環狀的Apelin類似物的製作方法
2023-10-20 22:47:37
Apelin基因編碼一種77個胺基酸的前原蛋白，該蛋白被加工產生由36、17或13個胺基酸組成的生物活性肽(分別為apelin-36、apelin-17和apelin-13)。兩種主要的亞型是apelin-13和apelin-36。Apelin受體APJ是一種G-蛋白偶聯受體(GPCR)。典型apelin-激活的APJ信號涉及激活百日咳毒素敏感的G-蛋白(Gi或Go)，導致cAMP產生減少，同時激活磷脂酶C、蛋白激酶C和細胞外信號調節激酶1和2。見O』Carroll等人(J.ofEndocrinology(2013)219，R13～R35)對於apelin信號的最近的綜述。此外，apelin相關的APJ激活導致β-抑制蛋白(β-arrestin)的募集(Lee等人，BiochemBiophysResCommun，2010；395：185～189)。如Ma和Pei所作綜述(J.CellScience(2007)120，213～218)，抑制蛋白形成一組支架蛋白，這些支架蛋白不僅調節受體的脫敏和內化，而且激活GPCR的其它的非G-蛋白依賴的下遊信號通路。例如，在應答特定的GPCR激活時，β-抑制蛋白從細胞質轉移到細胞核，在靶基因的啟動子處與轉錄輔因子如p300和cAMP-應答元件結合蛋白(CREB)結合，啟動轉錄。β-抑制蛋白也在細胞質內與轉錄因子的調節子如ΙκΒα和MDM2相互作用，間接調節轉錄。這種β-抑制蛋白介導的轉錄調節，似乎在細胞生長、凋亡和免疫功能調控中起到重要作用。與血管緊張素原和血管緊張素受體的模式相同，apelin和APJ廣泛表達於動物器官組織勻漿物中。Apelin廣泛分布於中樞神經系統CNS和外周神經系統，尤其是在心臟、腎臟、肺和乳腺。在脂肪細胞、胃黏膜、內皮細胞和肝巨噬細胞(肝臟Kupffer細胞)，檢測到apelin-樣的免疫反應性。Apelin-13是APJ受體的內源性配體，以0.37nM的EC50值激活該G蛋白偶聯受體(apelin-17及apelin-36的EC50值分別為2.5nM和20nM)。它主要作用於周圍和中樞神經系統，在調節心血管功能、體液平衡、高血壓和胰島素敏感性時發揮重要作用。與apelin-36不同，apelin-13不阻斷人類免疫缺陷病毒進入細胞。Apelin-13和apelin-36與APJ的結合抑制毛喉素誘導的cAMP產生，介導非Ras依賴的細胞外信號調節激酶(ERK)的激活。Apelin-13和apelin-36的結合都導致APJ內化，APJ可以再循環到細胞表面外層(Zhou,N等，2003APJ.Virology307，22～36)。外源性給予apelin改變心血管功能、血壓、體溫、體液和涉及攝食量和飲水量等行為。幾種人類心血管疾病伴有心血管組織中apelin和/或APJ的表達變化。在動物研究中，apelin發揮舒張血管和增強心肌收縮力作用(正性肌力作用)。Apelin激活內皮型一氧化氮合酶，從而刺激血管內皮細胞釋放一氧化氮。Apelin也改善病理狀態下心臟功能預後，如實驗性缺血和再灌注損傷(Lee,D.K.，George,S.R.和O』Dowd,B.F.(2006)TrendsinPharmacologicalSciences27，190～194)。然而，由於Apelin多肽短暫的循環壽命，這些心血管效應也是短暫的。在現有技術中已有人試圖提高apelin的半衰期。例如，WO2012/125408公開了一種聚乙二醇化的Apelin，包含一個或多個聚乙二醇分子(PEG)可操作地連接在一個Apelin的N-末端的至少一個胺基酸殘基上。相對於非聚乙二醇化的Apelin，發現聚乙二醇化的Apelin具有延長的循環壽命和收縮能效應。另一種提高apelin半衰期的方法涉及環狀突變體的產生。例如，apelin12的大環突變體(1-12；1-7；7-12)已經被製成，它們表現出對毛喉素誘導環磷酸腺苷(cAMP)累積的劑量依賴性抑制作用，最大的效果通過百日咳毒素(PTX)處理而幾乎消失(Hamada,J.(2008)InternationalJournalofMolecularMedicine.22，547～552)。然而，相比於pE-apelin13，所有的環狀類似物的活性都有幾個數量級的減少。WO2013/111110公開了用於治療心臟衰竭的合成的apelin模擬物。Apelin突變體包括環狀結構，其中胺基酸側鏈通過硫化、二硫鍵或醯胺鍵連接在一起。因此，需要一種改進的Apelin類似物，以提高它們的循環壽命和其他有益的特性。特別是，可取的是，這種類似物具有增加的半衰期，並具有一個不同的生物學活性，比如它可以用於選擇性地調節APJ受體激活的其他通路。例如，感興趣的是，有一種類似物，能夠通過cAMP活性表現出顯著的(激動性的)信號，但在誘導β-抑制蛋白募集、APJ受體內化和/或下調時不如內源性激動劑有效，這樣的生物學活性是增強的。相反地，鑑於β-抑制蛋白介導的轉錄調節和它在細胞生長、凋亡和免疫功能調控方面的作用，更有效激活抑制蛋白募集的突變體也提供有趣的偏向性激動劑。特別是，作用於β-抑制蛋白募集和Gi/Go激活可能導致不同的作用和/或細胞內不同動力學的效果。抑制蛋白似乎不通過Akt途徑，而Gi/Go則通過。G-蛋白依賴的ERK激活似乎是迅速並短暫的，可以被百日咳毒素或PKA抑制劑阻斷。相比之下，β-抑制蛋白依賴的ERK激活開始更慢，持續更久，且對於β-抑制蛋白缺失敏感，而對Gi/PKA抑制或Gs的缺失不敏感(LanMa2006)。Gi/Go激活MAPK和抑制蛋白支架對MAPK的作用對於ERK在細胞質/細胞核的分布有不同影響，產生不同結果的細胞命運。很驚訝的發現，通過提供新的環形apelin化合物，其特徵為通過一個跨越2、3、4或5個胺基酸殘基的硫醚橋，以產生空間限制的生物活性多肽，至少上述目標中的一些得到了滿足。例如，向apelin中引入一個硫醚橋，在信號活性保持的同時，導致其在細胞質中的穩定性增加2至8倍。而且，許多有趣的突變體被確認，它們與天然的apelin比較，相對於抑制蛋白，在cAMP介導的信號上表現出顯著增加或減少。因此，本發明提供了一種apelin類似物，由一種多肽組成或者該多肽的醯胺、酯或鹽，該多肽的通式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，包含一種結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸橋，或者一種結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸橋，其中X1是該多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg；X2不存在或選自pGlu、Gln和Ala；X3是Arg或Ala；X4是Pro、Ala、Pro-(me)Lan、Pro-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X5是Arg、Ala、(me)Lan、Dhb、Arg-(me)Lan、Arg-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X6是Leu、Ala、(me)Lan、Dhb、Leu-(me)Lan、Leu-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X7是Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-(me)Lan、Ala-Dhb、Dhb-Ala或(me)Lan-Ala；X8是His、Ala、(me)Lan、Dhb、His-(me)Lan、His-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X9是Lys、Ala、(me)Lan、Dhb、Lys-(me)Lan、Lys-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X10是Gly、Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan；X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X13不存在或選自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan；X14是C-末端，且不存在或選自Phe和Ala，除非X13不存在；其中Dhb是脫氫氨基丁酸；(me)Lan是Lan或meLan，其中Lan表示羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)的半個N-或C-末端，meLan表示甲基羊毛硫氨酸(Abu-S-Ala或Ala-S-Abu)的半個N-或C-末端；其條件是：(i)該類似物最多包含兩個Ala殘基；(ii)該序列X4至X13包含一對meLan或一對Lan，其共同形成(甲基)羊毛硫氨酸橋；並且(iii)其中所述的(甲基)羊毛硫氨酸橋的大小為i、i+3；i、i+4；i、i+5；或i、i+6；優選i、i+3或i、i+4；其中「i」表示參與硫醚橋形成的N-末端胺基酸殘基(例如X4)，且其中「i+…」表示參與硫醚橋形成的C-末端胺基酸殘基(例如，在i+3的情況下，為X7)。在一個實施方案中，X1是該多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg；X2不存在或選自pGlu、Gln和Ala；X3是Arg或Ala；X4是Pro、Ala、Pro-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X5是Arg、Ala、(me)Lan、Arg-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X6是Leu、Ala、(me)Lan、Leu-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X7是Ala、(me)Lan、Ala-(me)Lan或(me)Lan-Ala；X8是His、Ala、(me)Lan、His-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X9是Lys、Ala、(me)Lan、Lys-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X10是Gly、Ala、(me)Lan或Ala-(me)Lan；X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan；X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan；X13不存在或選自Pro、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan；X14是C-末端，且不存在或選自Phe和Ala，除非X13不存在；其中(me)Lan是Lan或meLan，其中Lan表示羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)的半個N-或C-末端，meLan表示甲基羊毛硫氨酸(Abu-S-Ala或Ala-S-Abu)的半個N-或C-末端；其條件是：(i)該多肽最多包含兩個Ala殘基；(ii)該X4至X13序列包含共同形成甲基羊毛硫氨酸橋的一對meLan，或共同形成羊毛硫氨酸橋的一對Lan；並且(iii)所述的(甲基)羊毛硫氨酸橋的大小為i、i+3；i、i+4；i、i+5；或i、i+6；其中「i」表示參與硫醚橋形成的N-末端胺基酸殘基(例如X4)，且其中「i+…」表示參與硫醚橋形成的C-末端胺基酸殘基(例如，在i+3的情況下，為X7)。換句話說，大小為i、i+3；i、i+4；i、i+5；或i、i+6表示在環下面有2個、3個、4個或5個殘基。發現一個大小為i、i+1的(甲基)羊毛硫氨酸橋結構很容易被蛋白水解，而橋i、i+2則很難形成。對環化酶活性來說，i、i+5和i、i+6不是很理想的底物，但是卻賦予了更好的抗蛋白水解能力。在一個優選的實施方案中，所述(甲基)羊毛硫氨酸橋的大小是i、i+3或i、i+4，這樣在環下面有2個或3個殘基。本發明涉及apelin的(甲基)羊毛硫氨酸突變體，其中硫醚橋的形成通過：(i)替換天然序列中兩個胺基酸；(ii)替換天然序列中一個胺基酸，並在替換處的N-或C-末端一側插入一個胺基酸；或者(iii)插入兩個胺基酸。一個包含羊毛硫氨酸的突變體以Ala-S-Ala結構為特徵，其通過在X4-X13段中存在的兩個「Lan」基團(通過替換或插入)形成。一個包含甲基羊毛硫氨酸的突變體以Abu-S-Ala或Ala-S-Abu結構為特徵，其通過在X4-X13段中存在的兩個「meLan」基團(通過替換或插入)形成。因此，包含在X4-X13中的Lan對或meLan對的註解是指最終的環狀的結構。Lan和meLan殘基來源於半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基的生物合成。首先，選擇的絲氨酸和蘇氨酸殘基被酶脫水分別形成脫氫丙氨酸(Dha)和脫氫氨基丁酸(Dhb)殘基。然後，半胱氨酸的巰基以麥可(Michael)方式親核加成到Dha或Dhb殘基上分別形成Lan或MeLan殘基。這種修飾在半胱氨酸的巰基和另一個殘基的β-碳原子上建立共價連接，從而形成硫醚橋。更具體地說，Ala-S-Ala結構可以來自Dha和Cys，其中Cys可以位於Dha的N-末端或C-末端。Abu-S-Ala或Ala-S-Abu結構分別來自Dhb和Cys或者Cys和Dhb。US2013/0196899提供了合成的apelin環狀類似物及其製備方法。US2013/0196899中的上述類似物的環是通過胺基酸側鏈或末端分別形成二硫鍵或醯胺鍵形成的。可是，二硫鍵和醯胺鍵的化學穩定性不如硫醚鍵。而且，立體化學在羊毛硫氨酸形成中發揮了作用，使產生的多肽結構的輪廓更分明，受體特異性更好。羊毛硫氨酸中的硫醚橋也比二硫橋和醯胺交聯更短。因此，羊毛硫氨酸得到的結構和二硫鍵和醯胺交聯得到的結構是不同的。Hamada等人(2008，Int.J.ofMol.Med.22：547～552)公開了apelin片段RPRLSHKGPMPF(apelin-12)的環狀類似物的合成，其中N-末端連接到C-末端上，或其中側鏈第7位Lys與N-末端或C-末端殘基形成環。在這個案例中也出現了環脲鍵，其穩定性不如硫醚橋。此外，Hamada等人的突變體沒有游離的N-末端或游離的C-末端。在本發明的多肽類似物中，X1至X14中的每一個都從一組選定的選項中選擇。X1表示該多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg。在一個優選的方面，X1不存在。X2不存在或選自pGlu、Gln和Ala。優選地，X1不存在且X2是Glu或pGlu(焦穀氨酸)。在一個具體方面，X1是pGlu。在N-末端引入焦穀氨酸可以保護類似物免受N-末端水解。焦穀氨酸(又名PCA、5-羥脯氨酸、氧脯氨酸、或焦穀氨酸鹽作為它的鹽基形式)是一種不常見的胺基酸衍生物，其中穀氨酸或穀氨醯胺的自由氨基環化形成一個內醯胺。它是穀胱甘肽環被5-羥脯氨酸酶轉化成穀氨酸時產生的代謝物。焦穀氨酸被發現存在於包括細菌紫膜質的許多蛋白質中。穀氨酸或穀氨醯胺殘基的N-末端可以自發的環化成為焦穀氨酸。X3是一種鹼性胺基酸殘基選自Arg和Ala，其中優選Arg。X4選自Pro、Ala、Pro-(me)Lan、Pro-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；偏愛Pro、Ala、Pro-(me)Lan或Ala-(me)Lan。在一個實施方案中，X4是Pro或Ala，其中優選Pro。在另一方面，X4參與硫醚橋的形成，且選自Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X4可以是Pro-Lan或Ala-Lan，這樣與第二個Lan殘基形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X4是Pro-meLan或Ala-meLan，這樣與第二個meLan殘基(例如位於X8的(me)Lan、His-(me)Lan或Ala-(me)Lan)形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。X5是Arg、Ala、(me)Lan、Dhb、Arg-(me)Lan、Arg-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；例如X5是Arg、Ala、(me)Lan、Arg-(me)Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X5是Arg或Ala，其中優選Arg。在另一方面，X5參與硫醚橋的形成，且選自(me)Lan、Arg-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X5可以是Lan、Arg-Lan或Ala-Lan，這樣與第二個Lan殘基(例如位於X9的Lan、Lys-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X5是meLan、Arg-meLan或Ala-meLan，這樣與第二個meLan殘基形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。X6選自Leu、Ala、(me)Lan、Dhb、Leu-(me)Lan、Leu-Dhb、Ala-Dhb和Ala-(me)Lan。例如X6是Leu、Ala、(me)Lan、Leu-(me)Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X6是Leu或Ala，其中優選Leu。在另一方面，X6參與硫醚橋的形成，且選自(me)Lan、Leu-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X6可以是Lan、Leu-Lan或Ala-Lan，這樣與第二個Lan殘基(例如位於X10的Lan或Ala-Lan)形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X6是meLan、Leu-meLan或Ala-meLan，這樣與第二個meLan殘基形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。X7選自Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-(me)Lan、Ala-Dhb、Dhb-Ala和(me)Lan-Ala。例如，X7是Ala、(me)Lan、Ala-(me)Lan或(me)Lan-Ala。優選地，X7參與硫醚橋的形成，且選自(me)Lan、Ala-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X7可以是Lan、Ala-Lan或Lan-Ala，這樣與第二個Lan殘基(例如位於X11的Lan、Pro-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X7是meLan、Ala-meLan或meLan-Ala，這樣與第二個meLan殘基形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。在一個具體方面，X7是(me)Lan，任選與為Lys-(me)Lan的X9相結合、或與為(me)Lan或Ala-(me)Lan的X10相結合、與為(me)Lan或Ala-(me)Lan的X11相結合、與為(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan的X12相結合。X8選自His、Ala、(me)Lan、Dhb、His-(me)Lan、His-Dhb、Ala-Dhb和Ala-(me)Lan。例如，X8是His、Ala、(me)Lan、His-(me)Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X8是His或Ala，其中優選His。在另一方面，X8參與硫醚橋的形成，且選自(me)Lan、His-(me)Lan和Ala-(me)Lan.。X8可以是Lan、His-Lan或Ala-Lan，這樣與第二個Lan殘基(例如位於X12的Lan、Met-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X8是meLan、His-meLan或Ala-meLan，這樣與第二個meLan殘基形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。優選X8由His組成或包含His。X9選自Lys、Ala、(me)Lan、Dhb、Lys-(me)Lan、Lys-Dhb、Ala-Dhb和Ala-(me)Lan。例如，X9是Lys、Ala、(me)Lan、Lys-(me)Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X9是Lys或Ala，其中優選Lys。在另一方面，X9參與硫醚橋的形成，且選自(me)Lan、Lys-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X9可以是Lan、Lys-Lan或Ala-Lan，這樣與第二個Lan殘基(例如位於X13的Lan、Pro-Lan和Ala-Lan)形成的硫醚橋是結構為Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X9是meLan、Lys-meLan或Ala-meLan，這樣與第二個meLan殘基形成的硫醚橋是結構為Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。優選X9由Lys組成或包含Lys。在一個具體方面，X9是Lys-(me)Lan。X10選自Gly、Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-Dhb和Ala-(me)Lan。例如，X10是Gly、Ala、(me)Lan或Ala-(me)Lan。在一個實施方案中，X10是Gly。在另一個實施方案中，X10是meLan。X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X11是Pro或(me)Lan。X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan。優選地，X12是Met。X13不存在或選自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan。優選地，X13選自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan，更優選地，選自Pro和(me)Lan。在一個具體方面，X13是Pro。在另一個具體方面，X13是Dhb。X14是C-末端，且不存在或選自Phe和Ala，除非X13不存在。在一個實施方案中，X14和X13不存在。在另一個實施方案中，X14是Phe或Ala，其中優選Phe。在一個具體方面，該肽突變體的C-末端是醯胺化的，例如，其中X14是一個醯胺化的Phe(Phe-NH2)。在一個具體的實施方案中，X1不存在，且序列X2-X3-X4-X5-X6是Gln-Arg-Pro-Arg-Leu或pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu。在序列X7-X8-X9-X10是(me)Lan-His-Lys-(me)Lan，優選meLan-His-Lys-meLan，或序列X7-X8-X9-X10是(me)Lan-His-Lys-(me)Lan-Gly，優選meLan-His-Lys-meLan-Gly時，得到了非常好的結果。在其它突變體中，序列X4-X5-X6-X7-X8是Pro-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan或Pro-Arg-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan。優選示例性突變體包含那些其中C-末端4個殘基是由序列Pro-Met-Pro-Phe組成的。然而，在其他有用的突變體中，X14不存在或者是Ala，例如，其中C-末端是Pro-Met-Pro，Pro-Met-Pro-Ala。在另一個實施方案中，X11-X12-X13-X14是(me)Lan-Met-Pro-Phe。也包含所述多肽的醯胺、酯或鹽。優選地，該鹽是一種藥學上可接受的鹽，比如任意無毒的鹽，例如，與無機酸的鹽、與有機酸的鹽、與無機鹼的鹽、與有機鹼的鹽、與胺基酸的鹽。本文中所用的「可接受的鹽」是指保持了寡肽或等效化合物所需活性的鹽，但是優選不對寡肽或使用該寡肽體系中其它成分的活性產生不利影響的鹽。這樣的鹽的例子是與無機酸形成的酸加成鹽，例如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。也可以是與有機酸形成的鹽，例如，醋酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、撲酸、海藻酸、聚穀氨酸等。鹽可以是與多價金屬陽離子形成的，比如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳等，或與由N,N』-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有機陽離子形成的，或其組合(例如，丹寧酸鋅鹽)。在一個實施方案中，本文提供的環狀類似物，與apelin-13或pyr-1-apelin-13相似，具有APJ受體的效力。在一個實施方案中，當檢測對cAMP產生的抑制、和/或對抑制蛋白募集的激活、和/或其他任何對APJ介導的信號的檢測時，本發明的環狀的APJ受體激動劑具有小於100nM的半最大效應濃度(EC50)。在另一個實施方案中，該EC50值小於50nM，優選小於25nM，更優選小於15nM。在另一個具體的實施方案中，本發明的類似物具有小於10nM的EC50值。該類似物優選具有優於apelin-13或pyr-1-apelin-13的血漿穩定性。在一個實施方案中，其血漿穩定性的改進比從已知apelin中觀察到的至少高了2倍。穩定性可以用半衰期(t50)來表徵，即保留最初酶活性50％的時間。在一個實施方案中，本發明的類似物在血漿中的半衰期(t50)至少為30分鐘。在另一個實施方案中，本發明的多肽具有至少10分鐘的半衰期，優選至少40分鐘，更優選至少60分鐘。在一個具體的實施方案中，血漿中的t50值超過1小時，優選超過2小時，最優選至少4小時。本發明具體的apelin類似物如表1所示。表1*自發環化產生的最常見的異構體**自發環化產生的較不常見的異構體還提供了一種提供根據本發明的apelin類似物的方法。在環肽中，兩個胺基酸側鏈之間分子內的鍵可以通過化學或酶法形成。使用宿主細胞，其包含一個或多個用於合成羊毛硫肽或羊毛硫抗生素的生物合成酶，可方便地製備環狀的apelin類似物(Arnison等人，2013NatProdRep30，108～160)。羊毛硫肽和羊毛硫抗生素(羊毛硫肽的一個亞群，具有抗菌活性)是包含內部橋的小肽，這些橋產生於(甲基)羊毛硫氨酸或賴丙氨醯殘基的形成(在McAuliffe等人，FEMSMicrobiol.Rev.25，285～308(2001)中綜述)。羊毛硫氨酸(Lan)和甲基羊毛硫氨酸(MeLan)分別產生於絲氨酸到脫氫丙氨酸(Dha)的脫水和蘇氨酸到脫氫氨基丁酸(Dhb)的脫水，硫醚鍵的形成產生於這些胺基酸與同一肽內半胱氨酸殘基的相互作用。眾所周知的羊毛硫抗生素的例子有乳鏈菌肽、枯草菌素、Pep5和表皮菌素。羊毛硫抗生素作為無活性的原肽在核糖體中合成，該原肽含有一個氨基末端前導肽和羧基末端前肽。該前導肽對羊毛硫抗生素前體與羊毛硫抗生素酶的相互作用是必要的。在產生的細胞內、或轉運到細胞外的過程中或之後，該前導肽被蛋白水解從前肽切除。該羊毛硫肽生物合成基因聚集在一起，並被給予基因座名稱lan。LanA是編碼羊毛硫抗生素原肽的基因，lanB是編碼負責絲氨酸或蘇氨酸脫水的酶的基因，lanC是編碼負責環形成的酶的基因。在某些情況下，LanB和LanC的活性合併在lanM編碼的一個雙功能酶中。LanP和lanT基因編碼涉及原肽加工和/或轉運的酶。因此，本發明提供了一種根據本發明的環狀apelin類似物的酶法製備方法，包括：提供宿主細胞，其包含：-核酸分子，其包含編碼在羊毛硫肽或羊毛硫抗生素前體肽中發現的N-末端前導肽的第一核酸片段，和編碼apelin類似物的第二核酸片段，其中所述第一和第二片段在所述核酸分子的同一開放閱讀框內；-核酸序列，其編碼能夠使絲氨酸和/或蘇氨酸脫水的酶；-任選的核酸序列，其編碼轉運蛋白；和-核酸序列，其編碼能夠誘導羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸形成的酶。隨著羊毛硫肽/羊毛硫抗生素前體發現的任意前導肽適用於製備根據本發明的環肽類似物的方法。例如這樣的前導肽是乳鏈菌肽、枯草菌素、Pep5和表皮菌素的前導肽。在一個優選的實施方案中，使用了乳鏈菌肽的前導肽。能夠使絲氨酸和/或蘇氨酸脫水的酶優選是LanB，比如NisB、PepB、SpaB或它們的功能等效物。能夠誘導羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸形成的酶優選是LanC，比如NisC、PepC、SpaC或它們的功能等效物。在一個實施方案中，絲氨酸和/或蘇氨酸脫水以及羊毛硫氨酸和/或甲基羊毛硫氨酸形成被同一種酶誘導，該酶是LanM，比如CinM、LtnM、LctM或它們的功能等效物。在脫氫丙氨酸和半胱氨酸之間形成羊毛硫氨酸在室溫下在能量上是能夠進行的，而且也可以自發地發生，而不用LanC或LanM酶的參與。因此，在一個實施方案中，提供了一種方法，用於以酶法製備根據本發明的包含(甲基)羊毛硫氨酸橋的環狀apelin類似物，其包括：a)提供宿主細胞，其包含：-核酸分子，其包含編碼在羊毛硫肽/羊毛硫抗生素前體肽中發現的N-末端前導肽的第一核酸片段，和編碼apelin類似物的第二核酸片段，其中所述第一和第二片段在所述核酸分子的同一開放閱讀框內；-核酸序列，其編碼能夠使絲氨酸和/或蘇氨酸脫水的酶；-(任選的)核酸序列，其編碼轉運蛋白；和b)允許翻譯所述第一核酸；c)收穫所述肽類似物，優選從培養基或者在宿主細胞裂解後從細胞質中收穫肽。因此，通過絲氨酸和蘇氨酸分別被酶脫水成α,β-不飽和殘基2,3-二脫氫丙氨酸(Dha)和(Z)-2,3-二脫氫氨基丁酸(Dhb)，接著通過半胱氨酸巰基的分子內麥可型加成產生硫醚交聯，(甲基)羊毛硫氨酸基團可以在翻譯後被插入到線型的前體肽中。這種方法使用生物合成裝置，可以在體外或細菌宿主中重建。在一個實施方案中，一種方法包括構建一種帶有質粒的宿主細胞，該質粒編碼羊毛硫肽修飾酶，其使絲氨酸/蘇氨酸脫水並將形成的脫氫胺基酸連接到半胱氨酸，且該質粒任選編碼羊毛硫肽轉運蛋白，另一種質粒編碼由N-末端羊毛硫肽前導肽和C-末端apelin類似物組成的結構。如上詳述，(甲基)羊毛硫氨酸形成在脫水的絲氨酸或蘇氨酸的側鏈與半胱氨酸之間，脫水的絲氨酸或蘇氨酸例如分別為脫氫丙氨酸或脫氫氨基丁酸。因此，一種apelin類似物(當環化時)包含至少一個羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸，編碼這種apelin類似物的核酸序列需要有一種編碼絲氨酸的核酸密碼子(TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC)或編碼蘇氨酸的核酸密碼子(ACT、ACC、ACA或ACG)，和一種編碼半胱氨酸的核酸密碼子(TGT或TGC)，在肽類似物中這兩個胺基酸位點將形成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。在一個實施方案中，編碼apelin類似物的第二核酸片段編碼選自如下的多肽：QRPTRLACKGPMPF、QRPSRLACKGPMPF、QRPRTLACKGPMPF、QRPSLAHCGPMPF、QRPRLTHKCPMPF、QRPRLSAHKCPMPF、QRPRLSAHKCPMPF、QRPRLSAHKCGPMPF、QRPRLSAHKCGPMPF、QRPRLTHKCGPMPF、QRPRLTHKCGPMPF-NH2、QRPRLTHKCGPMP、QRPRLSHKCGPMPF、QRPRLTHKGCPMPF、QRPRLSHKGCPMPF、QRPRLSHKGCPMPF、QRPRLAHSGPMCF、QRPRLSHKGCMPF、QRPRLTHKGCMPF、QRPRLSHKGPCPF、QRPRLSHKGPCMPF、KFRRQRPRLTHKCPMPF、KFRRQRPRLTHKCGPMPF、KFRRQRPRLSAHKCPMPF、KFRRQRPRLSAHKCGPMPF、KFRRQRPRLSHKGCPMPF、KFRRQRPRLAHSGPMCF、QRPRLSHKGPMCF和QRPRLSHKGPMCPF。假設該肽的N-末端殘基是穀氨醯胺(Q)，優選地，該方法進一步包括根據本領域已知方法將Q轉化成pE，例如，如Rink等人所述的方法(JournalofPharmacologicalandToxicologicalMethods61(2010)210～218)。如果宿主細胞是一種革蘭氏陽性菌，為了從培養基中收穫環肽類似物或還沒有環化的脫水的肽類似物，特別優選的是存在一種轉運蛋白。優選地，所述的轉運蛋白是LanT，比如NisT或其功能等效物。在大腸桿菌中，不需要轉運蛋白的存在，肽類似物的收穫優選跟隨在細胞裂解之後。在製備根據本發明的環狀類似物的方法中，使用的宿主細胞優選革蘭氏陽性原核細胞、革蘭氏陰性原核細胞或真核細胞。合適的宿主細胞的例子包含乳酸菌，比如乳酸乳球菌、枯草桿菌、表皮葡萄球菌，和革蘭氏陰性菌E.coli。代替脫氫胺基酸與半胱氨酸的酶法的環化偶聯，環化也可能通過在鹼性pH下保溫進行。這種pH-誘導的偶聯在如下情況下可以方便地用於形成(甲基)羊毛硫氨酸，例如當脯氨酸直接位於半胱氨酸前面時，這阻礙了有效的環化酶活性。或者，在肽沒有被環化酶NisC環化的情況下，在脫氫丙氨酸和半胱氨酸之間的環化可以自發發生，-根據不同的肽-，可以產生或不產生不同的異構體。因此，在本發明的另一個實施方案中，環的閉合是以非酶的方式實現的，例如，通過使脫水的類似物前體進行化學處理來誘導硫醚橋形成，該類似物前體在需要的位點包含脫氫丙氨酸或脫氫氨基丁酸殘基、和半胱氨酸殘基。例如，化學的環閉合可以涉及在pH8條件下暴露包含脫氫丙氨酸和半胱氨酸的肽至少10分鐘。(Burrage等人ChemEurJ，2000Biomimeticsynthesisoflantibiotics，6，1455～1466)或在pH8～9條件下暴露帶有脫氫氨基丁酸和半胱氨酸的肽約10小時(Zhu等人2003Biomimeticstudiesonthestereoselectivelanthionineformation，Org.Biomol.Chem，1，3304～3315)。在另一個實施方案中，通過固載型化學合成，比如根據Knerr等人(J.Am.Chem.Soc，2012，134(18)，7648～7651)或其中引用的文獻描述的步驟，合成了apelin類似物。鑑於它對以增加的穩定性結合的APJ受體的(差別性的)作用，本文提供的環狀apelin類似物容易發現其作為藥物的用途。因此，還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種根據本發明的apelin類似物和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。該類似物可以這樣以實體給藥，或者以一種藥學上可接受的酸或鹼加成鹽給藥，該酸或鹼加成鹽的形成通過與無機酸反應(比如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫代氰酸、硫酸和磷酸)；或與有機酸反應(如甲酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸和富馬酸)；或通過與無機鹼反應(如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)；或與有機鹼反應(比如單、二、三烷基胺、芳基胺和取代的乙醇胺)進行。在發明中，作為環肽化合物或其藥學上可接受的鹽，優選大體上純化形式的化合物或其藥學上可接受的鹽。更優選超過80％或更高的純度。該apelin受體APJ與心血管疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄、缺血性心血管疾病、病毒性心肌病、淋巴管穩定、內分泌系統和激素紊亂、糖尿病性視網膜病變和代謝疾病、胃腸道和肝臟疾病、癌症疾病、炎症性疾病、血液系統疾病、呼吸系統疾病、肌肉骨骼疾病、神經系統疾病、泌尿系統疾病、皮膚疾病、傷口癒合和生殖障礙相關。本發明提供了包含(甲基)羊毛硫氨酸的APJ受體激動劑和拮抗劑，它們的選擇性應用依賴於疾病。此外設想，羊毛硫氨酸apelin影響已知治療相關的APJ受體與AT1受體的異二聚體化。對apelin受體激動劑，存在多個治療領域。對於新血管形成特性，apelin的主要目標是心臟和腿部肌肉。APJ受體激活一般有心血管治療相關性。其他應用領域例如纖維質生成和神經保護作用，纖維質生成(甲基)羊毛硫氨酸-apelin對纖維質生成可能具有回覆的特性。Apelin在新生兒高氧暴露時有治療效果。在其他疾病例如病理性血管新生病例中apelin受體拮抗劑是有價值的：糖尿病腎病(Zhang2013PLOS8IIssue4|e60457page1～11)、抗腫瘤生長(Sorli2006Drugdiscoverytoday11，1100～1106)、缺血性視網膜病變。拮抗劑的獲得例如通過用ala13替換F13。阻斷APJ受體，其為HIV感染的共受體，有助於預防HIV感染。阻斷APJ受體可能有助於減少在年齡相關性黃斑變性(AMD)中的多餘血管的病理形成。因此，示例性的治療應用包含所有已知的或提示與通過apelinergic系統信號通路的信號相關的，例如與水平衡改變相關的病症、壓力誘導的紊亂比如焦慮和抑鬱、心血管和代謝紊亂。在一個實施方案中，apelin類似物產生內皮依賴性血管舒張、內皮非依賴性血管收縮和/或心臟收縮力增加。在高氧治療的老鼠幼崽中，apelin具有抗炎作用。本發明提供了一種環狀的apelin類似物，用於治療或預防心血管病症，例如選自缺氧、缺血和肺動脈高壓。在一個進一步的實施方案中，發現該apelin類似物在調節例如在腫瘤中的血管生成中的應用。APJ也是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的一種共受體，apelin通過APJ阻斷HIV-1進入。表達CD4和受體的CHO細胞和NP-2細胞，與apelin肽預培養後，抑制了HIV感染，支持APJ作為HIV和HIV-2共受體的作用。CD4陰性而APJ陽性的細胞系，與可溶性CD4培養，可以感染HIV。因此，在更進一步的實施方案中，一種本發明的環狀apelin用於HIV的治療。本文使用的「治療」意思是緩解或治療症狀或疾病、和/或它的伴隨症狀。「預防」意思是延緩或阻止症狀或疾病、和/或它的伴隨症狀出現的方法、阻止病人獲得症狀或疾病的方法、或減少病人獲得症狀或疾病的風險的方法。本發明的藥物組合物是通過以合適的量適當地混合本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽，和至少一種或更多種藥學上可接受的載體等，按照在藥物製備
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已知的方法生產的。在藥物組合物中，本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽的含量改變，依賴於劑型、劑量等，但是例如是整個藥物組合物重量的0.1～100％。「藥物組合物」包含口服製劑比如片劑、膠囊、顆粒劑、粉末劑、錠劑、糖漿、乳劑和混懸液，和腸胃外製劑比如外用製劑、栓劑、注射劑、滴眼液、滴鼻劑、肺部製劑。「藥學上可接受的載體」包含各種常規有機或無機載體物質，例如，固體製劑中的物質比如賦形劑、崩解劑、粘合劑、助流劑、潤滑劑，和液體製劑中的物質比如溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝劑和安撫劑。如果需要時使用添加劑，比如防腐劑、抗氧化劑、著色劑和甜味劑。「賦形劑」包括例如，乳糖、綿白糖、D-甘露醇、D-山梨醇、玉米澱粉、糊精、微晶纖維素、晶態纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基澱粉鈉、低取代羥丙基纖維素和阿拉伯樹膠。助流劑包括，例如，輕質無水矽酸、硬脂酸鎂。潤滑劑包括，例如、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石。溶劑包括，例如，純淨水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄欖油。增溶劑包括，例如，丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三乙醇胺、碳酸鈉和檸檬酸鈉。「懸浮劑」包括，例如，苯扎氯銨、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、丙二醇、聚維酮、甲基纖維素和單硬脂酸甘油酯。緩衝劑包括，例如，磷酸氫二鈉、醋酸鈉、碳酸鈉和檸檬酸鈉。本發明的藥物組合物可以以治療有效量口服或腸外給藥(例如，外用、直腸、靜脈注射)到其他非人類的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、貓、狗、豬、牛、馬、羊、猴)和人類。然而「治療有效量」根據患者、疾病、症狀、劑型、給藥途徑而改變，例如，本發明的環狀apelin類似物或其藥學上可接受的鹽作為活性成分，口服給予患心血管疾病的成人病例(約60公斤重)時，劑量範圍通常每天使用約1毫克到1克。這樣的量可以一天一次或幾次對病人給藥。包含本發明化合物或其藥學上可接受的鹽作為活性成分或激活劑的藥物組合物，及試劑盒(給藥、治療和/或預防試劑盒)、包裝(包裝商品等)，和藥物組(和/或，容器)，其包含關於藥物組合物的藥品說明書，提示該藥物組合物可以用於或應該用於治療和/或預防，也都是有用的。這樣的試劑盒、包裝和藥物組可以與一個或多個容器一起被提供，該容器填充有一種或多種活性成分和其他藥物、或上述藥物組合物的藥物(或成分)。作為這樣的試劑盒、包裝和藥物組的例子，包含針對治療和/或預防一種目標疾病的適當的商業試劑盒和商業包裝。作為包含在這樣試劑盒、包裝和藥物組中的藥品說明書，包含負責監管藥品或生物製品製造、使用或銷售的政府機構的說明，和表示政府機構批准生產、使用或銷售該給人用藥相關產品的說明。在上述的試劑盒、包裝和藥物組中，也可以包含包裝的產品，可以包含採用合適用藥步驟(步驟)構成的體系，可以包含體系，其構成可以達到在更優選藥物上的治療和/或預防包含目標疾病的治療、預防。本發明化合物或其藥學上可接受的鹽，可以通過目前在醫藥領域使用的一般方法，結合(以下稱為「聯合治療」)一個或多個其他藥物(以下稱為「伴隨藥物」)使用。本發明的apelin類似物或其藥學上可接受的鹽及其伴隨藥物的給藥時間選擇是不限的。它們可以以一種聯合藥物對病人給藥，或它們可以同時或以固定的時間間隔對病人給藥。可以使用一種藥物試劑盒，其特徵為由本發明的藥物組合物和伴隨藥物組成。伴隨藥物的劑量應符合臨床使用的劑量，並且它可以根據患者、疾病、症狀、劑型、給藥途徑、給藥時間及其聯合進行適當地選擇。伴隨藥物的給藥方式沒有特別的限制，本發明的化合物或其鹽和伴隨藥物應該僅僅是放在一起的。伴隨藥物包含，例如，(1)心血管疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄或缺血性心血管疾病的治療性藥物和/或預防劑，(2)內分泌系統和激素紊亂，糖尿病性視網膜病變或代謝性疾病的治療性藥物和/或預防劑，(3)癌症治療性藥物，(4)炎症性疾病的治療性藥物和/或預防劑，和(5)HIV的治療性藥物，這些藥物的任一種或多種與本發明化合物或其藥學上可接受的鹽可以聯合使用。為了清楚的目的，本文描述了簡潔的描述特徵，作為相同或不同實施方案的一部分，然而，應了解，本發明的範圍可以包括具有描述的所有或部分特徵的組合的實施方案。考慮到本段落，如提交的權利要求1中的突變體可以與如提交的本申請中描述的其他特徵相結合，尤其可以與從屬權利要求中公開的特徵相結合，這些權利要求通常與本發明最優選的實施方案相關，這對技術人員來說是明顯的。實驗部分實施例1：合成羊毛硫氨酸穩定的apelin類似物根據例如Kluskens,L.D.等人(2005)Post-translationalModificationofTherapeuticPeptidesbyNisB,theDehydrataseoftheLantibioticNisin，Biochemistry44，12827～12834；Kluskens,L.D.等人(2009)Angiotensin-(1-7)withthioether-bridge:anACE-resistant,potentAng-(l-7)analogue，J.Pharmacol.Exper.Ther.328，849～854；Rink,R.等人(2007)NisC,thecyclaseoftheLantibioticnisin,cancatalyzecyclizationofdesignednon-lantibioticpeptides，Biochemistry46，13179～13189中描述的既定的步驟，製備含有羊毛硫氨酸的apelin突變體。簡單地說，使用包含兩種質粒系統的乳酸乳球菌。第一種質粒編碼羊毛硫抗生素乳鏈菌肽的前導肽MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR，從基因方面，將其C-末端融合到目的蛋白(甲基)羊毛硫氨酸-apelin的前體上，該蛋白在i位置包含一個絲氨酸/蘇氨酸，在i+3、i+4、i+5或i+6位置包含一個半胱氨酸。或者，第一種質粒編碼乳鏈菌肽前導肽，之後連接乳鏈菌肽的前17個胺基酸和一個蛋白內切酶Glu-C酶切位點(E)：MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMIE。N-末端甲硫氨酸通常被宿主剪切掉。第一種質粒，編碼包含乳鏈菌肽前導肽和(甲基)羊毛硫氨酸apelin前體的融合肽，與第二種質粒pIL3BTC質粒，編碼成熟酶NisB和NisC以及轉位酶NisT，在乳酸乳球菌中共表達。NisB使絲氨酸或蘇氨酸脫水，分別產生脫氫丙氨酸和脫氫氨基丁酸。接著，環化酶NisC將脫氫胺基酸共價連接到半胱氨酸，分別產生羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。在GM17培養基中添加4μg/ml紅黴素和4μg/ml氯黴素，培養乳酸乳球菌於30℃生長過夜(KluskensLD，等人(2005)Post-translationalmodificationoftherapeuticpeptidesbyNisB,thedehydrataseofthelantibioticnisin，Biochemistry44：12827～12834)。轉移1/100體積到基本培養基中，培養物30℃生長過夜(RinkR，等人(2005)Lantibioticstructuresasguidelinesforthedesignofpeptidesthatcanbemodifiedbylantibioticenzymes，Biochemistry44：8873～8882)離心(10分鐘，12857g)收集上清液，並隨後進行真空過濾(0.2μm)。使用HiTrapSPHP離子交換色譜柱肽(GEHealthcare，瑞典)，從培養基部分純化肽。包含肽的收集部分除鹽(PD10柱，Amersham)並真空乾燥。於37℃，在50mM、pH7.6的磷酸鈉緩衝劑中，以10U/ml蛋白內切酶Glu-C酶切消化，釋放(甲基)羊毛硫氨酸-apelin肽。在所述溫度保溫48小時，結果N末端穀氨醯胺(Q)完全轉化成為焦穀氨酸(pE)。如果需要N-末端的穀氨醯胺，Glu-C消化的時間保持在最小值幾個小時。在反向高效液相色譜(HPLC)柱(Jupiter4μmProteoC12，Phenomenex)中分離消化的融合肽。在0.1％三氟乙酸的存在下，以1.0mL/min的流速，在milliQ水中以15％到40％的乙腈的梯度，進行分離。收集峰的餾分(在214nm檢測)，通過Maldi-TOF質譜(Voyager-DEPro，AppliedBiosystems)分析。(甲基)羊毛硫氨酸的存在與否通過與CDAP孵育進行評估，CDAP加到未修飾的半胱氨酸上，而不加到(甲基)羊毛硫氨酸上(Rink2007Biochemistry46，13179～13189)在某些情況下,脫水的絲氨酸以非酶方式連接到半胱氨酸，產生不同的異構體。羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)表示為[Lan-Lan]；甲基羊毛硫氨酸(Abu-S-Ala和Ala-S-Abu)表示為[meLan-meLan]。實施例2：羊毛硫氨酸-apelin突變體結合到APJ受體方法：APJ競爭性結合試驗[Glp65、Nle75、Tyr77][125I]-Apelin13結合試驗以SPA96-孔的形式進行。從穩定表達重組hAPJ或rAPJ的HEK293細胞製備本試驗中使用的膜。在試驗緩衝液(25mMHEPES，10mMMgCl2，1mMCaCl2，0.1％BSA，pH7.4)中含有0.06nM[Glp65、Nle75、Tyr77][125I]-Apelin13和濃度遞增的檢測化合物(10個點濃度響應曲線)，向其中加入WGAPVTSPA珠(0.5mg/孔)和0.08μg膜的混合物，開始孵育。非特異性結合在100nMapelin17存在下被測定。樣品在室溫(22℃)孵育8小時，然後在MicrobetaTrilux中讀取96-孔板。結果：表2pE是焦穀氨酸。結論：-P到A或P到V的突變消除結合。然而，本文下面的實施例8中，QRPRLAHLanGPMLanF顯示了顯著的活性。因此，羊毛硫氨酸橋可以模擬脯氨酸對螺旋的破壞作用。F到A的突變沒有結合。-兩個包含羊毛硫氨酸的apelin保持了對APJ受體的結合能力。它們的結合能力比野生型apelin13低。然而應該注意的是，羊毛硫氨酸apelin具有pE，而不是Q，這可能部分導致了受體結合的降低。實施例3：羊毛硫氨酸apelin在表達APJ受體的細胞中影響cAMP的水平方法：毛喉素激活的cAMP試驗通過HTRF競爭性免疫試驗，分析在表達重組APJ受體的HEK293細胞中的環狀AMP水平。細胞以4000個/孔的密度，將細胞重懸於試驗緩衝液中(HBSS含有Ca2+和Mg2+，添加0.1％BSA和5mMHEPES)，加入到試驗平板。加入含有10μΜ毛喉素和0.5mMIBMX的濃度遞增的化合物，室溫孵育40分鐘。根據製造商的說明，加入含有d2-標記cAMP的裂解緩衝液終止反應，隨後加入穴狀化合物-標記的抗-cAMP單克隆抗體。室溫下在黑暗處孵育2小時後，使用Envision設備，在620nm和665nm處測量時間分辨螢光。樣品中cAMP含量通過cAMP標準曲線中的內推確定。結果：表3結論：在實施例1中顯示結合受體的兩種突變體，對於cAMP水平的調節是有活性的。實施例4：羊毛硫氨酸apelin影響抑制蛋白募集方法：hAPJ的β-抑制蛋白募集試驗使用DiscoveRx的PathHunterTM系統，研究hAPJ與β-抑制蛋白的相互作用的激活。基因工程改造CHO-K1細胞系，使其共表達ProLink/酶供體(PK)-標記的APJ和酶激活子(EA)-標記的β-抑制蛋白融合蛋白。在GPCR激活時，酶片段發生互補，產生一種有活性的β-Gal酶。以15000個/孔的密度接種這些細胞。第二天，用有潛在激動劑性質的化合物，以不同濃度，激發細胞。與化合物在37℃孵育90分鐘後，細胞被裂解，在室溫與PathHunter試劑孵育1小時。然後以超靈敏的發光步驟，使用Envision設備(PerkinElmer)讀取樣品。結果：表4結論：在本試驗中，pEApeM5突變體具有顯著的活性。實施例5：包含羊毛硫氨酸的apelin不與血管緊張素II型受體1(AT1)相互作用鑑於APJ和AT1受體的同源性，研究了羊毛硫氨酸-apelin是否與血管緊張素II型受體1相互作用。例如，如果apelin的羊毛硫氨酸突變體激活AT1受體，則對各種治療應用將是不可取的。方法：通過AT1偶聯β-抑制蛋白試驗，測定羊毛硫氨酸apelin的激動作用和拮抗作用。結果：表5結論：羊毛硫氨酸apelin對AT1受體沒有激活作用，也沒有拮抗作用。實施例6：hAPJ受體內化試驗方法：在實驗前24小時，將HEK293細胞以50％細胞覆蓋接種入2xF75燒瓶中。第二天早晨，細胞被胰蛋白酶消化，渦旋攪拌60秒，過40微米篩網過濾器。細胞在OptiMEM+2％FBS中以300,000個/毫升的密度重懸，以1PFU/細胞的MOI加入Ad-GFP-hAPJ病毒。細胞被渦旋攪拌並以10,000個/孔的濃度分配到透明底的黑色96孔板中。細胞在室溫保持30分鐘以使其粘附到板，然後在5％CO2培養箱中37℃孵育過夜。第二天早晨，以濃度響應曲線(500nM為最大值)加入apelin類似物。在OlympusFV的共聚焦顯微鏡下觀察並記錄APJ-GFP的轉位。典型的轉位運行在3小時內完成，大部分的作用在與化合物接觸的最初90分鐘內被觀察到。結果：表6結論：由於內化可以反映脫敏，所以顯示信號能力而減少了內化的突變體是優選的。考慮到實施例2中的cAMP信號，在本系列中pEApeM6是優選的。實施例7：羊毛硫氨酸apelin對血漿中肽酶的抗水解性增加方法：大鼠血漿中apelin類似物的穩定性。Apelin(apelin終濃度為0.1mg/ml)在10％大鼠血漿中於37℃孵育，該大鼠血漿以16mMpH7.4的磷酸緩衝液緩衝。通過酸化到終濃度5％TFA使樣品猝熄。在HPLC上分析樣品。相對於起始峰高度，標繪峰高。結果：表7肽在大鼠血漿中T50穩定性(hr)QRPRLSHKGPMPF1pERPRLSHKGPMPF3環狀的apelinpEApeI3c2pEApeI4a2pEApeI5dSI2pEApeI5cSI3pEApeM12S3pEApeM6deltaF3pEApeM7SI6pERPRL[AbuHKA]GPMPA7pEApeT8cS8pEApeM68pEApeM59pEApeM6deltaF10pERPRL[AbuHKA]GPMVF10pEApeM715pEApeM824pEApeM5T24pEApeM26I＞24pEApeM26II＞24pEApeM27I＞24pEApeM27II＞24結論：帶有pGlu和羊毛硫氨酸的肽顯然比帶有Q的線性肽更穩定。pGlu和羊毛硫氨酸都有助於穩定。突變體pEApeM5T與pEApeM5的比較證明了通過Dhb殘基增強了穩定性。實施例8：通過激活APJ受體，抑制cAMP通路並激活β-抑制蛋白通路用DiscoverX公司的cAMP和β-抑制蛋白試驗檢測(甲基)羊毛硫氨酸apelin突變體。表8結論：-以低於或略高於線性S-A對照的濃度，幾種(甲基)羊毛硫氨酸突變體激活cAMP通路。-激活β-抑制蛋白通路的能力相當多樣並且取決於肽。這表明幾種突變體強烈的活性差異；最後一列給出了兩種通路的比值，該值的多樣性說明了這一點。-特別是，羊毛硫氨酸突變體看起來是非常有活性的。-不僅用羊毛硫氨酸的部分替換胺基酸，而且插入羊毛硫氨酸(的部分)，都產生有活性的突變體。-兩種突變體激活β-抑制蛋白通路比激活cAMP通路更有效。當前第1頁1 2 3