滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的用途
2023-10-04 01:05:04 4
滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的用途
【專利摘要】本發明公開了滅活肺炎克雷伯菌在在作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中新的用途，滅活肺炎克雷伯菌菌液作為免疫成分，具有免疫增強劑作用，既可以誘導機體產生針對肺炎克雷伯菌的抗體使機體免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫調節活性提高機體對疫苗應答水平，產生更好的免疫保護。
【專利說明】滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的用途
【技術領域】
[0001] 本發明公開了滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的應用，用於提 高動物滅活疫苗的免疫效果，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌具有豐厚莢膜，其莢膜物質具有極強的免疫原性，法國羅素公司 已將其開發成口服免疫調節劑。
[0003] 大量實驗證明，肺炎克雷伯菌莢膜糖蛋白能加速B淋巴細胞的增殖，增強巨噬細 胞的吞噬、消化、破壞抗原及其趨化作用，並能促進吞噬細胞白介素的產生，從而使T淋巴 細胞增殖。動物實驗還證明肺炎克雷伯菌莢膜糖蛋白對細菌(綠膿桿菌、金葡菌、大腸桿菌、 肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌)、病毒(流感病毒、引起腦和心肌炎病變的病毒）和真 菌（白色念珠菌）的感染均具明顯的保護作用。
[0004] 在充分的理論研究基礎上，法國羅素公司將其開發成新型免疫調節劑一必思添， 臨床上用於呼吸道感染的防治，並可用於潰瘍和燒傷的治療。國外關於肺炎克雷伯菌莢膜 糖蛋白的研究開展較早，主要集中在二十世紀70-80年代，報導最多的是有關肺炎克雷伯 菌莢膜糖蛋白免疫學活性方面的研究。
[0005] 據報導Kp莢膜多糖（CPS-K)對強抗原和弱抗原均有明顯的佐劑作用。在相同 條件下，其作用強於胞壁酞膚(MDP)，與A1 (0Η) 3和脂質體相似，從而證明CPS-K具有免疫增 強劑的作用。有關Kp莢膜多糖的免疫原性和作為獨立的免疫調節活性物質的研究已經有 報導。
[0006] 目前常用的疫苗佐劑，例如鋁膠佐劑、油佐劑等，由於局部刺激強烈、誘導免疫應 答差等諸多缺點，限制了其應用。因此開發新一代高效、低毒、廉價的疫苗佐劑十分迫切。
【發明內容】
[0007] 本發明公開了滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的用途，提供了 滅活肺炎克雷伯菌的新用途，配以滅活疫苗預防動物疾病，預防免疫效果佳，安全性好。
[0008] 本發明提供滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑的製備方法，包括以下步驟： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分別按培養基體積的2%接種於培養基培養，調整菌數為100 億CFU/mL ;500mL擋板瓶裝液量16%，搖床轉速在150r/min，37°C，增氧震蕩培養8h ; 2) 用終濃度0. 3%的甲醛滅活步驟1所得肺炎克雷伯菌培養物，24°C滅活72h，期間振 搖5-8次； 3) 將肺炎克雷伯菌滅活培養物與動物滅活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步驟3所得培養物中添加防腐劑，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐劑的滅活疫 苗；所述防腐劑為疊氮鈉，優選終質量濃度為〇. 01 %。
[0009] 本發明所述肺炎克雷伯菌菌株26混合製成的滅活疫苗，其製備工藝簡單，適合商 品化生產，具有良好的應用前景。
[0010] 本發明的積極效果在於：公開了滅活肺炎克雷伯菌在在作為免疫佐劑在動物滅活 疫苗中新的用途，滅活肺炎克雷伯菌菌液作為免疫成分，具有免疫增強劑作用，既可以誘導 機體產生針對肺炎克雷伯菌的抗體使機體免受克雷伯菌的感染，又可以起免疫調節活性提 高機體對疫苗應答水平，產生更好的免疫保護。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為肺炎克雷伯菌菌株26的形態； 圖2為肺炎克雷伯菌作為佐劑在水貂綠膿桿菌滅活疫苗中的應用； 圖3為肺炎克雷伯菌作為佐劑在雞大腸桿菌滅活疫苗中的應用； 圖4為肺炎克雷伯菌作為佐劑在水貂病毒性腸炎滅活疫苗中的應用； 圖5為小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗； 圖6為淋巴細胞增殖試驗。
【具體實施方式】
[0012] 通過以下實施例進一步舉例描述本發明，並不以任何方式限制本發明，在不背離 本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改 動或改變都將落入本發明的權利要求範圍之內。
[0013] 本發明涉及的肺炎克雷伯菌菌株26,購自中國農業科學院特產研究所(參見圖 1)。
[0014] 用Reed-Muench法測定毒株對小白鼠的半數致死量LD5(I，菌株26對水貂的半數致 死量 LD5Q 為 8X106CFU。
[0015] 試驗材料 發酵培養基配方（g/L):蔗糖40,胰蛋白腖20,酵母粉1，K2S04 1，MgS04 0. 25, ΚΗ2Ρ04 4， Na2HP04 3,121°C 滅菌 20min。
[0016] 綠膿桿菌分型用標準血清購自日本生研株式會社；肺炎克雷伯菌的分型採用PCR 分型方法進行；細菌鑑定微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑公司；18~22g小白鼠購 自吉林正業生物製品有限公司；甲醛，疊氮鈉購自北京化學試劑廠。
[0017] 實施例1 : 滅活免疫佐劑的製備 免疫佐劑製備：將菌株菌株26劃線接種於培養基中於37°C培養18h，之後挑單菌落接 種於5mlNB肉湯培養基中37°C振搖12h作為一代種子液，再按1 %比例接種於300mlNB肉 湯中37°C振搖12h作為二代種子液，將二代種子液按2%比例接種於500mL的發酵液體培 養基37°C增氧培養8h，即為培養好的疫苗菌液，通過細菌平板計數對菌液進行計數，並通 過計數結果將菌數均調整為1〇〇億CFU/mL，之後將菌液按甲醛終濃度為0. 3%滅活，24°C滅 活72h，期間震蕩5-8次。將滅活後的肺炎克雷伯菌，按照1 :9的比例與滅活疫苗混合。
[0018] 免疫佐劑的滅活檢驗：將甲醛滅活後的菌液取200μ L接於5mL液體培養基中，一 次培養取3次樣，每個樣品接種於3個試管中觀察5天進行滅活安全檢驗，5天後接種的液 體培養基仍澄清無混濁則安全檢驗合格。
[0019] 實施例2: 滅活肺炎克雷伯菌的安全檢驗 將實施例1製備好的三批佐劑單劑量、單劑量重複和超劑量注射健康小鼠，後肢內側 肌肉接種。通過14d觀察，接種小鼠體溫和食慾正常，接種局部無腫脹和炎症，未出現局部 和全身反應；每批選擇3隻，剖殺後切開注射部位皮膚觀察注射局部病理變化，小鼠接種部 位皮下無異常變化，後肢內側肌肉接種部位肌肉組織正常，注射部位未見炎症反應。說明對 小鼠具有較好的安全性。
[0020] 實施例3 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對水貂肺炎滅活疫苗的效力試驗測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與水貂出血性肺炎滅活疫 苗混合後免疫45日齡斷奶仔貂20隻，lml/只，免疫後用實驗室已經建立的間接ELISA方法 連續檢測10周抗體的水平，繪製抗體消長規律(參見圖2所示)。
[0021] 實施例4: 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對雞大腸桿菌滅活疫苗的效力試驗測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與雞大腸桿菌滅活疫苗混 合後免疫30日齡雛雞20隻，lml/只，免疫後用間接ELISA方法連續檢測10周抗體的水平， 繪製抗體消長規律(參見圖3所示)。
[0022] 實施例5 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對水貂病毒性腸炎滅活疫苗的效力試驗測定 將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按照1:9比例與水貂病毒性腸炎滅活疫 苗混合後免疫45日齡斷奶仔貂20隻，lml/只，免疫後用實驗室已經建立的血凝抑制試驗連 續檢測10周抗體的水平，繪製抗體消長規律(參見圖4所示)。
[0023] 實施例6 : 滅活肺炎克雷伯菌佐劑對小鼠非特異性免疫增強作用測定 進行免疫相關指標測定，包括小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗和脾臟淋巴細胞增殖實驗， 如圖5、6所示(註：PP.巨噬細胞吞噬率PI.巨噬細胞吞噬指數Vaccine.肺炎克雷伯菌佐劑 腸炎疫苗Control.鋁膠佐劑腸炎疫苗）；將滅活肺炎克雷伯菌佐劑和20%鋁膠佐劑分別按 照1:9比例與水貂病毒性腸炎滅活疫苗混合後免疫16~18g小白鼠20隻，實驗組和對照組 各10隻，0. 2ml/只。免疫一周後採用常規方法測定小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數， 使用MTT法測定淋巴細胞增值實驗。 本發明公開了肺炎克雷伯菌菌株26及用所述菌株製備的動物滅活疫苗及其製備方 法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本 發明的產品、方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發 明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應 用本發明技術。
【權利要求】
1. 滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑在動物滅活疫苗中的用途。
2. -種滅活肺炎克雷伯菌作為免疫佐劑的製備方法，包括以下步驟： 1) 肺炎克雷伯菌菌株26分別按培養基體積的2%接種於培養基培養，調整菌數為100 億CFU/mL ;500mL擋板瓶裝液量16%，搖床轉速在150r/min，37°C，增氧震蕩培養8h ; 2) 用終濃度0. 3%的甲醛滅活步驟1)所得肺炎克雷伯菌培養物，24°C滅活72h，期間振 搖5-8次； 3) 將肺炎克雷伯菌滅活培養物與動物滅活疫苗按照1:9比例混合； 4) 在步驟3)所得培養物中添加防腐劑，即得所述含肺炎克雷伯菌免疫佐劑的滅活疫 苗；所述防腐劑為疊氮鈉，優選終質量濃度為〇. 01%。
【文檔編號】A61K39/39GK104043122SQ201410280086
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月23日 優先權日:2014年6月23日
【發明者】雷連成, 閆新武, 欒浩麟, 趙成新, 王金玲 申請人:吉林大學