用於阻止木蝨進食的組合物和方法與流程
2023-10-20 16:07:17
本申請要求2014年6月6日提交的美國臨時申請號62/008,934(其在此以其整體通過引用併入)的權益。發明領域本發明總體涉及表達昆蟲抑制蛋白的植物的領域。具體而言，本發明涉及針對作物植物諸如茄科和柑橘植物的農業相關害蟲(具體地半翅類吸汁害蟲(hemipteroidsap-suckinginsectpests)，諸如亞洲柑橘木蝨、非洲柑橘木蝨、美洲柑橘木蝨和馬鈴薯/番茄木蝨(Bactericeracockerelli))表現出昆蟲抑制活性的蛋白。發明背景木蝨是通常在單一植物或幾種相關植物上進食的小的韌皮部進食性昆蟲。它們可以充當可以作為植物害蟲發揮作用的不同微生物物種的載體。它們也被懷疑當它們進食時向植物物種遞送毒素，引起發病。來自亞洲、非洲和美洲的柑橘木蝨是在柑橘樹的葉和莖上進食的小的害蟲。這些木蝨傳播稱為黃龍病(Huanglongbing,HLB)(也稱為柑橘青果病)的細菌性疾病。所有柑橘和密切相關的物種是柑橘木蝨昆蟲和HLB病的易感宿主。在木蝨在受感染的植物組織上進食之後，該細菌性疾病被木蝨傳播至健康樹。一旦柑橘樹被HLB感染，就無法治癒，且植物將最終死亡。目前預防該疾病殺死柑橘樹的最好方法是阻止這些柑橘木蝨。馬鈴薯/番茄木蝨(Bactericeracockerelli)已經是茄科作物(包括馬鈴薯、番茄、胡椒和茄子)的長期害蟲。其可以通過直接進食損害植物，懷疑遞送植物毒素，並且還傳播細菌病原體Liberibacterpsyllaurous和Liberibactersolanacearum。在馬鈴薯中，其據認為引起稱為木蝨黃斑(psyllidyellows)的全身性疾病，其包括生長減少、葉子變黃、新葉子直立、葉異常、節間縮短和增厚、節增大、空心塊莖、過早衰老和早期植物死亡。在番茄中，葉子症狀與馬鈴薯的症狀相似，並且可以降低坐果(fruitset)、大小、質地(texture)和產量。馬鈴薯/番茄木蝨和L.solanacearum的傳播也已與馬鈴薯中的斑馬片病相關，其引起萎縮、萎黃病、上部生長的腫脹節間、腋芽繁殖、空心塊莖、脈管系統褐變、葉焦枯和過早植物死亡。已經使用不同的殺蟲劑對抗馬鈴薯/番茄木蝨，然而，最近在加利福尼亞的木蝨種群中已經檢測到對常見處理的一些抗性(Butler和Trumble,TerrestrialArthropodReviews,5,87-111,2012)。目前還沒有將消除木蝨和在柑橘果園或茄科作物田間內的病原體傳播的風險的防治方法。抑制木蝨侵染的方法將可能減緩疾病的傳播並保持作物生產的經濟可行性。鑑於這些問題，開發了本文所述的發明。發明概述我們已經發現，來自定殖於昆蟲的多毛菌屬(Hirsutella)真菌和來自蔥屬植物(洋蔥科)的幾種基因和本文描述的其他基因，當在轉基因植物中表達時，可用於抑制木蝨昆蟲的進食。因此，本發明提供可用於保護植物免於由木蝨引起的疾病(例如柑橘青果病和斑馬片病)的經純化的核酸分子、載體(諸如表達載體)、細胞、植物和植物組分、產物和方法。在一個方面，本發明的特徵在於包括編碼異源多肽的轉基因的植物，所述多肽對表達所述多肽的植物賦予對半翅類吸汁害蟲的抗性(如本文所述)。在優選實施方案中，所述昆蟲是木蝨，諸如亞洲柑橘木蝨。在其他優選實施方案中，所述植物對木蝨的侵染具有抗性。在還有其他優選實施方案中，所述植物對木蝨的進食具有抗性。因此，本發明的特徵在於對吸汁昆蟲無吸引力的植物。在特別優選的實施方案中，所述植物是柑橘植物。因此，示例性植物包括芸香科的任何成員，包括但不限於橙、檸檬、酸橙和葡萄柚植物。優選地，所述轉基因與用於表達多肽的調節序列(諸如異源調節序列)可操作連接，並且其中所述調節序列包括啟動子(例如，組成型啟動子或細胞特異性啟動子，諸如在植物的韌皮部細胞或韌皮部組織中有活性的啟動子)。示例性多肽與如本文所述的HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1實質上相同。在其他優選實施方案中，根據常規技術(如本文所述)堆疊編碼所述多肽的多核苷酸。還考慮轉基因植物或植物組分中的一種或多種多核苷酸的組合。表達此類多核苷酸的植物通常證明與對照植物相比增加的產量。在另一個方面，本發明的特徵在於衍生自表達本文所述的任何多核苷酸的轉基因植物的產物，其中所述產物包括可檢測量的轉基因或從所述多核苷酸表達的多肽。優選地，所述產物是柑橘產物或茄科植物產物。在又另一個方面，本發明的特徵在於後代植物或種子，其中所述後代植物或種子包括表達本文所述的一種或多種多核苷酸的轉基因。在一些實施方案中，所述後代植物或種子包括賦予對除草劑的抗性的除草劑抗性基因。在另一個方面，本發明的特徵在於與HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1(各自描述於本文中)具有實質同一性的多核苷酸，任選地其中所述多核苷酸與用於表達所述多肽的調節序列可操作連接，並且其中所述調節序列包括啟動子。在另一個方面，本發明的特徵在於表達構建體，其包括表達一種或多種多肽的多核苷酸，所述多肽對植物賦予對半翅類吸汁昆蟲的抗性。示例性多核苷酸是與HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)、ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1具有實質同一性的那些。在其他優選實施方案中，所述多核苷酸與選自HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)、ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1的序列的至少20個連續核苷酸互補。在其他優選實施方案中，所述多核苷酸與異源調節序列諸如CaMV35S啟動子、CaMV35S串聯啟動子、Shpx6b啟動子、SUS1啟動子或CsSUS1啟動子可操作連接。在還有其他優選實施方案中，所述多核苷酸與nos-終止子可操作連接。在還有其他優選實施方案中，所述多核苷酸在植物的韌皮部組織中表達。在另一個方面，本發明的特徵在於包括本文所述的多核苷酸或表達構建體中的一種或多種的植物細胞，植物或植物組分。具體而言，本發明的特徵在於作為柑橘屬的成員的植物，諸如甜橙(Citrussinensis)、甜橙L.Osbeck『Hamlin』或甜橙L.Osbeck『Valencia』。在又另一個方面，本發明的特徵在於通過營養繁殖繁殖如本文所述的任何轉基因植物(諸如柑橘和馬鈴薯)。在又另一個方面，本發明的特徵在於衍生自包括本文所述的多核苷酸中的一種或多種的植物細胞、植物或植物組分的產物，其中所述產物包括可檢測量的重組多核苷酸。在優選實施方案中，所述產物是柑橘產物或茄科產物，其可以包括但不限於柑橘果實、柑橘果汁和柑橘果汁濃縮物。在其他方面，本發明的特徵在於防治半翅類吸汁昆蟲的方法，所述方法包括將所述昆蟲暴露於包括本文所述的多核苷酸中的一種或多種的植物細胞、植物或植物組分，其中所述植物細胞、植物或植物組分表達抑制昆蟲(例如直接或間接)進食的多肽。通常，所述方法，例如，涉及使植物對木蝨進食或侵染不太有吸引力。在另一個優選方面，本發明的特徵在於使植物對柑橘青果病具有抗性的方法，所述方法包括以下步驟：將本文所述的多核苷酸中的一種或多種引入植物細胞；和從所述植物細胞再生表達昆蟲抑制量的由所述多核苷酸編碼的多肽的轉基因植物；和任選地證明亞洲柑橘木蝨抗性作為轉基因柑橘植物或轉基因柑橘植物組分的特性。再次，所述方法通常涉及使植物對木蝨進食或侵染不太有吸引力。在又另一個優選方面，本發明的特徵在於使植物對斑馬片病和木蝨黃斑具有抗性的方法，所述方法包括以下步驟：將本文所述的多核苷酸中的一種或多種引入植物細胞；和從所述植物細胞再生表達昆蟲抑制量的由所述多核苷酸編碼的多肽的轉基因植物；和任選地證明馬鈴薯/番茄木蝨抗性作為轉基因茄科植物或轉基因茄科植物組分的特性。在另一個方面，本發明的特徵在於用於獲得柑橘果汁的方法，所述方法通常涉及提供收穫自表達賦予對半翅類吸汁害蟲的抗性的多肽的植物的果實，並從植物諸如由此類植物提供的果實提取柑橘果汁。在優選實施方案中，從柑橘植物的果實諸如橙、檸檬、酸橙或葡萄柚提取果汁。在其他優選實施方案中，所述方法進一步涉及濃縮柑橘果汁。在還有其他優選實施方案中，所述方法進一步涉及強化柑橘果汁(例如，維生素和營養素硫胺素和鉀，維生素D和鈣)。此外，如果需要，所述方法進一步涉及強化柑橘果汁濃縮物。在還有其他方面，本發明的特徵在於獲得柑橘類果實諸如橙、檸檬、酸橙和葡萄柚的方法，所述方法涉及從表達賦予對半翅類吸汁昆蟲的抗性的多肽的植物收穫果實。「核酸分子」或「多核苷酸」意指具有兩個或更多個共價鍵合的、天然存在或修飾的核苷酸的序列的分子，例如RNA或DNA。所述核酸分子可以是例如單鏈或雙鏈的，並且可以包括修飾或未修飾的核苷酸，或其混合物或組合。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。「核酸片段」或「多核苷酸片段」意指核酸分子的連續區段。核酸區段的長度可以範圍為至少一個鹼基對(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450個鹼基對)直至核酸分子的全長。當核酸分子在本文中被稱為具有多於一個核酸片段時，應當理解這些核酸片段可以佔據核酸分子的非重疊部分。「序列同一性」(在比較核酸分子或核酸片段的序列與參考序列或比較多肽的胺基酸序列與參考序列的上下文中)意指，當核酸分子或核酸片段的全長序列與參考序列的全長最佳比對時，核酸分子或核酸片段與參考序列具有相同的序列或具有指定百分比的在參考序列內的對應位置處相同的核苷酸。在該上下文中，參考較長序列的長度計算兩個序列之間相同的核苷酸的百分比。可以在DNA和DNA、RNA和RNA或DNA和RNA之間計算序列同一性。當在DNA和RNA之間計算序列同一性時，本領域充分理解，為了該計算的目的，胸苷殘基等同於尿嘧啶殘基。此外，本領域充分理解的是，如果反向互補序列與參考序列的百分比序列同一性大於正向序列的百分比序列同一性，則百分比序列同一性是前一量。例如，Needleman-Wunsch算法可以用於基於最佳總體比對來確定序列同一性。同樣可以根據標準方法在多肽之間計算序列同一性。用於測定核酸序列同一性或多肽同一性的電腦程式(例如，蛋白blast)可以在例如歐洲生物信息學研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI)網站公開獲得或使用在國家醫學圖書館(NationalLibraryofMedicine)網站找到的BLAST®。「實質上相同」(在比較核酸分子或核酸片段的序列與參考序列或比較多肽的胺基酸序列與參考序列的上下文中)意指，所述序列具有至少85％(例如，至少85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的序列同一性，如使用上述方法所計算的。「對植物害蟲的抗性」意指大於相對於對照植物(例如，非轉基因植物)的抗性水平的轉基因植物(或植物組分或細胞)中對害蟲(例如，半翅類吸汁昆蟲，諸如木蝨，諸如亞洲柑橘木蝨)的抗性水平。在一個實施方案中，轉基因植物中對害蟲的抗性水平比對照植物的抗性高至少5至10％(且優選20％、30％或40％)。在其他實施方案中，對害蟲的抗性水平比對照植物高50％、高60％且更優選甚至高75％或90％；其中與對照植物相比高達100％的抗性是最優選的。使用常規方法測量抗性水平。例如，通過比較相比於對照葉的轉基因葉對木蝨的無吸引力性來測定對木蝨的抗性水平。在另一個實例中，測定對木蝨侵染的抗性水平。並且在仍另一個實例中，在轉基因植物比對照植物中測定對木蝨進食的抗性水平，作為確定表達異源多肽以便為植物賦予抗性的有效性的量度，如本文所述。「可操作連接」意指基因和調節序列以這樣的方式連接，所述方式使得當適當分子(例如，轉錄激活蛋白)與調節序列結合時允許基因表達。「多肽」或「蛋白」意指任何胺基酸鏈，而無論長度或翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。「植物細胞」意指由半透膜界定且含有質體的任何自我繁殖細胞。如果期望進一步繁殖，此類細胞還需要細胞壁。如本文所使用的植物細胞包括但不限於獲得自種子、懸浮培養物、胚、分生組織區、愈傷組織、葉、根、枝、花粉和小孢子的任何細胞。「植物組分」意指獲得自完整植物的部分、區段、插條、液體、纖維或器官。示例性植物組分包括但不限於種子、體細胞胚、樹皮、葉、莖、花粉、根、枝、花、卷鬚、果實、接穗和根狀莖、果汁和果汁濃縮物以及用於營養繁殖的任何植物部分。「轉基因」意指通過人為插入細胞中並成為從該細胞發育的生物體的基因組的一部分的核酸分子(例如，DNA)的任何片段。此類轉基因可以包括對轉基因生物體部分或完全異源(即外源)的基因，或者可以代表與生物體的內源基因具有序列同一性的基因。「轉基因的」意指包括通過人為插入細胞中並成為從該細胞發育的生物體的基因組的一部分的分離核酸分子(例如，DNA序列)的任何細胞。如本文所使用，轉基因生物體通常是轉基因植物，並且DNA(例如，轉基因)通過人為插入核或質體基因組中。轉基因植物可以含有本文所述的分離核酸分子中的一種或多種。如本文所討論，已經鑑定、分離或工程改變和表徵了幾種多核苷酸，其可用於提供對木蝨的抗性。因此，本發明為針對害蟲保護植物提供了許多重要的進步和優點。例如，本發明有助於用於通過阻止害蟲進食來針對植物害蟲的植物中保護的有效和經濟的方法。此類針對害蟲的保護減少或儘可能減少傳統化學實踐(例如，施用殺細菌劑或殺蟲劑或兩者)的需求，所述傳統化學實踐通常由農民用於防治植物害蟲的傳播和提供針對致病害蟲諸如亞洲柑橘木蝨和馬鈴薯/番茄木蝨的保護。此外，因為具有本文所述的多核苷酸中的一種或多種的植物對害蟲及其疾病不太脆弱，所以本發明進一步提供增加的生產效率，以及改善農作物植物諸如柑橘作物植物和茄科植物的質量和產量。因此，本發明有助於產生高質量和高產量的基於柑橘的農產品，例如由害蟲引起的斑點、瑕疵和汙點減少(包括由於HLB導致的青果病減少)的果實、果汁以及作物；保質期增加和處理成本降低的農產品；以及用於農業，工業和商業目的的高質量和產量作物。此外，因為本發明減少針對植物害蟲的化學保護的必要性，所以本發明有利於作物生長的環境。詳述本申請描述了製備具有木蝨害蟲抗性的轉基因植物或轉基因植物組分；特別是，例如，阻止轉基因柑橘植物或植物組分諸如但不限於『Hamlin』或『Valenicia』甜橙、番茄和馬鈴薯上木蝨的進食或侵染。害蟲抑制性多核苷酸和多肽與以下序列實質上相同的多核苷酸可用於生成具有對半翅類吸汁昆蟲的抗性(諸如使植物或植物組分對例如木蝨無吸引力)的轉基因植物。可以設計合成的多核苷酸序列，使得它們將在植物中表達。用於合成植物基因以改善由合成的基因編碼的蛋白的表達水平的各種標準方法是本領域已知的。此類方法通常涉及修飾外源轉基因的結構基因序列，以使它們被植物更有效地轉錄、加工、翻譯和表達。在植物中良好表達的基因的特徵包括消除可以引起基因轉錄物的編碼區中的不期望的內含子剪接或聚腺苷酸化的序列，同時實質性保留表達的多肽的胺基酸序列。1.多毛菌素(Hirsutellin)A(「HtA」)：來自真菌多毛菌的核糖體毒素基因a.「天然」b.多肽：c.「短」d.多肽：2ASAL：來自大頭蒜(Alliumampeloprasum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：3.ASALR：來自玫瑰紅蔥(Alliumroseum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：4.ACA：來自洋蔥變種aggregatum(Alliumcepavar.aggregatum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：5.ACT：來自韭菜(Alliumtuberosum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：6.MpNPR1：參與蘋果中的基礎植物抗性的調節基因a.核苷酸序列：b.多肽序列：7.CsNPR1：參與柑橘中的基礎植物抗性的調節基因根據標準方法分離和鑑定有用的CsNPR1序列。例如，使用E.Z.N.A.植物DNA提取試劑盒根據製造商的說明書(OmegaBio-Tek,Norcross,GA)從甜橙栽培種valencia(C.sinensiscv.valencia)(FourWindsGrowers,Winters,CA)提取基因組DNA。由於先前沒有公開來自甜橙的CsNPR1序列，所以首先使用基於用來自Malusxdomestica的已知MpNPR1mRNA序列(GenBank登錄號EU624123.1)進行的CLUSTAL比對設計的簡併引物克隆包括編碼序列的5'部分的基因組區域。將使用1μM最終濃度的引物CsNPR1degF1(tggctgtgactatagtgatgct)(SEQIDNO:21)和CsNPR1degR1(ccctaaccttctgatttgcacc)(SEQIDNO:22)以及GoTaqHotStartMastermix(Promega,Madison,WI)從甜橙基因組DNA擴增近似1800-bp片段。循環參數為95℃持續2分鐘，35個循環的95℃持續30秒、50℃持續30秒、72℃持續1分鐘，且最終72℃延伸5分鐘。然後根據Liu等人(PlantMolBiolRep19:261-267,2001)實施基因組末端的5』快速擴增(RAGE)以克隆CsNPR1編碼序列上遊的區域。簡而言之，使用OMEGASP植物DNAmidi試劑盒根據製造商的說明書(OmegaBio-Tek)從甜橙栽培種valencia葉提取基因組DNA，並使用最初設計為在CsNPR1編碼序列的5'末端附近退火的引物進行PCR。使用基因步行策略進行性獲得上遊5'片段。然後將所有PCR產物克隆至測序載體諸如pGEM-Teasy(Promega)中。植物表達構建體用於在植物諸如茄科和柑橘植物中的表達盒的構建是充分確立的。表達盒是其中可操作連接各種啟動子、編碼和聚腺苷酸化序列的DNA構建體。一般而言，表達盒通常包含可操作連接至目標序列的啟動子，所述目標序列可操作連接至聚腺苷酸化或終止子區域。在某些情況(包括但不限於轉基因在植物中的表達)下，包括內含子序列也可能是有用的。當包括內含子序列時，其通常位於轉基因的5'非翻譯前導區。在某些情況下，在轉基因中引入特定5'非翻譯序列以增強轉錄物穩定性或促進轉錄物的有效翻譯也可能是有用的。在本發明的實踐中可以使用多種啟動子。有用啟動子的一個廣泛類別被稱為「組成型」啟動子，因為它們在整個植物發育中在大多數植物器官中是有活性的。例如，所述啟動子可以是病毒啟動子諸如CaMV35S啟動子。CaMV35S啟動子在多種轉化的植物組織和大多數植物器官(例如，愈傷組織、葉、種子和根)中有活性。CaMV35S啟動子的增強或重複版本同樣是特別有用的。其他有用的啟動子是本領域已知的。在某些植物組織中有活性的啟動子(即，組織特異性啟動子)也可用於驅動本文公開的昆蟲抑制性蛋白的表達。由於某些害蟲諸如木蝨是通常通過將它們的吻突插入宿主植物的維管組織而進食的吸汁昆蟲，所以在轉基因植物的維管組織中指導昆蟲抑制性蛋白或其片段的表達的啟動子在本發明的實踐中是特別有用的。示例性韌皮部特異性啟動子包括但不限於過氧化物酶基因啟動子Shpx6b。其他有用的韌皮部優選啟動子包括從蔗糖合酶1(SUS1)基因諸如玉米、菸草、柑橘、菸草或甘蔗分離的那些。來自李子(歐洲李栽培種改良法國李(PrunusdomesticaL.cv.ImprovedFrench))的示例性啟動子區域顯示如下。ATG(粗體)顯示SUS1基因的起始密碼子。下劃線序列對應於用於下遊研究以進行缺失構建體的引物(在1379、978和672個核苷酸的序列)。SEQIDNO:23中粗體斜體的序列對應於由網站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)描述的賦予菜豆(Phaseolusvulgaris)中的木質部特異性的元件。又另一種有用的韌皮部特異性啟動子是來自甜橙的蔗糖合酶-I啟動子(CsSUS1p)(Singer等人,Planta234:623-637(2011))。轉錄增強子元件還可以與在植物細胞中有活性的任何啟動子或與植物細胞中的活性需要增強子的任何基本啟動子元件結合使用。轉錄增強子元件可以激活各種植物細胞中的轉錄，並且通常為100-200個鹼基對長。增強子元件可以通過化學合成或通過從包括此類元件的調節元件分離來獲得，並且可以包含含有有用的限制性酶位點以促進子序列操作的額外的側翼核苷酸。增強子元件通常可以位於與啟動子締合的mRNA帽位點的5'的區域內，但也可以位於帽位點的3'的區域(即，在5'非翻譯區、內含子或聚腺苷酸化位點的3'內)以提供可操作連接的基因的增加表達水平。此類增強子是本領域眾所周知的。此外，5'非翻譯前導序列可以可操作連接至植物表達盒中的目標編碼序列。因此，所述植物表達盒可以含有一個或多個5'非翻譯前導序列，其用於增加可操作連接的編碼本文所述的任何多肽的核酸編碼序列的表達。編碼提供本文描述的任何多肽在亞細胞細胞器中的定位的肽的序列可以可操作連接至編碼特定多肽的序列。因此，預期可操作連接至信號肽的多肽進入分泌途徑，並且可以被細胞器諸如內質網保留或通過將適當的保留或靶向肽可操作連接至多肽的C-末端而靶向至液泡。液泡靶向肽以及用於靶向植物質體的肽的實例是本領域眾所周知的。如上所示，目標多核苷酸序列還可以可操作連接至含有聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區。該聚腺苷酸化信號向RNA的3'末端添加聚腺苷酸序列。農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒胭脂鹼合酶(NOS)基因3'和豌豆ssRUBISCOE9基因3'非翻譯區含有聚腺苷酸信號，並且代表此類3'非翻譯區的非限制性實例，其可用於本發明的實踐中。應當理解，該組示例性聚腺苷酸化區域是非限制性的，並且本領域技術人員可以採用本文中未明確引用的其他聚腺苷酸化區域。任何上述植物表達元件可以與設計用於表達由本文所述的任何多核苷酸編碼的一種或多種多肽(諸如與HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1具有實質同一性的多肽)的多核苷酸一起用於植物或植物組分中。本文提供植物表達盒，所述表達盒包括本文所述的多核苷酸中的一種或多種，其編碼其相應多肽中的一種或多種，或編碼其部分的昆蟲抑制性蛋白，所述表達盒將提供植物中一種或多種多肽的表達。優選的植物可表達的多核苷酸序列可以針對在源自目標植物物種或相關植物物種的原生質體細胞中的最佳表達進行評估或根據本文所述的任何方法進行評估。在選擇給出最佳表達的那些設計的多核苷酸序列之後，然後將選擇的序列轉化至穩定的植物中用於連續選擇。包括上述植物表達盒的DNA構建體通常保持於各種載體中。載體含有提供宿主細胞中載體和共價連接的序列的複製的序列。例如，細菌載體將含有允許載體在一種或多種細菌宿主中複製的複製起點。農桿菌介導的植物轉化載體通常包含允許在大腸桿菌和農桿菌兩者中均複製的序列，以及定位以便允許表達盒整合至植物染色體中的一個或多個「邊界」序列。編碼賦予抗生素抗性的基因的可選擇標記通常也包括於載體中以提供其在細菌宿主中的維持。轉基因植物和用於獲得昆蟲抑制性轉基因植物的方法本發明還提供獲得能夠抑制害蟲的轉基因植物(或轉基因植物組分)的方法。首先，使用轉化技術根據本領域眾所周知的標準方法將適於表達本文公開的任何多肽的表達的載體引入植物、植物細胞或植物組織中。接下來，通過從接受表達載體的植物、植物細胞或植物組織再生轉基因植物而獲得含有植物表達載體的轉基因植物。最後一步是獲得表達昆蟲抑制量的多肽的轉基因植物。本文考慮的表達昆蟲抑制量的一種或多種多肽(諸如與HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1或其任何組合的實質同一性)的轉基因植物包括但不限於茄科植物諸如番茄和馬鈴薯以及柑橘植物諸如橙、檸檬、酸橙和葡萄柚。植物表達載體可以經由方法諸如農桿菌介導的轉化、顆粒介導的轉化、DNA轉染或DNA電穿孔或通過所謂的須介導的轉化(whiskers-mediatedtransformation)引入宿主植物的染色體中。引入轉基因的示例性方法是本領域技術人員眾所周知的。例如，用於經由幼體或成體組織的農桿菌介導的轉化產生轉基因柑橘的方法描述於Orbović和Grosser,「Chapter17:Citrus」，AgrobacteriumProtocols,第二版，第2卷,KanWang,編輯,HumanaPress,Totowa,NewJersey(2006)。本領域技術人員將進一步理解，任何這些基因轉移技術都可用於將表達載體引入植物細胞、植物組織、植物或植物組分的染色體中。在將植物表達載體引入植物細胞或植物組織之後，通常通過在促進形成完整植物(即，再生葉、莖、根和（在某些植物中）生殖組織的過程)的條件下培養這些細胞或組織而將轉化的細胞或組織再生為完整植物。從單一植物原生質體或各種外植體發育或再生轉基因植物是本領域眾所周知的。該再生和生長過程通常包括選擇轉化的細胞和在將產生生根幼苗的條件下培養選擇的細胞的步驟。其後將所得的轉基因生根的苗種植於適當的植物生長介質諸如土壤中。已併入其基因組中編碼一種或多種本文所述多肽的轉基因DNA區段的轉基因植物在本發明的範圍內。進一步認識到，可以通過使用PCR或可以特異性檢測DNA構建體中的序列的其他方法來鑑定含有本文所述的DNA構建體的轉基因植物和由其衍生的材料。一旦再生或回收轉基因植物，多種方法可用於鑑定或獲得表達抑制量的一種或多種本文所述的多肽的轉基因植物。一組通用方法是進行測量產生的多肽的量的測定法。或者，可以測定由轉基因植物產生的mRNA的量，以鑑定表達昆蟲抑制量的多肽的植物。也可以通過直接測定此類植物的昆蟲抑制(例如，如本文所述)來鑑定表達昆蟲抑制量的多肽的轉基因植物。吸汁害蟲防治包括編碼一種或多種本文所述的多肽或其昆蟲抑制片段的多核苷酸的轉基因植物可用於防治昆蟲侵染的方法中。示例性轉基因植物包括但不限於柑橘植物諸如，例如但不限於『Hamlin』或『Valencia』甜橙(甜橙(CitrussinensisL.))和茄科植物諸如馬鈴薯(馬鈴薯(SolanumtuberosumL.))。由被本文所述的一種或多種多肽抑制的吸汁害蟲攻擊的轉基因柑橘植物諸如轉基因橙植物(諸如『Hamlin』甜橙)和馬鈴薯或番茄在農業中是有用的。受保護免於吸汁昆蟲進食或侵染的優選的轉基因植物(或轉基因植物組分)包括編碼本文所述的一種或多種多肽或其昆蟲抑制性片段的多核苷酸。此類轉基因植物對於防治刺穿植物的細胞和組織和/或從其吸取流體的半翅類吸汁昆蟲(諸如木蝨)的物種是特別有效的。首先通過本文所述的任一種方法鑑定表達昆蟲抑制量的昆蟲抑制性多肽或其昆蟲抑制性片段的轉基因植物。可以在受控的環境條件下(即，在封閉的生長室或溫室中)進行初始昆蟲抑制，評價昆蟲(例如，木蝨)進食。轉基因植物也可以在田間測試中經受昆蟲侵染，並針對非轉基因對照植物進行比較。如果期望，非轉基因對照植物將包括用殺蟲劑處理的植物和未處理的植物兩者。選擇展現昆蟲抑制活性(諸如使植物對於木蝨侵染或進食不太有吸引力)的轉基因植物株系(即，衍生自不同轉化事件(包括轉基因插入不同基因組位置)的轉基因植物)用於潛在發育以用於多種不同的遺傳背景(即，遺傳不同的栽培品種、品種和/或雜交種質)中。將轉基因滲入不同種質中和產生主要包括轉基因種子的種子批次的方法是本領域技術人員已知的。例如，可以在期望的遺傳背景中以純合狀態固定轉基因。一旦在該背景中固定轉基因，則純合轉基因植物可用於產生非雜交作物的轉基因種子。或者，純合轉基因植物可用作花粉供體或受體以產生雜交作物的轉基因種子。本發明考慮表達抑制特定害蟲的昆蟲抑制性多肽的轉基因植物的具體類型。具體考慮轉基因柑橘植物，諸如但不限於表達抑制亞洲柑橘木蝨的昆蟲抑制性多肽的『Hamlin』或『Valencia』橙植物。實施例以下實施例是本發明的代表。本文公開的具體細節不應被解釋為限制性的。實施例1-植物表達構建體本文所述的轉化構建體的示意圖顯示於表1和2中。所有載體都使用標準方案產生，並且包括具有插入的PZP-RSC1多克隆位點(Hajdukiewicz等人,PlantMolBiol.25:989-994,1994)的pBINplus(vanEngelen等人,TransgenicRes4:288-290,1995)作為背景，並在轉化前通過測序驗證。所有構建體含有部分複製的35S啟動子(本文稱為35S;Kay等人,Science236:1299-1302,1987)，豆科植物矮柱花豆(Stylosantheshumilis)的過氧化物酶基因啟動子Shpx6b(Curtis等，MPMI10:326-338,1997)，如本文所述克隆的來自李子(歐洲李栽培種改良法國李(PrunusdomesticaL.cv.ImprovedFrench))的蔗糖合酶1(SUS1)啟動子和來自甜橙(Citrussinensis)的蔗糖合酶-I啟動子(CsSUS1)(Singer等人，Planta234:623-637,2011)，所述啟動子與胭脂鹼合酶轉錄終止子(nos-t)融合。然後使用pGEMTeasy試劑盒(Promega,Madison,USA)根據製造商的說明書將所有啟動子nos-t融合盒插入pBINplus載體中的多克隆位點，並將其克隆入大腸桿菌的DH-5α菌株中。隨後，通過PCR擴增來自湯普森多毛菌(Hirsutellathompsonii)、蘋果(Malusxdomestica)、洋蔥assagi(Alliumcepaassagi)(ACA)、玫瑰紅蔥(Al.roseum)(ASALros)和大頭蒜(Al.ampeloprasum)(ASAL)的組織的cDNA製備物獲得構建體的cDNA的天然和成熟(短)版本。用於擴增天然和成熟HtAcDNA序列的引物獲得自Boucias等人,J.ofinvert.Pathol.72:258-261,1998，但在5'和3'末端分別被修飾以含有BamHI和SacI限制性位點以便於克隆。用於擴增MpNPR1cDNA的引物自蘋果(Malusxdomestica)獲得的mRNA序列(GenBank登錄號EU624123.1)，但在5'和3'末端分別被修飾以含有BamHI和SacI限制性位點以便於克隆。用於天然和成熟(短)蔥屬植物基因的引物也被修飾以含有BamHI和SacI限制位點以便於克隆，並且從已知序列(GenBank登錄號U58947(用於ASAL)和登錄號L12172(用於ACA))設計。這些引物如下：使用PlatinumPCRSuperMixHighFidelity根據製造商的說明書(Invitrogen,SanDiego,CA)進行所有PCR擴增，其具有以下熱概況：94℃持續2分鐘，隨後30個循環的94℃持續30秒、55℃持續30秒和68℃持續2分鐘。除了單個基因以外，還製備兩個基因融合盒。第一種是HtA、ACA(來自洋蔥assagi)和ASAL(大頭蒜(Al.ampeloprasum))的成熟序列之間的融合體，命名為HtA::ACAas::ASALam。第二個含有ACA的成熟序列和來自玫瑰紅蔥(Al.roseum)的ASAL基因，且命名為ACAros::ASALros。通過PCR用以下引物製備HtA::ACAas::ASALam融合盒：。類似地，通過PCR使用以下引物製備ACAros::ASALros融合盒：。為了生成兩種融合盒，根據製造商的說明書使用PlatinumPCRSuperMixHighFidelityPCRMix試劑盒(Invitrogen,SanDiego,CA)，其具有以下熱概況：94℃持續2分鐘，隨後30個循環的94℃持續30秒、55℃持續30秒和68℃持續2分鐘。製備cDNA後，從大腸桿菌的DH-5α菌株純化上述啟動子nos-t融合pBINplus載體，並且使用限制性酶消化和連接根據標準實踐將單個基因cDNA(例如HtA天然、ACA短、MpNPR1等)和成熟基因融合盒(即HtA::ACAas::ASALam和ACAros::ASALros)的各種組合插入到啟動子和胭脂鹼合酶終止子(nos-t)之間。連接後，使用pGEMTeasy試劑盒(Promega,Madison,USA)根據製造商的說明書將載體轉化回大腸桿菌的DH-5α菌株，以等待轉化入農桿菌菌株EHA105中用於植物轉化。表1構建體構建體名稱啟動子盒內容物表達的基因的宿主來源JM202CaMV35S35S::35S::nos-tJM220CaMV35S35S::35S::HtA天然::nos-t多毛菌JM204CaMV35S35S::35S::HtA短::nos-t多毛菌JM275CaMV35S35S::35S::ACA天然::nos-t洋蔥變種aggregatumJM276CaMV35S35S::35S::ACA天然::nos-t韭菜JM277CaMV35S35S::35S::ACA短::nos-t洋蔥變種aggregatumJM278CaMV35S35S::35S::ACA短::nos-t韭菜JM273CaMV35S35S::35S::ASAL天然::nos-t玫瑰紅蔥JM272CaMV35S35S::35S::ASAL天然::nos-t大頭蒜JM274CaMV35S35S::35S::ASAL短::nos-t玫瑰紅蔥JM282CaMV35S35S::35S::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t多毛菌，洋蔥變種aggregatum，韭菜JM283CaMV35S35S::35S::ACA短::ASAL短::nos-t韭菜，玫瑰紅蔥JM210CaMV35S35S::35S::GUS::nos-tJM206Shpx6bShpx6b::nos-tJM221Shpx6bShpx6b::HtA短::nos-t多毛菌JM264Shpx6bShpx6b::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t多毛菌，洋蔥變種aggregatum，韭菜JM285Shpx6bShpx6b::ACA短::ASAL短::nos-t韭菜，玫瑰紅蔥表2額外構建體構建體名稱啟動子盒內容物表達的基因的宿主來源EK101Sus1Sus1::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t歐洲李，多毛菌，洋蔥變種aggregatum，韭菜EK102Sus1Sus1::MpNPR1::nos-t歐洲李，蘋果EK103Sus1Sus1::CsNPR1::nos-t歐洲李，甜橙EK104CsSUS1CsSUS1::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t甜橙，多毛菌，洋蔥變種aggregatum，韭菜EK105CsSUS1CsSUS1::MpNPR1::nos-t甜橙，蘋果EK106CsSUS1CsSUS1::CsNPR1::nos-t甜橙實施例2通過根癌農桿菌介導的轉化根據標準方法使用實施例1中描述的植物表達構建體，獲得轉基因番茄植物。通過將番茄木蝨(B.catterelli)置於含有轉基因和對照非轉化葉的小室中，生物測定轉基因植物對番茄木蝨(B.catterelli)的吸引力。將葉上沒有殘留木蝨的那些植物鑑定為對木蝨不太有吸引力，因此不太可能被木蝨的進食吻突(feedingproboscises)刺穿。典型的測定法涉及製備含有對照和轉基因番茄葉的室，並將約5個木蝨引入室中。在設置測定之後十八至二十四小時，通過計數轉基因葉上的木蝨數目相比於對照葉上的數目來監測木蝨位置。當在轉基因葉上發現0或1個木蝨、而在對照葉上發現更多木蝨時，轉基因植物株系被當作有用的。在一些、但不是所有的實驗中，與對照葉相比，轉基因葉對木蝨不太有吸引力。下表3顯示被鑑定為對木蝨不太有吸引力的轉基因株系的選擇結果。表3構建體啟動子基因來源#轉基因株系#無吸引力株系%無吸引力株系20435SHta短多毛菌12433221Shpx6bHta短多毛菌8450總計Hta短多毛菌2084027235SASALA長大頭蒜2731127435SASALR短玫瑰紅蔥2031527735SACA短洋蔥aggregatum86141627835SACT短韭菜4971428235SHta-ACA-ASALR多毛菌，洋蔥aggregatum，和玫瑰紅蔥3451528335SACA-ASALR洋蔥aggregatum，和玫瑰紅蔥35926NPR135SMpNPR1蘋果22523來自多毛菌真菌的基因Hta在番茄中最有效地阻止木蝨的進食。具有兩個蔥屬植物凝集素(ACA-ASALR)基因的堆疊構建體同樣有效地阻止木蝨的進食。實施例3-柑橘青果病的預防柑橘青果病(黃龍病(Huanglongbing),HLB)由限於韌皮部壁的細菌(phloem-limitedwalledbacterium)柑橘黃龍病菌亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus)引起。HLB由亞洲柑橘木蝨(柑橘木蝨(Diaphorinacitri))攜帶。已經用來自定殖於昆蟲的多毛菌真菌和來自蔥屬植物(洋蔥科)物種的幾種基因轉化的番茄植物的生物測定證明，在轉基因株系中併入這些基因抑制木蝨昆蟲的進食。然後在橙植物中測試使番茄植物對番茄木蝨「無吸引力」的構建體，以確定此類構建體是否使橙植物對亞洲柑橘木蝨無吸引力，因此可能干擾引起HLB的細菌的傳播。通過根癌農桿菌介導的轉化根據標準方法使用實施例1中描述的植物表達構建體，獲得轉基因「Hamlin」甜橙(甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)植物。構建體JM204、JM277和JM282在本發明中特別有用。具體而言，已經使用JM277(ACA短)和JM282(Hta-ACA-ASALR)構建體生成轉基因Hamlin植物。如實施例2中所述，通過將木蝨置於含有轉基因和對照非轉化葉(例如幼葉)的小室中，鑑定並生物測定轉基因Hamlin植物對亞洲柑橘木蝨的無吸引力。如實施例2中所述，將葉上沒有殘留木蝨的那些植物鑑定為對木蝨不太有吸引力，因此不太可能被木蝨的進食吻突(feedingproboscises)刺穿。此類無吸引力的轉基因柑橘植物被當作可用於本發明。實施例4-馬鈴薯中的木蝨黃斑和斑馬片病的預防馬鈴薯中的斑馬片病被認為是由B.cockerelli馬鈴薯/番茄木蝨攜帶的Liberibactersolanacearum引起。木蝨黃斑是一種馬鈴薯病，其被認為是由馬鈴薯/番茄木蝨的幼蟲階段產生的毒素引起。已經用來自定殖於昆蟲的多毛菌真菌和來自蔥屬植物(洋蔥科)物種的幾種基因轉化的番茄植物的生物測定證明，這些基因的併入抑制木蝨昆蟲的進食。假設這些轉化的番茄植物對馬鈴薯/番茄木蝨(B.cockerelli)的「非吸引力」表明在馬鈴薯植物中轉化相同的基因將減少木蝨的進食，並因此幹擾Liberibactersolanacearum(斑馬片病的病因)和誘導木蝨黃斑的毒素的傳播。通過根癌農桿菌介導的轉化根據標準方法使用實施例1中描述的植物表達構建體，獲得轉基因馬鈴薯(馬鈴薯(SolanumtuberosumL.))植物。預測構建體JM204、JM277和JM282在本發明中特別有用。如實施例2中所述，通過將昆蟲置於含有轉基因和對照非轉化葉的小室中，鑑定並生物測定轉基因馬鈴薯植物對馬鈴薯/番茄木蝨(B.cockerelli)的無吸引力。如實施例2中所述，將葉上沒有殘留木蝨的那些植物鑑定為對木蝨不太有吸引力，因此不太可能被木蝨的進食吻突(feedingproboscises)刺穿並成為細菌和毒素的受體。此類無吸引力的轉基因植物被當作可用於本發明。由於可以在不背離本發明的範圍的情況下對本文描述和舉例說明的構建和方法進行各種修改，因此意欲前面描述中含有的所有內容應當被解釋為說明性的，而不是限制性的。因此，本發明的寬度和範圍不應當由任何上述示例性實施方案來限定，而應當僅根據隨後所附權利要求及其等同方案來限定。序列表CornellUniversity用於阻止木蝨進食的組合物和方法50341-025WO2US62/008,9342014-06-0641PatentIn版本3.51495DNA湯普森多毛菌1atgaaggcctttactgccattctcgccagcgcggccttgttcgccaccggcctcgcggct60cccgcctcagaagccacctcggtgaacagcctggaagagcgcgctcccatcgtcacctgc120cggcccaagctcgacgggcgggagaagccgttcaaggtagacgtggcgacggcgcaggca180caggcgcgcaaggcgggcctgacgacgggcaagagcggcgaccctcaccggtacttcgcc240ggcgaccacatccgctggggcgtcaacaactgcgacaaggcggacgcgatcctgtgggag300tacccgatctactgggtcggcaagaacgccgagtgggccaaggacgtcaagacgtcgcag360caaaagggagggccgacgccgatccgcgtcgtctacgccaacagcaggggcgccgtgcag420tactgcggcgtcatgacgcacagcaaggtcgacaagaataaccagggcaaggagttcttt480gagaagtgcgattag4952164PRT湯普森多毛菌2MetLysAlaPheThrAlaIleLeuAlaSerAlaAlaLeuPheAlaThr151015GlyLeuAlaAlaProAlaSerGluAlaThrSerValAsnSerLeuGlu202530GluArgAlaProIleValThrCysArgProLysLeuAspGlyArgGlu354045LysProPheLysValAspValAlaThrAlaGlnAlaGlnAlaArgLys505560AlaGlyLeuThrThrGlyLysSerGlyAspProHisArgTyrPheAla65707580GlyAspHisIleArgTrpGlyValAsnAsnCysAspLysAlaAspAla859095IleLeuTrpGluTyrProIleTyrTrpValGlyLysAsnAlaGluTrp100105110AlaLysAspValLysThrSerGlnGlnLysGlyGlyProThrProIle115120125ArgValValTyrAlaAsnSerArgGlyAlaValGlnTyrCysGlyVal130135140MetThrHisSerLysValAspLysAsnAsnGlnGlyLysGluPhePhe145150155160GluLysCysAsp3396DNA湯普森多毛菌3atggctcccatcgtcacctgccggcccaagctcgacgggcgggagaagccgttcaaggta60gacgtggcgacggcgcaggcacaggcgcgcaaggcgggcctgacgacgggcaagagcggc120gaccctcaccggtacttcgccggcgaccacatccgctggggcgtcaacaactgcgacaag180gcggacgcgatcctgtgggagtacccgatctactgggtcggcaagaacgccgagtgggcc240aaggacgtcaagacgtcgcagcaaaagggagggccgacgccgatccgcgtcgtctacgcc300aacagcaggggcgccgtgcagtactgcggcgtcatgacgcacagcaaggtcgacaagaat360aaccagggcaaggagttctttgagaagtgcgattag3964131PRT湯普森多毛菌4MetAlaProIleValThrCysArgProLysLeuAspGlyArgGluLys151015ProPheLysValAspValAlaThrAlaGlnAlaGlnAlaArgLysAla202530GlyLeuThrThrGlyLysSerGlyAspProHisArgTyrPheAlaGly354045AspHisIleArgTrpGlyValAsnAsnCysAspLysAlaAspAlaIle505560LeuTrpGluTyrProIleTyrTrpValGlyLysAsnAlaGluTrpAla65707580LysAspValLysThrSerGlnGlnLysGlyGlyProThrProIleArg859095ValValTyrAlaAsnSerArgGlyAlaValGlnTyrCysGlyValMet100105110ThrHisSerLysValAspLysAsnAsnGlnGlyLysGluPhePheGlu115120125LysCysAsp1305513DNA大頭蒜5atgagcgtggccactgtagccaccatcctaaccattttggcatctacatgcatggccaga60aacgtattggtgaacaacgaaggactgtacgcaggccaatccctagtcgaggaacagtac120acttttataatgcaggatgactgcaaccttgtactgtatgaatacagcacccccatctgg180gcctcaaacacaggcatcaccggtaaaaatgggtgcagggccgtgatgcagcctgatggc240aactttgtcgtctacgatgttaaggggcgtgccgtctgggccagtaacagcagaagaggg300aacgggaactatatcctggtgcttcagaaggacagaaacgttgttatttacggatctgat360atttggtctactggcacataccggaaaaaagtgggtggaactgttgttatggctatgagt420ggtacggtcgatggaggctccgcgattggaccggtaacagtgaatcagaatgtcactgcc480gtccgaaaggttgcagcagctgctgctgcttga5136170PRT大頭蒜6MetSerValAlaThrValAlaThrIleLeuThrIleLeuAlaSerThr151015CysMetAlaArgAsnValLeuValAsnAsnGluGlyLeuTyrAlaGly202530GlnSerLeuValGluGluGlnTyrThrPheIleMetGlnAspAspCys354045AsnLeuValLeuTyrGluTyrSerThrProIleTrpAlaSerAsnThr505560GlyIleThrGlyLysAsnGlyCysArgAlaValMetGlnProAspGly65707580AsnPheValValTyrAspValLysGlyArgAlaValTrpAlaSerAsn859095SerArgArgGlyAsnGlyAsnTyrIleLeuValLe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