機械激活的陽離子通道的製作方法

2023-10-25 02:29:17

專利名稱：機械激活的陽離子通道的製作方法
機械激活的陽離子通道
相關申請的交叉引用本申請要求於2010年8月23日提交的美國臨時申請號61/376，182的權益。該優先權申請通過引用以其整體併入本文中。
對於在聯邦資助的研究和研發下做出的發明的權利的聲明本發明是在美國國立衛生研究院授予的批號DE016927和NS046303的政府資助下做出的。政府享有本發明的某些權利。
背景技術：
力傳導是機械力向生物學信號的轉化，在生理學中具有關鍵性的作用。在哺乳動物中，胚胎發育、接觸、疼痛、本體感覺、聽覺、血管緊張度和血流的調節、腎臟中的流量傳感、肺的生長和損傷、骨骼和肌肉的內穩態，以及轉移都受力傳導的調控(M.Chalfie,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.10，44 (2009 年 I 月)；0.P.Hamill，B.Martinac，PhysiolRev81，685(2001年4月))。在植物中，機械力強烈影響形態發生，例如側根的形成(G.B.Monshausen, S.Gilroy, Trends CellBiol.19，228 (2009 年 5 月)。即使是單細胞生物(如纖毛蟲)也感知碰觸，並應答觸覺刺激而改變方向(K.1watsuki, T.Hirano, Comp.Biochem.Physiol.A.Physiol.110，167(1995 年 2 月))。來自脊椎動物的內耳毛細胞的電生理學記錄顯示力傳導是極為快的，提示了通過力直接激活的離子通道 D.P.Corey, A.J.Hudspeth, Biophys.J.26,499 (1979 年 6 月)。實際上，已經在多種力敏感的細胞中，包括在背根神經節(DRG)神經元(G.C.McCarter，
D.B.Reichling, J.D.Levine, Neurosc1.Lett.273,179)、腎初級纖毛(H.A.Praetorius,K.R.Spring, J Membr Biol 184，71 (2001 年 11 月 I 日))和植物(G.B.Monshausen，
S.Gilroy，Trends Cell Biol.19，228 (2009年5月))中描述了鈣可滲透的機械激活的(MA)陽離子電流。然而，目前只鑑別了極少數的MA通道。
發明概述本發明提供了篩選調節機械激活的陽離子通道的活性的活性劑的方法。在一些實施方案中，方法包括:將與SEQ ID NO:2、4、18或20中的至少一個具有至少70%胺基酸序列同一性的機械激活的陽離子通道多肽與活性劑接觸；和選擇調節機械激活的陽離子通道多肽的活性的活性劑。在一些實施方案中，多肽是在細胞中表達的，且接觸包括接觸細胞與活性劑。在一些實施方案中，多肽對於細胞是異源的。在一些實施方案中，細胞包含異源的表達盒，所述表達盒包含與編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸有效連接的啟動子。在一些實施方案中，多核苷酸包含 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:17 或 SEQ ID NO:19。在其他實施方案中，多肽對於細胞是內源的。在一些實施方案中，細胞是真核細胞。在一些實施方案中，細胞是神經元。在一些實施方案中，通過測量由多肽介導的電生理學改變，來確定機械激活的陽離子通道多肽的活性。在某些實施方案中，電生理學改變是膜電勢的改變、電流的改變或陽離子流入。在一些實施方案中，用膜電勢染色測定測量膜電勢。在一些實施方案中，用膜片鉗測定測量電生理學改變。在某些實施方案中，測量包括測量機械激活的電生理學改變。在一些實施方案中，方法還包括測試被鑑別為調節機械激活的陽離子通道的活性的活性劑調節機械激活的電生理學改變的能力。在一些實施方案中，選定的活性劑降低或抑制由多肽介導的電生理學改變。在一些實施方案中，選定的活性劑增加由多肽介導的電生理學改變。在一些實施方案中，細胞是在動物中的。在一些實施方案中，動物是小鼠。在一些實施方案中，方法還包括對動物施用活性劑和確定活性劑對於疼痛敏感度的影響。在一些實施方案中，多肽包含SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 18 或 SEQID NO:20o本發明還提供了拮抗機械激活的陽離子通道的活性的抗體。在一些實施方案中，抗體選擇性結合與SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少70%胺基酸序列同一性的機械激活的陽離子通道多肽。在某些實施方案中，多肽包含 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 18 或 SEQ ID NO:20。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在某些實施方案中，抗體是嵌合抗體。在其他實施方案中，抗體是人源化抗體。本發明還提供了減輕對象的疼痛的方法。在一些實施方案中，方法包括向對象施用抗體，所述抗體選擇性結合與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少70%胺基酸序列同一性的機械激活的陽離子通道多肽。

在一些實施方案中，方法包括施用抗體，所述抗體選擇性結合包含SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:20的機械激活的陽離子通道多肽的抗體。在一些實施方案中，多肽在膀胱、結腸、腎、肺或皮膚中表達。在一些實施方案中，多肽在背根神經節神經元中表達。在一些實施方案中，對象是哺乳動物。在某些實施方案中，對象是人。在一些實施方案中，疼痛選自急性機械性疼痛、慢性機械性疼痛、機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、關節炎、炎症、牙疼痛、癌症疼痛和分娩疼痛組成的組。本發明還提供了分離的反義寡核苷酸或小幹擾RNA(SiRNA)，其與和SEQ ID NOU
3、17或19具有至少70%同一性且編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸的至少15個連續核苷酸互補，其中反義寡核苷酸或siRNA抑制機械激活的陽離子通道多肽的生產。在一些實施方案中，反義寡核苷酸或小幹擾RNA(SiRNA)與SEQ ID N01、3、17或19的至少15個連續核苷酸互補。在一些實施方案中，反義寡核苷酸或siRNA包含SEQ IDN05-16中的任何一個。本發明還提供了表達盒，其包含與包含反義寡核苷酸或siRNA的多核苷酸有效連接的啟動子，所述反義寡核苷酸或siRNA與和SEQ ID N01、3、17或19具有至少70%同一性且編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸的至少15個連續核苷酸互補，其中反義寡核苷酸或siRNA抑制機械激活的陽離子通道多肽的生產。本發明還提供了包含所述表達盒的載體和包含所述表達盒和/或所述載體的細胞。本發明還提供了減輕對象的疼痛的方法，方法包括向對象施用反義寡核苷酸或小幹擾RNA(siRNA)，所述反義寡核苷酸或siRNA與和SEQ ID N01、3、17或19具有至少70%同一性且編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸的至少15個連續核苷酸互補，其中反義寡核苷酸或siRNA抑制機械激活的陽離子通道多肽的生產。
在一些實施方案中，反義寡核苷酸或siRNA抑制在膀胱、結腸、腎、肺或皮膚中機械激活的陽離子通道的生產。在某些實施方案中，反義寡核苷酸或siRNA抑制機械激活的陽離子通道在背根神經節神經元中的生產。在一些實施方案中，對象是哺乳動物。在某些實施方案中，對象是人。在一些實施方案中，疼痛選自急性機械性疼痛、慢性機械性疼痛、機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、關節炎、炎症、牙疼痛、癌症疼痛和分娩疼痛。
定義如本文中使用的，除非另外說明，否則下列術語具有歸結於它自身的含義。術語「機械激活的陽離子通道」指應答施用於例如表達通道的細胞的機械力或壓力而開放以允許帶正電的離子(即，陽離子)進入和離開細胞的離子通道。如本文中使用的，術語還包括機械激活的陽離子通道的多肽組分，例如，陽離子通道的亞基。在一些實施方案中，本發明的機械激活的陽離子通道基本與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18或SEQ ID N0:20相同。在一些實施方案中，本發明的機械激活的陽離子通道參與感覺傳導，例如疼痛傳導，包括但不限於細胞如神經元。機械激活的陽離子通道多肽活性的「抑制劑」、「激活劑」和「調節劑」在本文中可互換的使用，指使用用於感覺(例如 疼痛或軀體感覺)傳導的體外和體內測定所鑑別的抑制性、激活性或調節性分子，例如，配體、激動劑、拮抗劑，及其同源物和模擬物。術語「調節劑」涵蓋了抑制劑和激活劑。抑制劑是例如結合以部分或完全阻斷刺激、減少、阻止、延遲激活、失活、脫敏或下調信號傳導的化合物，例如拮抗劑。激活劑是例如結合以刺激、增加、開放、激活、促進、增強激活、致敏或上調信號傳導的化合物，例如激動劑。調節劑包括天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學分子等。用於抑制劑和激活劑的此類測定包括例如，在細胞或細胞膜中表達機械激活的陽離子通道多肽，施用推定的調節劑化合物，然後確定對於離子流、膜電勢、電生理學或機械激活的功能性作用。將包含用潛在的激活劑、抑制劑或調節劑處理過的機械激活的陽離子通道多肽的樣品或測定與不含抑制劑、激活劑或調節劑的對照樣品比較，以檢驗調節的程度。對照樣品(未用抑制劑處理過)被賦予100%的機械激活的陽離子通道多肽活性相對值。當機械激活的陽離子通道多肽活性相對於對照是約80 %，任選地75 %、50 %或25-0 %時，實現了對機械激活的陽離子通道多肽的抑制。當機械激活的陽離子通道多肽活性相對於對照是110%，任選地125%，任選地150%，任選地200-500%或1000-3000%更高時，實現了對機械激活的陽離子通道多肽的激活。「核酸」指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。術語涵蓋了含有已知核苷酸類似物或經修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，與參照核酸具有相似的結合特性，並且以與參照核苷酸相似的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於磷硫醯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另外指出，特別的核酸序列也暗示地涵蓋了它的保守修飾變體(例如，簡併密碼子替換物)和互補序列，以及明確提出的序列。具體而言，可以通過生成這樣的序列來實現簡併密碼子替換物，在所述序列中，一個或多個選定的(或所有)密碼子的第三個位置被混合的鹼基和/或脫氧肌苷殘基替換(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991)；Ohtsuka 等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985) ；Rossolini 等人，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。術語「核酸」涵蓋了術語基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。術語用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。術語「胺基酸」指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸相似的方式發揮作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及之後被修飾的胺基酸，例如，羥脯氨酸、Y-羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物指具有與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基連接的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基(例如，正亮氨酸)或經修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構。胺基酸模擬物指這樣的化學化合物，所述化合物具有胺基酸的一般化學結構不同的結構，但以與天然存在的胺基酸相似的方式發揮功能。「保守修飾的變體」用於胺基酸和核酸序列。對於特別的核酸序列，保守修飾的變體指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的核酸，或者當核酸不編碼胺基酸序列時，指基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定為丙氨酸的每個位置上，可以將所述密碼子改變為任何相應的描述的密碼子而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是「沉默變異」，這是一類保守修飾的變異。本文中編碼多肽的每條核酸序列也描述了核酸的每種可能的沉默變異。本領域技術人員將認識到，可以修飾核酸中的每個密碼子(除了通常是甲硫氨酸唯一的密碼子AUG，和通常是色氨酸唯一的密碼子TGG外)以產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異都暗含在每條所述序列中。對於胺基酸序列，本領域技術人員將認識到，當改變導致胺基酸被化學相似的胺基酸替換時，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列進行的改變、添加或缺失所編碼的序列中的單個胺基酸或少量百分比胺基酸的單個替換、缺失或添加是「保守修飾的變體」。保守替換表格提供了本領域普遍已知的功能相似的胺基酸。這類保守修飾的變體是本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因以外的，且不排除本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因。下列8組分別含有彼此是保守替換的胺基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E)；
3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)；
4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如，Creighton,Proteins (1984))。術語「分離的 」、「純化的」或「生物學純的」指基本上或本質上不含在天然狀態下所見的通常伴有的組分的材料。通常使用分析化學技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高性能液相色譜來確定純度和同質性。基本上純化了製劑中存在的主要物質的蛋白質。術語「純化的」表示在電泳凝膠中基本產生一條帶的核酸或蛋白質。特別是意指所述核酸或蛋白質是至少85 %純的，任選地至少95 %純的，和任選地至少99 %純的。當術語「重組」用於指例如，細胞，或核酸、蛋白質，或載體時，表示已經通過導入異源的核酸或蛋白質或改變天然的核酸或蛋白質對細胞、核酸、蛋白質或載體進行了修飾，或者所述細胞是源自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達未見於天然(非重組)形式的細胞的基因，或者表達異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。當術語「異源的」用於指蛋白質或核酸與細胞的關係時，表示在自然界中未發現蛋白質或核酸與細胞處於相同的關係(例如，不在細胞中表達)。當術語「異源的」用於指部分核酸時，表示核酸包含在自然界中未發現彼此處於相同關係的兩個或多個的子序列。例如，核酸通常是重組生產的，其具有兩個或多個序列，所述序列來自排列以構成新的功能性核酸的不相關基因，例如，來自一種來源的啟動子和來自另一種來源的編碼區。相似的，異源蛋白質表示蛋白質包含在自然界中未發現彼此處於相同關係的兩個或多個子序列(例如，融合蛋白)。「啟動子」定義為指導核酸轉錄的核酸控制序列的陣列。如本文中使用的，啟動子包括靠近轉錄起始位點處的必需的核酸序列，例如在II型聚合酶啟動子的情況下,是TATA元件。啟動子還任選的包括遠距離增強子或抑制子元件，後兩者可距離轉錄起始位點數千鹼基對。「組成型」啟動子是在大部分環境和發育條件下激活的啟動子。「誘導型」啟動子是在環境或發育調控下激活的啟動子。術語「有效連接」指在核酸表達控制序列(例如啟動子或轉錄因子結合位點陣列)與第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導與第二序列對應的核酸的轉錄。「表達盒」是重組或合成生成的核酸構建體，具有一系列允許特別的核酸在宿主細胞中轉錄的指明的核酸元件。表達盒可以是質粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表達盒包括與啟動子有效連接的待轉錄核酸。術語「相同的」或 百分比「同一性」在兩條或多條核酸或多肽序列的情況下，指相同的兩條或多條序列或子序列。「基本相同的」序列是當使用下列序列比較算法之一或通過手動比對和目測，在所測量的比較窗口或指定區域(指明的長度，或未指明時為全長)中進行比較和比對最大一致性時，具有指明的百分比的相同胺基酸或核苷酸殘基(即，在指定區域70%同一性，任選的75%、80%、85%、90%或95%同一性)。本發明提供了與例如，SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20基本相同的序列。任選的，同一性存在於長度至少約15個胺基酸或核苷酸的區域，或長度至少約18個胺基酸或核苷酸，長度約20個胺基酸或核苷酸，長度約22個胺基酸或核苷酸，長度約25-50個胺基酸或核苷酸，或長度約75-100個或更多個胺基酸或核苷酸的區域。對於序列比較，通常一條序列作為參照序列，將測試序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，給定子序列坐標，必要時，給定序列算法程序參數。可以使用默認的程序參數，或可以給定備選參數。然後，序列比較算法基於程序參數，計算測試序列相對於參照序列的百分比序列同一性。如本文中使用的，「比較窗口 」包括參考下列數量的連續位置的任一區段，所述位置數量選自從20至600，通常約50至約200，更常見約100至約150，其中，在兩條序列最佳比對後，可以比較序列與具有相同連續位置數量的參照序列。用於比較的序列比對方法是本領域普遍已知的。可以通過例如Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法，Pearson& Lipman, Proc.Nat』 I Acad.Sc1.USA85:2444 (1988)的相似性檢索方法，計算機化的這些算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group, 575ScienceDr.，Madison, ffis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或手動比對和目測(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編著，1995supplement)),進行用於比較的序列最佳比對。適合確定百分比序列同一性和序列相似性的兩個算法實例是BLAST和BLAST2.0算法，分別描述在 Altschul 等人；Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和 Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用於實施BLAST分析的軟體是公眾通過國立生物技術信息中心可獲得的。該算法涉及首先通過在查詢序列中鑑別長度W的短字，來鑑別高得分序列對(HSP)，當與資料庫序列中相同長度的字比對時，所述短字匹配或滿足一些正值閾值分數T。T被稱為相鄰字分數閾值(Altschul等人，見上文)。這些初始的相鄰字命中作為種子，用於發起對尋找含有它們的更長HSP的搜索。只要可以增加累積的比對分數，則字命中沿著每條序列的兩個方向延伸。累積分數如下計算，核苷酸序列使用參數M(匹配殘基對的獎勵分；總是> O)和N(錯配殘基的罰分；總是< O)。對於胺基酸序列，使用評分矩陣計算累積分數。當累積的比對分數距其實現的最大值跌落了 X ;由於積累了一個或多個負分殘基比對，使累積分數達到O或負值；或達到任一序列的末端時，中止在各個方向上字命中的延伸。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)使用字長度(W) 11、期望(E) 10、M = 5、N = -4和比較兩條鏈作為默認值。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用字長度3、期望(E) 10和BL0SUM62評分矩陣(參見Henikoff& Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89: 10915 (1989))比對(B) 50、期望(E)10、M = 5、N=-4和比較兩條鏈作為默認值BLAST算法還對兩條序列之間的相似性實施統計學分析(參見例如Karlin &Altschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一種相似性測量是最小總和概率 (P(N))，其提供了在兩條核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的提示。例如，如果在測試核酸與參照核酸的比較中，最小總和概率小於約0.2，更優選小於約0.01，最優選小於約0.001，則認為核酸與參照序列相似。詞組「選擇性(或特異性)雜交」指當序列存在於複雜混合物中時(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)，在嚴格的雜交條件下，分子僅與特別的核苷酸序列結合、成雙(duplex)或雜交。詞組「嚴格的雜交條件」指在所述條件下，探針與通常在複雜的核酸混合物中的其靶子序列雜交，而不與任何其他序列雜交。嚴格的條件是序列依賴性的，並在不同環境下是不同的。較長的序列在較高的溫度下特異性地雜交。對核酸雜交的廣泛指導可見於Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Probes，「Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays」(1993)。一般而言,選擇的嚴格條件是在定義的離子強度pH條件下，低於特定序列的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tm是50%的與靶互補的探針與靶序列雜交處於平衡時的溫度(在定義的離子強度、PH和核酸濃度下)(由於在Tm下靶序列過量存在，平衡時50%探針被佔用)。嚴格的條件是其中鹽濃度少於約1.0M鈉離子，通常是約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH7.0至8.3，並且對於短探針(例如，10至50個核苷酸)，溫度是至少約30°C，而對於長探針(例如，大於50個核苷酸)，溫度是至少約60°C的條件。還可以通過添加去穩定劑(如甲醯胺)實現嚴格的條件。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少2倍，任選是10倍背景雜交。示例性的嚴格雜交條件可如下:50%甲醯胺、5x SSC 和 1% SDS，在 42°C孵育，或 5x SSC、I % SDS，在 65°C孵育，和在 65° C 的 0.2xSSC和0.1% SDS中洗滌。如果它們編碼的多肽是基本上相同的，在嚴格條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本上相同的。這發生在例如使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡併性製備核酸拷貝時。在此類情況下，核酸通常在中度嚴格的雜交條件下雜交。示例性的「中度嚴格的雜交條件」包括在37°C的40%甲醯胺，IM NaCl, I % SDS緩衝液中雜交，和在45°C的Ix SSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的2倍。普通技術人員可以容易地認識到可以利用備選的雜交和洗滌條件以提供相似的嚴格性條件。「抗體」指包含來自免疫球蛋白基因的框架區或其片段的多肽，其特異性結合和識別抗原。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恆定區基因，以及大量的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε ,重鏈反過來分別定義了免疫球蛋白類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條「輕鏈」(約25kDa)和一條「重鏈」(約50-70kDa)。每條鏈的N端定義了主要負責抗原識別的約100至110個或更多個胺基酸的可變區。術語可變輕鏈(')和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重 鏈。抗體作為例如完整的免疫球蛋白或者用多種肽酶消化生產的多種良好表徵的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下方消化抗體，生產F(ab)』2，所述F(ab)』2是本身通過二硫鍵與Vh-Chi聯接的Fab的二聚體。可以在溫和的條件下還原F(ab) 』 2，以破壞鉸鏈區中的二硫鍵從而將F(ab)』 2 二聚體轉化為Fab』單體。Fab』單體本質上是具有部分鉸鏈區的Fab (參見Fundamental Immunology (Paul編著,第3版，1993))。儘管按照完整抗體的消化來定義多種抗體片段，本領域技術人員可理解可以通過化學從頭合成或使用重組DNA方法，來合成此類片段。因此，如本文中使用的，術語抗體還包括這樣的抗體片段，所述抗體片段是通過修飾整個抗體生產的，或者使用重組DNA方法從頭合成的(例如，單鏈Fv),或者使用卩遼菌體展示文庫鑑別的(參見例如，McCafferty等人，Nature348:552-554(1990))ο為了製備單克隆或多克隆抗體，可以使用本領域已知的任何技術(參見例如，Kohler & Milstein, Nature256:495-497(1975) ；Kozbor 等人，Immunology Today4:72 (1983) ;Cole 等人，第 77_96 頁，在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)中)。可以調整用於生產單鏈抗體(美國專利號4，946，778)的技術，來生產本發明多肽的抗體。也可以使用轉基因小鼠或其他生物(例如其他哺乳動物)來表達人源化抗體。備選地，可以使用噬菌體展示技術來鑑別特異性結合所選定的抗原的抗體和異數Fab片段(參見例如，McCafferty 等人，Nature348:552-554 (1990) ；Marks 等人，BiotechnologylO:779-783(1992))。「嵌合抗體」是這樣的抗體分子，其中(a)恆定區或其部分被改變、取代或交換，使得抗原結合位點(可變區)與具有不同的或經改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區，或賦予了嵌合抗體新的特性的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)連接；或(b)可變區或其部分被具有不同的或經改變的抗原特異性的可變區改變、取代或交換。「人源化抗體」是保留了非人抗體的反應性，同時在人中的免疫原性較低的抗體。這可以通過例如保留非人CDR區並用其人類對應物取代抗體的剩餘部分來實現。參見例如，Morrison 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984) ；Morrison 和 0i, Adv.1mmunol.，44:65-92(1988) ；Verhoeyen 等人，Science,239:1534-1536(1988) ；Padlan,Molec.Tmmun.,28:489-498(1991) ；Padlan, Molec.Tmmun.,31(3): 169-217(1994)。當涉及蛋白質或肽時，詞組「特異性(或選擇性)結合」抗體或「與......特異
性(或選擇性)免疫反應」指測定在蛋白質和其他生物製品的異質群體中的蛋白質存在的結合反應。因此，在指定的 免疫測定條件下，指明的抗體與特別的蛋白質以至少2倍背景結合，且基本上不與樣品中存在的其他蛋白質以顯著的量結合。在此類條件下與抗體的特異性結合可需要對於其針對特別的蛋白質的特異性而選擇的抗體。例如，可以選擇來自特定物種(如大鼠、小鼠或人)的針對Piezol或Piezo2產生的多克隆抗體，以僅獲得與Piezol或Piezo2而不與其他蛋白質(除了 Piezol或Piezo2的多態性變體和等位基因以外)特異性免疫反應的多克隆抗體。可以通過減去與來自其他物種的Piezol或Piezo2分子交叉反應的抗體來實現這一選擇。可以使用多種免疫測定形式來選擇與特別的蛋白質特異性免疫反應的抗體。例如固相ELISA免疫測定常規用於選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體(對於對能夠用來測定特異性免疫反應的免疫測定形式和條件的描述，參見例如，Harlow &Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988))。通常,特異性的或選擇性的反應是背景信號或噪聲的至少2倍，更通常是背景的10倍以上至100倍。「對象」或「個體」指動物，包括人、非人靈長類、小鼠、大鼠、兔、狗或其他哺乳動物。附圖簡介圖l.Neuro2A和C2C12細胞展示了不同類型的機械激活的電流。(A、B)在Neuro2A(N2A, A)和C2C12(B)細胞中表現的機械激活的(MA)內向電流的代表性跡線。在-SOmV保持電勢的全細胞膜片配置中，使用刺激電極(內置圖，箭頭)對細胞進行經歷一系列I μ m增量的機械步驟。(C)相對於在N2A和C2C12細胞中的_80mV保持電勢下觸發的電流的峰電流，機械步驟結束時(150ms持續期)的失活電流比率(平均值土SEM，細胞數在柱上方)。***，P<0.001。(D，E)在 N2A(D，n = 11)和 C2C12(E，n = 4)細胞中的 MA電流的平均電流-電壓關係。內置圖是在-80至+40mV範圍內的保持電勢(在機械步驟前
0.7sec應用)下引發的代表性MA電流。(F)在_80mV保持電勢下在N2A和C2C12細胞中觸發的MA內向電流的平均最大振幅(平均值土SEM，柱上方顯示了測試的細胞數)。*，P<0.05。(G)在N2A細胞中，在-80mV至+80mV範圍內的保持電勢下，由負電極壓力(內置圖，箭頭)誘導的單通道電流(細胞附著式膜片配置)。(H)在N2A細胞中，牽張激活的單通道的平均電流-電壓關係(η = 4，平均值土SEM)。從每個細胞的線性回歸線的斜率計算單通道電導給出Y =22.9±1.4pS(平均值土SEM)。單通道振幅被測定為全跡線直方圖的高斯擬合中的振幅差異。(I)在N2A細胞中，由負電極壓力(O至-60mm Hg, Δ IOmm Hg)誘導的代表性電流(平均跡線)。(J)用波耳茲曼等式擬合的-SOmV下的牽張激活電流的歸一化的電流-壓力關係(η = 21)。P5tl是來自單個細胞的P5tl的平均值。圖2.Piezol (Fam38A) siRNA對機械激活的電流的抑制。㈧在用亂序的siRNA (最左邊的點，η = 56)、Piezol (Fam38A)siRNA(右下方的點，η = 20)或針對測試的其他候選對象的siRNA(黑色點，從表S2可獲得候選對象列表)轉染的N2A細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的MA內向電流的平均最大振幅。對於每個候選對象，黑色圓圈和誤差棒代表了平均值土SEM，每者η = 4-27。黑色線代表所有測試細胞的平均值(η = 807)，兩條虛線代表了該值減少或增加4倍。(B)在-SOmV保持電勢下，在用亂序的siRNA(上方跡線)或Piezol (Fam38A) siRNA(下方跡線)轉染的N2A細胞中表現的MA內向電流的代表性跡線。(C)在用亂序的siRNA(左側柱)或不同的Piezol (Fam38A) siRNA轉染的N2A細胞中，在-80mV保持電勢下觸發的MA內向電流的平均最大振幅。siRNAl、2和3是單獨測試的smart-pool I的siRNA。(D)在用亂序的siRNA(左圖)或PiezolsiRNA(右圖)轉染的N2A細胞中，由負電極壓力(O至-60mm Hg，Δ IOmm Hg，細胞附著式)誘導的代表性電流(平均的跡線)。高亮了由-60mm Hg觸發的電流跡線。(E)在用亂序的siRNA(左側柱)或PiezolsiRNA (右側柱)轉染的N2A細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的牽張激活的電流的平均最大振幅。柱代表平均值土SEM，在柱上方顯示了測試的細胞數。* *，P < 0.01。
女女，P < 0.001。圖3.PiezolsiRNA qPCR和細胞活力對照，和在破壞整聯蛋白功能後的N2A MA電流。(A)在N2A細胞中siRNA誘導的PiezolmRNA的下調。沒有分選轉染的和未轉染的細胞，因此差異是被低估的。(B)共轉染了 TRPVl和GFP，以及亂序的siRNA或PiezolsiRNA的辣椒素刺激的N2A細胞的代表性比率鈣成像實驗(GFP-陽性細胞跡線的平均值土SEM)。(C)應答辣椒素的GFP陽性細胞的百分比(左圖，兩次實驗的平均值土SEM)和辣椒素應答細胞的Fura-2340/380比例倍數改變(平均值土SEM)。(D)在對照條件下或在用沒有二價離子的含有5mM EGTA的 溶液灌注30-60分鐘後，在_80mV保持電勢下，在N2A細胞中觸發的全細胞MA電流的最大電流振幅。(E)在對照條件下或在用沒有二價離子的含有5mM EGTA的溶液灌注30-60分鐘後，相對峰歸一化的MA電流的代表性跡線(左圖)。用單指數方程擬合失活電流。在沒有二價陽離子的條件下，失活的時間常數大於用對照溶液的(右圖)。* * *，P < 0.001，未配對t檢驗。圖4.Piezol和Piezo2的進化保守性、疏水性圖和表達譜。(A)顯示Piezo蛋白家族的不同成員的序列關係的無根系統發生樹。使用Megalign和DrawTree程序生成比對。點線代表容納擬合的人為延伸的線。Hs:智人(Homo Sapiens) ;Mm:小鼠(Mouse musculus) ;Gg:原雞(Gal Ius gallus) ;Dr:斑馬魚(Danio Rerio) ;C1:玻璃海鞘(Ciona intestinalis) ；Dm:黑腹果妮(Drosophila melanogaster) ；Ce:秀 _ 杆線蟲(Caenorhabditis elegans) ;Dd:盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum) ;At:擬南芥(Arabidopsis thaliana) ;0s:稻(Oryza sativa) ;Tt:嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)(「方法」中提供了登錄號)。(B)小鼠Piezol的疏水性分析。Kyte-Doolittle圖式(19個殘基的窗口)顯示連續的疏水性和親水性區域。通過TMHMM2預測30個跨膜結構域。(C)通過qPCR從多種成年小鼠組織確定的Piezol (左圖)和Piezo2(右圖)的mRNA表達譜。使用2_Λ 方法，使用GAPDH作為參照基因和肺作為組織校準物。每個柱形是兩次單獨實驗的平均的平均值+SEM。圖5.Piezol誘導大的機械激活的非選擇性陽離子電流。(A-F)在全細胞配置中記錄的表達Piezol的N2A (A-C)和HEK293T (D-F)細胞的MA電流。(A，D)在用Piezol轉染的不同細胞類型中表現的MA內向電流的代表性跡線。使用玻璃探針刺激和在_80mV保持電勢下，對細胞進行Ium(A)或0.5 μ m(D)增量的一系列機械步驟。(Β，Ε)在用Piezol轉染的不同細胞類型中表現的MA電流的代表性電流-電壓關係。內置圖是在範圍從-80至+40mV的保持電勢下引發的MA電流。(C，F)在Piezol轉染(右側柱)或模擬轉染(左側柱)的細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的MA內向電流的平均最大振幅。柱代表了平均值土SEM，而測試的細胞數顯示在柱上方。***，P <0.001。(G)表達Piezol的細胞中的MA電流的子選擇性比。(H) 30 μ M釓或釕紅對表達Piezol的細胞中的MA電流的百分比阻斷。(1-N)在細胞附著模式的配置中，表達小鼠Piezol的Ν2Α(Ι_Κ)和ΗΕΚ293Τ(L-N)細胞的牽張激活的電流。在用Piezol轉染的Ν2Α(Ι)和HEK293T(L)細胞中的由負電極壓力(O至-60mm Hg, Δ IOmm Hg)誘導的代表性平均電流。在Piezol轉染的N2A(J,n = 12)和HEK293T(M，n = 11)細胞中的在_80mV下觸發的牽張激活的電流的歸一化的電流-壓力關係，以及用波耳茲曼等式擬合。P5tl是對單個細胞確定的所有P5tl的平均值。在模擬轉染(左側柱)或用Piezol轉染(右側柱)的N2A(K)和HEK293T(N)細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的牽張激活的電流的平均最大振幅。柱代表了平均值土SEM，而測試的細胞數顯示在柱上方。* * * , P < 0.001 ο * * , P < 0.01。圖6.Piezol誘導的MA電流是 被釓和釕紅阻斷的陽離子非選擇性電流。(A-C)在全細胞配置中記錄的表達Piezol的C2C12細胞的MA電流。(A)在Piezol轉染的細胞中表現的MA內向電流的代表性跡線。使用玻璃探針刺激和在_80mV保持電勢下，對細胞進行I μ m增量的一系列機械步驟。(B)在Piezol轉染的細胞中表現的MA電流的代表性電流-電壓關係。內置圖是在範圍從-80至+40mV的保持電勢下觸發的MA電流。(C)在Piezol轉染(右側柱)或模擬轉染(左側柱)的細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的MA內向電流的平均最大振幅。柱代表了平均值土SEM，而測試的細胞數顯示在柱上方。***，？<0.001，使用帶有Welch校正的非配對t檢驗。⑶在對照溶液中水浴的(左圖)或用150mM NMDG-Cl溶液灌注後(中圖)，在Piezol轉染的細胞中觸發的全細胞MA電流跡線。以40mV的步驟，從-80mV至+80mV觸發了電流。右圖顯示了來自相同細胞中的MA電流-電壓關係。應注意，用外部NMDG-Cl溶液(空心符號)抑制了對照條件下(實心符號)存在的內向電流。(E-F)在Piezol轉染的HEK293T細胞中觸發的MA電流的平均電流-電壓關係，並用基於CsCl-的內部溶液和基於 150mM NaCl_、150mM KC1-、IOOmMCaCl2-或 IOOmM MgCl2-的胞外溶液記錄。(E)在校正液體接界電勢之前，相對-40mV的值歸一化單個細胞的1-V關係。(F)對於每個記錄條件和單個細胞確定的平均逆轉電勢值(平均值土SEM)。(G-H)在灌注30 μ M釓(E)或釕紅(F)之前、期間和之後，在Piezol轉染的細胞中觸發的MA電流的代表性電流跡線。圖7.Piezo2誘導大的機械激活的電流,該電流與Piezol-誘導的電流動力學不同。(A-F)在全細胞配置中，表達Piezo2的N2A(A_C)和HEK293T (D-F)細胞的MA電流。在N2A細胞中，將Piezo2或僅載體與PiezolsiRNA共轉染，以抑制內源性Piezol依賴性MA電流。(A，D)在用Piezo2轉染的不同細胞類型中表現的MA內向電流的代表性跡線。在-8OmV保持電勢下使用玻璃探針刺激，對細胞進行了 Iym增量的一系列機械步驟。(B，E)在用Piezo2轉染的不同細胞類型中表現的MA電流的代表性電流-電壓關係。內置圖是在範圍從-80至+40mV的保持電勢下觸發的MA電流。(C，F)在Piezol轉染(右側柱)或模擬轉染(左側柱)的細胞中，在_80mV保持電勢下觸發的MA內向電流的平均最大振幅。(G-H)在指明的保持電勢下，在用Piezol(右跡線)或Piezo2(左跡線)轉染的細胞中表現的機械激活的內向(G)或外向(H)電流的代表性跡線。將跡線相對峰歸一化，虛線代表用單指數方程對失活的擬合。(I)在負(-80和-40mV，上圖)和正(40和80mV，下圖)保持電勢下，Piezol(左側柱)和Piezo2(右側柱)的失活時間常數。柱代表了平均值土SEM，而測試的細胞數顯示在柱上方。* *，P < 0.01，* * *，P < 0.001。圖8.Piezo2誘導的MA電流是陽離子非選擇性的。(A)在對照溶液中水浴(左圖)和用NMDG-Cl溶液灌注後(右圖)的Piezo2轉染的細胞中的全細胞MA電流跡線。在-80、_40、0、+40和+80mV觸發電流。(B)來自相同細胞的MA電流-電壓關係。應注意用NMDG-Cl溶液(空心符號)抑制對照條件(實心符號)中存在的內向電流。(C)在灌注30 μ M釓(上圖)或釕紅(下圖)之前、期間和之後，在Piezo2轉染的細胞中觸發的MA電流的代表性電流跡線。( 0)3(^1釓和釕紅對表達？1以02的細胞中的MA電流的百分比阻斷。柱代表了平均值土SEM，而測試的細胞數顯示在柱上方。圖9.Piezol抗體檢測轉染的HEK293T細胞中的Piezol。⑷在轉染Piezol-1RES-EGFP的細胞(綠色)中的Piezol標記(紅色)的代表性圖像。應注意GFP-陰性的(因此是未轉染的)細胞不含標記。(B)在共轉染TRPAl和Piezol的HEK293T細胞的質膜附近或質膜處表達部分Piezol。用TRPAl抗體(綠色)活體標記細胞以描繪出質膜，將細胞固定、透化並對Piezol (紅色)和MYC(總TRPA1)染色。內置圖是重疊圖像中的方框區域的高倍放大。比例尺=20 μ m。

圖10.DRG神經元中的Piezo2的siRNA-敲低選擇性地降低快失活MA電流。(A)使用反義(左圖)和有義(右圖)探針的背根神經節(DRG)神經元中的Piezo2的比色原位雜交的代表性圖像。(B)通過不同的失活動力學表徵DRG神經元中表現的三種典型MA內向電流的代表性跡線。在_80mV保持電勢下,對神經元進行I μ m增量的一系列機械步驟。用雙指數方程擬合電流失活，給出快速時間常數(τ)為7.3ms，而慢時間常數> IOOms (左圖)，或用單指數方程擬合，給出時間常數為27ms (中圖)。一些具有τ > 30ms的電流過於緩慢以至於不能在持續150ms的步驟刺激中有效擬合(右圖)。(C-D)指示響應機械刺激的、轉染了亂序的SiRNA(Ctr)或PieZ02siRNA(siRNA)的神經元比例的頻率直方圖，其中MA電流通過其失活動力學進行表徵。柱代表了來自7次單獨實驗的神經元的比例(B，每種條件和每次實驗下η = 12-19個神經元)或混合來自所有7次實驗的所有神經元的比例(C)的平均值土SEM ;C中的柱上方的數值代表了神經元的數量。**，P<0.01。ns，無顯著差異。圖11.在DRG神經元的亞群中表達的Piezo2mRNA。組合Piezo2螢光測定原位雜交(左圖)與小鼠DRG中免疫染色的外周蛋白(A，中圖)和神經絲200(NF200) (B，中圖)，以及與(C)大鼠DRG中免疫染色的TRPVl (中圖)，顯示在Piezo2陽性神經元中，60%也表達外周蛋白(對於Piezo2n = 204，對於外周蛋白η = 555，其中23%還表達Piezo2，共1188個神經元)；28%也表達NF200(對於Piezo2n = 277，對於NF200n = 368，其中19%還表達Piezo2，共計1203個神經元)，並且24%也表達TRPVl (對於Piezo2n = 233，對於TRPVln=394,其中15%也表達Piezo2,共975個神經元)。箭頭顯示了表達Piezo2和各個標誌物的神經元的實例(A-C，右圖)。比例尺=50 μ m。圖12.DRG和Piezo2siRNA對照實驗和比較DRG神經元中的MA電流失活。(A-B)在培養的DRG神經元中，siRNA介導的TRPAl敲低。(A)對用亂序的siRNA對照(η = 415神經元，左圖)和TRPAlsiRNA(η = 467神經元，右圖)轉染的培養的DRG神經元的比率鈣成像的代表性跡線。(B)在轉染48至72小時後測定來自2次獨立轉染的、應答芥子油(MO, TRPAl通道的激動劑)和辣椒素(CAPS，TRPVl通道的激動劑)的神經元的平均百分t匕。儘管siRNA處理後MO(100 μ M)應答者的百分比顯著降低(亂序的:15.34±3.69% ；siRNA:2.48 ±0.96%；P = 0.0286，Mann Whitney 檢驗)，而對 CAPS (0.5 μ Μ)的應答則不受TRPAlsiRNA 處理的影響(亂序的:27.43±5.81 % ;siRNA:32.28±3.84% ;ns)。柱代表了平均值土SEM。(C)存在或缺少Piezo2siRNA時，Piezo2誘導的MA電流的平均最大振幅。用 Piezo2cDNA 或 Piezo2cDNA+Piezo2siRNA 共轉染 N2A 細胞，所述細胞轉染了 PiezolsiRNA以抑制內源性MA電流。⑶在亂序的siRNA轉染的DRG神經元中，記錄的MA電流失活的時間常數直方圖。使用2.5ms間距，繪製具有 30ms時間常數的電流的失活動力學過於緩慢，而不能在150ms內準確擬合)。與雙高斯方程擬合表現出分別以7.2±0.5ms和16.0±2.Ims為中心的兩個峰。(E)顯示在機械刺激150ms後失活的電流的量(I失活，右雙箭頭)和峰處的電流量(I峰，左雙箭頭)(左圖)之間的比較的MA電流的跡線實例。在亂序的或Piezo2siRNA轉染的條件之間(右圖，分別是每對柱的左側和右側柱)，比較在150ms時具有不同程度的電流失活的DRG神經元的百分比(以5%增量的I失活/I峰，其中100%是完全失活)。
發明詳述
1.介紹

本發明鑑別了稱為「Piezo」蛋白的多通道跨膜蛋白質在細胞的力傳導中的作用。已經在動物、植物和其他真核物種中鑑別了一種或多種Piezo蛋白，包括但不限於脊椎動物(例如哺乳動物，如人和小鼠，鳥類如雞，魚如斑馬魚)、無脊椎動物(例如，海鞘(Ciona)、果蜆(Drosophila)、按蚊(Annopheles)和秀 I 杆線蟲(C.elegans))、擬南芥、稻和纖毛蟲，儘管之前尚未報導過這些Piezo蛋白的功能特徵。Piezo蛋白具有中等保守的二級結構和全長，一般是從約2100個胺基酸至約4700個胺基酸，約24-36個跨膜結構域遍布於推定的蛋白質中。在本文中首次證實，過表達Piezo誘導強的機械激活的電流，然而抑制Piezo的表達降低了機械激活的電流。在並非意在限制本發明範圍的條件下，認為Piezo作為機械激活的陽離子通道的組分參與細胞中的力傳導。因此，本發明提供了通過將活性劑和基本上與Piezo蛋白相同的多肽接觸篩選調節機械激活的陽離子通道多肽的活性的活性劑的方法。本發明還提供了拮抗機械激活的陽離子通道活性的針對Piezo蛋白的抗體，和通過施用所述抗體減輕對象的疼痛的方法。本發明還提供了抑制Piezo蛋白質生產的反義寡核苷酸或siRNA，和通過施用所述反義寡核苷酸或siRNA減輕對象疼痛的方法。本發明還提供了用於實踐所述方法的試劑盒。I1.機械激活的陽離子通道活性的調節劑的測定在一個方面，本發明提供了篩選調節機械激活的陽離子通道的活性的活性劑的方法，方法包括:將機械激活的陽離子通道多肽與活性劑接觸；和選擇調節機械激活的陽離子通道多肽的活性的活性劑。
A.機械激活的陽離子通道多肽的表達機械激活的陽離子通道多肽，和編碼所述多肽的多核苷酸，與跨膜蛋白的Piezo家族的成員基本上相同。在一些實施方案中，機械激活的陽離子通道多肽與SEQ ID NO:2,
4、18或20中的任一項基本上相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%,94% 95%、96%、97%、98%或99%相同)。在一些實施方案中，機械激活的陽離子通道多肽包含SEQ ID NO:2、4、18或20中的任一項。在一些實施方案中，篩選調節機械激活的陽離子通道的活性的活性劑的方法包括將細胞與活性劑接觸，和選擇調節機械激活的陽離子通道多肽的活性的活性劑，所述細胞包含與SEQ ID NO:2、4、18或20的任一項基本上相同(例如，具有至少70%同一性)的機械激活的陽離子通道多肽。在一些實施方案中，細胞內源性表達機械激活的陽離子通道多肽。在一些實施方案中，機械激活的陽離子通道多肽對於細胞是異源的。本發明的篩選方法中可以使用任何這樣的細胞，所述細胞內源性表達處於可檢測的水平的機械激活的陽離子通道多肽，所述多肽與SEQ ID N0:2、4、18或20中的任一項具有至少70%同一'丨生。可以通過本領域已知的核酸或蛋白質表達的任何方法,來確定細胞是否內源性表達處於可檢測的 水平的機械激活的陽離子通道多肽。可以使用常規技術檢測核酸，例如Northern分析、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、微陣列、序列分析或基於與標誌物編碼序列的一部分互補的核酸序列雜交的任何其他方法(例如，槽印跡雜交)。可以使用常規的基於抗體的技術檢測蛋白質，例如免疫測定如ELISA、Western印跡、流式細胞計數、免疫螢光和免疫組化。內源性表達處於可檢測的水平的機械激活的陽離子通道多肽的細胞實例包括但不限於Neuro2A，所述多肽與SEQ ID NO:2、4、18或20中的任一項具有至少70%同一性。備選地，使用表達盒可以在目標細胞中異源表達機械激活的陽離子通道多肽。使用本領域已知的技術生成表達盒，所述表達盒包含與編碼本文描述的機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸有效連接的啟動子。在一些實施方案中，編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸基本上與SEQID NO:1、3、17 或 19 中的任一項相同(例如，至少 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、91 %、92%,93%,94% 95%、96%、97%、98%或99%相同)。在一些實施方案中，編碼機械激活的陽離子通道多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、3、17或19中的任一項。可以通過化學方法合成或通過本領域普遍已知的技術製備本文公開內容的多核苷酸。參見例如Creighton，Proteins-Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman&C0.，NewYork, NY(1983)。可以根據本領域普通技術人員普遍已知的技術，合成和/或克隆、和表達本文公開內容的編碼機械激活的陽離子通道多肽的核苷酸序列。參見例如Sambrook，等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, NY (1989)。通過與探針雜交或可以從cDNA和基因組DNA文庫中克隆編碼機械激活的陽離子通道的多核苷酸，或使用利用寡核苷酸引物的擴增技術分離所述編碼機械激活的陽離子通道的多核苷酸。例如可以通過與核酸探針(其序列可以源自SEQ ID N0:l、3、17或19)雜交，從哺乳動物核酸(基因組或cDNA)文庫中分離機械激活的陽離子通道多核苷酸序列。用於製備和篩選cDNA文庫的方法是普遍已知的(參見例如，Gubler & Hoffman, Gene25:263-269 (1983) ;Sambrook等人,見上文；Ausubel等人,見上文)。可以分離機械激活的陽離子通道多肽RNA和cDNA的合適組織包括但不限於背根神經節、神經、神經元、膀胱、結腸、腎、肺和皮膚。分離機械激活的陽離子通道多核苷酸的備選方法組合使用了合成的寡核苷酸引物和擴增RNA或DNA模板(參見美國專利號4，683，195和4，683，202 ；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (Innis 等人編著，1990))。可以使用如聚合酶鏈式反應(PCR)和連接酶鏈式反應(LCR)的方法，直接從mRNA、從cDNA、從基因組文庫或從cDNA文庫中擴增機械激活的陽離子通道的核酸序列。擴增技術是本領域已知的，參見例如，Sambrook,等人，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 1-3 卷，Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,NY。可以使用在公眾可獲得的資料庫中可獲得的多核苷酸序列製備引物。可以從瓊脂糖凝膠純化通過PCR反應擴增的基因，並將所述基因克隆到含有選擇標誌物的恰當載體中，用於在宿主中增殖。此類標誌物包括但不限於用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，和用於在E.coli和其他細菌中培養的四環素、青黴素或卡那黴素抗性基因。為了獲得高水平表達的克隆的基因或核酸(例如編碼機械激活的陽離子通道的cDNA)，通常將機械激活的陽離子通道亞克隆到表達載體中，所述表達載體含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子，和如果用於編碼蛋白質的核酸時，含有用於翻譯起始的核糖體結合位點。合適的細菌啟動子是本領域普遍已知的，描述在例如Sambrook等人和Ausubel等人中。用於表達機械激活的陽離子通道多肽的細菌表達系統可獲得自例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬某種(Bacillus sp.)和沙門氏菌屬某種(Salmonella) (Palva等人，Gene22:229-235(1983) ;Mosbach 等人，Nature302:543-545 (1983))。用於此類表達系統的試劑盒是可商購的。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統是本領域普遍已知的，也可以商購。用於指導異源核酸表達的啟動子取決於特別的應用。啟動子任選地大概位於距異源轉錄起始位點這樣的距離的位置上，所述距離與天然環境中距其轉錄起始位點相同。然而，如本領域已知的，在不丟失啟動子功能的條件下可以容納對該距離的一些變化。除啟動子外，表達載體通常含有轉錄單元或表達盒，所述轉錄單元或表達盒含有在宿主細胞中表達機械激活的陽離子通道編碼核酸所需的所有額外元件。因此，典型的表達盒含有與編碼機械激活的陽離子通道的核酸序列有效連接的啟動子，對於轉錄物的有效多聚腺苷酸化所需的信號，核糖體結合位點和翻譯終止。編碼機械激活的陽離子通道的核酸序列通常可以與可切割的信號肽序列連接，以促進經轉化的細胞分泌所編碼的蛋白質。其中，此類信號肽包括來自組織纖維蛋白溶酶原激活劑、胰島素、神經元生長因子和煙芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信號肽。盒的其他元件可包括增強子，以及如果使用基因組DNA作為結構基因，還包括具有功能性剪接供體和受體位點的內含子。除啟動子 序列外，表達盒還可以含有在結構基因下遊的轉錄終止區，來提供有效的終止。終止區可獲得自與啟動子序列相同的基因，或者可以獲得自不同的基因。用於運輸遺傳信息到細胞內的特比的表達載體不是特別關鍵的。可以使用用於在真核或原核細胞中表達的任何常規載體。標準的細菌表達載體包括質粒，如基於PBR322的質粒、pSKF、pET23D，和融合表達系統，如GST和LacZ。還可以向重組蛋白添加表位標籤(例如c-myc)以提供方便的分離方法。通常在真核表達載體中使用含有來自真核病毒的調控元件的表達載體，例如SV40載體、乳頭瘤病毒載體和源自Epstein-Barr病毒的載體。其他示例性的真核載體包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo_5、杆狀病毒pDSVE和任何其他允許蛋白質表達的載體，所述蛋白質表達處於SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其他在真核細胞中表現出有效表達的啟動子的指導之下。一些表達系統具有提供基因擴增的標誌物，例如胸苷激酶、潮黴素B磷酸轉移酶，和二氫葉酸還原酶，備選地，不涉及基因擴增的高產表達系統也是合適的，例如在昆蟲細胞中使用杆狀病毒載體，所述載體具有處於多角體蛋白啟動子或其他強杆狀病毒啟動子指導下的機械激活的陽離子通道編碼序列。

通常包括在表達載體中的元件還包括在E.coli中有功能的複製子,允許選擇具有重組質粒的細菌的編碼抗生素抗性的基因，和允許插入真核序列的質粒的非必需區域中的獨特的限制性酶切位點。所選擇的特別的抗生素抗性基因不是關鍵的，本領域已知的多種抗性基因中的任一種都是合適的。如果需要，任意選擇原核序列，使其不幹擾DNA在真核細胞中的複製。可以使用多種普遍已知的方法中的任一種，將包含由異源啟動子驅動的機械激活的陽離子通道編碼序列的重組表達載體導入到理想的宿主細胞的基因組中。這些方法包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒載體，和任何其他普遍已知的用於將克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遺傳材料導入到宿主細胞中的方法(參見例如，Sambrook等人，見上文)。唯一必需的是所使用的特別的遺傳工程方法能夠成功地將至少一個基因導入到能夠表達機械激活的陽離子通道的宿主細胞中。
B.篩選對陽離子通道活性的調節
1.陽離子通道活性測定Piezo是機械激活的陽離子通道的組分。可以使用多種體外和體內測定，例如，測量電生理學改變，如電流的改變(在機械敏感型測定中和不依賴於機械刺激的測定中)，測量第二信使和轉錄水平，測量配體結合，測量陽離子流入，和使用電壓-敏感型染料、離子敏感型染料(例如Ca2+)等，來評估包含與Piezo基本上相同的多肽的機械激活的陽離子通道的活性，此外，此類測定可用於測試機械激活的陽離子通道的抑制劑和激活劑。此類調節劑可用於治療涉及機械激活的陽離子通道的多種病症。在一些實施方案中，使用測定，在初始篩選中鑑別了調節(激活或抑制)機械激活的陽離子通道活性的活性劑，所述測定測量不依賴於機械刺激的方面，例如，電壓鉗或膜片鉗測定、電壓敏感型染料、離子敏感型染料、陽離子流入測定等。然後，對於使用此類測定鑑別的激動或抑制機械激活的陽離子通道活性的活性劑，可以通過測試活性劑在機械敏感型測定中的對抗或拮抗效應(例如使用壓電驅動壓力測定或膜牽張測定)，篩選具有以機械依賴性方式調節機械激活的陽離子通道活性的能力的活性劑。在一些實施方案中，在使用本文描述的機械敏感型測定的初篩中，鑑別了調節機械激活的陽離子通道活性的活性劑。使用基本上與Piezo相同的、具有生物學活性的重組的或天然存在的機械激活的陽離子通道多肽，來測試調節劑。可以分離，在細胞中共表達或表達，或在源自細胞的膜中表達機械激活的陽離子通道多肽。使用上述體外或體內測定中的一種來測試調節。將用潛在的機械激活的陽離子通道抑制劑或激活劑處理的樣品或測定與不含測試化合物的對照樣品進行比較，以檢驗調節程度。對照樣品(未用激活劑或抑制劑處理)的機械激活的陽離子通道活性的相對值被賦值100。當機械激活的陽離子通道的活性值相對於對照是約低於90 %，例如低於75 %、低於50 %或低於25 %時，實現對機械激活的陽離子通道的抑制。當機械激活的陽離子通道的活性值相對於對照是高於110%、高於125%、高於150%或高於200%或更高時，實現對機械激活的陽離子通道的激活。增加離子流的化合物將通過增加機械激活的陽離子通道開放的概率，通過減少其關閉的概率，通過增加通過通道的電導，和/或通過允許離子通過，來導致離子電流密度的可檢測的增加。可以通過確定表達機械激活的陽離子通道的細胞或膜的極化(S卩，電勢)改變，評估離子流的改變。確定細胞極化改變的方法是通過用電壓鉗和膜片鉗技術，例如「細胞附著」模式、「由內而外」模式和「全細胞」模式來測量電流的改變(從而測量極化的改變)(參見例如，Ackerman 等人，New Engl.J.Med.336:1575-1595 (1997))。使用標準方法方便地確定全細胞電流(參見例如，Hamill等人，Pflugers.Archiv.391:85-100 (1981))。其他已知的測定包括:放射性標記的離子流測定和使用電壓敏感型或離子敏感型染料的螢光測定(參見例如，Vestergarrd-Bogind 等人，J.Membrane Biol.88:67-75(1988) ；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.25:185-193 (1991) ;Holevinsky 等人，J.Membrane Biologyl37:59-70(1994))。可以通過將化合物應用於接觸和包含具有本發明通道的細胞的槽液，實施對能夠經機械激活的陽離子通道抑制或增加陽離子流的化合物測定(參見例如，Blatz等人，Nature323:718-720(1986) ；Park, J.Physiol.481:555-570 (1994))。一般而言，存在的待測試的化合物範圍為 IpM至IOOmM的範圍。可以通過電流或離子流的改變，或通過電流和離子流改變的後果，測量測試化合物對通道功能的影響。通過離子流例如陽離子(例如，鈣、鈉、鉀或鎂離子)的增加或減少，測量電流或離子流的改變。可以以多種標準方式測量離子。可以通過離子的濃度改變直接測量，例如胞內濃度的改變，或者通過膜電勢或放射性標記的離子間接測量。測試化合物對離子流的影響可以非常不同。因此，可以使用任何合適的生理學改變來評估測試化合物對本發明的通道的影響。在一些實施方案中，用於測定中的機械激活的陽離子通道多肽具有下列GenBank登錄號中展示的序列:人 Piezol-NP_001136336.2 ；小鼠 Piezol-NP_001032375.1 ；雞 Piezol-XP_414209.2 或 ΧΡ_423106.2 ;斑馬魚 Piezol_XP_696355.4 ;人Piezo2-NP_071351.2 ；小鼠 Piezo2-NP_001034574.3 ；雞 Piezo2_XP_419138.2 ;斑馬魚Piezo2-XP_00266625.1 ;或其保守修飾的變體、直系同源物和/或基本上相同的變體。一般而言，胺基酸序列同一性將是至少65%，例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或至少 99%0Piezo直系同源物、等位基因、多態性變體和保守修飾的變體一般對上述機械激活的陽離子通道賦予基本上相似的特性。在一些實施方案中，在真核細胞如爪蟾的卵細胞(例如，非洲爪蟾(Xenopus Iaevis))或哺乳動物細胞如CHO或HeLa細胞中，測定與懷疑是Piezo同源物的化合物接觸的細胞離子流的增加或減少，或在使用相似細胞類型的結合研究中進行測定。以與Piezo相似的方式受到化合物影響的通道被認為是Piezo的同源物或直系同源物。
2.機械敏感型陽離子通道活性測定在一些實施方案中，篩選具有調節通道中的機械激活的電生理學改變的能力的活性劑，所述通道包含基本上與Piezo相同的多肽。機械敏感型測定是本領域已知的，包括例如壓電驅動壓力、膜片膜牽張、剪切脅迫、滲透壓刺激和兩親性化合物。作為非限制的實例，可以使用測量由壓電驅動的機械探針造成的刺激的全細胞記錄，測定活性劑調節細胞內機械激活的電生理學的改變的能力。已描述了測定壓電驅動的壓力的方法，參見例如，Hu和Lewin，J.Physiol.577:815-828 (2006))。簡而言之，通常將火拋光的玻璃探針以> 45°角放置在靠近細胞表面。使用Clampex(Molecular Devices,Sunnyvale, CA)受控壓電晶體微型定位臺，以受控的速度和受控的時間長度驅動探針靠近細胞，並記錄機械激活的內向電流。本領域技術人員可認識到，可以改變參數例如電壓和密度、速度和機械刺激的持續時間。

作為另一個非限制的實例，可以在細胞附著模式中通過膜片電極牽張細胞膜，測定活性劑調節細胞內機械激活的電生理學的改變的能力。已描述了測定膜片膜牽張的方法，參見例如，Gil 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:14594-14599 (1999)。簡而言之，通過將熱拋光的膜片電極壓向細胞膜，然後使用Clampex壓力控制鉗(例如，HSPC-1壓力鉗，ALAScientific Instruments, Westbury, NY)向膜片電極施加輕微負壓來形成細胞上(on-cell)，或細胞附著式膜片，並記錄機械激活的內向電流。本領域技術人員可認識到，改變參數例如電壓、所使用的壓力的量和持續時間是有用的。
3.固態和高通量測定在本發明的高通量測定中，可以在一天內篩選多達數千、上萬、數十萬或更多種不同的調節劑或配體。特別的是，可以使用微滴度板的每個孔運行針對選定的潛在調節劑的獨立測定，或者如果要觀察濃度或孵育時間效應，則每5-10個孔可以測試單種調節劑。因此，單個標準的微滴度板可以測定約100種(例如，96種)調節劑。如果使用1536個孔，則單個平板可以方便的測定約100-約1500種不同的化合物。每天可以測定若干個不同的平板；使用本發明的整合系統，測定可以篩選多達約6，000-20，000或更多種不同的化合物。最近，由例如Caliper Technologies (Palo Alto, CA)研發了用於試劑操控的微流體方法，並可以使用該方法。作為非限制的實例，可以使用高通量電生理學篩選系統，例如1nWorks HT (Molecular Devices, Sunnyvale, CA),篩選對機械激活的陽離子通道具有效應的潛在的調節劑。簡而言之，1nWorksTMHT系統使用384孔板同時測量多個細胞的全細胞電流。用機載液壓系統將表達目標電壓門控型離子通道的細胞平行的分散到單獨的孔中，之後將單個細胞放置在每個孔內的單個小孔上，所述孔分隔出了兩個分離的、充滿液體的上下腔室，每個腔室含有緩衝液和獨立電極。所放置的細胞在孔上形成穩定的密封，阻止兩個腔室之間的電流。將細胞膜造孔劑(例如，兩性黴素B)導入到下腔室中，創造通過每個孔中的小孔所暴露的細胞膜部分的電通路。將含有48個電極的電子頭放入上方的腔室中，夾住細胞膜電勢，之後平行記錄48個細胞的離子電流。從96或384孔微滴度板吸取化合物，並用12通道射流頭移液器平行分散。目標分子可以直接或通過共價或非共價鍵(例如通過標籤)間接地與固體組分結合。標籤可以是多種組分中的任一種。一般而言，將結合標籤的分子(標籤結合物)固定在固體支持物上，並通過標籤與標籤結合物的相互作用將被標記的目標分子(例如，機械激活的陽離子通道多肽)附著到固體支持物上。基於文獻中普遍描述的已知分子相互作用，可以使用多個標籤和標籤結合物。例如，當標籤具有天然結合物(例如生物素、蛋白A或蛋白G)時，其可以與恰當的標籤結合物(抗生物素蛋白、鏈黴親和素、neutravidin、免疫球蛋白的Fe區等)聯合使用。具有天然結合物(例如生物素)的分子的抗體也是可廣泛獲得的，恰當的標籤結合物參見SIGMAImmunochemicals1998catalogue SIGMA, St.Louis MO。類似地，任何半抗原或抗原性化合物都可以與恰當的抗體組合使用，形成標籤/標籤結合物對。數千種特異性抗體是可商購的，文獻中也描述了許多其他的抗體。例如，在一種常見配置中，標籤是一抗，而標籤結合子是識別一抗的二抗。除抗體-抗原相互作用夕卜，受體-配體相互作用也適合作為標籤-標籤結合物對。例如，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如，細胞受體-配體相互作用，如轉鐵蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘蛋白家族、整聯蛋白家族、選擇素家族等；參見例如，Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book 1(1993)。類似地，毒素和毒液、病毒表位、激素類(例如，阿片製劑、類固醇)、細胞內受體(例如，介導多種小配體效應，包括類固醇、胸腺激素、類視黃醇和維生素D ;肽)、藥物、凝聚素、糖、核酸(線性和環狀聚合物構象)、寡糖、蛋白質、磷脂和抗體都可以與多種細胞受體相互作用。

合成的聚合物，例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚醯胺、聚乙烯亞胺、聚芳硫醚、聚矽氧烷、聚醯亞胺和聚乙酸酯，也可以形成恰當的標籤或標籤結合物。許多其他標籤/標籤結合物對也可用於本文所述的測定系統，參考本公開內容這對於本領域技術人員而言是顯而易見的。常見的接頭如肽、聚醚等也可以作為標籤，並且包括多肽序列，如在約5至200個胺基酸之間的多聚Gly序列。此類柔性接頭是本領域技術人員已知的。例如聚(乙二醇)接頭可獲得自Shearwater Polymers, Inc.Huntsville, Alabama。這些接頭任選的具有酸胺鍵、巰基鍵或雜官能鍵。使用多種現有方法中的任一種將標籤結合物固定在固體底物上。通常通過將全部或部分底物暴露於化學試劑，來衍生或功能化固體底物，所述化學試劑將化學基團固定至與標籤結合物的一部分具有反應性的表面。例如，適合附著於較長鏈部分的基團包括胺基、輕基、硫醇基和竣基。氣燒基娃燒和輕燒基娃燒可用於功能化多種表面，例如玻璃表面。文獻中詳細描述了此類固相生物聚合物的構建。參見例如，Merrifield, J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen 等人，J.1mmun.Meth.102:259-274 (1987)(描述了在針上合成固相組分)；Frank & Doring, Tetrahedron44:60316040 (1988)(描述了在纖維素盤上合成多種肽序列)；Fodor等人，Science, 251:767-777(1991) ;Sheldon等人，Clinical Chemistry39 (4):718-719(1993) JPKozal 等人，Nature Medicine2(7):753759(1996)(都描述了固定在固體底物上的生物聚合物陣列)。將標籤結合物固定至底物的非化學方法包括其他的常見方法，例如熱、UV輻射交聯等。
4，驗證可以進一步測試通過任意前述篩選方法經初始鑑別的活性劑，來驗證活性劑的表觀活性和/或確定活性劑的其他的生物學效應。在一些情況下，向動物(例如非人哺乳動物，如小鼠)施用經鑑別的活性劑，以確定活性劑對疼痛敏感度的作用。
C.調節陽離子通道活性的活性劑作為機械激活的陽離子通道調節劑所測試的化合物可以是任何小化學化合物或生物學實體，例如蛋白質、糖、核酸或脂類。通常，測試化合物可以是小化學分子和肽。實質上在本發明的測定中，可以使用任何化學化合物作為潛在的調節劑或配體，但最常見的是使用可以溶解在水性或有機(尤其是基於DMSO的)溶液中的化合物。測定設計為通過自動化進行測定步驟和為測定提供任何方便來源的化合物，來篩選大型化學品文庫，所述測定通常是平行運行的(例如，在機器測定中的微滴度板上的微滴度形式)。可以理解，有許多化學化合物的供應商，包括Sigma (St.Louis, M0.)、Aldrich (St.Louis,M0.)、Sigma-Aldrich (St.Louis, M0.) > Fluka Chemika-Biochemica Analytika (BuchsSwitzerland)等。在一個實施方案中，高通量篩選方法涉及提供含有大量潛在的治療化合物(潛在的調節劑或配體化合物)的組 合化學品或肽文庫。然後，如本文所述，在一個或多個測定中篩選此類「組合化學品文庫」或「配體文庫」，來鑑別那些表現出理想的特徵活性的文庫成員(特別是化學品物種或亞類)。因此，經鑑別的化合物可以作為常規的「先導化合物」發揮作用，或者它們本身可以用作潛在的或實際的治療劑。組合化學品文庫是通過化學合成或生物學合成，通過組合多種化學品「構件」如試劑而生成的多種多樣的化學化合物集合。例如，通過以所有的可能方式組合給定化合物長度(即，多肽化合物中的胺基酸數)的化學品構件(胺基酸)的組，形成線性組合化學品文庫如多肽文庫。通過此類化學品構件的組合混合，可以合成數百萬種化學化合物。組合化學品文庫的製備和篩選是本領域技術人員普遍已知的。此類組合化學品文庫包括但不限於肽文庫(參見例如，美國專利號5, 010,175 ；Furka, Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和 Houghton 等人，Nature354:84-88 (1991))。也可以使用用於生成化學品多樣性文庫的其他化學物。此類化學物包括但不限於:類肽(例如，PCT
發明者B·科斯特, A·帕塔普蒂安 申請人:Irm有限責任公司，德拉瓦有限責任公司, 斯克裡普斯研究所