一種地衣芽孢桿菌新菌株及其應用的製作方法

2023-10-24 23:08:22

本發明涉及農用微生物製劑及土壤肥料領域，具體地說，涉及一種地衣芽孢桿菌新菌株及其應用。

背景技術：

白色農業是指微生物資源產業化的工業型新農業，通常指微生物發酵工程在農業上的應用。農業生產需要土壤提供作物生長的營養物質和生存環境。多年來，化學肥料的施用對農業增收起到了關鍵作用。然而，由於長期施用化學肥料，土壤有益微生物菌群受到破壞、有機肥供應不足，各類養分比例失調，致使農田生態環境、土壤理化性狀和土壤微生物區系受到了不同程度的破壞，在一定程度上影響了農產品的品質，我國目前土壤資源現狀迫切需要通過人為措施解決土壤被逐漸破壞的問題，確保農業種植水平和農作物產品品質。一些有益微生物可固定空氣中的氮素、活化土壤中難以利用的磷、鉀及其他營養元素，提高土壤養分供應能力和保水、保肥能力，提高土地資源的持續生產能力，還能增強農作物抗病性，減少農藥用量。

在我國生態環境保護的十大對策中明確提倡要推廣「生態農業」，保護生態環境和農田土壤，推動無公害健康食品的生產，促進生態系統中生物循環，達到保持和增強土壤肥力及生物活性目的。以有益微生物為核心的微生物製劑或肥料產品能起到改良土壤、提高地力、促進生長等作用，是優質無公害農產品生產的優選生產資料。隨著我國現代農業的快速發展，特別是綠色有機農業種植面積不斷擴大，將特定微生物菌融入到農業生產中來，已成為當今政府及企業所關注的熱點問題。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種地衣芽孢桿菌新菌株及其應用。

為了實現本發明目的，本發明提供的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)CLIMAX-VBL是從農作物根部土壤中分離、提純、復壯而得，該菌株能夠顯著提高農作物產量和抗逆能力，顯著降低作物病害。研究分析，地衣芽孢桿菌是一種在健康的農作物土壤微生態環境中佔據優勢的菌群，它可以產生包括幾丁質酶、抗菌蛋白、多肽類、苯乙酸類等抗菌物質，並通過作用於病原菌提高植物的抗病力。同時，地衣芽孢桿菌具有嗜熱特性，在植物快速生長期間，該菌群繁殖迅速，有效改善土壤根際環境(提高土壤透氣、保水和保肥性能)，促進植物根系生長。地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL可分泌蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶和纖維素酶，有效促進土壤有機物的降解和利用。菌株CLIMAX-VBL現已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No.12499，保藏日期2016年5月25日。

菌株CLIMAX-VBL通過培養特徵、顯微形態特徵、生理生化特徵和遺傳特徵，確定該菌株符合地衣芽孢桿菌的特徵。

本發明的地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL可製備成菌劑，其中，菌株CLIMAX-VBL的活菌數可為2億/克以上，優選為10億/克以上，更優選為100億/克。

本發明提供的含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的菌劑，可按如下液體發酵的方式進行製備：

將保存於凍幹管中的菌株CLIMAX-VBL接入到肉湯培養基的固體斜面中，在30-32℃下培養24-48小時；然後挑取菌落接入PDA固體斜面中，在30-32℃下培養3-7天；然後挑取菌落接入到經過滅菌的液體培養基中，在30±1℃、150-200r/min條件下培養36-48小時，獲得菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液直接作為液體菌劑，其中地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為10億/克以上。

所述液體培養基含有如下重量份的組分：蔗糖20份、氯化鈉5份、蛋白腖20份、硫酸鎂5份、磷酸二氫鉀3份和水1000份。

本發明提供的含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的菌劑，還可以按如下液體發酵+固體吸附的方式進行製備：按照上述方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液與固體吸附劑按1：4-8的重量比混合，乾燥後進行活菌數檢測，即得菌株CLIMAX-VBL的固體菌劑。其中，地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為2億/克以上；所述固體吸附劑為草炭、沸石或(輕質)碳酸鈣等中的至少一種。

本發明提供的含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的菌劑，進一步可按如下液體發酵+離心噴霧乾燥的方式進行製備：按照上述方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，向發酵液中加入可溼性固形物(如麥芽糊粉、葡萄糖、環糊精等)，調整到含水量90％以內，採用離心噴霧乾燥的方式蒸發水分，製成菌粉，然後進行活菌數檢測，即得。其中地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為100億/克以上。

本發明還提供所述地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL或上述製備的菌劑在提高農作物產量、抗逆能力以及提高土壤肥力等方面的應用。

本發明還提供所述地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL或上述製備的菌劑在在製備種子處理劑、肥料增效劑、菌肥以及噴灌劑中的應用。

本發明還提供一種種子處理劑，含有如下重量份的組分：上述製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑30-90份、粘土5-30份、麥飯石5-20份、農用稀土0-40份和硫酸鋅0-10份；其中所述粘土為沸石粉、膨潤土、凹凸棒石粘土等中的至少一種。

本發明還提供一種微生物菌肥，含有如下重量份的組分：上述製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑0.2-30份、有機肥30-100份、腐植酸粉10-50份和氮磷鉀元素0-50份。

本發明還提供一種噴灌劑，含有如下重量份的組分：上述製備的地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL液體菌劑50-400份、胺基酸液300-600份、磷酸二氫鉀10-200份、硼酸10-50份、一水硫酸錳10-60份、七水硫酸鋅10-50份、尿素20-150份、農用稀土0-50份和少量表面活性劑。

其中，所述胺基酸液中各成分的質量百分含量如下：天冬氨酸3.41％、絲氨酸5.22％、穀氨酸7.15％、蘇氨酸3.00％、甘氨酸2.36％、精氨酸2.34％、丙氨酸2.48％、酪氨酸0.48％、脯氨酸3.84％、纈氨酸5.38％、苯丙氨酸0.38％、異亮氨酸1.57％、亮氨酸3.16％、組氨酸0.84％、賴氨酸1.88％、蛋氨酸0.35％和胱氨酸2.64％。所述胺基酸液以水配製。也可由天然動植物成分經水解、脫鹽製成。

所述表面活性劑包括烷基糖苷、聚山梨酯和聚醚改性聚矽氧烷等中的至少一種。當所述表面活性劑為烷基糖苷時，烷基糖苷的添加量為所述噴灌劑總重的5-15％；當所述表面活性劑為聚醚改性聚矽氧烷時，聚醚改性聚矽氧烷的添加量為所述噴灌劑總重的0.1-0.5％；當所述表面活性劑為聚山梨酯時，聚山梨酯的添加量為所述噴灌劑總重的1-5％，優選聚山梨酯80。

所述噴灌劑可按如下方法進行製備：先將胺基酸液300-600份、磷酸二氫鉀10-200份、硼酸10-50份、一水硫酸錳10-60份、七水硫酸鋅10-50份、尿素20-150份、農用稀土0-50份和少量表面活性劑在60-80℃的反應罐中進行攪拌混合30-60分鐘，待溫度降至25℃以下，加入地衣芽孢桿菌液體菌劑50-400份，在常溫下攪拌5-10分鐘，即得。

本發明具有以下優點：

(一)本發明提供一種高活性、耐高溫、抗病害的地衣芽孢桿菌菌株CLIMAX-VBL，其具有十分顯著的抗病和提高土壤肥力性能。

(二)本發明的地衣芽孢桿菌可採用液體發酵、液體發酵+固體吸附、液體發酵+離心噴霧乾燥三種方法進行製造增殖，製成液體或固體菌劑，具有產孢量高、代謝產物量大，其產品的生物活性更好，保存期更長的優點。

(三)菌株CLIMAX-VBL經過工業化生產，具有廣闊應用前景，可以用於配置多種肥料產品，並可用於苗床、灌根、配肥(製作生物有機肥)等用途。本發明對苗床、灌根、配肥三種應用提供了可行的方案，並且獲得良好的實際應用效果。可有效解決我國目前土壤肥力日益低下、農作物的多種植障礙(如土壤傳播病害、連作障礙、根際微生態環境被破壞等)問題。

具體實施方式

以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

若無特別說明，本發明中所述的「份」是指「重量份」。

實施例1地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的菌學特徵

菌株CLIMAX-VBL是從農作物根部土壤中分離、提純、復壯而得，它的形態特徵如下：細胞杆狀，革蘭氏染色陽性，大小為(0.6-0.8μm)×(2.0-3.5μm)。芽孢端生或偏端生，柱形，孢囊不膨大。在肉湯培養基上，菌落圓形，溼潤，邊緣整齊，有紅色色素。

生理生化特徵如下：接觸酶、氧化酶、澱粉酶試驗呈陽性反應；厭氧生長；可利用丙酸鹽；卵磷脂酶試驗呈陰性反應。

實施例2地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的鑑定

通過對菌株CLIMAX-VBL 16S rDNA序列進行測定，將測序結果在GenBank中進行比對，發現與其它已公布的地衣芽孢桿菌的16S rDNA的序列同源性較高。

通過上述形態特徵、生理生態特徵和16S rDNA序列分析，可以確定分離到的確為地衣芽孢桿菌的新菌株。

實施例3地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL菌劑的製備(液體發酵方式)

將保存於凍幹管中的菌株CLIMAX-VBL接入到肉湯培養基的固體斜面中，在32℃下培養24小時；然後挑取菌落接入PDA固體斜面中，在32℃下培養3-7天；然後挑取菌落接入到經過滅菌的液體培養基中，在32℃、150r/min條件下培養3天，獲得菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液直接作為液體菌劑，其中地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為10億/克以上。

所述液體培養基含有如下重量份的組分：蔗糖20份、氯化鈉5份、蛋白腖20份、硫酸鎂5份、磷酸二氫鉀3份和水1000份。

實施例4地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL菌劑的製備(液體發酵+固體吸附方式)

按照實施例3方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液與固體吸附劑按1:4的重量比混合，乾燥後經過平板計數法進行有效活菌數檢測合格後作為地衣芽孢桿菌原菌製劑包裝入庫保存。其中，地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為6億/克以上。

所述固體吸附劑為草炭、沸石或(輕質)碳酸鈣中的至少一種。

實施例5地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL菌劑的製備(液體發酵+固體吸附方式)

按照實施例3方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液與固體吸附劑按1:6的重量比混合，乾燥後經過平板計數法進行有效活菌數檢測合格後作為地衣芽孢桿菌原菌製劑包裝入庫保存。其中，地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為4億/克以上。

所述固體吸附劑為草炭、沸石或(輕質)碳酸鈣中的至少一種。

實施例6地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL菌劑的製備(液體發酵+固體吸附方式)

按照實施例3方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，將發酵液與固體吸附劑按1:8的重量比混合，乾燥後經過平板計數法進行有效活菌數檢測合格後作為地衣芽孢桿菌原菌製劑包裝入庫保存。其中，地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為8億/克以上。

所述固體吸附劑為草炭、沸石或(輕質)碳酸鈣中的至少一種。

實施例7地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL菌劑的製備(液體發酵+離心噴霧乾燥方式)

按照實施例3方法製備菌株CLIMAX-VBL的發酵液，向發酵液中加入可溼性固形物(如麥芽糊粉等原料)，調整到含水量90％以內，採用離心噴霧乾燥機快速蒸發水分，製成乾燥菌粉，經過平板計數法進行有效活菌數檢測合格後作為地衣芽孢桿菌原菌製劑包裝入庫保存。其中，地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的活菌數為100億/克以上。

實施例8含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的種子處理劑

實施例4製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑30份、粘土5份和麥飯石5份，以上原料充分混合均勻即得。

其中所述粘土為沸石粉、膨潤土、凹凸棒石粘土中的至少一種。

實施例9含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的種子處理劑

實施例5製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑60份、粘土20份、麥飯石10份、農用稀土10份和硫酸鋅5份，以上原料充分混合均勻即得。

其中所述粘土為沸石粉、膨潤土、凹凸棒石粘土中的至少一種。

實施例10含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的種子處理劑

實施例6製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑90份、粘土30份、麥飯石20份、農用稀土40份和硫酸鋅10份，以上原料充分混合均勻即得。

其中所述粘土為沸石粉、膨潤土、凹凸棒石粘土中的至少一種。

實施例11含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥

實施例4製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑0.2份、有機肥30份和腐植酸粉10份，以上原料充分混合均勻即得。

實施例12含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥

實施例5製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑20份、有機肥80份、腐植酸粉30份和氮磷鉀元素25份，以上原料充分混合均勻即得。

實施例13含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥

實施例6製備的菌株CLIMAX-VBL固體菌劑30份、有機肥100份、腐植酸粉50份和氮磷鉀元素50份，以上原料充分混合均勻即得。

實施例14含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的噴灌劑

先將胺基酸液300份、磷酸二氫鉀10份、硼酸10份、一水硫酸錳10份、七水硫酸鋅10份、尿素20份和聚山梨酯80型3份，在60-80℃的反應罐中進行攪拌混合30-60分鐘，待溫度降至25℃以下，加入實施例3製備的地衣芽孢桿菌液體菌劑50份，在常溫下攪拌5-10分鐘，即得。

實施例15含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的噴灌劑

先將胺基酸液450份、磷酸二氫鉀100份、硼酸30份、一水硫酸錳35份、七水硫酸鋅30份、尿素100份、農用稀土25份和聚山梨酯80型5份，在60-80℃的反應罐中進行攪拌混合30-60分鐘，待溫度降至25℃以下，加入實施例3製備的地衣芽孢桿菌液體菌劑200份，在常溫下攪拌5-10分鐘，即得。

實施例16含有地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL的噴灌劑

先將胺基酸液600份、磷酸二氫鉀200份、硼酸50份、一水硫酸錳60份、七水硫酸鋅50份、尿素150份、農用稀土50份和聚山梨酯80型10份，在60-80℃的反應罐中進行攪拌混合30-60分鐘，待溫度降至25℃以下，加入實施例3製備的地衣芽孢桿菌液體菌劑400份，在常溫下攪拌5-10分鐘，即得。

其中，實施例14-16中所用胺基酸液中各成分的質量百分含量如下：天冬氨酸3.41％、絲氨酸5.22％、穀氨酸7.15％、蘇氨酸3.00％、甘氨酸2.36％、精氨酸2.34％、丙氨酸2.48％、酪氨酸0.48％、脯氨酸3.84％、纈氨酸5.38％、苯丙氨酸0.38％、異亮氨酸1.57％、亮氨酸3.16％、組氨酸0.84％、賴氨酸1.88％、蛋氨酸0.35％和胱氨酸2.64％。所述胺基酸液以水配製。也可由天然動植物成分經水解、脫鹽製成。

試驗例1種子處理劑

在水稻播種前，用實施例9的種子處理劑對水稻種子進行浸泡/拌種處理，每畝用量的稻種使用20克加5公斤水攪勻後進行浸種，在播種後2周左右進行調查發現，秧苗健壯，苗高增加3-5釐米，根長增加1.2-1.8釐米，單株分櫱增加60％，大田生長旺盛，結實率和千粒重分別增加1.1％和2.0％，產量平均增加7.8％，與此同時，還具有防治水稻稻瘟病效果，經田間實際應用，防治效果可達50％以上。實施例8和10的種子處理劑具有類似的效果。

試驗例2微生物菌肥

在底肥期，每畝辣椒均勻溝施50公斤實施例12的菌肥。與實施例12配方相同，但不含地衣芽孢桿菌CLIMAX-VBL原菌製劑的對照相比，施用後能提前採收3-5天，增產幅度達16.2％，且顯著提高商品性能，著色好、光澤好、辣味香濃。實施例11和13的菌肥具有類似的效果。

試驗例3噴灌劑

在西紅柿定植緩苗後和快速生長期各噴施並結合根灌實施例15的噴灌劑，其中，每次200毫升按照1:75配水，結合每畝用5公斤按照比水1：200進行灌根。經過跟蹤調查，對番茄灰黴病具有良好的抑制作用，平均增產12-16％，最高可達25％，且西紅柿的商品性能顯著提高，個頭均勻，果色健康，單個果重顯著增加，具有良好的經濟效益。實施例13和16的噴灌劑具有類似的效果。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。