 和 XhoI 酶切；2 :PFastbacl-2_VP4EcoRI 和 XhoI 酶切。圖 13 為 PFastBacl-2_VP4，PFastBacl-2_VP7 酶切檢測結果。圖14VP7測序檢測結果。圖15為sf9單層對照細胞。圖16為sf9單層轉染細胞。圖17為VP4病毒液PCR檢測結果。圖18為VP7病毒液PCR檢測結果。圖19為PPIC9K-VP4基因PCR擴增結果。圖20為PPIC9K-VP7基因PCR擴增結果。圖 21 為 PPIC9K-3-VP4 和 PPIC9K-3-VP7 菌落 PCR 篩選結果。圖22為重組質粒酶切檢測結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。實施例1豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達1.材料1.1病料、菌株及質粒病料PRV肺組織，本實驗室保存。菌株感受態細胞T0P10、BL21 (DE3) (gen印low Ltd)。質粒質粒載體pMD 18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司，原核表達載 體PGEX-4T-1質粒由山東農業大學動物遺傳實驗室惠贈。1. 2酶和主要試劑酶AMV反轉錄酶、rTaq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內 切酶BamHI，Xhol等購自NEB公司。主要試劑TRNZOL-A+購自天根公司；RNA酶抑制劑RNase、DNAMarkerDL2000.DNA Marker DL10000、小量膠回收試劑盒(Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0)，均購 自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白腖、酵母提取物購自OXXID LTD。Tris鹼購自鼎國； Goldview染料購自賽百盛。1. 3抗生素氨苄青黴素用ddH20配製成100mg/ml，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存備用； 卡那黴素(Kan)用ddH20配製成100mg/ml，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存備用；慶 大黴素(Gen)用ddH20配製成7mg/ml，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，-20°C保存備用；四環素 (Tet)用ddH20配製成10mg/ml，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存備用。1. 4X-gal用N，N- 二甲基甲醯氨配製成100mg/ml，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C避光保存備用。1. 5IPTG用ddH20製成100mol/L，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C避光保存備用。1. 6主要儀器設備Sigma低溫離心機，BIO-RAD PCR擴增儀，DYY-III穩壓穩流電泳儀(北京六一儀 器廠)，HZS-H水浴振蕩器，37°C恆溫培養箱，紫外凝膠成像分析系統(UVP公司，英國)，紫 外分光光度計(Pharmacia BiotechINC)，SK-1渦旋快速混勻器等。2.方法2. IPRV肺組織中RNA的提取RNA提取按TRNZOL-A+提取總RNA說明書進行。2. 2PRV-VP4 基因 RT-RCR 擴增2.2. 1引物的設計與合成根據Genebank上公布的PRV-VP4基因序列設計一對引物，並引入BamHI，Xhol位 點，標記為VP4-F、VP4-R，其序列如下，斜體為酶切位點。預期擴增VP4基因產物長度為 881bp，引物由上海生物工程有限公司合成。VP4-F/R 序列
VP4-F-AGCAGGATCCATGGCTTCGCTCATTTATAGACAVP4-R-TAACCTCGAGTAACCTCGAGGACCATTTATAACCCAATCC2. 2. 2 反轉錄20 μ 1反應體系如下PRV 病毒 RNA5. 0 μ 15 X Reverse transcriptase Buffer 4. 0 μ 1dNTP Mixture (IOmmo 1/L)Ι.ΟμΙVP4-R(10ymol/L)Ι.ΟμΙRNase 抑制劑Ι.ΟμΙAMV Reverse Tanscriptase (5U/μ L) Ι.ΟμΙDEPC 處理水7· O μ 1在冰上混合後，室溫lOmin，42°C Ih後冰上冷卻2_;3min ；_20°C保存備用。2. 2. 3PCR 反應PCR 反應體系(50 μ 1)模板(cDNA)2. O μ 110 X Buffer (Mg2+free)5. O μ 1MgSO44· O μ 1dNTP (IOmM)Ι.ΟμΙVP4-F(10yM)2. O μ 1VP4-R(10yM)2. O μ 1rTaq g|0. 5 μ 1ddH2033. 5 μ 1在冰上混合。PCR反應條件94°C預變性:3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90s，循環 35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中IOOV電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2.3目的片段的回收按小量膠回收試劑盒說明書進行目的片段的回收。2. 4感受態細胞的製備用CCMB80化學法製備感受態細胞，菌種為大腸桿菌E. Coli TOPlO及BL21 (DE3)。2. 5PMD18-T與目的片段的克隆2. 5. 1連接T載體在10 μ 1體系下，按pMD 18-T載體連接試劑盒說明如下PMD18-T1 μ 1VP44μ 1SlutionI5μ 1於冰上混合後，16°C連接過夜。2. 5. 2 轉化
(1)將T0P10感受態細胞從_70°C冰箱內取出，快速融化，冰浴15min。0)5 μ 1連接產物加100 μ 1 Τ0Ρ10感受態中，冰浴30min。(3)42°〇熱激9086(；，冰浴 1 2min。(4)加800 μ 1無抗生素的LB液體培養基，37°C搖床上培養1小時。(5)4500r/min離心％iin，預留200 μ 1左右上清懸浮沉澱，取100 μ 1均勻塗布於 含IPTG、X-gal和Amp的LB瓊脂平板上。(6) 37°C先正置培養30min再倒置培養14 16h。2. 5. 3陽性質粒克隆篩選在PCR管中各加入17. 2μ 1的ddH20，用接種環挑取白色菌落接到含有17. 2μ 1的 ddH20的PCR管中，沸水煮5min，低速離心後冰浴，以此做模版。PCR反應體系(25 μ 1)如下模板17. 2μ1IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgC12(25mM)2. 0 μ 1dNTP (IOmM)Ι.ΟμΙrTaq(5U/l)酶0. 3 μ 1VP4-F(10yM)Ι.ΟμΙVP4-R(10yM)Ι.ΟμΙPCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，循環 35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況，並拍照保存，陽性克隆命名為PMD18-T-VP4。2. 5. 4陽性克隆的序列測定挑取一個陽性菌落接種於3ml含Amp的LB液體培養基中，37°C振蕩培養12_14h 後送上海生物工程有限公司測序。2. 6目的基因的原核重組表達載體的構建和鑑定2. 6. 1 原核表達載體 pGEX-4T-l載體pGEX-4T-l的啟動子為tac啟動子，具有Amp抗性，誘導表達的蛋白以GST形 式表達。2. 6. 2 抽提質粒 PMD18-T-VP4，pGEX_4T_l用小量質粒回收試劑盒提取質粒。2. 6. 3酶切1)PMD18-T-VP4質粒酶切體系如下質粒20. Ομ IOXbuffer 3. 0 μ 110XBSA3. 0 μ 1BamHI2. 0 μ 1XhoI2. 0μ 1加水至40μ 1，37°C水浴3-4小時。2) pGEX-4T-l質粒酶切體系如下0138]質粒0139]IOXbuffer0140]10XBSA15. 0μ 1 3. Ομ 1 3. Ομ 1 2. Ομ 1 2. Ομ 10141]BamHI0142]XhoI加水至40μ 1，37°C水浴3-4小時。用膠回收試劑盒分別回收目的片段，方法同2. 3。2. 6. 4 連接酶切純化回收後的pGEX-4T-13 μ 1，VP4 基因產物 5 μ 1, Buffer for T41ul, T4 連 接酶1μ1，16 連接過夜。2. 6. 5 轉化連接物轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，步欒同2. 5. 2。2. 6. 6陽性重組質粒篩選鑑定1)菌落PCR篩選在PCR管中各加入17. 2μ 1的ddH20，用接種環挑取白色菌落接到含有17. 2μ 1的 ddH20的PCR管中，沸水煮5min，低速離心後冰浴，以此做模版。PCR反應體系(25 μ 1)如下模板17. 2μ110 X Buffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgCl2 (25mM)2. 0 μ 1dNTP(IOmM)1. 0μ 1r^TaqGU/yl)酶0· 3 μ 1VP4-F(10yM)1. 0μ 1VP4-R(10yM)1. 0μ 1PCR反應條件94"C預變性5min，94°C變性30s，60"C退火30s，72°C延伸60s，循環 35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況，將含有該目的片段的質粒命名為PGEX-4T-1-VP4。2)陽性重組質粒酶切鑑定質粒pGEX-4T-l-VP45. 0 μ 1IOXbufferΙ.ΟμΙ10XBSAΙ.ΟμΙBamHI0. 5 μ 1XhoI0. 5μ 1ddH202 μ 1反應總體積為10 μ 1，37°C，水浴3小時。取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠 中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠成像系統觀察擴增情況。3)pGEX-4T-l-VP4陽性重組質粒測序挑取一個陽性菌落接種於3ml含Amp的LB液體培養基中，37°C振蕩培養12_14h後送上海生物工程有限公司測序。2. 7 重組菌 pGEX-4T-l-VP4 誘導表達(1)挑取陽性重組菌pGEX-4T-l-VP4的單菌落，接種於3mL含Amp (50 μ g/μ 1)的 LB液體培養基中，於37°C搖床中200rpm過夜培養。(2)按1 100稀釋到含Amp的LB液體培養基中，37°C 200rpm振搖培養至對數生 長期0D600約0. 5-0. 8，加入終濃度為1. OmM的IPTG，其中有一管未加IPTG作為對照。(3) 370C 200r/min振搖誘導培養3、4、釙後分別收集菌液。2. 8表達蛋白的SDS-PAGE電泳(1)各取出200μ 1菌液4500rpm離心4min，棄上清。(2)菌體沉澱用200μ IddH2O洗一次，4500rpm離心％iin，棄上清。(3)沉澱各用 20 μ 1 的 ddH20 溶解，加入 20 μ 1 2 X protein loading buffer (還 原型)，沸水煮5min，取20ul左右上樣。(4)80伏電壓電泳20-3011^11後加大電壓至120伏到電泳結束。(5)用考馬斯亮藍染液浸泡凝膠，在脫色搖床上染色約1小時。(6)染色液回收，凝膠用水衝洗後，加入脫色液，在搖床上平緩搖動脫色至條帶顯 現。2. 9重組蛋白可溶性分析挑取陽性重組菌的單菌落，接種於3mL含Amp的LB液體培養基中，37°C活化過夜 後，1 100稀釋到IOOml含Amp的LB液體培養基中，37°C 200r/min振搖培養至對數生長 期0D600約0. 5-0. 8，加入終濃度為1. OmM的IPTG，37°C 200r振搖誘導培養4- 收集菌體。將菌體用20ml PBS洗2次，然後用PBS懸浮細菌，經超聲波裂解，12000r離心 15min,沉澱也用20ml PBS溶解，分別取適量超聲後上清和沉澱加2倍上樣緩衝液，煮沸裂 解5min，用10%的聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。3.結果分析3. 1PRV-VP4 蛋白基因的 RT-RCR 擴增豬輪狀病毒(PRV)肺組織所提取的RNA，經RT-PCR擴增，得到一段約890bp的片 段，與預期結果一致，見圖1。3. 2PMD18-VP4 菌落 PCR 檢測結果挑4個白色菌落PCR檢測結果，有兩個菌落為陽性，得到一段約890bp的片段，與 預期結果一致，見圖2。3. 3陽性克隆的測序結果VP4基因PCR產物與PMD 18-T連接轉化後，篩選的陽性克隆測序結果如下，從中可 以看出此基因已成功引入了 BamHI (GGATCC)，XhoI (CTCGAG)酶切位點，結果如圖3所示。3. 4重組原核表達載體的菌落PCR篩選與酶切鑑定PMD18-T-VP4質粒與原核表達載體pGEX_4T_l經BamHI和XhoI酶切、回收、連接 後，通過菌落PCR鑑定，結果4個菌落有3個為陽性，PCR產物大小為890bp，如圖4所示。所得的重組質粒pGEX-4T-l-VP4經BamHI和XhoI酶切鑑定，結果出現約5000bp 和890bp的條帶，為陽性質粒，如圖5所示。
3. 5pGEX-4T-l陽性克隆的測序結果VP4基因PCR產物與pGEX_4T_l連接轉化後，篩選的陽性克隆測序結果與3. 3相 同，從中可以看出此基因已成功引入了 BamHI (GGATCC)，XhoI (CTCGAG)酶切位點。3. 6重組菌誘導表達重組菌pGEX-4T-l-VP4經IPTG誘導4h後，10 % PAGE的SDS-PAGE電泳分析，所得 重組融合蛋白的分子量約58KDa，其中GST大小為^KDa,目的蛋白大小約為32KDa，與預期 結果相同，見圖6所示。3. 7重組蛋白可溶性分析重組菌pGEX-4T-l-VP4經IPTG分別誘導3、4、5h，於3、4、5h時分別收集菌液，10% 的SDS-PAGE電泳分析，誘導3、4、證蛋白表達量相差不大。重組菌體超聲裂解後，經10% 的SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白在超聲後沉澱中，上清液中沒有，說明重組蛋白為包涵體， 見圖7所示。實施例2輪狀病毒基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl重組載體的構建及轉 染1.材料1.1病料、菌株及質粒病料豬肺組織(PRV)菌株同實施例1細胞昆蟲細胞sf9由本實驗室保存(Invitrogen)。質粒昆蟲表達載體PFastbacl由本實驗室保存，其餘同實施例1。1. 2酶和主要試劑酶K0D-Plus酶購自碩盟生物，其餘同實施例1。主要試劑同實施例1。1.3培養基及試劑配製SFX-insect培養基購自大連寶生物公司。其餘同實施例1。1.4主要儀器設備同實施例1。2.方法2. IPRV肺組織中RNA的提取同實施例1。2. 2引物的設計與合成根據Genebank上公布的豬輪狀病毒VP4、VP7基因序列設計一對引物，並引入 EcoRI，XHOI位點，上遊序列弓丨入GCCACCATGG序列。下遊序列引入6個組氨酸序列，標記為 2-VP4-F、2-VP4-R ；2-VP7_F、2_VP7-R序列如下，斜體為酶切位點。重組載體轉座重組後檢 測引物標記為M13-F、M13-R。引物由上海生物工程有限公司合成。昆蟲細胞sf9細胞表達載體擴增引物2-VP4-F :CGCAGAATTCGCCACCATGGCTTCGCTCATTTATAGACA2-VP4-R :ATCTCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGACCATTTATAACCCAATCC2-VP7-F :CGCAGAATTCGCCACCATGGATGGTATTGAATATACCACAG
2-VP7-R :ATCTCTCGAGCTAGTGATGGTGATGGTGATGTACTCTGTAATAAAATGCAGCM13-F :GTTTTCCCAGTCACGACM13-R :CAGGAAACAGCTATGAC2. 3反轉錄PRV病毒RNA5. Ομ 15 X Reverse transcriptase Buffer4. Ομ 1dNTP Mixture (IOmmo1/L)1· 0μ 12-VP4/VP7-R(10ymol/L)1· 0μ 1RNase抑制劑1· 0μ 1AMV Reverse Tanscriptase(5U/μ L)2. 0μ 1DEPC處理水5. 0μ 1反應體系在冰上混合後，室溫10min，42°C Ih後冰上冷卻2_;3min ；_20°C保存備用。2. 4PCR反應PCR反應體系(50 μ 1)模板(cDNA) 2. 0 μ 110 X Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ 1MgSO4 4· 0 μ 1dNTP (2mM) 5. 0 μ 12-VP4/VP7-F(10yM) 2. 0 μ 12-VP4/VP7-R(10yM) 2. 0 μ 1KOD-Plus 酶(1U/μ L) 2. Ομ 1ddH20 28. Ομ 1在冰上混合。PCR反應條件94"C預變性3min，94°C變性30s，60"C退火30s，68"C延伸90s，循環35次，最後68°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2. 5PMD18-T-2-VP4/VP7 構建2. 5. IPCR 產物沉澱:KOD-Plus酶擴增的PCR產物加十分之一體積的乙酸鈉再加2. 5倍的無水乙 醇，-20°C放置1-2小時，12000rpm離心lOmin，棄上清，70%的乙醇洗一次，烘乾，30 μ 1的 ddH20溶解沉澱。2. 5. 2 加 A 尾反應反應體系(25μ 1)模板5. 0 μ 110 X Buffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgCl2(25mM)1. 5μ 1dATP (IOOmM)0. 5 μ 1BSA (0. 1% )5. 0 μ 1
rTaq 酶0. 3 μ 1ddH2010. 2μ 1PCR產物與反應體系在冰上混合後，72°C lh,加A反應後產物用膠回收試劑盒回 收，方法同實施例1。2. 5. 3PMD18-T 與 PCR 產物連接方法同實施例1。2. 5. 4 轉化連接物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，步欒同實施例1。2. 5. 5陽性克隆質粒挑菌篩選鑑定方法同實施例1，篩選出的陽性重組菌將其命名為PMD18-2-VP4和PMD18-2-VP7。2. 5. 6質粒抽提方法同實施例1。2. 5. 7酶切鑑定質粒PMD18-2-VP4 和 PMD18-2-VP7 酶切體系如下質粒5. 0 μ 1IOXbufferΙ.ΟμΙ10XBSA Ι.ΟμΙEcoRI 0. 5 μ 1Xhol0. 5μ 1ddH20 2 μ 1反應總體積為10μ 1，37°C，水浴3小時，取5μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中 IOOV電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠成像系統觀察擴增情況。2. 6PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 載體構建2. 6.1 酶切質粒PMD18-T-2-VP4 和 PMD18-T-2-VP7 酶切體系如下質粒20. 0 μ 1IOXbuffer4. 0 μ 110XBSA4. 0 μ 1EcoRI2. 0 μ 1XhoI2. Ομ 1加水至40 μ 1，37°C水浴3-4小時。PFastbacl質粒酶切體系如下質粒15. Ομ IOXbuffer3. O μ 1IOXBSA3. O μ 1EcoRI2. O μ 1XhoI2. Ομ 加水至30 μ 1，37°C水浴3_4小時，用膠回收試劑盒分別回收目的片段酶切4 μ g陽 性質粒，方法同實施例1。
2. 6. 2酶切產物回收用小量膠回收試劑盒，同實施例1。2. 6. 3PFastbacl載體與目的基因連接PFastbacl酶切回收產物3 μ 1，PCR酶切回收產物5 μ 1，T4buffer 1 μ 1，T4連接 酶1 μ 1 (總體積lOul)，16°C連接過夜。2. 6. 4 轉化取5μ 1連接產物加到lOOulTOPIO感受態細胞中，同實施例1。2. 6. 5陽性質粒篩選同實施例1，篩選出的陽性重組菌將其命名為Pi^stl3aCl-2-VP4、 PFastbacl-2-VP7。2. 6. 6陽性重組菌序列測定PFastbac 1-2-VP4,PFastbac 1-2-VP7 陽性菌落經 LB 液體培養基培養 14_16h 後送 上海桑尼科技有限公司測序鑑定。2. 7PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 轉座重組載體構建重組載體轉入DHlOBacl感受態細胞後，與細胞內其中一輔助質粒發生轉座重組。2. 7. IDHlOBac感受態細胞的製作方法同實施例1。2. 7. 2重組質粒轉化與轉座方法同實施例1。2. 7. 3重組菌落PCR鑑定篩選取20 μ L菌液3000rpm離心!Bmin後，加ddH20,100°C水浴5min，最後低速離心使液 體集中離心管底部。用轉座重組後載體固有引物M13-F、M13-R以此做模板進行PCR反應。體系(25μ L)如下:模板17. 2μ110 X Buffer (Mg2+free)2. 5 μ 1MgSO44· 0 μ 1dNTP (IOmM)1·0μ1r^TaqGU/yL)酶0. 3 μ 1M13-F(10yM)1·0μ1M13-R(10yM)Ι.ΟμΙPCR 反應條件94°C預變性 3min，94°C變性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 5min，循 環35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2. 7. 4重組質粒抽提方法同實施例1。2. 7. 5重組質粒PCR鑑定篩選PFastbac-VP4和VP7轉座重組質粒稀釋10倍後取1 μ L做模板，引物M13-F、 2-VP4-F分別與M13-R組合檢測VP4轉座重組質粒；M13-F、2_VP7_F分別與M13-R組合PCR檢測VP7轉座重組質粒。模板IOXBuffer (Mg2+free)MgCl2dNTP (IOmM)rTaq (5U/ μ L)酶2-VP4/2-VP7/M13-F(10 μ Μ)M13-R(10yM)1.0μ 1 2. 5μ 12.5μ 1 1. Ομ 1 0. 3μ 1 1· Ομ 1 1· Ομ 1PCR 反應條件94°C預變性 3min，94°C變性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 5min，循 環35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中IOOV電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2. 8昆蟲細胞轉染2. 8. 1昆蟲細胞sf9復甦(1)現將lOmlSFX-insect昆蟲細胞培養基轉移至25cm2培養瓶中，然後加入10% 血清，於27°C培養箱中預熱待用。(2)從液氮中取出細胞管，置37°C水浴中輕輕攪動使其快速融化。
(3)當管內細胞融化後，迅速用75 %酒精棉球擦拭清潔管壁，乾燥後置於冰浴中。(4)直接將細胞懸浮液轉移至準備好的25cm2培養瓶中，於27°C無CO2培養箱中孵 育池，使細胞貼壁。(5)吸棄上清，加入新鮮SFX-insect昆蟲細胞無血清培養基培養3_4天，細胞恢復 好後，用於細胞傳代培養。2. 8. 2昆蟲細胞sf9培養Sf9細胞在復甦培養開始的Mh內，換兩次SFX-insect無血清培養基，3_4天後 細胞長至90%鋪滿培養瓶壁時，超淨臺中，吸棄舊的培養基，加入Iml培養基用無菌吸管吹 打貼壁細胞，使成細胞懸浮狀態。吸棄0. 7ml懸浮液，留0. 3ml於瓶中，同時加入IOml新鮮 的培養基，於27°C CO2的培養箱中培養，3-4天後，繼續同法傳代。2. 8. 3昆蟲細胞sf9凍存(1)在倒置的顯微鏡下觀察，觀察細胞處於對數生長期，切貼壁率達90%以上。(2)以lmlSFX-insect培養基吹打貼壁細胞，使細胞懸浮％ ；然後轉移到離心管中 IOOOrpm離心4min，吸棄上清，加入Iml含有30% FBS和10% DMSO的SFX-insect培養基， 使細胞重新懸浮。(3)現將細胞於4°C冰箱中預冷15-30min，迅速轉移入-20°C冰箱中，30min-lh，再 轉移入液氮罐上層(約-80°C )過夜，最後使其沒入液氮中長期保存。2. 8. 4重組質粒轉染sf9昆蟲細胞株(1)倒置顯微鏡下觀察細胞生長良好，每個視野至少90%細胞貼壁率，在六孔板 中接種約9\105個細胞於^115 乂-^1紹(^無血清培養基中，271培養箱中使細胞貼壁lh。(2)在無菌管中配液溶液A 每次轉染，稀釋1 μ g質粒約1 μ 1於99 μ 1的不含抗生素的SFX-insect培養基中。溶液B 稀釋6 μ 1 cellfectin轉染試劑於94 μ 1的不含抗生素的SFX-insect培養基中。(3)混合兩種溶液，輕輕混勻，室溫孵育15-45min。(4)用2ml不含抗生素的培養基洗孔一次。(5)在A、B混合物中加入0. 8mlSFX-insect培養基輕輕混勻，從六孔板吸出洗液 後覆蓋上述Iml混合物，27°C、無(X)2培養細胞證。(6)移去轉染混合物並用培養基洗孔2次，加入aiilSFX-insect培養基，繼續培養 24-72h。(7)從培養24h開始，每隔24h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，並與沒有轉染的正 常細胞作對照。初步判斷細胞轉染成功與否。待細胞變大脫落並開始破碎時。收集上清， 並低速離心除去溶液中細胞及其碎片。上清液可於4°C避光保存待用，也可於-70中長期保 存待用。含有VP4病毒上清記為Al ；含有VP7病毒上清記為Bi。2. 8. 5PCR鑑定重組病毒將收集Al、Bl的病毒上清取出約100μ 1煮沸5min，冰浴仍卻後，7000rpm離心 IOmin,取上清作模板進行PCR檢測，25 μ IPCR反應體系如下模板2. 0μ 1IOXBuffer (Mg2+free)2. 5μ 1MgCl2 (25mM)4. 0μ 1dNTP(IOmM)1. 0μ 1rTaq(5U/μ L)酶0. 3μ 12-VP4/VP7-F(10yM)1. 0μ 12-VP4/VP7-R(10yM)1. 0μ 1加水至25 μ 1，在冰上混合。PCR反應條件:94°C預變性:3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90S，循環35次，最後72°C延伸IOmin0取5 μ 1擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2. 8. 6重組杆狀病毒感染正常細胞觀察細胞形態，待細胞大量脫落並開始裂解時，收集細胞及上清混合液，IOOOrpm 離心^iin後。取100 μ L、10 μ L、1 μ L病毒液分別加入6孔板中正常的細胞中，含有VP4的 3孔病毒上清分別極為Α2-1、Α2-2、Α2-3 ；含有VP7的3孔病毒上清分別記為Β2-1、Β2-2、 Β2-3。每隔24h觀察細胞形態。待細胞出現變形脫落並開始裂解時，收集細胞並用A2-3、 B2-3上清做PCR檢測。體系及反應條件同上3. 2. 8. 5。2. 8. 7病毒液保存將鑑定為陽性的病毒液，加2%胎牛血清後，與4°C避光保存；如果長期保存要放 於-70°C冰箱中。3.結果分析3. 1PRV-VP4、VP7 基因的 RT-RCR 擴增
PRV肺組織所提取的RNA，經RT-PCR擴增，分別得到約910bp的VP4基因片段和 IOlObp的VP7片段，與預期結果基本一致。3. 2菌落PCR篩選結果PCR產物先用乙醇沉澱後，經過加A尾後，與PMD18-T載體連接轉入T0P10大腸杆 菌後，PMD18-2-VP4挑2個白色菌落進行PCR，PMD18-2-VP7挑4個白色菌落PCR檢測。結 果？1 18-2-￥ 42個白色菌落？0 得到一段約91(^ 的片段；全為為陽性；PMD18-2-VP74個 白色菌落有3個白色菌落為為陽性，得到一段約IOlObp的片段，與預期結果一致。結果見 圖8。3. 3PMD18-2-VP4/VP7 質粒酶切檢測分別選取兩個陽性菌落，接入LB液體培養基培養過夜後，抽提質粒。EcoRI和B10I 內切酶進行雙酶切檢測。結果PMD18-2-VP4經EcoRI和BioI酶切後，只有一個為陽性，產 生2條約2600bp和9 IObp的條帶。PMD18-2-VP7經EcoRI和XhoI酶切後，2個質粒全為陽 性，產生2條約^OObp和IOlObp的條帶。結果證明成功引入了 EcoRI和BioI酶切位點， 結果見圖9。3. 4陽性重組質粒的PCR鑑定選取陽性質粒後，PMD18-2-VP4/VP7質粒和PFastBacl質粒分別用EcoRI和XhoI 內切酶進行雙酶切後，分別用膠回收試劑盒回收目的片段。回收後用T4連接酶進行連接， 然後轉化入TOPlO大腸桿菌中，分別挑去4個菌落用PCR方法進行初步檢測，結果4個菌落 全為陽性，結果見圖10和11。3. 5陽性重組質粒的酶切鑑定分別選取兩個陽性菌落，接入LB液體培養基培養過夜後，抽提質粒。EcoRI和 XhoI內切酶進行雙酶切檢測。結果PFastBacl-2-VP4經EcoRI和BioI酶切後，產生2條約 5200bp 和 910bp 的條帶。PFastBacl-2_VP7 經 EcoRI 和 XhoI 酶切後，產生 2 條約 5200bp 和IOlObp的條帶。結果證明2個質粒全為陽性，並成功引入了 EcoRI和B10I酶切位點，結 果見圖12。3. 6陽性重組質粒測序結果PFastBacl-2-VP4和i^astBacl-2-VP7經PCR和酶切鑑定為陽性後，送上海桑尼科 技有限公司測序鑑定。篩選的陽性克隆測序結果如下，其中包含Kozak序列、6個組氨酸序 列以及引入的EcoRI和XhoI酶切位點。3. 7重組質粒轉座重組後菌落PCR篩選分別挑取9個白色和1個藍色菌落進行菌落PCR鑑定，結果PFastBaCl-2-VP4菌 落有7個明顯為陽性有一條約3200bp大小的條帶，對照藍斑產生約300bp大小條帶，可初 步判定這7個菌落為陽性；FastBacl-2-VP7菌落有6個明顯為陽性有一條約3300bp大小的 條帶，對照藍斑產生約300bp大小條帶，可初步判定這6個菌落為陽性。結果見圖13、14。3. 8陽性轉座重組質粒PCR鑑定分別選取兩個經PCR鑑定為陽性的菌落，培養抽提質粒後，稀釋10倍後做模板， 引物M13-F、2-VP4-F分別與M13-R組合檢測PFastBacl-2_VP4轉座重組質粒，分別產生約 3300bp 和 1440bp 大小條帶；M13-F、2_VP7_F 分別與 M13-R 組合 PCR 檢測 PFastBacl_2_VP7 轉座重組質粒，分別產生約3400bp和1540bp大小條帶，結果與預期結果基本一致。
3. 9PFastBacl-2-VP4/VP7轉座重組質粒杆狀病毒轉染sf9昆蟲細胞轉染後，分別與Mh、48h、96h、120h對照觀察正常細胞和轉染細胞形態變化，4 時，對照細胞形態基本沒有變化，除少量細胞變形死亡外，其他細胞輪廓清晰，大小均一，胞 體明亮。轉染細胞變化明顯，表現為細胞體積增大，邊緣模糊，輪廓不清，病變後細胞大量 脫落、死亡，並逐漸裂解。以上現象初步說明PFastBaCl-2-VP4/VP7轉座重組質粒通過脂質體介導轉染昆 蟲sf9細胞成功，見圖15、16。3. 10 一代和二代重組杆狀病毒感染正常細胞後PCR檢測病變後細胞大量脫落、死亡並逐漸裂解時，收集細胞，低速離心後取上清，100°C煮 5min，用此做模板用於PCR檢測。結果含有VP4/VP7基因的一代和二代病毒都能被檢測到， 結果見圖17、18。實施例3輪狀病毒基因與酵母細胞GSl 15表達載體PPIC9K重組載體的構建1.材料1.1病料、菌株及質粒病料PRRSV肺組菌株同實施例1細胞酵母GSl 15由本實驗室保存質粒酵母表達載體PPIC9K(invitrogen)，其餘同實施例1。1. 2酶和主要試劑酶K0D Plus酶購自碩盟生物，其餘同實施例1。主要試劑同實施例1。1. 3培養基及試劑配製同實施例1。1.4主要儀器設備同實施例1。2.方法2. IPRV肺組織中RNA的提取同實施例1。2. 2PRV-VP4、VP7 基因 RT-RCR 擴增2.2. 1引物的設計與合成根據Genebank上公布的VP4、VP7基因序列設計一對引物，並引入EcoRI、NotI位 點，標記為3-VP4-F、3-VP4-R、3-VP7-F、3-VP7-R，序列如下，斜體為酶切位點，引物由上海生 物工程有限公司合成。昆蟲細胞sf9細胞表達載體擴增引物3-VP4-F
CAGAATTCCATCATCATCATCATCATATGGCTTCGCTCATTTATAGACA3-VP4-R :ATCTGCGGCCGCTCATGACCATTTATAACCCAATCC
3-VP7-F CGCAGAATTCCATCATCATCATCATCATATGTATGGTATTGAATATACCACAG3-VP7-R :ATCTGCGGCCGCCTATACTCTGTAATAAAATGCAGC2. 2. 2反轉錄同實施例1。2. 2. 3PCR 反應PCR反應體系(50 μ 1)模板(cDNA)2. Ομ 1IOXBuffer (Mg2+free)5. 0μ 1MgSO44. Ομ 1dNTP(2mM)5. Ομ 13-VP4/VP7-F(10yM)2. 0μ 13-VP4/VP7-R(10yM)2. 0μ 1KOD-Plus 酶2. 0μ 1(MH2O28. 0μ 1在冰上混合。PCR反應條件94"C預變性3min,94°C變性30s，60"C退火30s，68"C延伸90s，循環35次，最後68°C延伸IOmin0取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠 成像系統觀察擴增情況。2. 3PMD18-T-3-VP4、VP7 載體構建2. 3. IPCR 產物沉澱KOD-Plus酶擴增的PCR產物加十分之一體積的乙酸鈉再加2. 5倍的無水乙 醇，-20°C放置1-2小時，12000r離心lOmin，棄上清，70%的乙醇洗一次，烘乾，30ul的ddH20溶解沉澱。2. 3. 2加A尾反應方法同實施例1。2. 3. 3PMD18-T與PCR產物連接方法同實施例1。2. 3. 4轉化連接物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，步驟同實施例1。2. 3. 5陽性克隆質粒挑菌PCR篩選鑑定方法同實施例1。2. 3. 6質粒抽提方法同實施例1。2. 3. 7酶切鑑定質粒PMD18-3-VP4和PMD18-3-VP7酶切體系如下質粒 5. 0 μ 1IOXbuffer 1. 0μ 1
10XBSAΙ.ΟμΙEcoRI0. 5μ 1NotI0. 5μ 1ddH202. Ομ 1反應總體積為10 μ 1，37°C，水浴3小時。取5 μ L擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中 IOOV電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠成像系統觀察擴增情況。2. 4PIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7 載體構建2. 4. 1 酶切質粒PMD18-T-3-VP4 和 PMD18-T-3-VP7 酶切體系如下質粒15·0μ1IOXbuffer 4. O μ 1IOXBSA4. O μ 1EcoRI2. Ομ 1NotI2. Ομ 1加水至40 μ 1，37°C水浴3-4小時。PPIC9K質粒酶切體系如下質粒15·0μ1IOXbuffer 3. O μ 1IOXBSA3. O μ 1EcoRI 2. O μ 1NotI2. Ομ 1加水至30 μ 1，37°C水浴3-4小時。用膠回收試劑盒分別回收目的片段，方法同實施例1。2. 4. 2酶切產物回收用小量膠回收試劑盒，同實施例1。2. 4. 3PPIC9K載體與目的基因連接PPIC9K載體酶切回收產物3μ 1，PCR酶切回收產物5μ l，T4buffer 1μ1，Τ4連接 酶1 μ 1 (總體積10 μ 1)，16°C連接過夜。2. 4. 4 轉化取5μ 1連接產物加到100 μ 1 TOPlO感受態細胞中，方法同實施例1。2. 4. 5陽性質粒PCR篩選方法同實施例1，篩選出的陽性重組菌將其命名為PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3_VP7。2. 4. 6陽性質粒酶切鑑定質粒PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7，酶切體系如下質粒5·0μ1IOXbuffer1. Ομ 1IOXBSA1. Ομ 1EcoRI0. 5 μ 1NotI0. 5μ 1
ddH202. 0 μ 1反應總體積為10 μ 1，37°C，水浴3小時；取5 μ 1擴增產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中 100V電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠成像系統觀察擴增情況。2. 4. 7陽性重組質粒序列測定PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3_VP7陽性菌落經LB液體培養基培養14_16h後送上海桑 尼科技有限公司測序鑑定。3.結果分析
3. 1PRV-VP4、VP7 基因的 RT-RCR 擴增PRV肺組織所提取的RNA，經RT-PCR擴增，得到一段約IOlObp的VP7和910bpVP4 片段，與預期結果一致，分別見圖19、20。3. 2PMD18-3-VP4/VP7 菌落 PCR 檢測結果挑白色菌落PCR檢測，PMD18-3-VP4挑選3個菌落結果有全為陽性，得到一段約 910bp的片段，與預期結果一致。PMD18-3-VP7挑選2個菌落結果有全為陽性，得到一段約 IOlObp的片段，與預期結果一致。3. 3PMD18-3-VP4/VP7陽性克隆的測序結果VP4、VP7基因PCR產物與PMD18-T連接轉化後，篩選的陽性克隆測序結果如下，從 中可以看出此基因已成功引入了 EcoRI (GAATTC)，NotI (GCGGCCGC)酶切位點。3. 4PPIC9K-3-VP4/VP7重組載體的菌落PCR篩選鑑定結果挑白色菌落PCR檢測，PPIC9K-3-VP4挑選3個菌落結果有全為陽性，得到一段約 910bp的片段，與預期結果一致。PPIC9K-3-VP7挑選4個菌落結果有3個為陽性，得到一段 約IOlObp的片段，與預期結果一致，見如圖21。3. 5 重組載體 PPIC9K-3-VP4/VP7 酶切鑑定分別選取兩個陽性菌落，接入LB液體培養基培養過夜後，抽提質粒。重組載體 PPIC9K-3-VP4,PPIC9K-3-VP4VP7 經 EORI 和 NOtI 內切酶進行雙酶切檢測，PPIC9K-3-VP4 經 EORI和NOtI酶切後，產生2條分別約9300bp和910bp的條帶。PPIC9K-3-VP4VP7經EORI 和NOtI酶切後，產生2條分別約9300bp和IOlObp的條帶。結果證明2個質粒全為陽性， 並成功引入了 EcoRI和NotI酶切位點，結果見圖22。3. 6PPIC9K-3-VP4/VP7陽性質粒的測序結果PPIC9K-3-VP4和PPIC9K_3_VP7經PCR和酶切鑑定為陽性後，送上海桑尼科技有限 公司測序鑑定。篩選的陽性克隆測序結果，其中包含6個組氨酸序列以及引入的EcoRI和 NotI酶切位點，結果與本實施例3. 3相同。最後應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參 照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在 本發明的權利要求範圍中。附本申請中所涉及到的核苷酸/胺基酸序列表 其中SEQ ID No 1 為 PMD18—T-VP4 的序列表。 SEQ ID No 2為引物VP4-F的序列表。SEQ ID No 3為引物VP4-R的序列表。 SEQ ID No 4為引物2-VP4-F的序列表。 SEQ ID No 5為引物2-VP4-R的序列表。 SEQ ID No 6為引物2-VP7-F的序列表。 SEQ ID No 7為引物2-VP7-R的序列表。 SEQ ID No 8為引物M13-F的序列表。 SEQ ID No 9為引物M13-R的序列表。 序列表上海市農業科學院豬輪狀病毒疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建 2PatentIn version 3.3 SEQ ID No 1 887 DNA 豬輪狀病毒(porcine rotavirus) 1GGATCCATGGCTTCGCTCATTTATAGACAACTACTTACTAATTCATACACAGTCAATCTT61CCTGACGAAATTCAAGAGATTGGATCAGCTAAGTCACAGGATGTTACTATAAATCCTGGT121CCATTCGCACAAACAGGTTATGCACCAGTTAATTGGGGAGCAGGTGAGACTAATGACTCC181ACAACTGTCGAGCCGTTATTAGATGGTCCATACCAACCAACCACTTTCAATCCACCAACA241AGCTATTGGGTACTACTTGCGCCAACTGTAGAGGGCGTAATTATTCAAGGAACAAACAAT301ACCGATAGATGGTTGGCCACTATACTAATTGGACCAAACGTACAAACAACTAACAGAATA361TACAATCTTTTTGGTCAGCAAGTAACTTTATCGGTGGAGAATACGTCACAGACACAATGG421AAGTTCATTGATGTGAGTACAACTACGCCAACAGGAAGTTATACGCAGCACGGACCATTG481TTCTCTACACCAAAATTATACGCTGTAATGAAATTCAGTGGTAGAATATATACATATAAT541GGAACCACACCAAACGCAACAACAGGATACTATTCAACTACTAATTATGACACAGTAAAT601ATGACATCATTTTGTGATTTTTATATTATACCAAGAAATCAAGAAGAAAAATGTACTGAG661TATATCAATCATGGATTACCTCCTATACAAAATACAGGGAATGTTGTGCCAGTATCTTTA721TCGGCTAGAGAGATAGTGCACACAAGAGCTCAAGTTAATGAGGATATTGTTGTTTCAAAA781ACTTCACTTTGGAAAGAAATGCAATGCAACAGAGACATAACCATAAGATTCAAATTTGAT841AGAACAATTATTAAAGCTGGAGGATTGGGTTATAAATGGTCCTCGAGSEQ ID No 233DNA 豬輪狀病毒(porcine rotavirus) AGCAG GATCC ATGGC TTCGC TCATT TATAG ACA 1 5 10 15 20 25 30
權利要求
1.豬輪狀病毒VP4、VP7疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建方法，其特 徵在於包括豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達、豬輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞 sf9表達載體PFastbacl重組載體的構建及轉染，以及豬輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細 胞GSl 15表達載體PPIC9K重組載體的構建。
2.根據權利要求1所述的豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達的方法，其特徵在於， 所述豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達如下從豬肺中提取總RNA，根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白VP4基 因核酸序列設計引物，經RT-PCR擴增得到豬VP4基因的編碼區，插入pMDIS-T載體中；再經 限制性內切酶BamHI和B10I雙酶切，將回收的片段插入原核表達載體pGEX_4T_l中，命名 為pGEX-4T-l-VP4 ；重組質粒pGEX_4T-l_VP4轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，經IPTG 誘導、SDS-PAGE電泳分析，得到分子量為58KDa的重組融合蛋白；經超聲破碎後，SDS-PAGE 電泳分析其為包涵體。
3.根據權利要求1所述的輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl 重組載體的構建及轉染方法，其特徵在於，所述豬輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表 達載體PFastbacl重組載體的構建及轉染如下根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白VP4、VP7基因核酸序列設計 引物，用RT-PCR方法擴增出PRV的核衣殼蛋白VP4、VP7基因；將得到的豬VP4、VP7基因的 編碼區插入PMD18-T載體中；再經限制性內切酶EcoRI和BioI雙酶切，將回收的VP4、VP7 基因片段克隆到昆蟲表達載體PFastbacl上，將重組質粒分別命名為PFastbaCl-2-VP4、 PFastbac 1-2-VP7 ；將 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 質粒分別轉化入 DHlOBacl 感受 態細胞中，使其與輔助質粒發生轉座重組；通過藍白斑篩選、PCR鑑定結果表明獲得了含有 輪狀病毒基因的杆狀病毒的陽性重組子；純化該線性杆狀病毒重組子使其轉染昆蟲細胞， 3d後收穫重組病毒，根據細胞形態變化及PCR鑑定表明重組病毒轉染sf9細胞成功；收集 病毒上清，將其含有VP4、VP7病毒上清分別命名為A1、B1 ；分別將A1、B1代病毒接種於sf9 中，待細胞大量病變後收收集細胞，PCR鑑定為陽性病毒，其上清分別命名為A2、B2代病毒。
4.根據權利要求1所述的輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl15表達載體PPIC9K 重組載體的構建方法，其特徵在於，所述豬輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl 15表達載 體PPIC9K重組載體的構建如下根據GeneBank上公布的豬輪狀病毒病毒PRV核衣殼蛋白VP4、VP7基因核酸序列設計 引物，用RT-PCR方法擴增出PRV的核衣殼蛋白VP4、VP7基因片段；將得到的豬VP4、VP7基因 的編碼區插入PMD18-T載體中；再經限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切，將回收的VP4、VP7 基因片段克隆到酵母細胞表達載體PPIC9K上，將其命名為PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7。
5.根據權利要求2所述的豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達的方法在蛋白的大量 純化中的應用。
6.根據權利要求3所述的輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl 重組載體的構建及轉染方法在昆蟲細胞sf9中蛋白表達及疫苗的研製中的應用。
7.根據權利要求4所述的輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GSl15表達載體PPIC9K 重組載體的構建方法在畢赤酵母細胞中表達蛋白中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRV)VP4、VP7疫苗候選基因的原核表達及其真核表達載體的構建方法，包括豬輪狀病毒VP4基因的克隆與原核表達、輪狀病毒VP4、VP7基因與昆蟲細胞sf9表達載體PFastbacl重組載體的構建及轉染，以及輪狀病毒VP4、VP7基因與酵母細胞GS115表達載體PPIC9K重組載體的構建。
文檔編號C12R1/19GK102041266SQ200910197158
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月14日 優先權日2009年10月14日
發明者易建中, 肖長峰 申請人:上海市農業科學院