致病性嗜水氣單胞菌的lamp檢測試劑盒及檢測方法

2023-10-18 06:52:54

專利名稱：致病性嗜水氣單胞菌的lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及靶DNA片斷的檢測技術，具體涉及一種利用環介導等溫擴增 (Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術快速檢測致病性嗜水氣單胞菌所 用的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
嗜水氣單胞菌(Aeromona hydrophila)是條件致病菌，廣泛存在於水和土壤中， 可引起軟體動物、魚類、兩棲類、爬行類及哺乳動物類等多種動物的全身性敗血症或局部感 染，常導致動物大量死亡，亦可引起人的敗血症，腦膜炎和腸炎腹瀉。嗜水氣單胞菌是我國 養魚史上危害魚的種類最多，流行地區最廣，流行季節最長，危害養魚水域類別最多，造成 的損失最嚴重的一種急性傳染病病原。自90年代在全國大範圍流行以來，許多水產養殖 動物都可以被感染髮病，如鯽、鯿、鯪、鯉、鰱、鱅、草魚、香魚、狼鱸、鱒魚、尼羅非魚、鯰魚、鮰 魚、黃鱔、鱉、鱖魚和蛙等。嗜水氣單胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。目前已被證實的致病因子有外 毒素、蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白及載鐵體等。致病性嗜水氣單胞菌引起的疾病不僅給 水產養殖業帶來嚴重的經濟損失，還可通過水產動物和水產品感染人畜，導致人畜腹瀉和 食物中毒，影響人類健康。目前的致病性嗜水氣單胞菌檢測方法步驟繁多，包括將分離後的 菌體進行菌落分析、氧化酶試驗、AHM鑑別培養、吲哚試驗、革蘭氏染色、糖發酵試驗，之後進 一步進行致病性鑑別，包括脫脂奶平板和斑點酶聯免疫等試驗步驟。這些方法操作比較煩 瑣，對實驗結果的數據處理需要對菌落形態，生化特性進行人為的比較，判定，其準確性往 往因人而異，難以把握，且費時。LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術，該技術針對靶基因的6個區域設計6條特 異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恆溫條件下即可完成核酸擴 增反應，擴增出LAMP特徵性梯狀條帶。LAMP技術在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增 強了反應的特異性並縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環儀，在等溫條件下 就能完成反應，且擴增產物用肉眼能觀察，可用於病原微生物的現場快速檢測。因此，本發明採用環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術，通過檢測嗜水氣單胞菌的致病因子四型菌毛編碼基因，來檢測致病性嗜水氣單 胞菌，這在國內外尚無報導。該方法的建立為由致病性嗜水氣單胞菌引起的水產動物疾病 診斷提供技術支撐。

發明內容
本發明要解決目前致病性嗜水氣單胞菌檢測步驟繁多、操作煩瑣、對檢測的數據 處理費時且準確性難以把握的問題，為此提供致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒和 檢測方法。本發明的試劑盒特異性強，敏感性高；本發明致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測 方法利用所述試劑盒檢測，該方法方便、靈敏、準確、快速。
為解決上述問題，本發明採用的技術方案包括建立致病性嗜水氣單胞菌的LAMP 檢測試劑盒及用該試劑盒檢測致病性嗜水氣單胞菌的方法。本發明致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括細菌DNA提取試劑和LAMP 反應試劑，所述LAMP反應試劑中含有用於檢測致病性嗜水氣單胞菌的LAMP擴增用核酸引 物組，該引物組包含弓I物AH. PV-FIP、弓I物AH. PV-BIP、弓|物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3，其特 殊之處是所述引物AH. PV-FIP、引物AH. PV-BIP、引物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3分別為AH. PV-FIP GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTGAH. PV-BIP TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCTAH.PV-F3 TGATGGCACGAGACATCCAAH. PV-B3 TGCTTGATCCCCTTGCTACT所述LAMP反應試劑包括以下組分(I)LAMP 預反應液20 25mM pH 為 8. 2 9. 0 的 Tris_HCl、6 IOmM 硫酸鎂、 10 12mM 氯化鉀、8 12mM硫酸按、0. 1 0. 2% Triton X_100(或是 0. 1 0. 2% Tween 20)、1 1. 6mM dNTP、0. 6 1. OM 甜菜鹼、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-FIP、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-BIP,0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV_F3、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶；(3) LAMP反應穩定液由礦物油或液體石蠟油組成；(4) LAMP反應顯色液含有10% SYBR Green工的螢光染料；所述細菌DNA提取試劑包含以下組分TE緩衝液，5-15mM Tris, 0. 5-1. 5mM EDTA, pH 8.0 ；溶菌酶，濃度 10-20mg/mL，pH8. 0 ；蛋白酶 K 溶液，濃度 10_20mg/mL，pH8. 0 Jris 飽 和酚，ρΗ8· 0 ；乙酸鈉，濃度2-5mol/L ；乙醇，濃度95 %。本發明所述LAMP預反應液還含有0. 6 1. 2uM引物AH. PV-LB和0. 6 1. 2uM引 物AH. PV-LF,所述引物AH. PV-LB和引物AH. PV-LF分別為AH. PV-LF GACCGGCTGCCAGAAGGAGAH. PV-LB :GTGCGCTATGACAACGATGAA。本發明所述試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為致 病性嗜水氣單胞菌基因組DNA，所述的陰性對照試樣為非致病性嗜水氣單胞菌基因組DNA。本發明所述的引物是根據在線軟體PrimerExplorerV4 (http //primerexplorer. ip/e/)設計和手工修改而得，這六條引物能特異識別靶序列的八個不同位點，增加了擴增 的特異性，並在反應中產生莖環結構。本發明致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測方法，其特殊之處是按以下步驟(I)DNA 抽提挑取純化的菌落若干加入到pH8. 0的100 μ L TE緩衝液中振蕩混勻，加入100 μ L 溶菌酶溶液，37°C保溫10分鐘，再加蛋白酶K溶液10 μ L於55°C保溫1_2小時，加同體積 Tris飽和酚，pH8. 0,強烈振蕩，12000rpm離心5分鐘，取上清液，重複酚抽提；取上清液， 加入0. 1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻後低溫靜置30分鐘， 12000rpm離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000rpm離心5分鐘，棄上清，加入100 μ L TE溶液，得到待檢基因組DNA溶液；(2)致病性嗜水氣單胞菌的LAMP擴增①.根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N，N=樣品數+2(其中1管 為陽性對照，1管為陰性對照)；②.吸取LAMP預反應液的體積為NX 23uL，加入一潔淨的1. 5mL離心管中，然後加 入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒，取上清之混合液；③.向設定的N個反應管中分別加入Mu L②步所述混合液，向上述N個PCR反 應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA各IuL ；④.然後在上述每個反應管中再分別加入30u L LAMP反應穩定液，蓋緊管蓋並做 好標記，2000轉/分鐘離心5秒；⑤.在61 °C 67 °C下恆溫反應40 70分鐘；(3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品 和陽性對照的順序依次分別加入IuL顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。也可以用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳後用溴化乙錠染色。電泳結果在紫外分析儀 下觀察，如果發現有階梯狀的擴增特徵條帶，說明樣品中有致病嗜水氣單胞菌。本發明利用環介導等溫擴增技術快速檢測致病性嗜水氣單胞菌的檢測方法，在已 試驗的沈種不同種或同種的細菌進行了檢測，結果都符合預期。與現有技術相比，本發明具有如下優點(1)本發明根據靶基因序列設計了致病嗜水氣單胞菌檢測用引物組，能特異性識 別靶序列上的八個獨立區域，在BstDNA聚合酶的作用下啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA 區啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖一環 DNA混合物，由於LAMP技術只有在四條引物完全識別靶序列六個結合區的情況下才能順利 進行，所以本發明的引物組在很大程度上減少了擴增反應的背景影響，大大增強了致病嗜 水氣單胞菌檢測的特異性；(2)採用本發明的引物組對致病嗜水氣單胞菌進行檢測，因為特異性高，所以可以 根據是否擴增就能判斷目標基因的存在與否；(3)本發明的快速診斷試劑盒是利用環介導等溫擴增技術快速檢測致病嗜水氣單 胞菌，檢測靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；(4)本發明的快速診斷試劑盒不但反應條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特殊 試劑，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易汙染及檢測成本高等缺點；(5)本發明的快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到Ih即可完成擴增，且產率 尚；(6)本發明的快速診斷試劑盒鑑定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液 中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉澱，可通過肉眼觀察鑑定，並且加入顯色液後， 陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；(7)本發明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術素質要求較低，可建立 成本低廉的快速篩選體系，實現現場高通量快速檢測；(8)本發明的快速診斷試劑盒建立了一套經過優化的環介導等溫擴增反應體系，不但使得致病性嗜水氣單胞菌定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且可用於 魚、蝦、蟹類養殖過程中各時期的致病性嗜水氣單胞菌跟蹤檢測，避免該病原菌傳播流行， 提高科學管理效率，具有很高的實用價值。


圖1引物種特異性測試圖；M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水氣單胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水氣單胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水氣單胞菌TPS-30 ;4.嗜水氣單胞菌PPL0711 ;5.嗜水氣單胞菌BJK0805 ;6.溫和氣單胞 菌ATCC43979 ;7.豚鼠氣單胞菌ATCC15468 ;8.獸生氣單胞菌ATCC51108 ;9.異嗜糖氣單 胞菌ATCC51208 ;10.中間氣單胞菌ATCC33907 ;11.嗜泉氣單胞菌ATCC23309 ； 12.小魚氣 單胞菌ATCC49904 ;13.大腸桿菌ATCC25922 ;14.金黃色葡萄球菌ATCC25923 ； 15.銅綠假 單胞菌ATCC27853 ;16.哈維氏弧菌ATCC33842 ;17.副溶血弧菌ATCC33847 ;18.溶藻弧菌 ATCC17749 ； 19.遲鈍愛德華氏菌TL5m ;20.陰性對照。圖2致病性嗜水氣單胞菌特異性檢測圖。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水氣單胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水氣單胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水氣單胞菌TPS-30 ;4.嗜水氣單胞菌PPL0711 ;5.嗜水氣單胞菌BJK0805 ;6.嗜水氣單胞 菌YBH0907L ；7.嗜水氣單胞菌CL99920 ；8.嗜水氣單胞菌TL0903 ；9.嗜水氣單胞菌TYG ； 10.嗜水氣單胞菌A541 ;11.嗜水氣單胞菌XY2005 ;12.嗜水氣單胞菌HFJ0907L ； 13.陰性 對照。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。一 ) DNA 抽提挑取疑似菌落加入到0. 4mL TE緩衝液(pH8. 0)中振蕩混勻。加入100 μ L溶菌酶 溶液，37°C保溫10分鐘，再加蛋白酶K溶液10μ L於55°C保溫1_2小時，加同體積Tris飽 和酚(pH8. 0)，強烈振蕩，IlOOOg離心3分鐘，取上清液，重複酚抽提；取上清液，加入0. 1倍 體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻後低溫靜置30分鐘，15000g離心 5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下15000g離心5分鐘，棄上清，加入50 μ L TE 溶液，得待檢基因組DNA溶液，置-20°C保存。二)環介導等溫擴增致病性嗜水氣單胞菌特異基因區根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N，N =樣品數+1管陽性對照+1 管陰性對照；吸取LAMP預反應液的體積為NX23uL，加入一潔淨的1. 5mL離心管中，然後加 入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒，取上清之混合液；向 設定的N個反應管中分別加入MuL上述混合液，然後在上述每個反應管中再分別加入30u L LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒；向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入 陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA各luL，蓋緊管蓋並做好標記；在61°C 67X 下恆溫反應40 70分鐘；80°C滅活5min。取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘 離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入IuL顯色液，輕輕混勻， 直接用肉眼觀察顏色變化或用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳後用溴化乙錠染色。電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現階梯狀的擴增特徵條帶，說明樣品中有致病嗜水氣單胞菌。採用上述快速診斷試劑盒和方法進行LAMP檢測嗜水氣單胞菌種特異性和致病性 嗜水氣單胞菌特異性試驗結果如附圖1和2所示。圖1引物種特異性測試圖，如圖所示，僅致病性嗜水氣單胞菌能擴增出階梯狀的 擴增特徵條帶，其它種的菌株無階梯狀的擴增特徵條帶，表明對非嗜水氣單胞菌無交叉擴 增性。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水氣單胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水氣單胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水氣單胞菌TPS-30 ;4.嗜水氣單胞菌PPL0711 ;5.嗜水氣單胞菌BJK0805 ;6.溫和氣單胞 菌ATCC43979 ;7.豚鼠氣單胞菌ATCC15468 ;8.獸生氣單胞菌ATCC51108 ;9.異嗜糖氣單 胞菌ATCC51208 ;10.中間氣單胞菌ATCC33907 ;11.嗜泉氣單胞菌ATCC23309 ； 12.小魚氣 單胞菌ATCC49904 ;13.大腸桿菌ATCC25922 ； 14.金黃色葡萄球菌ATCC25923 ； 15.銅綠假 單胞菌ATCC27853 ;16.哈維氏弧菌ATCC33842 ； 17.副溶血弧菌ATCC33847 ； 18.溶藻弧菌 ATCC17749 ； 19.遲鈍愛德華氏菌TL5m ;20.陰性對照。圖2致病性嗜水氣單胞菌特異性檢測圖，如圖所示，僅致病性嗜水氣單胞菌能擴 增出階梯狀的擴增特徵條帶，表明對致病菌株篩選特異性強。M. IOObp DNA Marker ；1.嗜水氣單胞菌 ATCC7966 ；2.嗜水氣單胞菌 BSK-10 ；3.嗜 水氣單胞菌TPS-30 ;4.嗜水氣單胞菌PPL0711 ;5.嗜水氣單胞菌BJK0805 ;6.嗜水氣單胞 菌YBH0907L ；7.嗜水氣單胞菌CL99920 ；8.嗜水氣單胞菌TL0903 ；9.嗜水氣單胞菌TYG ； 10.嗜水氣單胞菌A541 ;11.嗜水氣單胞菌XY2005 ;12.嗜水氣單胞菌HFJ0907L ； 13.陰性 對照。
權利要求
1.致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括細菌DNA提取試劑和LAMP反應試劑， 所述LAMP反應試劑中含有用於檢測致病性嗜水氣單胞菌的LAMP擴增用核酸引物組，該引 物組包含引物AH. PV-FIP、引物AH. PV-BIP、引物AH. PV-F3、引物AH. PV-B3，其特徵是所述引 物 AH. PV-FIP、引物 AH. PV-BIP、引物 AH. PV-F3、引物 AH. PV-B3 分別為AH. PV-FIP GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTGAH. PV-BIP TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCTAH. PV-F3 TGATGGCACGAGACATCCAAH. PV-B3 TGCTTGATCCCCTTGCTACT所述LAMP反應試劑包括以下組分(1)LAMP預反應液20 25mMpH為8. 2 9. 0的Tris-HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、8 12mM 硫酸按、0. 1 0. 2% Triton X_100(或是 0. 1 0. 2% Tween 20)、 1 1. 6mM dNTP、0. 6 1. OM 甜菜鹼、1. 5 2. 2uM 所述引物 AH. PV-FIPU. 5 2. 2uM 所述 引物 AH. PV-BIP、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV_F3、0. 15 0. 3uM 所述引物 AH. PV-B3 ；(2)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；(3)LAMP反應穩定液由礦物油或液體石蠟油組成；(4)LAMP反應顯色液含有10%SYBR Green工的螢光染料；所述細菌DNA提取試劑包含以下組分TE緩衝液，5-15mM Tris, 0. 5-1. 5mM EDTA, pH 8. 0 ；溶菌酶，濃度 10-20mg/mL，pH8. 0 ；蛋白酶 K 溶液，濃度 10_20mg/mL，pH8. 0 ；Tris 飽和 酚，ρΗ8· 0 ；乙酸鈉，濃度2-5mol/L ；乙醇，濃度95 %。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵是所述LAMP預反應液還含有0.6 1. 2uM引物 AH. PV-LB和0. 6 1. 2uM引物AH. PV-LF,所述引物AH. PV-LB和引物AH. PV-LF分別為AH. PV-LF :GACCGGCTGCCAGAAGGAGAH. PV-LB :GTGCGCTATGACAACGATGAA。
3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述 陽性對照試樣為致病性嗜水氣單胞菌基因組DNA，所述的陰性對照試樣為非致病性嗜水氣 單胞菌基因組DNA。
4.致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測方法，其特徵是按以下步驟(1)DNA抽提挑取純化的菌落若干加入到pH8. 0的100 μ L TE緩衝液中振蕩混勻，加入100 μ L溶菌 酶溶液，37°C保溫10分鐘，再加蛋白酶K溶液10 μ L於55°C保溫1_2小時，加同體積Tris 飽和酚，PH8. 0，強烈振蕩，12000rpm離心5分鐘，取上清液，重複酚抽提；取上清液，加入0. 1 倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻後低溫靜置30分鐘，12000rpm 離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000rpm離心5分鐘，棄上清，加入 100 μ L TE溶液，得到待檢基因組DNA溶液；(2)致病性嗜水氣單胞菌的LAMP擴增①.根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N，N =樣品數+2 (其中1管為陽 性對照，1管為陰性對照)；②.吸取權利要求1所述LAMP預反應液的體積為NX23uL，加入一潔淨的1.5mL離心 管中，然後加入N u L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒，取上清 之混合液；③.向設定的N個反應管中分別加入MuL②步所述混合液，向上述N個PCR反應管 內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA各IuL ；④.然後在上述每個反應管中再分別加入30uL LAMP反應穩定液，蓋緊管蓋並做好標 記，2000轉/分鐘離心5秒；⑤.在61°C 67°C下恆溫反應40 70分鐘； (3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽 性對照的順序依次分別加入IuL顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
全文摘要
使用方便，檢測快速的致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括細菌DNA提取試劑和LAMP反應試劑，反應試劑中含引物FIPGTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTG、BIPTCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCT、F3TGATGGCACGAGACATCCA、B3TGCTTGATCCCCTTGCTACT；致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測方法(1)DNA抽提；(2)致病性嗜水氣單胞菌的LAMP擴增；(3)顯色檢測。本發明適合檢測致病性嗜水氣單胞菌。
文檔編號C12Q1/68GK102140512SQ20101061157
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者姚嘉贇, 尹文林, 徐洋, 沈錦玉, 潘曉藝, 郝貴傑 申請人:浙江省淡水水產研究所