一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光PCR引物探針組、試劑盒及應用

2023-10-21 05:23:59 2

一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr引物探針組、試劑盒及應用
技術領域
1.本發明涉及生物信息檢測技術領域，特別是涉及一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr引物探針組、試劑盒及應用。


背景技術：

2.病毒性腹瀉是貓常見的疾病，根據相關報導，大部分腹瀉貓存在腸道病毒合併感染的情況。貓細小被認為是導致腹瀉的主要原因，目前臨床診斷僅針對貓細小病毒(feline parvovirus，fpv)具有較完善的診斷與診療系統，2018年後陸續出現報導的貓庫布病毒(feline kobuvirus，fekov)，貓博卡病毒(feline bocavirus，fbov)和新型貓星狀病毒(feline astrovirus，feastv)，這些病毒在針對腹瀉貓的病原學調查中易被忽略。
3.貓細小病毒是一種小型的，無包膜的單鏈dna病毒，是食肉動物原病毒屬1的成員，屬於細小病毒科原病毒屬。具有高度傳染性，主要通過糞口途徑感染六月齡以下的幼貓，可造成嚴重的腹瀉和免疫抑制疾病，死亡率高達25％-90％，呈急性發作時死亡率高達100％，在全世界範圍內呈大範圍流行。貓博卡病毒屬於博卡病毒屬的肉食動物博卡病毒，目前貓博卡病毒已被分為1、2、3型，貓博卡病毒1型在腹瀉症狀貓中呈高流行率，主要導致家貓出血性腸炎，與貓細小病毒共同感染的情況下會出現更嚴重的臨床表現。貓庫布病毒是一種小的球型非包膜rna病毒，屬於小核糖核酸病毒科新建立的一個屬。貓庫布病毒在腹瀉貓糞便中檢出，隨後的報導中發現了貓庫布病毒與貓細小病毒和貓冠狀病毒較為普遍的混合感染現象，貓庫布病毒作為一種新型病毒已經成為貓腸道病毒的常見部分，但目前對其的檢測方法尚未深入開發，其致病機理同時缺乏相關研究報導。貓星狀病毒是一種小型的，無包膜的單鏈rna病毒，分類為星狀病毒2型，是一種已知的常見的貓腸道病毒。在人類中，星狀病毒感染主要引起嬰兒腹瀉，是嬰幼兒病毒性腸炎的第二位病因，同時有研究發現貓星狀病毒會造成人的隱形感染。星狀病毒由於其病毒特性變異較快，病理現象複雜，目前的疫苗僅有用於雞星狀病毒的防治。作為貓重要的腸道病毒之一，貓星狀病毒常常伴隨著貓細小病毒、貓博卡病毒和貓庫布病毒等病毒造成混合感染。
4.由於這四種病毒都主要通過糞口途徑傳播，混合感染的概率較高，引起的臨床症狀較為相似，在臨床診斷和流行病學調查中往往容易被忽視。現階段對於貓病毒腹瀉的病原檢測主要通過臨床症狀分析、免疫檢測及普通pcr等常規手段進行診斷及病原體排查。免疫檢測靈敏度低，且存在「窗口期」，感染後3-7天才能檢測出相應的抗原或抗體。普通pcr作為傳統分子檢測技術，雖然耗時短但相比taqman法靈敏度較差，易出現假陰性情況，並且只能通過核酸凝膠電泳觀察結果，步驟相對繁瑣。taqman法具有靈敏度高和特異性高的特點，可用於定量分析。相比普通pcr可以精確並可視化地檢測出腹瀉貓糞便和體液中的病毒種類和含量，更方便高效。目前僅有針對貓細小病毒、貓博卡病毒1型和貓星狀病毒單個病毒的taqman檢測技術，而貓庫布病毒的taqman檢測技術未見報導。目前對貓腹瀉相關病毒的多重檢測僅限於多重普通pcr方法建立的嘗試，該方法最低檢測限為每份病毒拷貝數105到
104，檢測靈敏度不甚理想。因此，開發一種檢測貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr方法是十分有必要的。


技術實現要素：

5.本發明的目的是提供一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr引物探針組、試劑盒及應用，以解決上述現有技術存在的問題，本發明通過四重螢光pcr反應，一次反應能夠覆蓋四種病原體檢測並將其準確區分，相比於現階段的免疫檢測技術，更加高效精準。
6.為實現上述目的，本發明提供了如下方案：
7.本發明提供一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr引物探針組，包括：
8.檢測貓星狀病毒的如seq id no：1-2所示的引物組和如seq id no：3所示的探針；
9.檢測貓博卡病毒1型的如seq id no：4-5所示的引物組和如seq id no：6所示的探針；
10.檢測貓庫布病毒的如seq id no：7-8所示的引物組和如seq id no：9所示的探針；
11.檢測貓細小病毒的如seq id no：10-11所示的引物組和如seq id no：12所示的探針。
12.進一步地，所述探針5』端連接有螢光基團，3』端連接有猝滅基團，且，任一所述探針的所述螢光基團與其他三者螢光基團不同。
13.本發明還提供一種上述的多重螢光pcr引物探針組在製備檢測貓腹瀉相關病毒產品中的應用。
14.本發明還提供一種檢測貓腹瀉相關病毒的試劑盒，包括上述的多重螢光pcr引物探針組。
15.本發明還提供一種檢測四種貓腹瀉相關病毒的多重螢光pcr方法，包括以下步驟：
16.(1)以待測樣本的dna或cdna為模板，使用上述的多重螢光pcr引物探針組或上述的試劑盒進行pcr擴增；
17.(2)根據有無擴增曲線和ct值，判斷待測樣本是否為四種貓腹瀉相關病毒。
18.進一步地，若有擴增曲線，且滿足ct≤35，說明待測樣本為所述多重螢光pcr引物探針組的螢光基團對應的貓腹瀉相關病毒；若無擴增曲線，說明待測樣本不是四種病毒中的任何一種。
19.進一步地，所述pcr擴增的擴增體系包括以下組分：2x taqman fast qpcr master mix 10μl，上下遊引物各0.4μl，探針各0.2μl，模板dna 1μl，ddh2o補足至20μl。
20.進一步地，所述pcr擴增的擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性5s，60℃檢測信號30s，循環40次。
21.本發明還提供一種如上述的多重螢光pcr引物探針組或上述的試劑盒在檢測貓腹瀉相關病毒中的應用。
22.本發明公開了以下技術效果：
23.本發明提供了一種檢測多種新發貓腹瀉病毒的試劑盒及檢測方法，該方法能同時檢測並鑑別貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒，具有良好的靈敏性、特異性和重複性。本發明的方法最低檢測限可達到每個病毒1
×
102拷貝數，相比常規pcr靈敏了100-1000倍；本發明所設計的貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的
上下遊引物和特異性探針特異性高，不會與貓冠狀病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒和貓茶帕病毒產生交叉反應造成假陽性；同時本發明的方法具有較好的重複性，重複實驗結果穩定，對不同環境下不同人員進行的實驗組採集數據，組間分析與組內分析變異係數均小於0.05。
24.本發明的方法首次提供了貓庫布病毒的螢光定量pcr檢測方法，填補了市場上該新發病毒檢測方法的缺口，完善了針對貓腹瀉病毒臨床診斷的醫療體系。本發明的方法能夠為貓腹瀉的病原學調查提供快速、可靠的檢測方法，針對國內新發貓腹瀉相關病毒進行檢測鑑定和監控，相比傳統方法在提高效率和精準度的同時降低人力與物力消耗，高效並便捷地對常見貓病毒性腹瀉做出病原診斷。
附圖說明
25.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
26.圖1為陽性對照品和陰性對照品擴增結果圖；其中1-4為陽性對照品擴增結果：1：1
×
108copies/μl的貓博卡病毒1型質粒模板；2：1
×
108copies/μl的貓細小病毒質粒模板；3：1
×
108copies/μl的貓庫布病毒質粒模板；4：1
×
108copies/μl的貓星狀病毒質粒模板；5為陰性對照品擴增結果；
27.圖2為多重螢光定量pcr的靈敏性結果；從左往右依次為拷貝數1
×
108copies/μl至1
×
102copies/μl的貓博卡病毒1型、貓細小病毒、貓庫布病毒和貓星狀病毒的標準質粒擴增結果；
28.圖3為多重螢光定量pcr的標準曲線圖；
29.圖4為多重螢光定量pcr特異性結果圖；其中1-4分別為貓博卡病毒1型、貓細小病毒、貓庫布病毒和貓星狀病毒的標準質粒，5-9分別為貓冠狀病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓茶帕病毒和ddh2o。
具體實施方式
30.現詳細說明本發明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應認為是對本發明的限制，而應理解為是對本發明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。
31.應理解本發明中所述的術語僅僅是為描述特別的實施方式，並非用於限制本發明。另外，對於本發明中的數值範圍，應理解為還具體公開了該範圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述範圍內的中間值以及任何其他陳述值或在所述範圍內的中間值之間的每個較小的範圍也包括在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括或排除在範圍內。
32.除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。雖然本發明僅描述了優選的方法和材料，但是在本發明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用併入，用以公開和描述與所述文獻相關的方法和/或材料。在與任何併入的
文獻衝突時，以本說明書的內容為準。
33.在不背離本發明的範圍或精神的情況下，可對本發明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。由本發明的說明書得到的其他實施方式對技術人員而言是顯而易見的。本發明說明書和實施例僅是示例性的。
34.關於本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」、「含有」等等，均為開放性的用語，即意指包含但不限於。
35.實施例1同時檢測四種貓腹瀉相關病毒的螢光定量pcr方法
36.1.取腹瀉貓糞便樣本，用病毒基因組dna/rna提取試劑盒(dp315，天根，北京)進行核酸提取，得到樣本中的總核酸，即總dna和總rna，於-20℃保存；
37.2.取一部分步驟1中提取的總核酸，運用fastking rt kit反轉錄試劑盒(kr116，天根，北京)進行反轉錄，得到對應樣本cdna；混合待測樣本的dna和cdna，得到待檢樣本核酸。
38.3.目標基因的選擇和引物探針的設計，見表1：
39.表1上下遊引物和探針的序列信息
[0040][0041][0042]
4.打開qpcr儀器預熱準備檢測，取出qpcr儀器對應的反應試劑八連管，進行樣本核酸、陽性對照品和陰性對照品的加樣，每個樣孔體系均為20μl；a.樣本核酸孔：以樣本核酸為模板，分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博
卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的上遊和下遊引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，樣本核酸模板1μl，ddh2o補足至20μl；b.陽性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，1μl陽性對照品模板(包含貓細小病毒質粒、貓博卡病毒1型質粒、貓庫布病毒質粒和貓星狀病毒質粒，拷貝數均為1
×
108copies/μl)，ddh2o補足至20μl；c.陰性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，ddh2o補足至20μl。
[0043]
5.將加好樣的八聯管上機檢測。a.循環條件設置：94℃預變性3min；94℃變性5s，60℃檢測信號30s，循環40次。b.儀器檢測通道選擇：螢光通道設定為fam、hex、cy5和texas red。
[0044]
6.收集儀器反應結束每個樣孔的ct值，進行有效性判斷。陰性對照品應無ct值或者為0，陽性對照品ct值應≤35，否則，本次實驗結果無效。陽性對照品和陰性對照品的擴增結果見圖1，其中1-4為陽性對照品擴增結果：1：1
×
108copies/μl的貓博卡病毒1型質粒模板；2：1
×
108copies/μl的貓細小病毒質粒模板；3：1
×
108copies/μl的貓庫布病毒質粒模板；4：1
×
108copies/μl的貓星狀病毒質粒模板；5為陰性對照品擴增結果。
[0045]
7.確定實驗結果有效後，對樣本陽性進行判斷。a.texas red通道ct值≤35時視為貓細小病毒陽性，否則為貓細小病毒陰性。b.cy5通道ct值≤35時視為貓博卡病毒1型陽性，否則為貓博卡病毒1型陰性。c.fam通道ct值≤35時視為貓庫布病毒陽性，否則為貓庫布病毒陰性。d.hex通道ct值≤35時視為貓星狀病毒陽性，否則為貓星狀病毒陰性。
[0046]
實施例2多重螢光定量pcr的靈敏性分析
[0047]
1.取陽性對照品，裡面含有貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的重組質粒模板，所有模板拷貝數均為1
×
108copies/μl。對陽性對照品進行10倍梯度稀釋，具體步驟如下：a.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl陽性對照品，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
107copies/μl的質粒樣。b.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl操作a中所得的1
×
107copies/μl質粒樣，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
106copies/μl的質粒樣。c.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl操作b中所得的1
×
106copies/μl質粒樣，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
105copies/μl的質粒樣。d.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl操作a中所得的1
×
105copies/μl質粒樣，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
104copies/μl的質粒樣。e.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl操作a中所得的1
×
104copies/μl質粒樣，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
103copies/μl的質粒樣。f.取90μl ddh2o至ep管內，再加入10μl操作a中所得的1
×
103copies/μl質粒樣，吹打混勻後震蕩離心，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的質粒拷貝數均為1
×
102copies/μl的質粒樣。
[0048]
2.將陽性對照品和步驟1中所得的六個質粒樣組成一套10倍梯度稀釋的標準質粒
樣，進行加樣。打開qpcr儀器預熱準備檢測，取出qpcr儀器對應的反應試劑八連管，進行標準質粒樣孔和陰性對照品孔的加樣，每個樣孔體系均為20μl。a.標準質粒樣孔：以稀釋好的每個質粒樣為模板，分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，1μl質粒樣模板，ddh2o補足至20μl；b.陰性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，ddh2o補足至20μl；
[0049]
3.將加好樣的八聯管上機檢測。a.循環條件設置：94℃預變性3min；94℃變性5s，60℃檢測信號30s，循環40次。b.儀器檢測通道選擇：螢光通道設定為fam、hex、cy5和texas red。
[0050]
4.收集儀器反應結束每個樣孔的ct值，進行有效性判斷。陰性對照品應無ct值或者為0，否則，本次實驗結果無效。
[0051]
5.確定實驗結果有效後，進行標準曲線的構建，得出反應最低檢測限。
[0052]
圖2為多重螢光定量pcr的靈敏性結果；從左往右依次為拷貝數1
×
108copies/μl至1
×
102copies/μl的貓博卡病毒1型、貓細小病毒、貓庫布病毒和貓星狀病毒的標準質粒擴增結果，該四種病毒最低共同檢測限為1
×
102copies/μl。
[0053]
圖3為多重螢光定量pcr的標準曲線圖；根據貓博卡病毒1型、貓細小病毒、貓庫布病毒和貓星狀病毒的標準質粒擴增結果構建標準曲線圖，其中貓博卡病毒1型相關係數(r2＝0.996)；貓細小病毒相關係數(r2＝0.9985)；貓庫布病毒相關係數(r2＝0.9997)；貓星狀病毒相關係數(r2＝0.998)。
[0054]
結合圖2-3實驗結果可知，所有病毒相關係數均大於0.995，本發明對貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的重組質粒模板最低檢測限度為1
×
102copies/μl。
[0055]
實施例3多重螢光定量pcr的特異性分析
[0056]
1.取貓冠狀病毒(genbank序列號：mt444152)、貓杯狀病毒(genbank序列號：mt649084)、貓茶帕病毒(genbank序列號：mt708231)和貓皰疹病毒(fel-0 vax pct feline vaccine,boehringer-ingelheim，疫苗株)的病毒株並提取核酸，得到相應病毒的dna和cdna作為模板。
[0057]
2.取陽性對照品，裡面包含貓細小病毒(genbank序列號：mt614366)、貓博卡病毒1型(genbank序列號：mt577646)、貓庫布病毒(genbank序列號：on219928)和貓星狀病毒(genbank序列號：mn977118)的重組質粒。
[0058]
3.分別對貓冠狀病毒、貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓茶帕病毒、陽性對照品和陰性對照品進行加樣。a.病毒核酸孔：以貓冠狀病毒cdna、貓杯狀病毒cdna、貓皰疹病毒dna和貓茶帕病毒dna分別為模板，分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，1μl模板，ddh2o補足至20μl；b.陽性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒
和貓星狀病毒的探針各0.2μl，1μl陽性對照品模板，ddh2o補足至20μl；c.陰性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，ddh2o補足至20μl。
[0059]
4.將加好樣的八聯管上機檢測。a.循環條件設置：94℃預變性3min；94℃變性5s，60℃檢測信號30s，循環40次。b.儀器檢測通道選擇：螢光通道設定為fam、hex、cy5和texas red。
[0060]
5.收集儀器反應結束每個樣孔的ct值，進行有效性判斷。陰性對照品應無ct值或者為0，否則，本次實驗結果無效。
[0061]
圖4為多重螢光定量pcr特異性結果圖，其中1-4分別為貓博卡病毒1型、貓細小病毒、貓庫布病毒和貓星狀病毒的標準質粒，5-9分別為貓冠狀病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓茶帕病毒和ddh2o。
[0062]
6.確定實驗結果有效後，分析實驗結果。圖4結果顯示，僅貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒出現了典型的擴增曲線。而其它病毒基因組均無擴增曲線出現，表明該方法具有良好的特異性。
[0063]
實施例4多重螢光定量pcr的重複性分析
[0064]
1.根據實施例2中的步驟1，得到一套貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的重組質粒模板拷貝數均由1
×
108copies/μl至1
×
102copies/μl的一套標準質粒。進行標準質粒樣孔和陰性對照品孔的加樣，每個樣孔體系均為20μl。a.標準質粒樣孔：以稀釋好的每個質粒樣為模板，分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，1μl質粒樣模板，ddh2o補足至20μl；b.陰性對照孔：分別加入10μl的2x taqman fast qpcr master mix酶混合液，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的引物各0.4μl，貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的探針各0.2μl，ddh2o補足至20μl；標準質粒每個濃度設3個重複樣孔，用本發明建立的多重螢光定量pcr方法進行檢測並確定實驗結果有效，作為組內重複性試驗。
[0065]
2.由不同的實驗人員在在相同條件下重複進行三次獨立的步驟1實驗，作為組間重複性試驗。
[0066]
3.收集組內重複性實驗和組間重複性實驗的ct值，分別計算平均數和變異係數，來驗證該方法的重複性。
[0067]
4.組內重複性分析和組間重複性分析的結果見表2，結果顯示所有變異係數均小於0.05，表明該方法具有良好的重複性和穩定性。
[0068]
表2多重螢光定量pcr重複性分析結果
[0069][0070]
實施例5可疑樣本的臨床檢測
[0071]
根據實施例1的方法對135份腹瀉貓糞便可疑樣本進行臨床檢測，得到多重螢光定量pcr檢測樣本病毒感染率結果見表3。再對該135份腹瀉貓糞便可疑樣本運用普通pcr方法進行檢測，具體實施步驟如下：
[0072]
1.按實施例1中的步驟1和2得到135份待檢可疑樣本核酸。
[0073]
2.取540個0.1ml離心管，以4個離心管為一個樣品小組，總共135個樣品小組分別對應135個可疑樣本核酸進行加樣。
[0074]
3.每個樣品小組的4個離心管分別對應加入貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的上遊和下遊引物各0.5μl；統一加入樣品小組對應可疑樣本核酸1μl、2
×
taq pcr mastermixⅱ10μl，ddh2o補足至20μl。
[0075]
4.將加好樣的離心管上機檢測。循環條件設置：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環40次；72℃再延伸10min。
[0076]
5.製備核酸電泳膠，具體實施步驟如下：a.取10g瓊脂糖(agarose)加入500ml 1
×
tae溶液中混勻，室溫時為渾濁溶液，加入微波爐中或水浴加熱使其高溫溶解成澄清透明狀粘稠溶液。b.待瓊脂糖溶液降溫至60℃左右，加入50μl核酸染料(本次加入為50μl spark goldview)，混勻後將含有核酸染料的瓊脂糖溶液倒入已插好膠梳的制膠模中待其凝固。c.凝固後得到2％的帶孔核酸膠，可直接進行後續點樣跑膠步驟。f.對pcr產物進行點樣和核酸電泳，具體實施步驟如下：a.將制好的核酸膠放入核酸瓊脂糖水平電泳儀中，往電泳槽中倒入1
×
tae溶液至浸沒膠體。b.在每塊膠第一個孔加入dna marker(本次加入為d2000 dna marker)，取pcr結束後的反應產物進行加樣，每個離心管對應一個膠孔。c.加樣完畢後進行核酸電泳，電泳儀設置：電壓120v、電流不限、電泳時長30min。d.電泳完畢後取出膠體置於紫外燈下觀察，通過dna marker條帶位置確定貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的目的條帶位置，其中貓細小病毒目的條帶位置在126bp、貓博卡病毒1型目的條帶位置在114bp、貓星狀病毒目的條帶位置在137bp、貓庫布病毒目的條帶位置在112bp。若樣本孔泳道無條帶則為病毒陰性；若樣本孔泳道出現條帶並與對應病毒目的條帶位置一致，則可確定為對應病毒感染。
[0077]
6.對每個樣品小組分別進行觀察分析防止混淆出錯，統計並收集135個可疑樣本的普通pcr檢測數據，匯總得到普通pcr檢測樣本病毒感染率結果見表4。
[0078]
根據表3和表4數據可得，針對樣本中腹瀉病毒總陽性、單病毒感染和混合感染情況分別進行分析，本發明所提供的多重螢光定量pcr檢測方法的檢測結果均優於普通pcr。
對比於動物醫院和獸醫診療所在臨床診斷上使用較多的普通pcr檢測方法，本發明所提供的多重螢光定量pcr檢測方法的靈敏性較高，對可疑樣本的檢出率高，在臨床診斷中能更靈敏和精確地對病毒進行檢測和鑑別。同時本發明所提供的多重螢光定量pcr檢測方法省去了制膠跑膠觀察條帶等傳統pcr的必須步驟，可做到通過直觀的數據分析得出結果；並能夠在單個反應管內同時檢測單個樣本中的四個病毒，相當於節省了四倍試劑酶消耗並同時地減少了人員工作量和診斷時間，節省了目前臨床上在貓腹瀉病毒診斷環節的人力物力資源消耗，同時提高了檢測效率和精確度。
[0079]
表3多重螢光定量pcr檢測樣本病毒感染率結果
[0080][0081][0082]
表4普通pcr檢測樣本病毒感染率結果
[0083][0084]
實施例6病毒質粒的構建
[0085]
本試劑盒中的陽性對照品內含有貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的重組質粒模板，所有模板拷貝數均為1
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108copies/μl。質粒的構建過程如下：1.取含有貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒毒株的陽性樣本，其中病毒
序列均通過公司測序鑑定並上傳至genbank獲得對應序列號，貓細小病毒(genbank序列號：mt614366)、貓博卡病毒1型(genbank序列號：mt577646)、貓庫布病毒(genbank序列號：on219928)和貓星狀病毒(genbank序列號：mn977118)。
[0086]
2.取病毒陽性樣本，用病毒基因組dna/rna提取試劑盒(dp315，天根，北京)進行核酸提取，得到樣本中的總核酸，即總dna和總rna，於-20℃保存；
[0087]
3.取一部分步驟2中提取的總核酸，運用fastking rt kit反轉錄試劑盒(kr116，天根，北京)進行反轉錄，得到對應樣本cdna；混合待測樣本的dna和cdna，得到目的病毒核酸。
[0088]
4.取4個0.1ml離心管，分別對應加入貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的上下遊引物各0.5μl，2
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taq pcr mastermixⅱ10μl、目的病毒核酸1μl，ddh2o補足至20μl。
[0089]
5.將加好樣的離心管上機進行普通pcr擴增。循環條件設置：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環40次；72℃再延伸10min。
[0090]
6.製備2％核酸電泳膠，取dna marker和pcr擴增產物點樣進行核酸電泳，電泳結束後膠體置於紫外燈下觀察。確定病毒目的條帶位置，其中貓細小病毒目的條帶位置在126bp、貓博卡病毒1型目的條帶位置在114bp、貓星狀病毒目的條帶位置在137bp、貓庫布病毒目的條帶位置在112bp。目的條帶在紫外燈下呈明亮的淡綠色，目的膠塊為病毒對應目的條帶明亮部分的膠塊。分別切下貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的目的膠塊。
[0091]
7.用普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒(dp209，天根，北京)對目的膠塊進行膠回收，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的純化目的片段，目的片段序列經公司測序鑑定，詳細序列見表5。
[0092]
8.取克隆載體pmd 19-t質粒(pmd
tm 19-t vector cloning kit，takara，北京)加入純化目的片段進行載體連接，分別得到連接有貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒目的片段的重組質粒。
[0093]
9.將貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的重組質粒分別轉化入dh5α感受態細胞(cb101，天根，北京)，塗布於氨苄抗性lb培養基平板，37℃過夜培養。
[0094]
10.第二天分別挑取貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的單克隆菌株於氨苄抗性lb液體培養基中搖菌擴增，搖床搖速200r/min，37℃搖菌8h。
[0095]
11.得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒渾濁菌液，用質粒小量抽提試劑盒(d0007m，碧雲天，上海)分別抽提菌液中的重組質粒，得到貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒的粗質粒。
[0096]
12.通過核酸濃度測定儀確定貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒粗質粒的濃度，分別進行倍比稀釋得到模板拷貝數均為4
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108copies/μl的貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒重組質粒。
[0097]
13.將步驟12中稀釋好的模板拷貝數均為4
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108copies/μl的貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒重組質粒，等比等容混勻最終得到含有模板拷貝數均為1
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108copies/μl的貓細小病毒、貓博卡病毒1型、貓庫布病毒和貓星狀病毒重組質粒的陽性標準品。
[0098]
表5病毒目的片段序列
[0099][0100]
以上所述的實施例僅是對本發明的優選方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。