應用濾泡素抑制素增加肌肉質量的製作方法

2023-10-19 15:50:12

專利名稱：應用濾泡素抑制素增加肌肉質量的製作方法
技術領域：
本發明一般地涉及了生長分化因子(GDF)受體，更特別地涉及GDF-8(肌肉生長抑制素(myostatin))受體，以及在細胞中影響肌肉生長抑制素信號轉導作用的組合物，和應用這些組合物調節肌肉生長抑制素在細胞中信號轉導的方法。
背景技術：
在美國，決定要減肥的個人每年花費的時間、精力和費用是驚人的。對於這些人中的許多人，其目的不僅僅是要更好看些，更重要的是要防止由於超重而產生的無法避免的醫學問題。
在美國超過半數以上的成人群體被認為是超重的。而且，美國成年男人的20至30％、成年婦女的30至40％被認為是肥胖症，在窮人和少數民族人種中出現比例是最高的。肥胖症，其定義是超過肥胖平均水平至少大約20％以上，其流行在過去幾十年中大幅增加，並已經在兒童人群中成為一種主要的問題。20％的兒童現在被認為是超重的，這個數字意味著在過去5年中增加了一倍。
肥胖症和與其直接相關的醫學問題是全世界發病率和死亡率的主要原因。肥胖症是形成許多病理狀況的一個主要危險因素，包括動脈粥樣硬化、高血壓、心臟病發作、II型糖尿病、膽囊疾病、和某些癌症，並引起過早死亡。在美國心臟疾病是死亡率的最主要因素，II型糖尿病使超過1600萬美國人受到折磨並是疾病引起死亡的最主要原因之一。
80％以上的II型糖尿病發生在肥胖人中。儘管II型糖尿病影響所有人種，但在本土美國人、非洲美國人和美籍西班牙人中特別普遍。特別是，II型糖尿病，過去幾乎只發生在年齡超過40歲的成人中，現在發生在兒童中，在過去5年中報導的病例幾乎增至三倍。II型糖尿病也稱為非胰島素依賴型糖尿病，其特徵是胰島素對葡萄糖的反應性分泌降低，以及機體對胰島素的作用產生抗性，即便是循環中胰島素水平一般是正常的或升高的。II型糖尿病可影響許多不同組織和器官的功能，可能引起血管疾病、腎衰、視網膜病和神經病。
與肥胖症相關的醫學問題相反，患有某些慢性疾病的患者中常常發生的嚴重的體重減輕對於醫學幹預也是一種挑戰。這種體重減輕的分子基礎，就惡病質來說，不是很清楚。但是，很明顯，惡病質使這些疾病的處理變得複雜起來，並與患者的不佳預後有關。惡病質的影響在癌症和愛滋病(AIDS)患者中發生的消耗症候群中表現得很明顯。
儘管已經做了大量的努力試圖闡明體重調節中所涉及的生物學過程，但是所提供的結果較實際應用價值更多的是浮誇。例如，苗條蛋白(leptin)的發現曾經被歡呼為了解人類脂肪聚積分子基礎的重大突破，並許諾使用它治療肥胖症。在動物中的研究表明苗條蛋白涉及傳輸調節食慾的內部信號，並認為苗條蛋白可能被用於治療患有肥胖症的人。但是，使用苗條蛋白治療肥胖症的進程是緩慢的，迄今苗條蛋白沒有達到最初的期望。
病態肥胖的治療目前限制於手術去除部分小腸，從而減少食物(和卡路裡)吸收的量。對於中等肥胖，僅有的「治療方法」是攝入健康飲食和規律地鍛鍊，這種方法已經證明至多一定程度地有效。因此，需要確定涉及體重調節，包括肌肉發育和脂肪聚積的生物學因子，由此可以開發用於治療失調如肥胖症和惡病質的方法。本發明滿足了這種需求，並提供了其它的優勢。
發明概述本發明涉及一種基本上經純化過的GDF受體。本發明的GDF受體可以是，例如肌生長抑制素受體、GDF-11受體、或其它GDF受體。例如肌生長抑制素受體可至少與肌生長抑制素(myostatin)特異地相互作用，也可特異地與一種或另外的一些成熟的GDF肽相互作用。本發明還提供了編碼一種GDF受體的多核苷酸、與GDF受體特異地相互作用的抗體以及類似物。
本發明還涉及一種通過影響GDF作用的信號轉導調節GDF效應的方法。通過實施例方式，提供了一種通過使細胞與影響細胞中肌生長抑制素信號轉導的藥劑接觸來調節肌生長抑制素對細胞效應的方法。在一個實施方案中，該藥劑可改變肌生長抑制素與一種由細胞表達的肌生長抑制素受體之間的特異性相互作用，由此可調節細胞中的肌生長抑制素信號轉導。肌生長抑制素受體可以是激活素(activin)受體，或可以是任何其它的受體，該受體可與一種成熟的肌生長抑制素或其功能性肽部分接觸，這樣可以激活肌生長抑制素信號轉導作用。在另一個實施方案中，該藥劑與一種肌生長抑制素受體結合，因此可增強肌生長抑制素與受體的結合或與肌生長抑制素競爭受體。象這樣，該藥劑可增加肌生長抑制素的信號轉導作用，或可減少或抑制肌生長抑制素的信號轉導作用。仍然在另一個實施方案中，該藥劑可在細胞內作用以改變細胞中的肌生長抑制素信號轉導作用。
用於調節細胞中GDF信號轉導作用的藥劑可是一種肽、一種肽模擬體、一種多核苷酸、一種小的有機分子、或任何其它的藥劑，可作為GDF信號轉導作用的激動劑，或作為GDF信號轉導作用的拮抗劑。在一個實施方案中，肽藥劑可改變肌生長抑制素與一種肌生長抑制素受體的特異相互作用。這種一種肽藥劑可以是，例如，一種可結合或使肌生長抑制素隱蔽的肽，因此可以影響肌生長抑制素與其受體特異相互作用的能力。這樣的藥劑的實施例是一種突變的肌生長抑制素受體，例如，一種肌生長抑制素受體的可溶的胞外域，它可以與肌生長抑制素特異的相互作用；一種肌生長抑制素前結構域，可與肌生長抑制素特異的相互作用；一種突變的肌生長抑制素多肽，可抵抗蛋白酶剪切成為前結構域和成熟的肌生長抑制素，可與肌生長抑制素特異的相互作用，可用作肌生長抑制素信號轉導的拮抗劑，它可減少或抑制細胞中肌生長抑制素的信號轉導作用。
在另一個實施方案中，肽藥劑可特異的與一種在細胞中表達的肌生長抑制素受體相互作用，因此可與肌生長抑制素競爭受體。這樣一種肽藥劑的實施例是一種抗肌生長抑制素受體抗體或一種抗肌生長抑制素抗體的抗獨特型抗體。這樣一種肽藥劑具有其它的優勢，即不僅可選擇其特異與一種肌生長抑制素受體相互作用的能力，因此可與肌生長抑制素競爭受體，也可進一步選擇其不活化或不激活肌生長抑制素信號轉導作用的能力。因此，一種可特異與細胞表達的一種肌生長抑制素受體相互作用，並激活肌生長抑制素依賴的信號轉導作用的肽藥劑，可用作一種肌生長抑制素激動劑，增加細胞內的肌生長抑制素信號轉導作用，而一種可特異與細胞表達的一種肌生長抑制素受體相互作用，但不能激活肌生長抑制素信號轉導的肽藥劑可用作肌生長抑制素的拮抗劑，以減少或抑制細胞中的肌生長抑制素的信號轉導作用。
一種用在本發明方法中的藥劑可是一種多核苷酸。一般來說，但不是必要的，多核苷酸可被引入細胞中，在此可直接發揮其功能，或隨著轉錄，或翻譯或兩者都在進行時發揮其功能。例如，多核苷酸藥劑可編碼一種肽，後者可在細胞中表達並調節肌生長抑制素的活性。這樣一種表達的肽可以是，例如一種突變的肌生長抑制素受體，如一種可溶性的肌生長抑制素受體胞外域；一種與細胞膜錨著區域有效地連接的肌生長抑制素受體胞外域；或一種缺乏蛋白激酶活性的突變肌生長抑制素受體。
由一種多核苷酸藥劑表達的肽也可以是一種影響GDF信號轉導通路的細胞內多肽組分水平或活性的肽。細胞內多肽可以是，例如一種Smad多肽，如一種顯性失活Smad，如在此公開的，後者可影響細胞內的肌生長抑制素信號轉導。因此，一種多核苷酸藥劑可編碼一種顯性失活Smad2，Smad3或Smad4多肽，這些多肽在細胞中表達過程中，可減少或抑制細胞中的肌生長抑制素信號轉導；或可編碼一種Smad6或Smad7多肽，這些多肽在表達過程中，可減少細胞中的肌生長抑制素信號轉導。一種多核苷酸藥劑也可編碼一種細胞內c-ski多肽，其表達可減少或抑制肌生長抑制素的信號轉導。
用於本發明的方法中的一種多核苷酸藥劑也可以是，或可以編碼一種反義分子，一種核酶或一種三聯藥劑(triplexing agent)。例如，多核苷酸可以是(或可編碼)一種反義核苷酸序列，如一種反義c-ski核苷酸序列，後者可以增加細胞內的肌生長抑制素信號轉導；或一種反義Smad核苷酸序列，根據特殊的Smad反義核苷酸序列，可增加肌生長抑制素信號轉導或減少或抑制肌生長抑制素信號轉導。
本發明也涉及一種改善嚴重病理狀況的方法，該病理狀況的特徵至少部分是被試者的肌肉或脂肪組織中異常的重量、發育或代謝活性。這樣一種方法包括在細胞中調節與病理狀況相關的GDF信號轉導，例如在被試者的肌肉細胞或脂肪組織細胞中調節肌生長抑制素信號轉導。採用本發明的方法可改善多種病理狀況，包括，例如消耗綜合症如惡病質、厭食症、肌營養不良、神經肌肉疾病；和代謝失調如肥胖症和II型糖尿病。
本發明進一步涉及一種通過給予生物體一種可影響GDF受體介導的信號轉導的藥劑來調節真核細胞生物體中肌肉組織或脂肪組織的生長的方法。在一個實施方案中，通過給予一種可影響肌生長抑制素信號轉導的藥劑，施行一種調節肌肉組織或脂肪組織生長的方法。在另一個實施方案中，該藥劑可影響GDF-11的信號轉導，或肌生長抑制素和GDF-11信號轉導。該藥劑可以是，例如，可改變肌生長抑制素與肌生長抑制素受體之間的特異相互作用的藥劑，可減少或抑制肌生長抑制素與肌生長抑制素受體之間的特異相互作用的藥劑，或任何其它在此公開的藥劑。真核細胞生物體可以是脊椎動物，例如，哺乳動物、鳥類或魚類生物，或可以是無脊椎動物，例如，軟體動物如蝦、扇貝、烏賊、章魚、蝸牛或蛞蝓。
本發明還涉及一種識別特異地與生長分化因子(GDF)受體相互作用的藥劑的方法。本發明的這樣一種篩選測定實驗可如下進行，例如，通過將一種GDF受體與一種檢測藥劑接觸，並確定該檢測藥劑可特異地與GDF受體相互作用，因此可以識別出可特異地與GDF受體相互作用的藥劑。GDF受體可以是任何GDF受體，特別是肌生長抑制素受體，該藥劑可以是GDF受體激動劑，它可以增加GDF信號轉導作用，或是GDF受體拮抗劑，它可以減少或抑制GDF的信號轉導作用。本發明的這樣一種方法可用於篩選檢測藥劑的文庫，特別是檢測藥劑的組合文庫。
本發明還提供了GDF受體或GDF受體的功能性肽部分的虛擬表現形式，例如，GDF 8受體或GDF-11受體的虛擬表現形式。在一個實施方案中，虛擬表現形式包括一種可與GDF受體特異相互作用的藥劑。如此，本發明進一步提供了一種採用一個計算機系統識別可特異地與生長分化因子(GDF)受體或一種GDF受體的功能性肽部分相互作用的藥劑的方法，。例如，該方法可通過檢測一種虛擬的測試藥劑與一種虛擬GDF受體或其功能性肽部分特異性相互作用的能力來進行；並檢測虛擬測試藥劑與虛擬GDF受體或其功能性肽部分的特異相互作用，因此可以識別能與GDF受體或其功能性肽部分特異地相互作用的藥劑。


圖1顯示了小鼠原肌生長抑制素(SEQ ID NO4)；大鼠原肌生長抑制素(SEQ ID NO6)；人原肌生長抑制素(SEQ ID NO2)；狒狒原肌生長抑制素(SEQ ID NO10)；牛原肌生長抑制素(SEQ ID NO12)；豬原肌生長抑制素(SEQ ID NO14)；羊原肌生長抑制素(SEQ ID NO16)；雞原肌生長抑制素(SEQ ID NO8)；火雞原肌生長抑制素(SEQ ID NO18)；和斑馬魚原肌生長抑制素(SEQ ID NO20)的胺基酸序列。胺基酸根據人原肌生長抑制素(SEQ ID NO2)進行編號。虛線表示引導最大同源性的間隙。序列中相同的殘基被劃上陰影。
圖2顯示了小鼠原肌生長抑制素(SEQ ID NO4)和斑馬魚原肌生長抑制素(SEQ ID NO20)的胺基酸序列，鮭魚等位基因1原肌生長抑制素(SEQ ID NO27；「鮭魚1」)和鮭魚等位基因2原肌生長抑制素(SEQ IDNO29；「鮭魚2」)的部分胺基酸序列。相應的人原肌生長抑制素的胺基酸部位標記在每排的左側(比較圖1；鮭魚1的第一個胺基酸對應於人原肌生長抑制素218；鮭魚2的第一個胺基酸對應於人原肌生長抑制素239)。虛線表示引導最大同源性的間隙。相對的胺基酸位置，包括間隙，沿著每排的上方標記。序列中相同的殘基被劃上陰影。
發明祥述本發明提供了一種基本上經純化的原肌生長抑制素(promyostatin)多肽的肽部分。原肌生長抑制素，以前被稱為生長分化因子-8(GDF-8)，包括一個氨基末端的功能前區(prodomain)和一個C-末端的成熟的肌生長抑制素(myostatin)肽(見美國專利No.5,827,733)。從原肌生長抑制素中剪切下來後，肌生長抑制素的活性由成熟的肌生長抑制素肽實現。因此，原肌生長抑制素是一個前體多肽(precursor polypeptide)，可被蛋白酶水解剪切產生活性的肌生長抑制素。如在此所公開的，肌生長抑制素的功能前區可抑制肌生長抑制素的活性，GDF-11的活性，或兩者的活性。
本發明也提供了一種原-GDF-11多肽的基本上經純化的肽部分。原-GDF-11(pro-GDF-11)，以前一般被稱為GDF-11，包括一個氨基末端的功能前區和一個C-末端的成熟GDF-11肽(見國際公開號WO98/35019，在此引入作為參考文獻)。從原-GDF-11中剪切下來後，GDF-11的活性由成熟的GDF-11肽實現。因此，原-GDF-11像原肌生長抑制素一樣，是一個前體多肽，可被蛋白水解剪切產生活性的GDF-11。如在此所公開的，GDF-11的功能前區可抑制GDF-11活性，肌生長抑制素活性，或抑制兩者的活性。
原肌生長抑制素和原-GDF-11是轉化生長因子-β(TGF-β)超家族的成員，該超家族由在許多細胞類型中控制增殖、分化和其它功能的多功能多肽組成。TGF-β超家族，包括一組可在胚胎發育過程中對分化過程影響廣泛的結構相關蛋白，包括例如，繆勒氏管抑制物質(MIS)，它是正常雄性發育過程中是必需的(Behringer等人，Nature345167，1990)，果蠅decapentaplegic(DPP)基因產物，它是背腹軸形成和成蟲盤形態發生所必需的(Padgett等人，Nature 32581-84，1987)，爪蟾Vg-1基因產物，它位於卵的植物極上(Weeks等人，Cell 51861-867，1987)，激活素(Mason等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.135957-964，1986)，它可誘導爪蟾胚的中胚層和前端結構的形成(Thomsen等人，Cell 63485，1990)，和骨形態發生蛋白(BMPs，成骨素，OP-1)，它可重新誘導軟骨和骨的形成(Sampath等人，J.Biol.Chem.26513198，1990)。TGF-β家族成員可影響許多分化過程，包括脂肪形成、肌形成、軟骨發生、血細胞生成、和上皮細胞分化(Massague，Cell49437，1987；Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998；每一篇在此都引入作為參考文獻)。
許多TGF-β家族成員對其它肽生長因子具有調節作用(正調節作用或負調節作用)。特別的是，TGF-β超家族的某些成員具有與神經系統功能相關的表達方式或活性。例如，抑制素和激活素都在腦中表達(Meunier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85247，1988；Sawchenko等人，Nature 344615，1988)，激活素可作為一個神經細胞生存分子而起作用(Schubert等人，Nature 344868，1990)。另一個家族成員，生長分化因子-1(GDF-1)，在其表達方式上是神經系統特異性的(Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 884250，1991)，和其它家族成員如Vgr-1(Lyons等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 864554，1989；Jones等人，Development111531，1991)、OP-1(Ozkaynak等人，J.Biol.Chem.26725220，1992)、和BMP-4(Jones等人，Development 111531，1991)，也在神經系統中表達。因為骨骼肌可產生促進運動神經元存活的一種因子或多種因子，(Brown，Trends Neurosci.710，1984)，肌生長抑制素(GDF-8)和GDF-11在肌肉中的表達表明肌生長抑制素和GDF-11是神經元的營養因子。像這樣，調節肌生長抑制素，GDF-11或兩者活性的方法可用於治療神經變性疾病，如肌萎縮側索硬化症或肌營養不良，或在移植前在培養物中保存細胞或組織。
TGF-β家族的蛋白可合成為大的前體蛋白，它隨後經歷蛋白水解，從C-末端切除一簇大約110至140個胺基酸鹼性殘基，形成一個功能前區肽和一個C-末端的成熟肽。這個蛋白家族成員的C-末端成熟肽在結構上是相關的，不同家族成員根據其同源性可分成不同的亞組。儘管在特殊的亞組內的同源性範圍為70％至90％的胺基酸序列同一性，在亞組之間的同源性明顯更低，一般在20％至50％範圍內。在每個成員中，有活性的類型似乎是一個二硫鍵聯接的C-末端肽片斷的二聚體。
原肌生長抑制素和原-GDF-11多肽在哺乳動物、鳥類和魚類中已經被鑑定，肌生長抑制素在許多其它的物種，包括脊椎動物和無脊椎動物中是有活性的。在胚胎發育過程中和在成體動物中，例如，由肌源性譜系中的細胞特異地表達肌生長抑制素(McPherron等人，Nature38783-90，1997，在此引入作為參考文獻)。在早期胚胎生成過程中，由發育體節的生肌節室中的細胞表達肌生長抑制素。在晚期胚胎期和成體動物中，肌生長抑制素廣泛地表達在骨骼肌組織中，儘管在肌肉之間的表達水平變化非常大。肌生長抑制素的表達也可在脂肪組織中檢測到，儘管比在肌肉中的水平更低。類似地，GDF-11在骨骼肌和脂肪組織，以及成人胸腺、脾臟和子宮中表達，也在不同發育時期的腦內表達。
來自多個物種的原肌生長抑制素多肽具有實質上相同的序列，人、小鼠、大鼠和雞的成熟肌生長抑制素C-末端序列的胺基酸序列100％相同(見圖1)。在此原肌生長抑制素多肽的實例(見圖1)為人的原肌生長抑制素(SEQ ID NO2)；鼠肌生長抑制素(SEQ ID NO4)；大鼠肌生長抑制素(SEQ ID NO6)；狒狒原肌生長抑制素(SEQ ID NO10)；牛原肌生長抑制素(SEQ ID NO12)；豬原肌生長抑制素(SEQ ID NO14)；羊原肌生長抑制素(SEQ ID NO16)；雞原肌生長抑制素(SEQ ID NO8)；火雞原肌生長抑制素(SEQ ID NO18)；和斑馬魚原肌生長抑制素(SEQ IDNO20)的胺基酸序列。在此原肌生長抑制素多肽的實例也可以包括部分的鮭魚等位基因1(SEQ ID NO27；「鮭魚1」)和鮭魚等位基因2(SEQID NO29；「鮭魚2」，見圖2)的一種多肽。在此公開的編碼這些原肌生長抑制素多肽的核酸分子分別是SEQ ID NOS1，3，5，9，11，13，15，7，17，19，26和28(也見，McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9412457，1997，在此引入作為參考文獻)。在此一個原-GDF-11多肽的實例是人的原-GDF-11(SEQ ID NO25)，它由SEQ ID NO24編碼。
考慮到在原肌生長抑制素多肽中的廣泛保守性，特別是在如同具有像人和魚之間的差別性的物種中，從任何物種中獲得編碼肌生長抑制素的多核苷酸和在任何物種中識別原肌生長抑制素或肌生長抑制素的表達將是很普通的，其中這些多核苷酸包括鮭魚1和鮭魚2序列的剩餘部分。特別的是，成熟的肌生長抑制素序列與TGF-β超家族的其它成員具有明顯的同源性，肌生長抑制素含有大多數在其它家族成員間和其它物種內高度保守的殘基。而且，像TGF-βs和抑制素βs一樣，除了實際上存在於所有其它家族成員中的7個半胱氨酸殘基以外，肌生長抑制素含有額外的一對半胱氨酸殘基。肌生長抑制素與Vgr-1(45％序列同一性)是最同源的。像TGF-β超家族的其它成員，肌生長抑制素被合成為一個較大的前體原肌生長抑制素多肽，它可被蛋白水解剪切成一種有活性的肌生長抑制素肽。
編碼多種生物體的原肌生長抑制素多肽的多核苷酸可用熟知的程序和算法基於與公開序列的同一性(或同源性)來識別。同源性或同一性經常採用序列分析軟體來測定，這些軟體如遺傳學計算機集團的序列分析軟體包(威斯康星大學生物技術學中心，大學路1710號，Madison，WI53705)。這樣的軟體可通過對多種刪除，替代和其它修飾作用賦予不同程度的同源性值，從而匹配相似的序列。術語「同源性」和「同一性」，當在這裡應用在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中時，是指當被比較和被排列以最大的對應於比較窗或指定區域時，採用任何數量的序列比較算法測量或通過人工排列和目測時，兩個或更多個相同的序列或子序列，或具有特殊比例的相同的胺基酸殘基或核苷酸。
為了比較序列，一般一個序列可作為一個參考序列，將待測序列與它比較。當採用一種序列比較算法時，將待測和參考序列輸入計算機，如果需要，指定子序列的坐標，並指定序列算法程序的參數。採用預設的程序參數或指定可選的參數。然後序列比較算法基於程序參數計算待測序列與參考序列等同的序列百分比。
在此廣泛使用的術語「比較窗」包括所指定的連續位點數目中任一數目的一個片段，例如，大約20至600個位點，例如，胺基酸或核苷酸位點普遍是大約50至大約200個位點，更普遍的是大約100至大約150個位點，其中在兩個序列被最佳的排列之後，一個序列可與相同數目連續位點的一個參考序列進行比較。進行比較的序列排列的方法在本領域中是為人熟知的。進行比較的最佳序列排列可通過，例如Smith和Waterman局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性排列算法(J.Mol.Biol.48443，1970)，Person和Lipman的相似法檢索(Proe.Natl.Acad.Sci.，USA 852444，1988)，上述每種方法在此均引入作為參考文獻；這些算法的計算機化應用(威斯康星遺傳學軟體包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，遺傳學計算機集團，575 Science Dr.，Madison，WI)；或人工排列和目測。確定同源性或同一性的其它算法包括，例如，除BLAST程序以外(國立生物學信息中心的基本局部排列檢索工具)，有ALIGN，AMAS(多次排列序列分析)，AMPS(蛋白質多次序列排列)，ASSET(排列片段統計估算工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物學序列比較分析結點)，BLIMPS(Blocks IMProved檢索器)，FASTA，Intervals Points，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，FNAT(強制核苷酸排列工具)，框架排列，框架檢索，DYNAMIC，FILTER，FSAP(Fristensky序列分析包)，GAP(球形排列程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(敏感性序列比較)，LALIGN(局部序列排列)，LCP(局部容量程序)，MACAW(多次排列構建和分析工作檯)，MAP(多次排列程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(圖形引導的多次序列排列)，SAGA(遺傳算法的序列排列)和WHAT-IF。這樣的排列程序也可用於篩選基因組資料庫以識別具有實質上相同序列的多核苷酸序列。
許多基因組資料庫可用於比較，包括，例如作為人類基因組測序項目(J.Roach，http//weber.u.Washington.e一部分的人類基因組的主要部分。另外，至少有21個基因組已經完全被測序，包括，例如，生殖器支原體(M.genitalium)，甲烷球菌(M.jannaschii)，流感嗜血桿菌(H.influenzae)，大腸桿菌，酵母(釀酒酵母)，和果蠅(D.melanogaster)。在如鼠，秀麗新小杆線蟲(C.elegans)和擬南芥(Arabadopsis sp.)等生物體模型基因組的測序中已經獲得了明顯的進展。幾個含有一些功能性信息說明的基因組信息資料庫由不同的機構維護，也經網際網路上獲得，例如，http//wwwtigr.org/tdb；http//www.genetics.wisc.edu；http//genome-www.stanford.edu/～ball；http//hiv-web.lanl.gov；http//www.ncbi.nlm.nih.gov；http//www.ebi.ac.uk；http//Pasteur.fr/other/biology；http//www.genome.wi.mit.edu。
有用的算法的一個實施方案是BLAST和BLAST2.0算法，由Altschul等人所描述(Nucleic Acids Res.253389-3402，1977；J.Mol.Biol.215403-410，1990，每一篇文獻在此都引入作為參考文獻)。執行BLAST分析的軟體可公開地從國家生物技術學信息中心獲得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。這種算法首先通過在查詢序列中識別短的長度為W的字符串，識別出高分值序列配對(HSP)，當在一個資料庫序列中與相同長度的字符串排列時，該序列配對匹配或滿足一些陽性意義的閾值評分T。T被稱為是鄰近的字符串分值的閾值(Altschul等人，見前，1977，1990)。這些最初的鄰近字符串點擊可作為啟動檢索尋找含有它們的更長的HSP的開端。字符串點擊可沿著每個序列兩個方向延伸，只要累計的排列分值增加。對核苷酸序列的累計分值的計算可以採用參數M(對一對相匹配的殘基的獎勵分值；一般＞0)。對於胺基酸序列，採用一種評分矩陣來計算累計的分值。字符串點擊在每個方向的延伸當出現以下情況時停止累計排列分值從達到的最大值下降至數量X時；由於一個或多個負分的殘基排列分值的積累，導致累計的分值到達0或之下時；或達到每個序列的末端時。BLAST算法參數W，T和X決定了排列的敏感性和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)採用的預設字符串長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，並比較兩條鏈。對於胺基酸序列，BLASTP程序採用的預設字符串長度為3，期望值(E)為10，BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 8910915，1989)排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，並比較兩條鏈。
BLAST算法也在兩個序列之間進行相似性的統計學分析(見，例如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993，在此引入作為參考)。由BLAST算法提供的一種相似性的測量方法是最小和數概率(P(N))，它提供了一種概率的指示法，根據它在兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配將偶然發生。例如，如果在比較待測核酸與參考核酸之間的最小和數概率少於大約0.2，更優選少於大約0.01，最優選少於大約0.001時，該核酸被認為與參考序列是相似的。
在一個實施方案中，蛋白質和核酸序列同源性是採用基本局部排列檢索工具(「BLAST」)進行評價的。尤其是，5個特殊的BLAST程序用來進行下列的工作(1)BLASTP和BLAST3將一種胺基酸查詢序列與一個蛋白質序列資料庫進行比較；(2)BLASTN將一種核苷酸查詢序列與一個核苷酸序列資料庫進行比較；(3)BLASTX將一個查詢核苷酸序列(兩條鏈)的6框的概念翻譯產物與一個蛋白質序列資料庫進行比較；(4)TBLASTN將一個查詢蛋白質序列與一個在所有六個閱讀框(兩條鏈)中翻譯的核苷酸序列資料庫進行比較；和(5)TBLASTX將一個核苷酸查詢序列的6框翻譯與一個核苷酸序列資料庫的6框翻譯進行比較。
BLAST程序通過識別相似片段來鑑定同源序列，這裡所指的相似片段是指在查詢胺基酸或核酸序列和一種待測序列之間的「高分值的片段對」，該待測序列優選從一種蛋白質或核酸序列資料庫中獲得。高分值的片段對優選採用一種評分矩陣的方法進行鑑定(即排列)，在本領域中許多這樣的矩陣是已知的。優選地，使用的評分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等人，Science 2561443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 1749-61，1993，兩文在此均引入作為參考)。不太優選的是，也可使用PAM或PAM250矩陣(Schwartz和Dayhoff，主編，「檢測距離關係的矩陣蛋白質序列和結構圖集」(Matrices for Detecting DistanceRelationshipsAtlas of Protein Sequence and Structure)(Washington，國家生物醫學研究基金會1978))。BLAST程序可通過美國國家醫學圖書館訪問，例如，在www.ncbi.nlm.nih.gov。
在上述算法中使用的參數可根據研究的序列長度和同源性程度進行調整。在一些實施方案中，沒有用戶指令時，參數可以是算法所提供的預設參數。
編碼一種原肌生長抑制素的多核苷酸可來自任何生物體，包括例如，小鼠、大鼠、牛、豬、人、雞、火雞、斑馬魚、鮭魚、有鰭的水族、其它水生生物和其它物種。水生生物的實例包括那些屬於魚塘魚類的生物，如鮭魚、紅點鮭、香魚、鯉魚、鯽魚、金魚、昏白魚、銀魚、鱔魚、海鰻、沙丁魚、飛魚、巴西刺鱸、鯛、鸚鵡鱸魚、紐西蘭真鯛、鯖、白腹鯖、鮪魚、鰹魚、、鯡魚、巖魚、平魚(fluke)、鰨魚、比目魚、河豚、純魚；那些屬於頭足類的生物，如魷魚、墨魚、章魚；那些屬於斧足類的生物，如蛤(如，硬殼蛤、蛤仔、圓蛤、海蛤蜊、軟殼蛤)；烏蛤、蛤貝、海螺；扇貝(如，海扇貝、海灣扇貝、calloo)；海螺、蝸牛、海參、赤貝；牡蠣(如貞潔巨牡蠣(C.virginica)，海灣牡蠣，紐西蘭牡蠣，太平洋牡蠣)；那些屬於腹足類的生物，如螺旋貝、鮑魚(如綠鮑魚、粉紅鮑魚、紅鮑魚)；和那些屬於甲殼類的生物，如龍蝦，包括但不限於刺蜥、巖蜥和美洲蜥；對蝦；河蝦，包括但不限於羅氏對蝦(M.rosenbergii)，P.styllrolls，印度對蝦(P.indicus)，日本對蝦(P.jeponious)，斑節對蝦(P.monodon)，P.vannemel，M.ensis，S.melantho，N.norvegious，冷水河蝦；蟹，包括但不限於藍蟹、白嘴蟹、石蟹、王蟹、雪花蟹、雪蟹、褐蟹、鄧傑內斯蟹、約拿蟹、紅樹蟹、軟殼蟹；蝦蛄、磷蝦、河蝥蝦(langostinos)；小龍蝦/龍蝦，包括但不限於藍色的、慄色的、紅爪的、紅沼澤的、軟殼的、白色的；環節動物門的動物；脊索動物門的動物，包括但不限於爬蟲類如美洲鱷魚和龜；兩棲類生物，包括蛙；和棘皮類，包括但不限於海膽。
本發明提供一種基本上經純化的原肌生長抑制素多肽的肽部分，和一個基本上經純化的原-GDF-11多肽的的肽部分。如在此所使用的，提到「原-GDF」，例如原肌生長抑制素或原-GDF-11，它意味著全長的多肽，包括氨基末端的功能前區和羧基末端的生物學活性GDF肽。另外，功能前區包括一個信號肽(引導序列)，它由功能前區氨基末端的起始15至30個胺基酸組成。信號肽可從全長的原-GDF多肽中剪切下來，後者可進一步在一個Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白質水解剪切位點上被剪切。
在此所提到的胺基酸殘基的參照物是根據圖1和2(也見序列列表)中顯示的全長原-GDF多肽而言。也應該認識到在此所提到的特定多肽是開始或者終止在「大約」一個特殊的胺基酸殘基處。在此文中使用術語「大約」是因為認識到在蛋白水解剪切識別位點處或鄰近部位，一個特殊的蛋白酶可切斷原-GDF多肽，或從識別位點切下一個或幾個胺基酸。如此，例如，所提到的一個具有SEQ ID NO4的大約1至263胺基酸殘基的序列的肌生長抑制素功能前區包括原肌生長抑制素的一個氨基末端肽部分，包括信號肽，並具有在胺基酸殘基257至胺基酸殘基269，優選在胺基酸殘基260至胺基酸殘基266終止的一個羧基末端。
類似地，信號肽可從一個原-GDF多肽的大約15至30胺基酸殘基的任何位置上被切斷，例如，在殘基15，20，25或30上切斷，不影響剩餘功能前區的功能。因此，為方便起見，在此一般談到一個原-GDF多肽的肽部分時，信號肽已經從中被切下來，其起始在大約胺基酸殘基20處。但是，將要認識到的是信號肽的剪切可以在一個原-GDF多肽氨基末端大約起始15至30個胺基酸之中的任意胺基酸位置處進行。如此，例如，所提到的一個具有SEQ ID NO4的大約20至263個胺基酸殘基的序列的肌生長抑制素功能前區包括原肌生長抑制素的一個肽部分，它缺少原肌生長抑制素的大約起始的15至30個胺基酸，包含信號肽，並具有在胺基酸殘基257至胺基酸殘基269，優選在胺基酸殘基260至胺基酸殘基266終止的一個羧基末端。
一般來說，在此提到的一個原-GDF多肽或一個GDF功能前區其開始在大約胺基酸1處。但考慮到上述的公開內容，將認識到這樣的缺少信號肽的原GDF多肽或GDF功能前區也包括在本發明中。在此方面應進一步認識到在本發明的肽中存在或缺少信號肽可影響，例如，細胞的區室，該細胞是一種肽，例如原肌生長抑制素功能前區將穿過它，並且該肽將最終定位在此的細胞，包括該肽是否可從細胞中被分泌出來。因此，本發明進一步提供了一個基本上經純化的原-GDF多肽的信號肽部分。如在此所公開的，這樣一種信號肽可用來將一種藥劑，特別是一種肽藥劑，引導到產生該信號肽的天然合成GDF的相同細胞區室中。
術語「肽」或「肽部分」在此廣泛用來指通過肽鍵連接的兩個或更多個的胺基酸。術語「片段」或「蛋白水解片段」在此也用來指一種可通過在一個多肽上進行蛋白水解反應產生的產物，即一種通過切斷多肽中的肽鍵所產生的肽。儘管術語「蛋白水解片段」一般在此用來指通過蛋白水解反應產生的一種多肽，應該認識到該片段不僅不必必須通過蛋白水解反應來產生，而且也可採用化學合成或重組DNA技術的方法來產生，如在下面所詳述的，這些方法可產生一種合成肽，它與蛋白水解片段是相同的。考慮到原肌生長抑制素和其它TGF-β超家族成員之間已公開的同源性，將要認識到本發明所述肽的特徵部分地在於它不存在於以前公開的該超家族的成員之中。採用上述的計算機算法可很容易地確定，一個原肌生長抑制素或原-GDF-11多肽的肽部分是否存在於以前所公開的TGF-β超家族成員中。
一般來說，本發明所述肽含有至少6個胺基酸，一般含有大約10個胺基酸，可含有15個或更多的胺基酸，特別是20個或更多的胺基酸。應該認識到術語「肽」在此並不用來說明組成分子的胺基酸的特定的大小或數目，本發明所述肽含有可達幾個胺基酸殘基或更多的殘基數目。例如，全長的成熟C-末端肌生長抑制素肽含有超過100個胺基酸，一個全長的功能前區肽可含有超過260個胺基酸。
如在此所使用的，術語「基本上經純化的」或「基本上純的」或「分離的」是指所提到的分子，例如一種肽或一種多核苷酸，其形式相對地不含有蛋白質、核酸、脂類、碳水化合物或其它與其天然相關的物質。一般來說，基本上純的肽、多核苷酸、或其它分子其含量至少是樣品量的20％。一般至少佔樣品量的大約50％，通常至少佔樣品量的大約80％，尤其是佔樣品量的大約90％或95％或更多。判斷本發明所述肽或所述多核苷酸基本上是純的，可以採用熟知的方法來進行，例如通過進行電泳，將相對分離的條帶鑑定特定的分子。一種基本上純的多核苷酸，例如可通過克隆該多核苷酸或化學或酶合成的方法獲得。一種基本上純的肽，例如可通過化學合成的方法，或採用蛋白質純化的方法來獲得，然後進行蛋白質水解，如果需要，通過色譜或電泳的方法來進一步純化。
本發明的肽可分別通過與原肌生長抑制素或原-GDF-11序列的比較並確定該肽的胺基酸序列包含在原肌生長抑制素或原-GDF-11多肽序列中來鑑定。但應該認識到，本發明的肽不需要與原肌生長抑制素或原-GDF-11的相應胺基酸序列相等同。因此，例如，本發明的肽可對應原肌生長抑制素多肽的胺基酸序列，但可與天然發生序列有所不同，例如在對應的L-胺基酸的位置含有一個或多個D-胺基酸；或含有一個或多個胺基酸類似物，例如，已經發生衍生化作用或者是在其活性側鏈上具有被修飾的胺基酸。類似地，在肽的一個或多個肽鍵上可以被修飾。另外，在氨基末端或羧基末端或兩者上的活性基團可以被修飾。這樣的肽被修飾後，例如，可提高對蛋白酶、氧化劑或該肽在生物學環境中可能遇到的其它活性物質的穩定性，並因此在本發明所述方法的實施過程中特別有用。當然肽可以被修飾使其在生物學環境中降低穩定性，以便減少該肽在環境中具有活性的時間。
與原肌生長抑制素或原-GDF-11多肽中的相應序列相比較，本發明的肽序列也可通過插入一種保守的胺基酸替代肽中的一個或幾個胺基酸而進行修飾。保守的胺基酸替代作用包括用具有相對相同化學特性的另一個胺基酸殘基替代一個胺基酸殘基，例如一個疏水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代另一個，或一個極性殘基替代另一個，例如精氨酸替代賴氨酸；或穀氨酸替代天冬氨酸；或穀氨醯胺替代天冬醯胺；或類似的情況。細查圖1，原肌生長抑制素多肽可被修飾位置的實例是很明顯的，它顯示了實質上不影響原肌生長抑制素或肌生長抑制素活性的肌生長抑制素功能前區和成熟肌生長抑制素肽中的多個胺基酸差異。
本發明也提供了一種生長分化因子(GDF)多肽(原-GDF多肽)或其功能性肽部分的一種基本上經純化的蛋白水解片段。原-GDF多肽的蛋白水解片段在此的實例是原肌生長抑制素多肽的蛋白水解片段和原-GDF-11多肽的蛋白水解片段。如在此所公開的，與原-GDF蛋白水解片段相同的原-GDF多肽的肽部分可通過一種化學的方法或一種重組DNA的方法來產生。考慮到此處公開的內容，其它GDF多肽的蛋白水解片段可很容易的進行製備和使用。
總體來說，對應原-GDF多肽蛋白水解片段的肽的實例是一個羧基末端(C-末端)成熟GDF片段，它可特異地與一個GDF受體相互作用，並影響GDF的信號轉導，以及一個氨基末端功能前區片段，它可包括一個信號肽，如在此所公開的，它可特異地與原-GDF多肽或成熟的GDF肽相互作用，並影響其引發GDF信號轉導作用的能力。例如，原肌生長抑制素多肽的蛋白水解片段包括一個C-末端成熟肌生長抑制素肽，它可特異地與一個肌生長抑制素受體相互作用，並誘導肌生長抑制素信號轉導作用；以及一個氨基末端功能前區片段，它可特異地與肌生長抑制素相互作用，因此減少或抑制肌生長抑制素誘發肌生長抑制素信號轉導作用的能力。
原-GDF多肽的蛋白水解片段或其功能性肽部分一個的特性部分地在於具有或影響與GDF信號轉導作用刺激或抑制作用相關的活性。例如，一個原肌生長抑制素多肽或其功能性肽部分具有肌生長抑制素受體結合活性，肌生長抑制素信號轉導作用刺激或抑制活性，肌生長抑制素結合活性，原肌生長抑制素結合活性，或其聯合作用。因此，術語「功能性肽部分」，當在此用來說明原-GDF多肽時，是指可與其受體特異地相互作用，並刺激或抑制GDF信號轉導作用的原-GDF多肽的一個肽部分；可特異的與一個成熟的GDF或原-GDF相互作用的原-GDF多肽的一個肽部分；或可發揮細胞定位活性的原-GDF多肽的一個肽部分，即信號肽的活性。應該認識到，例如，全長成熟的肌生長抑制素肽的功能性肽部分，不需要具有與成熟肌生長抑制素相同的活性，包括刺激肌生長抑制素信號轉導作用的能力，因為成熟肽的功能性肽部分，例如，具有特異地與肌生長抑制素受體相互作用的能力，而不需要具有激活信號轉導作用通路的能力。鑑定這樣一種可用作肌生長抑制素拮抗劑的原-GDF多肽的功能性肽部分的方法，在此被公開或在本領域是已知的。因此，在一個實施方案中，原肌生長抑制素多肽的一種功能性肽部分可特異地與一種肌生長抑制素受體相互作用，並可作為刺激肌生長抑制素信號轉導作用的一種激動劑或減少或抑制肌生長抑制素信號轉導作用的一種拮抗劑。
在另一個實施方案中，原肌生長抑制素多肽的一種功能性肽部分可特異地與一種原肌生長抑制素多肽或一種成熟的肌生長抑制素肽相互作用，因此可阻斷肌生長抑制素信號轉導作用。這樣的一種原肌生長抑制素的功能性肽部分的作用有，例如，可阻止原肌生長抑制素多肽斷裂成為成熟的肌生長抑制素；與成熟的肌生長抑制素肽形成一個複合體；或有其它一些機制。在肽-肌生長抑制素複合體形成的部位，複合體可阻斷肌生長抑制素的信號轉導，例如通過減少或抑制肌生長抑制素與其受體特異地相互作用的能力，或通過與受體結合，該結合形式缺乏誘導肌生長抑制素信號轉導作用的能力。
原-GDF多肽的蛋白水解片段可通過在蛋白水解剪切位點剪切多肽來產生，該位點具有共有胺基酸序列Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ IDNO21)。這樣的蛋白水解識別位點的實例是Arg-Ser-Arg-Arg(SEQ IDNO22)序列，在SEQ ID NO1(原肌生長抑制素)中顯示為胺基酸殘基263至266，或SEQ ID NO25(人原-GDF-11；也見，圖2的相對位置267至270)中的胺基酸殘基295至298，在SEQ ID NO20顯示為胺基酸殘基263至266的Arg-Ile-Arg-Arg(SEQ ID NO23)序列。
除了信號肽的蛋白水解位點以外，例如原肌生長抑制素多肽，含有其它兩個潛在的蛋白酶解加工位點(Lys-Arg和Arg-Arg)。在後一個蛋白酶解加工位點或其附近剪切原肌生長抑制素多肽，可產生一個生物學活性的C-末端成熟人肌生長抑制素片段，其中該位點包含在共有Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白水解剪切識別位點之中(見，例如，SEQ ID NO2的胺基酸殘基263至266)。全長的成熟肌生長抑制素肽的實例含有大約103至大約109個胺基酸，其預測分子量為大約12,400道爾頓(Da)。另外，肌生長抑制素可形成二聚體，後者的預期分子量大約為23至30千道爾頓(kDa)。二聚體可以是肌生長抑制素同型二聚體，或是雜二聚體，例如，與GDF-11或另一個GDF或TGF-β家族成員一起。
本發明的一個蛋白水解片段的實例是GDF功能前區(GDFprodomain)，例如一個肌生長抑制素功能前區，它包括大約原肌生長抑制素多肽的胺基酸殘基20至262，或其功能性肽部分，或GDF-11的功能前區，它包括原-GDF-11多肽的大約胺基酸殘基20至295，或其功能性肽部分，兩者都進一步含有信號肽，該信號肽由各自的原-GDF多肽的大約胺基酸1至20組成。肌生長抑制素功能前區的進一步實例是，在SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中列出的胺基酸殘基大約20至263；以及在SEQ ID NO2，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，SEQ ID NO20中列出的胺基酸殘基大約20至262，它們可通過相應的原肌生長抑制素多肽的蛋白水解剪切，通過化學合成，或可從編碼蛋白水解片段的重組多核苷酸的表達而產生。肌生長抑制素功能前區的功能性肽部分的實例是可特異與肌生長抑制素或原肌生長抑制素相互作用的原肌生長抑制素功能前區的肽部分。一個GDF-11功能前區的實例是SEQ IDNO25的大約胺基酸殘基20至295，它可進一步包括信號肽，該信號肽由SEQ ID NO25的大約胺基酸殘基1至20組成，GDF-11功能前區的功能性肽部分的實例是可特異與成熟GDF-11或原-GDF-11多肽相互作用的GDF-11功能前區的肽部分。優選的是，GDF功能前區的功能性肽部分可抑制相應GDF或相關GDF刺激信號轉導作用的能力，例如通過減少或抑制GDF特異地與其受體相互作用的能力，或通過與受體結合成為一個無活性複合體。在一個實施方案中，本發明提供了一個原-GDF多肽的功能性片段，特別是一個GDF功能前區的功能性片段，可有效地連接於一個GDF信號肽，優選一個肌生長抑制素信號肽或GDF-11信號肽，分別由原肌生長抑制素或原-GDF-11的起始大約15至30個末端胺基酸組成。
如在此所公開的，肌生長抑制素功能前區或GDF-11功能前區可與成熟的肌生長抑制素，GDF-11或兩者相互作用，因此可減少或抑制成熟GDF與其受體特異相互作用的能力(見實施例7和8)。因此，獲得肌生長抑制素功能前區的一個功能性肽部分的方法，例如，可採用在此提供的方法，通過檢測肌生長抑制素功能前區的肽部分，並鑑定可特異地與肌生長抑制素或與原肌生長抑制素相互作用並且減少或抑制肌生長抑制素與肌生長抑制素受體的相互作用或肌生長抑制素刺激肌生長抑制素信號轉導作用的能力的功能前區功能性肽部分。
可特異地與肌生長抑制素相互作用的肌生長抑制素功能前區的一個功能性肽部分，或另一個GDF功能前區的一個功能性肽部分，也可採用任何已知用於識別特異的蛋白質-蛋白質相互作用的測定方法來鑑定。這樣的測定方法包括，例如，凝膠電泳法，親合層析法，Fields和Song的雙雜種系統法(the two hybrid system)(Nature 340245-246，1989；也見美國專利5,283,173；Fearon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA897958-7962，1992；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 889578-9582，1991；Young，Biol.Reprod.58302-311(1998)，每一篇文獻都在此引入作為參考文獻)，逆向雙雜種測定方法(Leanna和Hannink，Nucl.Acid Res.243341-3347，1996，在此引入作為參考文獻)，阻遏型反式激活蛋白系統(美國專利No.5,885,779，在此引入作為參考)，噬菌體展示系統(Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-424，1997，在此引入作為參考)，GST/HIS破壞測定，突變體操縱子(WO 98/01879，在此引入作為參考文獻)，蛋白補充系統(美國專利No.5,776,689，在此引入作為參考文獻)，以及類似方法(見，例如，Mathis，Clin.Chem.，41139-147，1995 Lam，Anticancer Drug Res.12145-167，1997；Phizicky等人，Microbiol.Rev.5994-123，1995；每一篇文獻在此都引入作為參考文獻)。
GDF功能前區的一個功能性肽部分也可採用製作分子模型的方法進行鑑定。例如，一個成熟的肌生長抑制素肽的一個胺基酸序列可輸入具有合適的模擬軟體的計算機系統中，可產生肌生長抑制素的三維表象(「虛擬的肌生長抑制素」)。原肌生長抑制素的胺基酸序列也可被輸入至計算機系統中，這樣模擬軟體可模擬原肌生長抑制素序列的部分，例如，功能前區的部分，可鑑定出能與虛擬肌生長抑制素特異相互作用的功能前區的這些肽部分。特異相互作用的基線可通過模擬虛擬的肌生長抑制素和全長的原肌生長抑制素功能前區而預先確定，鑑定在虛擬肌生長抑制素中被功能前區「接觸」的胺基酸殘基，因為這樣的一個相互作用已知可抑制肌生長抑制素的活性。
應該認識到，這樣的方法，包括雙雜種體系測定法和製作分子模型方法，也可用來鑑定包括在本發明中的其它特異性相互作用的分子。因此諸如雙雜種體系測定法可用來鑑定GDF受體如肌生長抑制素受體，例如可採用能特異地與一個Act RIIA或Act RIIB受體相互作用的肌生長抑制素肽或其肽部分作為測定中的一個結合成分，並鑑定能與肌生長抑制素肽特異相互作用的GDF受體。類似地，製作分子模型的方法可用來鑑定能與一個成熟GDF肽如成熟的肌生長抑制素，或與一個GDF受體，特異性相互作用的藥劑，因此該藥劑可用作GDF或GDF受體介導的信號轉導作用的激動劑或拮抗劑。這樣一種藥劑可以是，例如肌生長抑制素功能前區或GDF-11功能前區的一個功能性肽部分，或一種可模擬GDF功能前區作用的化學藥劑。
用於在此公開的目的的模擬系統是基於通過例如結晶學分析或核磁共振分析得到的結構信息，或根據一級結構序列信息(見，例如，Dunbrack等人，「會議綜述蛋白質結構預測技術關鍵性評價第二次會議(Meeting reviewthe Second meeting on the Critical Assessment ofTechniques for Protein Structure Prediction)(CASP2)(Asilomar，加利福尼亞，1996年12月13-16日)」Fold Des.2(2)R27-42，(1997)；Fischer和Eisenberg，Protein Sci.5947-55，1996；(也見美國專利5,436,850)；Havel，Prog.Biophys.Mol.Biol.5643-78，1991；Lichtarge等人，J.Mol.Biol.274325-37，1997；Matsumoto等人，J.Biol.chem.27019524-31，1995；Sali等人，J.Biol.Chem.2689023-34，1993；Sali，Molec.Med.Today 1270-7，1995a；Sali，Curr.Opin.Biotechnol.6437-51，1995b；Sali等人，Proteins23318-26，1995c；Sali，Nature Struct.Biol.51029-1032，1998；美國專利No.5,933,819；美國專利No.5,265,030，每一篇在此都引入作為參考文獻)。
原肌生長抑制素多肽或GDF受體的晶體結構坐標可用來設計可與該蛋白質結合的化合物，並可用多種方法改變其物理或生理學特性。蛋白質的結構坐標也可用來在小分子資料庫中計算機篩選可與該多肽結合的藥劑，以便開發調節或結合的藥劑，它可作為GDF信號轉導作用的激動劑或拮抗劑發揮作用。這樣的藥劑可通過計算機採用標準的方程匹配動力學數據來鑑定(見，例如，Segel，「酶動力學」(J.Wiley Sons1975)，在此引入作為參考文獻)。
採用晶體結構數據來設計抑制劑或結合劑的方法在本領域是已知的。例如，GDF受體坐標可添加到其它可獲得的相似受體的坐標上，包括具有一個結合抑制物的受體，可為抑制物與受體的相互作用提供最接近的方式。在合理化藥劑設計實踐中，使用的電腦程式也可用來鑑定一些化合物，這些化合物可複製類似於已發現的相互作用特性，例如在成熟肌生長抑制素和共結晶的肌生長抑制素功能前區之間發現的相互作用特性。詳細了解特異性相互作用的性質有助於修飾化合物以改變或改善其可溶性，藥劑動力學和類似特性，而不影響結合活性。
執行應用晶體結構信息設計藥劑所需功能的電腦程式是為人熟知的。這樣程序的實例包括，Catalyst DatabasesTM-一個可訪問化學資料庫如BioByte Master File，Derwent WDI和ACD的信息檢索程序；Catalyst/HYPOTM-產生化合物的模型，並可用藥劑侯選物的結構推測解釋活性的變化；LudiTM-通過鑑定和匹配互補極性和疏水基團，將分子插入到蛋白質的活性位點中；以及LeapfrogTM-採用遺傳學算法在用戶控制的參數下「生成」新的配體。
許多普通用途的機器均可使用這種程序，或更方便的是組建更專業化的儀器來執行這種操作。一般來說，實例的實施可在一個或多個在可編程的系統中運行的電腦程式中執行，每個系統至少包含一個處理器，至少一個數據存儲系統(包括易失性存儲器和非易失性儲器和/或存儲元件)，至少一個輸入裝置，至少一個輸出裝置。程序在處理器上運行以執行在此所述的各種功能。
每個這樣的程序都可以以任何所需的計算機語言，包括例如，機器語言，彙編語言，高等程序語言，或面向目標的程序語言，來實現與計算機系統的交流。在任何情況下，語言都可以是一個已編譯或解釋語言。電腦程式典型地將被儲存在存儲介質或裝置中，例如，只讀存儲器(ROM)，大容量只讀存儲器(CD-ROM)，磁性或光學介質，或類似物，當存儲介質或裝置被計算機讀取執行在此所述的步驟時，這些介質可以被一般或特殊用途程序計算機所讀取以配置和運行計算機。該系統也可被認為是當作一個計算機可讀取的存儲介質，用電腦程式配置，其中這樣配置的存儲介質可使計算機以一種特殊的和預定的方式運行以執行在此所述的各種功能。
本發明的實例包括一些系統，例如，基於網際網路的系統，特別是存儲和處理坐標信息的計算機系統，如在此所述，這些信息來自結晶學或NMR分析，或胺基酸或核苷酸序列信息。如在此所使用的，術語「計算機系統」是指用來分析在此出現的坐標或序列的硬體部件，軟體部件和數據存儲部件。典型地計算機系統包括一個處理、訪問和操縱序列數據的處理器。處理器可以是任何已知類型的中央處理器，例如Intel公司的奔騰II或奔騰III處理器，或太陽，摩託羅拉，康柏，先進微裝置(AMD)或國際商用機器的類似處理器。
典型地計算機系統是一個一般用途的系統，包括處理器和一個或多個存儲數據的內部數據存儲部件，以及一個或多個在數據存儲部件中檢索數據的數據檢索裝置。專業技術人員可很容易的理解現在可見到的任何一個計算機系統都是適合的。
在一個實施方案中，計算機系統包括連接於系統總線的一個處理器，該總線與主存儲器相連接，優選用RAM來實現，和一個或多個內部數據存儲裝置，如一個硬碟驅動器或其它記錄數據的計算機可讀介質。在一些實施方案中，計算機系統進一步包括一個或多個可在內部數據存儲裝置上讀取存儲數據的數據檢索裝置。
數據檢索裝置可能代表，例如，一個軟盤驅動器，一個光碟驅動器，一個磁帶驅動器，或一個能與遠程數據存儲系統連接的數據機(如，通過網際網路)。在一些實施方案中，內部的數據存儲裝置是一種可移動的計算機可讀介質，如一張軟盤，一張光碟，一張磁帶等等，上面包含已記錄的控制邏輯和/或數據。有利地是計算機系統可以包含或編有適當的軟體，以便一旦插入數據檢索裝置，就從數據存儲部件中讀取控制邏輯和/或數據。
計算機系統一般包含一個顯示器，它可用來對計算機用戶進行顯示輸出數據。也應該指出的是計算機系統可在一個網絡或廣域網絡中連接到其它的計算機系統上以便提供對該計算機系統的集中式訪問。
只要需要鑑定一種可特異地與肌生長抑制素或與GDF受體相互作用的化學實體時，可以使用任何能篩選其具有與該分子的特異相互作用能力的化學實體或片段的方法。這種過程的開始可通過，例如，在計算機屏幕上觀察肌生長抑制素和肌生長抑制素功能前區。然後選擇的功能前區的肽部分或可作為模擬物的化學實體，可被定位在多種方向，或插入至肌生長抑制素的單個結合位點中。可採用軟體如Quanta和Sybyl完成插入過程，然後進行能量最小化，並用標準的分子力學力場，如CHARMM和AMBER完成分子動力學。
可特別採用專門的電腦程式來選擇功能前區的肽部分，或有用的化學實體，例如GDF受體激動劑或拮抗劑。例如，這樣的程序包括GRID(Goodford，J.Med.Chem.，28849-857，1985；可從牛津大學獲得，牛津，英國)；MCSS(Miranker和Karplus，ProteinsStructure.Function andGenetics 1129-34，1991，可從Molecular Simulation獲得，Burlington MA)；AUTODOCK(Goodsell和Olsen，ProteinsStructure.Function andGenetics 8195-202，1990，可從Scipps Research Institute，La Jolla CA獲得)；DOCK(Kuntz等人，J.Mol.Biol.161269-288，1982，可從加利福尼亞大學獲得，舊金山CA)，每一篇文獻在此都引入作為參考文獻。
已經被選擇的合適的肽或藥劑可組裝成一個單一的化合物或結合藥劑。裝配可通過觀察顯示在計算機屏幕的三維影像上片段之間的相互關係來進行，然後採用軟體如Quanta或Sybyl進行人工模型構建。能輔助本領域專業技術人員連接單個化學實體或片段的有用的程序，包括，例如，CAVEAT(Bartlett等人，Special Pub.，Royal Chem.Soc.78182-196，1989，可從加利福尼亞大學獲得，伯克利CA)；3D資料庫系統如MACCS-3D(MDL信息系統，聖萊昂納多CA；綜述，見Martin，J.Med.Chem.352145-2154，1992)；HOOK(可從Molecular Simulations獲得，Burlington，Mass.)，每一篇在此均引入作為參考文獻。
除了採用逐步剔除的方式，如上所述每次一個片段或一個化學實體，構建或鑑定這樣特異相互作用的藥劑的方法以外，藥劑可設計成一個整體或重新採用一個空閒的活性位點，或任意的包含一個已知的可特異相互作用的藥劑的一部分，例如一個全長的肌生長抑制素功能前區，其與肌生長抑制素特異地相互作用。這樣的方法包括，例如，LUDI(Bohm，J.Comp.Aid.Molec.Design 661-78，1992，可從BiosymTechnologies獲得，聖地牙哥CA)；LEGEND(Nishibata和Itai，Tetrahedron 478985，1991，可從Molecular Smiulations，Burlington MA獲得)；LeapFrog(可從Tripos Associates獲得，聖路易MO)，以及那些由Cohen等人(J.Med.Chem.33883-894，1990)和Navia和Murcko(Curr.Opin.Struct.Biol.2202-210，1992)所描述的，每一篇在此均引入作為參考文獻。
在本領域中可得到專門的計算機軟體來評價化合物的形變能和靜電相互作用。設計用於這些目的的程序的實例包括Gaussian 92，修正版C(Frisch，Gaussian公司，Pittsburgh PA，1992)；AMBER，4.0版(Kollman，加利福尼亞大學舊金山分校，1994)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations公司，Burlington MA，1994)和Insight II/Discover(Biosysm Technologies公司，聖地牙哥CA，1994)。這些程序可採用，例如Silicon圖形工作站，IRIS 4D/35或IBM RISC/6000工作站550型來執行。其它的硬體系統和軟體包對本領域專業技術人員是已知的，其速度和容量可不斷的更改。
鑑定一種可與目標分子，例如與一個成熟的GDF肽如成熟的肌生長抑制素，或與一個GDF受體特異相互作用的藥劑的製作分子模型過程，可如在此所公開的那樣進行。第一步，執行一個靶分子，例如肌生長抑制素的虛擬表現形式。因此，在一個實施方案中，本發明可提供一個靶分子的虛擬表現形式，其中靶分子選自原-GDF多肽，例如，原肌生長抑制素；原-GDF多肽的肽部分；GDF受體；以及GDF受體的一個相關功能區，例如，GDF結合功能區。靶分子的虛擬表現形式可被顯示出來或保存在計算機系統存儲器中。該過程以起始狀態啟動，含有虛擬的靶分子，然後轉換至一種狀態，其中含有一個或多個虛擬受檢分子的資料庫存儲至計算機系統的一個存儲器中。如上所述，存儲器可以是任何類型的存儲器，包括RAM或其它內部的存儲裝置。
然後該過程轉換至一種狀態，其中第一個虛擬的受檢分子對虛擬的靶分子特異相互作用的能力被確定，其中含有虛擬受檢分子的資料庫被開放以分析虛擬靶分子和虛擬受檢分子的相互作用，並進行分析，其中受檢分子可以是一組受檢分子中的一個。確定特異性相互作用是基於維持在計算機系統中的軟體所進行的計算，或通過與一個預先確定的特異相互作用進行比較，後者可存儲在計算機系統的存儲器內，在適當時可被訪問。
然後該過程轉換至一種狀態，其中特異的相互作用在此被檢測到，虛擬的受檢分子被顯示，或被存儲在計算機上的第二個資料庫中。如果合適，在需要時，重複該過程檢測虛擬的靶分子和第二個虛擬的受檢分子，第三個虛擬的受檢分子，等等。
如果確定一個虛擬的受檢分子能特異地與虛擬的靶分子相互作用，所鑑定的虛擬受檢分子從資料庫中移出，並顯示給用戶。這種狀態通知用戶，在被輸入的範圍內顯示名稱或結構的分子可與靶分子特異的相互作用。一旦所鑑定的受檢分子的名稱顯示給用戶，該過程轉換至判定狀態，其中可得出結論是否在資料庫中是否存在更多的虛擬受檢分子或要被檢測。如果在資料庫中不存在更多的分子，該過程終止在結束狀態。但是，如果在資料庫中存在更多的受檢分子，該過程轉換至一種狀態，其中指示器指向資料庫中的下一個受檢分子以便檢測其特異的結合活性。以這種方式，檢測新分子與虛擬的靶分子特異相互作用的能力。
如上所述，這樣的方法可用在包括在本發明權利要求範圍內的多個方面。因此，這些方法可用來鑑定一個原肌生長抑制素功能前區的肽部分，該功能區可與肌生長抑制素特異地相互作用，可減少或抑制肌生長抑制素與其受體相互作用的能力或影響肌生長抑制素引發信號轉導作用的能力。類似地，這些方法可用來鑑定小的有機分子，它們可模擬GDF功能前區的作用，因此可減少或抑制肌生長抑制素或GDF-11的信號轉導作用。這些方法也可用來鑑定可與GDF受體特異相互作用的藥劑，例如，Act RIIA，Act RIIB或其它GDF受體，這樣的藥劑可用作GDF受體激動劑或拮抗劑，它們可在細胞中調節GDF信號轉導作用。另外，這些方法提供了一種手段來鑑定以前未知的原-GDF多肽或GDF受體，例如，通過鑑定特殊多肽的保守結構特徵。
類似TGF-β超家族的其它成員，活性的GDF肽可作為前體多肽表達，它可被剪切成為成熟的、生物學活性的形式。因此，仍然在另一個實施方案中，原-GDF多肽的蛋白水解片段是一個成熟的GDF肽，或一個成熟GDF肽的功能性肽部分，其中如上所述，該功能性肽部分可具有GDF激動劑或拮抗劑的活性。蛋白水解片段可以是一個成熟的C-末端肌生長抑制素肽，它包括原肌生長抑制素多肽的大約胺基酸殘基268至374(見圖1；也見圖2)，或一個成熟的C-末端GDF-11多肽，它包括原-GDF-11多肽的大約胺基酸殘基299至407。全長的成熟肌生長抑制素肽的實例是在SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中列出的胺基酸殘基大約268至375；在SEQ ID NO2，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SEQ IDNO20中列出的胺基酸殘基大約267至374，以及SEQ ID NO27中的胺基酸殘基大約49至157和SEQ ID NO29中的胺基酸殘基大約28至136。全長的成熟GDF-11肽的實例是SEQ ID NO25的胺基酸殘基大約299至407。成熟GDF肽的功能性肽部分的實例是成熟肌生長抑制素或成熟GDF-11的肽部分，與成熟的GDF肽相比它們具有激動劑或拮抗劑活性。優選的，成熟的GDF肽活性具有與其受體特異相互作用的能力。
如在此所公開的，成熟的肌生長抑制素肽(在此一般是指「肌生長抑制素」)可通過與表達在細胞表面上的肌生長抑制素受體的特異相互作用(見實施例7)而誘發肌生長抑制素的信號轉導活性。因此肌生長抑制素的功能性肽部分可通過採用在此描述的一種方法(實施例7)或本領域已知的方法，檢測成熟肌生長抑制素肽的肽部分而獲得，並鑑定能特異與一個肌生長抑制素受體，例如，表達在細胞上的激活素IIA型受體(Act RIIA)或Act RIIB受體相互作用的肌生長抑制素的功能性肽部分(Act RIIA，Cell 65973-982，1991；Act RIIB，Cell 6897-108，1992，二者在此全文引入以供參考)。
肌生長抑制素功能前區可減少或抑制肌生長抑制素信號轉導活性。在一個實施方案中，肌生長抑制素功能前區可與肌生長抑制素特異的相互作用，因此減少或抑制了肌生長抑制素肽與其受體特異相互作用的能力。如在此所公開的，一個前體原肌生長抑制素也缺乏與肌生長抑制素受體特異相互作用的能力，因此可減少或抑制原肌生長抑制素斷裂成為成熟肌生長抑制素的原肌生長抑制素突變體提供了一種減少或抑制肌生長抑制素信號轉導作用的方法。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了一個突變體原-GDF多肽，它含有一個或多個胺基酸突變，這些突變可阻止突變體原-GDF蛋白水解成為活性成熟的GDF肽。
本發明的突變體原-GDF多肽發生的突變，可影響蛋白水解位點如共有的蛋白水解切割識別位點Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)處的斷裂，該位點存在於原-GDF多肽中。因此，突變可以是SEQ ID NO21的一個Arg殘基的突變，這樣以致於突變體原肌生長抑制素，例如，不能剪切成為肌生長抑制素功能前區和成熟的肌生長抑制素肽。但是，突變也可發生在不是蛋白水解剪切位點的位點上，可改變蛋白酶結合原-GDF多肽的能力，以致影響在剪切位點上的蛋白水解作用。本發明的突變體原-GDF多肽，例如，一個突變體原肌生長抑制素或突變體原-GDF-11相對肌生長抑制素或GDF-11具有顯性失活活性，因此可用來減少或抑制肌生長抑制素或GDF-11在細胞中的信號轉導作用。
本發明也提供了一個基本上純化的多核苷酸，如上所述，它編碼一個原肌生長抑制素多肽或一個突變體原肌生長抑制素的肽部分，或一個原-GDF-11多肽或突變體原-GDF-11的肽部分。如在下面更詳細公開的，本發明也提供了可用作調節細胞上肌生長抑制素效應的藥劑的多核苷酸，並進一步提供了一個編碼GDF受體的多核苷酸，或其功能性肽部分。在下面的公開書中也提供了這樣多核苷酸的實例。同樣地，應該認識到下面的公開內容與在此公開的本發明的許多實施方案是相關的。
術語「多核苷酸」在此廣泛用於表示兩個或更多的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的序列，它們通過磷酸二酯鍵聯繫在一起。像這樣，術語「多核苷酸」包括RNA和DNA，可以是一條基因或其一部分，cDNA，合成的多聚脫氧核糖核酸序列，或類似物，可以是單鏈或雙鏈，也可以是DNA/RNA雜交鏈。而且，在此所使用的術語「多核苷酸」包括天然存在的核酸分子，可從細胞中分離，也可以是合成的分子，例如，可通過化學合成或酶學的方法如通過聚合酶鏈式反應(PCR)來製備。在許多實施方案中，本發明的多核苷酸含有核苷類似物或核苷酸類似物，或主鏈鍵而不是磷酸二酯鍵(見上)。
一般來說，包含多核苷酸的核苷酸是天然存在的脫氧核糖核苷酸，如與2』-脫氧核糖連接的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸如與核糖連接的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶。但是，多核苷酸也可含有核苷酸類似物，包括非天然存在的合成核苷酸或修飾的天然核苷酸。這樣的核苷酸類似物在本領域內是為人熟知的，並在市面上可購得，含有這樣的核苷酸類似物的多核苷酸也是一樣(Lin等人，Nucl.Acids Res.225220-5234(1994)；Jellinek等人，Biochemistry3411363-11372(1995)；Pagratis等人，Nature Biotechnol.1568-73(1997)，每一篇文獻在此均引入作為參考文獻)。
連接多核苷酸的核苷酸的共價鍵一般是磷酸二酯鍵。但是，共價鍵也可以是許多其它鍵中的任意一種，包括硫二酯鍵、硫代磷酸鍵、類似肽鍵或任何其它本領域已知可用於連接核苷酸產生合成多核苷酸的鍵(見，例如，Tam等人，Nucl.Acids.Res.22977-986(1994)；Ecker和Crooke，BioTechnology 13351360(1995)，每一篇在此均引入作為參考文獻)。摻入非天然存在的核苷酸類似物或連接核苷酸或類似物的化學鍵，在多核苷酸暴露於含有核酸降解活性的環境中時特別有用，這種環境包括，例如一種組織培養基或在給一個活體給藥時，因為被修飾的多核苷酸不太容易被降解。
由天然存在的核苷酸和磷酸二酯鍵組成的多核苷酸可被化學合成來產生，或採用重組DNA的方法，使用一個合適的多核苷酸作為模板來產生。相對比的是，由核苷酸類似物或不是磷酸二酯鍵的共價鍵組成的多核苷酸一般採用化學合成，儘管如T7聚合酶的酶可以將某種類型的核苷酸類似物摻入到多核苷酸中，因此可用來從一個合適的模板重組產生一個這樣的多核苷酸(Jellinek等人，見前，1995)。
當一種多核苷酸編碼一種肽，例如，原肌生長抑制素的肽部分或一個肽藥劑，編碼的序列一般包含在一個載體中，並可操作性地與合適的調控元件相連接，後者包括，如果需要，一個組織特異性啟動子或增強子。編碼肽可進一步被操作性地與，例如，肽標記如His-6標記或類似物連接，後者便於在靶細胞上鑑定該藥劑的表達。多聚組氨酸標記肽如His-6可採用二價陽離子如鎳離子，鈷離子或類似物來進行檢測。其它的肽標記包括，例如，FLAG抗原表位，它可採用抗FLAG抗體來檢測(見，例如，Hopp等人，BioTechnology 61204(1988)；美國專利No.5,011,912，每一篇均在此引入作為參考文獻)；c-myc抗原表位，它可採用該抗原表位的特異抗體來檢測；生物素，它可採用鏈黴抗生物素或抗生物素蛋白來檢測；和穀胱甘肽S-轉移酶，它可採用穀胱甘肽來檢測。這樣的標記可提供其它的優勢，即它們可便於分離可操作的連接的肽或肽藥劑，例如，在需要獲得一個對應於肌生長抑制素多肽的蛋白水解片段的基本上純化的肽。
如在此所使用的，術語「可操作的連接」或「可操作的結合」的意思是兩個或更多的分子根據相互的位置進行定位，這樣它們可作為一個單一的單位，並可產生一種屬於一個或兩個分子或其聯合體的功能。例如，編碼本發明一種肽的一個多核苷酸序列可操作地與一個調控元件連接，其中調控元件可將其調節效應賦予該多核苷酸，這種方法類似於該調控元件作用於在細胞中與該調控元件相聯繫的一種多核苷酸序列。第一個多核苷酸編碼序列也可操作地與第二個(或更多的)編碼序列連接，這樣嵌合的多肽可從可操作地連接的編碼序列中表達。嵌合的多肽可以是一個融合多肽，其中兩個(或更多的)編碼肽被翻譯成一個單一多肽，即通過一個肽鍵共價結合；或可被翻譯成兩個單獨的多肽，在翻譯中，可操作地的互相連接形成一個穩定的複合體。
一個嵌合多肽一般可表現其肽組分的一些或所有特性。像這樣，如在此所公開的，嵌合多肽在實施本發明的方法中是特別有用的。例如，在一個實施方案中，本發明的一種方法可在細胞中調節肌生長抑制素的信號轉導。因此，當一個嵌合多肽的一個肽組分編碼細胞區室的定位結構域，並且第二個肽組分編碼顯性失活的Smad多肽時，該功能性嵌合多肽可被轉運到由細胞區室定位結構域指定的細胞的區室中，並具有Smad多肽的顯性失活活性，因此可調節細胞中的肌生長抑制素信號轉導作用。
細胞區室化分結構域是為人所熟知的，包括，例如質膜定位結構域，核定位信號，線粒體膜定位信號和內質網定位信號，或類似物(見，例如，Hancock等人，EMBO J.104033-4039，1991；Buss等人，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；美國專利No.5,776,689，每一篇文獻在此均加入作為參考)。這種結構域可用來將一種藥劑靶向至細胞中的一個特殊區室中，或引導該藥劑從細胞中分泌出來。例如，肌生長抑制素受體的激酶結構域如Act RIIB一般與質膜的內表面是相聯繫的。因此，包含顯性失活肌生長抑制素受體激酶結構域的嵌合多肽，例如缺乏激酶活性的顯性失活Act RIIB受體，可進一步包含質膜定位結構域，因此可將顯性失活Act RIIB激酶結構域定位在細胞膜的內表面。
如在此所公開的，原-GDF信號肽具有細胞定位活性。如在此所使用的，術語「細胞定位活性」是指信號肽指引可操作地與之連接的肽轉運至一個或多個特異的細胞內區室中，或引導分子從細胞中分泌出來。像這樣，原-GDF信號肽可特殊地用於指引肽或其它與信號肽可操作連接的藥劑轉運至與具有實質上同一信號肽的天然表達的GDF相同的細胞內區室中，。而且，信號肽，例如一個原肌生長抑制素信號肽包含原肌生長抑制素的大約起始15至30個胺基酸，可引導一個可操作連接的藥劑從細胞中分泌出來，其分泌途徑與含有信號肽的天然存在的原-GDF分泌途徑相同。因此，實施本發明的一種方法的特別有用的藥劑包括一個GDF功能前區，或其與GDF信號肽可操作連接的功能性肽部分，優選原肌生長抑制素或原-GDF-11信號肽。
本發明的一種多核苷酸，包括用於實施本發明方法中的一種多核苷酸，可直接與一種靶細胞接觸。例如，用作反義分子的寡核苷酸，核酶，或三聯藥劑(triplexing agent)可直接與一種靶細胞接觸，因此進入細胞並影響它們的功能。一個多核苷酸藥劑也可特異地與一種多肽相互作用，例如，肌生長抑制素受體(或肌生長抑制素)，因此可改變肌生長抑制素與受體特異性相互作用的能力。這樣的多核苷酸，以及製備和鑑定這種多核苷酸的方法在此被公開或在本領域中是已知的(見，例如，O□Connell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 935883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science 249505-510，1990；Gold等人，Ann.Rev.Biochem.64763-797，1995；每一篇在此均引入作為參考文獻)。
本發明的多核苷酸，可編碼原-GDF多肽如原肌生長抑制素的肽部分，或編碼突變體原肌生長抑制素多肽，或編碼GDF受體或其功能性肽部分，或是可用在實施本發明方法中的多核苷酸藥劑，可被包含在一個載體中，這樣可便於多核苷酸的操作，包括將多核苷酸引入一個靶細胞中。載體可以是一個克隆載體，可用於保留多核苷酸，或可以是一個表達載體，它除了含有多核苷酸以外，還含有用於表達多核苷酸的調控元件，當多核苷酸編碼一種肽時，用以在一種特殊的細胞中表達所編碼的肽。一種表達載體可以包含表達元件，例如這些元件是，維持編碼的多核苷酸的轉錄所必須的，或在被克隆進載體前，調控元件可操作地與多核苷酸連接。
一個表達載體(或多核苷酸)一般含有或編碼一個啟動子序列，它能提供組成型，或如果需要，誘導性或組織特異性或發育期特異性的編碼多核苷酸的表達，一個聚腺苷酸(poly-A)識別序列，以及一個核糖體識別位點或內部核糖體進入位點，或其它的調控元件如一個增強子，它可以是組織特異性的。如果需要，載體也可含有原核或真核宿主系統複製所需的元件，或兩者都有。這樣的載體，包括質粒載體和病毒載體如細菌噬菌體，杆狀病毒，逆轉錄病毒，慢病毒，腺病毒，痘苗病毒，塞姆利基森林病毒和腺伴隨病毒載體，都是已知的，並可從商業渠道中獲得(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)或由本領域的專業技術人員來構建(見，例如，Meth.Enzymol.185卷，Goeddel，主編(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther.151-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等人，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每一篇在此均引入作為參考文獻)。
四環素(tet)誘導型啟動子可特別用於驅動本發明的多核苷酸的表達，例如，一個編碼肌生長抑制素的顯性失活形式的多核苷酸，其中蛋白酶解加工位點已經突變，或編碼肌生長抑制素功能前區的多核苷酸，它可與一個成熟的肌生長抑制素肽形成複合體，或編碼GDF受體的顯性失活形式的多核苷酸。在將四環素，或四環素類似物給與一個含有與tet誘導型啟動子可操作連接的多核苷酸的受試者的過程中，可誘導編碼肽的表達，由此肽可以影響其活性，例如，由此一種肽藥劑可減少或抑制肌生長抑制素的信號轉導作用。可採用這樣一種方法，例如，來誘導成體生物體的肌肉過度生長。
多核苷酸也可操作地與組織特異性調控元件相連接，例如，一個肌肉細胞特異性調控元件，這樣編碼肽的表達被限制在個體的肌肉細胞中，或培養細胞中，例如器官培養的混合細胞群體中的肌肉細胞中。肌肉細胞特異調控元件包括，例如，肌肉肌酸肌酶啟動子(Sternberg等人，Mol.Cell.Biol.82896-2909，1988，在此引入作為參考文獻)和肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子(Donoghue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA885847-5851，1991，在此引入作為參考文獻)，在本領域均是為人熟知的。
病毒表達載體可特別用來將多核苷酸引入細胞中，特別是受試者的細胞中。病毒載體提供了這樣的優勢，即它們可以以相對高的效率感染宿主細胞，並可感染特殊的細胞類型。例如，編碼原肌生長抑制素功能前區或其功能性肽部分的多核苷酸可被克隆進一個杆狀病毒載體中，然後它被用於感染一個昆蟲宿主細胞，因此提供了一種產生大量編碼功能前區的方法。病毒載體也可來自一種感染目標生物體細胞的病毒，該生物體，如脊椎動物如哺乳動物、鳥類或魚類宿主細胞。病毒載體可特別地用於將一個用在實施本發明方法中的多核苷酸引入一個靶細胞中。已經開發出了用於特殊宿主系統的病毒載體，特別是哺乳動物系統，包括，例如逆轉錄病毒載體，其它的慢病毒如那些以人免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎的病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，皰疹病毒載體，痘苗病毒載體，和類似載體(見Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等人，Nature 39225-30Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，NewEngl.J.Med.3341185-1187(1996)，每一篇文獻在此均引入作為參考文獻)。
當逆轉錄病毒，例如，用於基因轉移時，理論上是可以開發出複製逆轉錄病毒，因為在用來產生逆轉錄病毒載體的包裝細胞系中重組逆轉錄載體和病毒基因序列。包裝細胞系，其中該包裝細胞系中已經減少或消除了由重組產生的複製病毒，可用來將複製逆轉錄病毒產生的可能性降至最低。所有用來感染細胞的逆轉錄病毒載體上清液均被採用標準的測定方法如PCR和逆轉錄酶測定來篩選複製病毒。逆轉錄病毒載體可允許異源基因整合進入宿主細胞基因組中，這可允許基因在細胞分裂後傳遞給子細胞。
包含在一個載體中的一種多核苷酸，可通過任何本領域已知的各種方法引入到細胞中(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；Ausubel等人，現代分子生物學方法(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995年增刊)，每一篇文獻在此均加入作為參考)。這樣的方法包括，例如，轉染、脂質轉染法、微注射、電穿孔和用病毒載體，感染；可能包括使用脂質體、微乳劑或類似物，它們可促進多核苷酸進入細胞中，並可保護多核苷酸在進入細胞前免遭降解。特殊方法的選擇將依賴於，例如多核苷酸要引入的細胞，以及細胞是否從培養物中分離，或存在於培養的組織或器官或原位中。
通過用病毒載體感染將多核苷酸引入細胞中是特別有益處的，因為它可有效的將核酸分子在離體或體內引入細胞內(見，例如，美國專利No.5,399,346，在此引入作為參考)。而且，病毒是非常專一性的，被選為載體是基於它在一種或幾種特殊類型細胞中感染和增殖的能力。因此，它們的天然特異性可用來將包含在載體中的核酸分子靶向至特殊類型的細胞中。像這樣，基於HIV的載體可用來感染T細胞，基於腺病毒的載體可用來，例如，感染呼吸上皮細胞，基於皰疹病毒的載體可用來感染神經元細胞，和類似情況。其它載體，如腺伴隨病毒具有更大的宿主細胞範圍，因此可用來感染多種細胞類型，儘管病毒或非病毒載體也可用特殊的受體或配體修飾通過受體介導的形式改變靶向的特異性。
本發明也提供了一些抗體，它們可特異地與原肌生長抑制素多肽或突變體原肌生長抑制素多肽的肽部分結合。本發明中特別有用的抗體包括可特異與肌生長抑制素功能前區，或其功能性肽部分結合的抗體，和可與原肌生長抑制素多肽結合併減少或抑制原肌生長抑制素蛋白水解斷裂為成熟肌生長抑制素肽的抗體。另外，本發明的一種抗體可以是與GDF受體特異結合的抗體，或其功能性肽部分，如下面所描述的。製備和分離本發明的抗體的方法在下面更詳細的進行描述，其公開內容在此引入作為參考文獻。
肌生長抑制素對於骨胳肌質量的正常調節是很重要的。相對於野生型的小鼠，敲除肌生長抑制素的小鼠，缺乏肌生長抑制素，因為增生和肥大的聯合作用，其肌肉的量是前者的兩至三倍。如在此所公開的，敲除肌生長抑制素的小鼠的脂肪聚積大幅度減少，至少部分是因為全身骨胳肌組織合成代謝增加。相反的是，在裸鼠中肌生長抑制素的過度表達誘導了消耗症候群，類似於在人類慢性疾病如癌症或AIDS的患者中所觀察到的惡病質狀態。如在此進一步公開的，肌生長抑制素活性可通過一種具有Smad信號轉導通路特性的信號轉導作用進行介導。因此，本發明提供了調節細胞肌生長抑制素效應的方法，其方法是將細胞與一種可影響細胞內肌生長抑制素信號轉導的藥劑接觸。
如在此所使用的，術語「調節」，當用來指肌生長抑制素在細胞上的作用時，其意思是細胞中的肌生長抑制素信號轉導作用是增加的或減少或抑制的。術語「增加」和「減少或抑制」用來指相對於肌生長抑制素信號轉導活性的基線水平，它是在缺乏肌生長抑制素時的信號轉導通路的水平，或在存在肌生長抑制素時是正常細胞的活性水平。例如，肌生長抑制素信號轉導通路可在與肌生長抑制素接觸的肌肉細胞中表現特殊的活性，在肌肉細胞與肌生長抑制素功能前區的進一步的接觸中，肌生長抑制素信號轉導活性被減少或抑制。像這樣，肌生長抑制素功能前區是一種可用來減少或抑制肌生長抑制素信號轉導作用的藥劑。類似地，另一個GDF家族成員的功能前區如GDF-11功能前區，或另一個TGF-β家族成員如激活素功能前區，MIS功能前區，或類似物，可用來降低肌生長抑制素的信號轉導作用。術語「減少或抑制」在此一起使用，是因為認識到，在一些情況下，肌生長抑制素信號轉導作用的水平可降低至用一種特殊檢測方法可檢測到的水平之下。像這樣，採用這種測定方法來確定是否保持低水平的肌生長抑制素信號轉導作用，或信號轉導作用是否完全被抑制是不可能的。
如在此所使用的，術語「肌生長抑制素信號轉導作用」是指一系列事件，一般是發生在細胞中的一系列蛋白-蛋白的相互作用，其原因是肌生長抑制素與表達在細胞表面上的肌生長抑制素受體之間的特異相互作用。像這樣，肌生長抑制素信號轉導作用可被檢測，例如，可通過檢測肌生長抑制素與細胞上其受體的特異相互作用，通過檢測在細胞中肌生長抑制素信號轉導作用中涉及的一個或多個多肽的磷酸化，通過檢測一個或多個由於肌生長抑制素信號轉導所特定誘導的基因的表達，或通過檢測對肌生長抑制素信號轉導作用反應而發生的表型改變(見實施例)。如在此所公開的，一種用在本發明方法中的藥劑可作為刺激肌生長抑制素信號轉導的激動劑或作為減少或抑制肌生長抑制素信號轉導的拮抗劑。
本發明的方法在此一般以關於肌生長抑制素為例。但應該認識到，本發明的方法可更廣泛地包括通過將細胞與影響細胞內由GDF產生的信號轉導的藥劑接觸，調節其它GDF肽，例如GDF-11，對細胞的作用。實行本發明所有範圍的方法因為本公開內容而很容易地理解，包括例如，識別GDF受體的方法，鑑定藥劑的方法，該藥劑調節由於GDF與其受體特異性相互作用而產生的信號轉導，和類似方法。
肌生長抑制素信號轉導通路在此的實例是Smad通路，它是在肌生長抑制素特異地與一個激活素II型受體的細胞外結構域作用過程中啟動的，通過細胞內多肽的相互作用而進行傳導，多肽包括細胞中的Smad蛋白。一般來說，肌生長抑制素信號轉導與特殊的細胞內多肽如Smad多肽的磷酸化或去磷酸化有關。因此，在存在肌生長抑制素時，細胞中的肌生長抑制素信號轉導可通過與缺少肌生長抑制素時多肽磷酸化水平比較，檢測一個或多個Smad多肽磷酸化增加的水平來進行檢測。本發明的一種方法提供了增加或減少肌生長抑制素信號轉導作用0的手段，因此涉及肌生長抑制素信號轉導通路中的Smad多肽的磷酸化水平將分別增加至正常的水平之上或降低至期望的水平之下。
本發明的方法的實施，例如，可通過在合適的條件下，將靶細胞和一種影響細胞肌生長抑制素信號轉導的藥劑相接觸。合適的條件可通過將細胞置於合適的培養基中，該細胞可以是一種分離的細胞或是一種組織或器官的成分，或與生物體中的原位細胞接觸。例如，含有細胞的培養基可與影響肌生長抑制素與表達在細胞上的肌生長抑制素受體特異相互作用的能力的一種藥劑接觸，或者與影響細胞內肌生長抑制素信號轉導通路的一種藥劑接觸。一般來說，細胞可以是受試者一種組織或器官的成分，在這種情況下，接觸細胞可包括將該藥劑給與受試者。但是，細胞也可在培養液中處理，然後保存在培養液中，給與一個受試者，或用來產生轉基因的非人動物。
用在本發明方法中的一種藥劑可以是任何類型的分子，例如，一種多核苷酸，一種肽，一種肽模擬體(peptidominetic)，類肽(peptoids)如vinylogous類肽，一種小的有機分子，或類似物，可以以任何方式作用影響肌生長抑制素的信號轉導。該藥劑可通過結合肌生長抑制素或肌生長抑制素受體如激活素受體在細胞外作用，因此可改變肌生長抑制素與其受體特異相互作用的能力，或可在細胞內作用改變細胞內的肌生長抑制素信號轉導。另外，該藥劑可以是一種激動劑，可模仿或增強細胞上肌生長抑制素的作用，例如，肌生長抑制素與其受體特異相互作用的能力，因此增加了細胞中的肌生長抑制素信號轉導作用；或可以是一個拮抗劑，它可減少或抑制肌生長抑制素在細胞上的作用，因此減少或抑制細胞中的肌生長抑制素的信號轉導。
如在此所使用的，術語「特異的相互作用」或「特異的結合」或類似的情況意味著兩種分子形成一種複合體，在生理環境下該複合體是相對穩定的。在此所使用的術語涉及多種相互作用，包括，例如，肌生長抑制素與肌生長抑制素受體的相互作用，肌生長抑制素信號轉導通路細胞內組分的相互作用，抗體與其抗原的相互作用，以及肌生長抑制素功能前區與肌生長抑制素的相互作用。一種特異的相互作用的特徵是，解離常數至少為大約1×10-6M，一般至少為大約1×10-7M，通常至少大約1×10-8M，特殊的是至少大約1×10-9M或1×10-10M或更大。一般一種特異的相互作用在生理條件下是穩定的，包括，例如，在活個體如人類或其它脊椎動物或無脊椎動物中發生的條件，以及發生在細胞培養中的條件，細胞培養如用來保留哺乳動物細胞或來自另一個脊椎動物機體或無脊椎動物機體的細胞。另外，一種特異的相互作用如肌生長抑制素功能前區和肌生長抑制素的細胞外相互作用一般在一定條件下是穩定的，例如那些用來水產養殖具有商業價值的海生生物的條件。確定兩個目的分子是否特異的相互作用的方法是為人所熟知的，包括，例如平衡透析，表面胞質團共振(surface plasmon resonance)和類似方法。
一種可改變肌生長抑制素與其受體特異相互作用的藥劑可通過，例如，與肌生長抑制素的結合來發揮作用，這樣肌生長抑制素不能特異地與其細胞受體相互作用，通過與肌生長抑制素競爭結合其受體，或通過繞過肌生長抑制素與其受體的特異相互作用的需求以便誘發肌生長抑制素的信號轉導。截短型肌生長抑制素受體如肌生長抑制素受體的一種可溶性細胞外結構域是可與肌生長抑制素結合的藥劑一個實施方案，因此可隱蔽肌生長抑制素，並減少或抑制其與細胞表面肌生長抑制素受體特異相互作用的能力。肌生長抑制素功能前區或其功能性肽部分是可結合肌生長抑制素的藥劑的另一個實施方案，因此可減少或抑制肌生長抑制素與細胞表面肌生長抑制素受體特異的相互作用的能力。這樣的肌生長抑制素拮抗劑可用於本發明方法的實踐中，特別是減少或抑制細胞中的肌生長抑制素信號轉導作用。
濾泡素抑制素(follistatin)是可與肌生長抑制素結合的藥劑的另一個實施方案，因此可減少或抑制肌生長抑制素與其受體特異相互作用的能力。濾泡素抑制素可結合併抑制多種TGF-β家族成員的活性，包括肌生長抑制素(GDF-8；美國專利No.6,004,937)和GDF-11(Gamer等人，Devel.Biol.208222-232，1999)和，因此可用來實施如所公開的方法。儘管以前已經有人描述使用濾泡素抑制素來調節肌生長抑制素的作用(美國專利No.6,004,937)，但在本公開書之前並不了解濾泡素抑制素可減少或抑制肌生長抑制素與肌生長抑制素受體如Act RIIB的特異相互作用的能力。
一種可用在本發明的方法中的藥劑也可與一種細胞肌生長抑制素受體相互作用，因此可與肌生長抑制素競爭受體。這樣的藥劑可以是，例如，一種可特異結合細胞表面肌生長抑制素受體的一種抗體，包括肌生長抑制素結合區的所有或一部分，因此可阻止肌生長抑制素與受體的特異相互作用。這樣一種抗肌生長抑制素受體抗體的選擇是以其特異結合受體而不激活肌生長抑制素信號轉導作用的能力，因此它可用作減少或抑制肌生長抑制素信號轉導作用的一種肌生長抑制素拮抗劑；或選擇是以其特異結合受體並激活肌生長抑制素信號轉導作用的能力，因此它可作為肌生長抑制素的一種激動劑。抗體可以採用一種肌生長抑制素受體，或受體的細胞外結構域作為免疫原來產生，或是一種抗獨特型抗體，可針對抗肌生長抑制素抗體，模擬肌生長抑制素。抗GDF受體抗體在下面更為詳細的討論。
在本發明方法中使用的一種藥劑也可以是一種減少或抑制原-GDF多肽蛋白水解剪切成為一個活性的成熟GDF肽的藥劑，因此可減少或抑制GDF信號轉導作用。這樣一種藥劑可以是一種蛋白酶抑制劑，特別是一種能抑制可識別並剪切Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白水解識別位點的蛋白酶活性的抑制劑。當原-GDF是原肌生長抑制素，可減少或抑制蛋白酶與肌生長抑制素中Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ IDNO21)蛋白水解斷裂位點特異結合的抗肌生長抑制素抗體也可用來減少或抑制原肌生長抑制素的蛋白水解作用，因此可降低所產生的成熟肌生長抑制素的量。這樣一種抗體可結合蛋白水解剪切位點，或可結合一些原-GDF多肽上的其它位點，這樣蛋白酶的結合和剪切被減少或抑制。
另外，在本發明方法中使用的一種藥劑可以是一種突變體肌生長抑制素受體，例如，它對肌生長抑制素結合的反應缺乏肌生長抑制素信號轉導活性，或具有組成型肌生長抑制素信號轉導活性。例如，突變體肌生長抑制素受體在其激酶結構域具有一個點突變，即缺失，或類似情況，這樣該受體缺乏激酶活性。這樣一種顯性失活突變體肌生長抑制素受體缺乏傳遞肌生長抑制素信號轉導的能力，儘管它可具有與肌生長抑制素特異結合這樣的事實。
在本發明方法中使用的一種藥劑也可調節涉及肌生長抑制素信號轉導通路中的一種細胞內多肽的水平或活性。如在此所公開的，肌生長抑制素對肌肉生長的調節涉及一種信號轉導通路的成分，該通路可被激活素II型受體激活(見實施例7和9；也見實施例14)。肌生長抑制素可特異的與表達在培養COS細胞上(實施例7)的激活素II型受體(ActRIIB)相互作用。低親和性結合表明肌生長抑制素在體內與Act RIIB的結合可能涉及其它因子，類似於TGF-β，後者當I型受體也存在時，它與II型受體具有更高的親和性(Attisano等人，Cell 75671-680，1993)，或類似其它的系統，需要其它的分子來將配體遞呈給信號受體(Massague，見前，1998；Wang等人，Cell 67795-805，1991)。
肌生長抑制素與Act RIIB的特異相互作用表明肌生長抑制素信號轉導涉及Smad信號轉導通路的組分。因此，Smad信號轉導通路提供了在細胞上調節肌生長抑制素作用的靶標，影響Smad通路的藥劑可用來調節細胞中的肌生長抑制素信號轉導。
用來調節GDF信號轉導的細胞內多肽組分的水平或活性的藥劑包括激動劑，它可增加信號轉導活性，和拮抗劑，它可減少或抑制信號轉導活性。對於肌生長抑制素，例如，可增加肌生長抑制素信號轉導活性的藥劑的實例是磷酸酶抑制劑，它可減少或抑制Smad多肽的去磷酸化，因此可延長Smad的信號轉導活性。顯性失活Smad 6或Smad 7多肽，它能消除Smad 6和Smad 7對肌生長抑制素信號轉導的抑制效應，是可通過增加Smad信號轉導而增加肌生長抑制素信號轉導活性的藥劑的另外的實例。
可減少或抑制肌生長抑制素信號轉導活性的拮抗劑的實例是顯性失活Smad多肽如顯性失活Smad 2，Smad 3或Smad 4，其中C末端磷酸化位點已經突變。抑制性的Smad多肽如Smad 6和Smad 7，可抑制Smad 2和Smad 3的激活；以及c-ski多肽，可結合Smad多肽並抑制信號轉導作用，是用來通過減少Smad信號轉導作用來減少或抑制肌生長抑制素信號轉導作用的拮抗劑的另外的實例。
當在細胞內作用的藥劑是一種肽，它可與細胞直接接觸，或一種編碼該肽(或多肽)的多核苷酸可引入細胞中，該肽可在細胞中表達。可認識到的是一些用在本發明方法中的肽相對是較大的，因此可能不容易穿過細胞膜。但是，已知多種方法可將肽引入細胞內。選擇將這樣的肽引入細胞中的方法部分取決於該多肽要進入的靶細胞的特性。例如，當靶細胞，或包括靶細胞的幾種細胞類型，表達一種受體，該受體在結合一種特殊配體過程中被內化至細胞中時，肽藥劑可操作地與配體相連接。一旦與受體的結合，肽可通過受體介導的內吞作用轉運至細胞中。肽藥劑也可被封裝在一個脂質體或配製在一種液體複合體中，它可便於肽進入細胞中，可進一步被修飾以如上所述表達一種受體(或配體)。肽藥劑也可通過肽的改造而被引入至細胞中，這種改造使其含有蛋白轉導結構域如人免疫缺陷型病毒TAT蛋白轉導結構域，這樣便於肽轉運進入細胞中(見Schwarze等人，Science2851569-1572(1999)，在此引入作為參考；也見Derossi等人，J.Biol.Chem.27118188(1996))。
靶細胞也可與編碼肽藥劑的多核苷酸接觸，後者可在細胞中表達。表達的肽藥劑可以是一個突變體GDF受體或其肽部分。突變體GDF受體的實例包括肌生長抑制素受體的激酶缺陷形式，如一種顯性失活Act RIIA或Act RIIB，它們可以但不需要具有與配體(如，肌生長抑制素)特異結合的能力；一種截短型肌生長抑制素或其它GDF受體，如一種肌生長抑制素受體的可溶形式，可與肌生長抑制素結合，由此可阻止肌生長抑制素與細胞肌生長抑制素受體的特異相互作用；Smad多肽的顯性失活形式如顯性失活Smad 3，其中C-末端磷酸化位點已經突變(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9410669-10674，1997)；Smad 7多肽，可抑制Smad 2和Smad 3的激活作用(Heldin等人，Nature390465-471，1997)；或c-ski多肽，可結合Smad多肽並抑制Smad的信號轉導作用(Sutrave等人，Genes Devel.41462-1472，1990)。
c-ski肽藥劑在細胞中的表達可特別用來調節肌生長抑制素的信號轉導。缺乏c-ski的小鼠顯示骨胳肌群嚴重減少(Berk等人，Genes Devel.112029-2039，1997)，而在肌肉中過度表達c-ski的轉基因小鼠顯示大量的肌肉肥大(Sutrave等人，見前，1990)。c-ski作用並阻斷一些Smad蛋白的活性，包括Smad 2，Smad 3和Smad 4，它們可介導TGF-β和激活素II型受體的信號(Luo等人，Genes Devel.132196-1106，1999；Stroschein等人，Science 286771-774，1999；Sun等人，Mol.Cell4499-509，1999a；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 96112442-12447，1999b；Akiyoshi等人，J.Biol.Chem.27435269，1999)。因此根據本發明的公開書，肌生長抑制素活性可通過Act RIIB的結合而被介導，將要認識到使用Smad通路的肌生長抑制素或任何GDF的活性，可通過在靶細胞中增加或降低c-ski的表達而被調節。
用於本發明方法中的藥劑可以是一種多核苷酸，它可與上述的細胞接觸或被引入其中。一般來說，但不是必須的，該多核苷酸被引入細胞中，在此它可直接，或在轉錄或翻譯後，或兩者都存在的情況下影響其功能。例如，如上所述，多核苷酸可編碼一種肽藥劑，後者在細胞中表達，可調節肌生長抑制素活性。這樣一種表達的肽，例如，可以是一個突變體原肌生長抑制素多肽，它不能被剪切形成活性的肌生長抑制素；或可以是一個突變體肌生長抑制素受體，例如，一個截短型肌生長抑制素受體細胞外結構域；一個可操作地與膜錨著結構域連接的肌生長抑制素受體細胞外結構域；或一個缺乏蛋白激酶活性的突變體肌生長抑制素受體。將一種多核苷酸引入細胞的方法的實例見下或在本領域中已知。
用在本發明方法中的一種多核苷酸藥劑也可以是，或編碼，一個反義分子，一個核酶或一個三聯藥劑。例如，該多核苷酸可以是(或編碼)一個反義核苷酸序列，如一個反義c-ski核苷酸序列，它可作為一個激動劑增加細胞中肌生長抑制素的信號轉導；或一個反義Smad核苷酸序列，根據特殊的Smad反義核苷酸序列，它可作為一個激動劑增加肌生長抑制素的信號轉導或作為一個拮抗劑減少或抑制肌生長抑制素信號轉導。這樣的多核苷酸可直接與靶細胞接觸，一旦被細胞攝取，可影響它們的反義、核酶或三聯活性；或可被一個引入細胞中的多核苷酸編碼，因此一旦表達多核苷酸即可以產生，例如，一個反義RNA分子或核酶，其可以影響它的活性。
一種反義多核苷酸，核酶或三聯藥劑與靶序列互補，後者可以是一個DNA或RNA序列，例如，信使RNA，可以是一個編碼序列，一個包含內含子-外顯子連接的核苷酸序列，一個調控序列如一個SD序列(Shine-Delgrno序列)，或類似物。互補的程度為多核苷酸，例如，一個反義多核苷酸可與細胞內的靶序列特異性相互作用。根據反義或其它多核苷酸的總長度，對於靶序列一個或幾個錯配是可被耐受的，不丟失其靶序列多核苷酸的特異性。因此，如果有錯配的話，在一個由，例如20個核苷酸組成的反義分子中能耐受的錯配很少但是幾個錯配將不影響反義分子的雜交效率，該反義分子，例如，可與編碼一個細胞多肽的靶mRNA的全長互補。可耐受的錯配數目是可被估計的，例如，採用已知的公式確定雜交動力學(見Sambrook等人，見前，1989)或採用如在此所公開的方法或本領域已知的方法來經驗性的確定，特別是確定細胞中反義多核苷酸，核酶或三聯藥劑的存在可降低靶序列的水平或細胞中靶序列編碼的多肽的表達。
用作反義分子，核酶或三聯藥劑的多核苷酸，可抑制翻譯或剪切核酸分子，因此可在細胞中調節肌生長抑制素的信號轉導。一種反義分子，例如，可與一個mRNA結合形成一個不能在細胞中翻譯的雙鏈分子。優選至少含有大約15至25個核苷酸的反義寡核苷酸，因為它們可很容易地被合成，並可特異地與靶序列雜交，儘管從引入靶細胞的多核苷酸也可表達更長的反義分子。用作反義分子的特異核苷酸序列可採用已知的方法來鑑定，例如，基因步移法(見，例如，Seimiya等人，J.Biol.Chem.2724361-4636(1997)，在此引入作為參考文獻)。當反義分子直接與靶細胞接觸，它可操作地與化學活性基團如鐵聯EDTA相連接，這樣可在雜交位點上剪切靶RNA。作為比較，一個三聯藥劑可使轉錄停止(Maher等人，Antisense Res.Devel.1227(1991)；Helene，Anticancer Drug Design 6569(1991))。因此，三聯藥劑可被設計成，例如可識別Smad基因調控元件的序列，因此可降低或抑制細胞中Smad多肽的表達，從而可調節靶細胞中肌生長抑制素的信號轉導。
本發明也提供了一種方法，它可鑑定能改變GDF如肌生長抑制素在細胞中作用的藥劑，特別是可改變GDF與其細胞受體特異相互作用能力的藥劑。這樣的藥劑可通過增加或降低GDF與其受體特異相互作用的能力來起作用，因此可分別用於增加或降低GDF信號轉導作用。在此本發明的一種篩選方法的實例是採用一種肌生長抑制素受體，例如，一種激活素II型受體如Act RIIA或Act RIIB。
實施本發明的一種篩選方法可，例如，通過在合適的條件下與肌生長抑制素，或其功能性肽部分，一種肌生長抑制素受體如Act RIIA或Act RIIB，和要檢測的藥劑接觸來進行。肌生長抑制素，受體和藥劑可以以任何所需要的順序接觸。像這樣，篩選的方法可用來鑑定競爭性或非競爭性抑制肌生長抑制素與受體結合的藥劑，可介導或增強肌生長抑制素與受體結合的藥劑，可誘導特異結合的肌生長抑制素從受體上解離下來的藥劑，和影響肌生長抑制素誘導信號轉導能力的藥劑，這類藥劑具有激動劑或拮抗劑活性。進行適當的反應控制以證實的的作用是對肌生長抑制素或其它GDF受體特異的。
實施本發明篩選方法的合適條件可以是任何可允許肌生長抑制素特異與其受體相互作用的條件，包括在此公開的方法(見實施例7和9)或本領域已知的方法。因此，實施篩選測定的合適條件可以是，例如，採用基本上純化的肌生長抑制素受體的體外條件；細胞培養條件，使用正常表達肌生長抑制素受體的細胞，例如一種脂肪細胞或一種肌肉細胞，或一種已經被基因工程修飾以在其表面表達功能性肌生長抑制素受體的細胞；或在象生物體內發生的原位條件下。
本發明的一種篩選方法也可採用如上所述的製作分子模型的方法來實施。採用製作分子模型的方法提供了一種便利，經濟有效的方法來在大量的群體如一個潛在藥劑的組合文庫中識別那些藥劑，這些潛在藥劑最有可能特異的與GDF受體相互作用，因此降低了採用生物測定方法需要篩選的潛在藥劑數量。採用製作分子模型的方法鑑定可與GDF受體如Act RIIB特異相互作用的藥劑過程中，採用在此公開的方法檢測所選擇的藥劑調節GDF如細胞上的肌生長抑制素的作用的能力。
採用在此公開的方法(見實施例7和9)或本領域已知的方法檢測待側藥劑調節肌生長抑制素作用的能力。在此廣泛使用的術語「待測藥劑」或「待測分子」是指被檢測以尋找具有本發明方法中的激動劑或拮抗劑活性任何藥劑。儘管該方法一般用作篩選測定法以鑑定以前未知的分子，這些分子如在此所述可作為激動劑或拮抗劑藥劑，該方法也可用來證實事實上已知具有特殊活性的藥劑具有這樣的活性，例如使藥劑活性標準化。
本發明的方法的實施可以，例如通過將肌生長抑制素與一種細胞接觸，該細胞已經被基因工程修飾以表達Act RIIB受體，並通過檢測參與肌生長抑制素信號轉導通路中Smad多肽磷酸化來確定藥劑的作用，例如一種顯性失活Act RIIB的作用。如果需要，該細胞可進一步被基因工程修飾以包含一種報導核苷酸序列，其表達依賴於肌生長抑制素信號轉導通路，例如，依賴於Smad通路的激活，待測藥劑的作用可通過比較存在和不存在該藥劑，肌生長抑制素或兩者的情況下報導核苷酸序列的表達來確定。檢測報導核苷酸序列的表達可以，例如通過檢測該報導核苷酸序列的RNA轉錄物，或通過檢測該報導核苷酸序列編碼的多肽來進行。一種多肽報導分子可以是，例如，一種β-內醯胺酶，氯黴素乙醯基轉移酶，腺苷脫氨酶，氨基糖甙磷酸轉移酶，二氫葉酸還原酶，潮黴素-B磷酸轉移酶，胸苷激酶，β-半乳糖苷酶，螢光素酶或黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶多肽或類似物，其檢測可以通過，例如檢測放射活性，發光，化學發光，螢光，酶活性，或由於報導多肽引起的特異結合來進行。
本發明的一種篩選方法可提供這樣的優勢，即它可適應高通量分析，因此可用於篩選待測藥劑的組合文庫以鑑定那些能調節肌生長抑制素對細胞作用的藥劑，包括那些可改變肌生長抑制素與肌生長抑制素受體的特異相互作用的藥劑。製備能檢測所需活性的分子組合文庫的方法在本領域是為人熟知的，並包括，例如，製備噬菌體展示肽庫的方法，該肽可以是限制性的肽(見，例如，美國專利No.5,622,699；美國專利No.5,206,347；Seott和Smith，Scienc249386-390，1992；Markland等人，Gene 10913-19，1991；每一篇文獻在此均引入作為參考文獻)；一個肽文庫(美國專利No.5,264,563，在此引入作為參考文獻e)；一個肽模擬文庫(Blondelle等人，Trends Anal.Chem.1483-92，1995)；一個核酸文庫(O□Connell等人，見前，1996；Tuerk和Gold，見前，1990；Gold等人，見前，1995；每一篇在此都引入作為參考文獻)；一個寡糖文庫(York等人，Carb.Res.，28599-128，1996；Liang等人，Science，2741520-1522，1996；Ding等人，Adv.Expt.Med.Biol.，376261-269，1995；每一篇在此都引入作為參考文獻)；一個脂蛋白文庫(de Kruif等人，FEBS Lett.399232-236，1996，在此引入作為參考文獻)；一個糖蛋白或糖脂文庫(Karaoglu等人，J.Cell.Biol.，130567-577，1995，在此引入作為參考文獻)；或一個含有，例如藥劑或其它藥劑的化學文庫(Gordon等人，J.Med.Chem.371385-1401，1994；Ecker和Crooke，Bio/Technology，13351-360，1995；每一篇在此都引入作為參考文獻)。多核苷酸可特別用作能調節肌生長抑制素與其受體特異相互作用的藥劑，因為核酸分子具有細胞靶位的結合特異性，該靶位包括天然存在的細胞多肽，並且因為具有這樣特異性的合成分子可很容易的被製備和被鑑定(見，例如，美國專利No.5,750,342，在此引入作為參考文獻)。
考慮到本公開書，將要認識到多種動物模型系統可用作研究工具以鑑定用於實施本發明方法的藥劑。例如，轉基因小鼠或其它實驗動物可採用在此公開的多種肌生長抑制素抑制劑構建物來製備，轉基因非人生物體可直接被檢測以確定由生物體中一種特殊藥劑不同水平的表達所產生的作用。另外，轉基因生物體，例如，一種轉基因小鼠，可與其它小鼠，例如，與ob/ob，db/db，或野灰色的致死黃色突變體小鼠雜交，以確定用於治療或防止如肥胖症、II型糖尿病或類似的疾病的一種肌生長抑制素抑制劑表達的最佳水平。像這樣，本發明提供了轉基因的非人生物體，特別是含有編碼肌生長抑制素功能前區的多核苷酸，或編碼突變體原肌生長抑制素多肽的一種多核苷酸的轉基因生物體，該生長抑制素功能前區包含肌生長抑制素信號肽，是一種前肽(見實施例)而且，本發明還提供了表達高水平濾泡素抑制素(follistatin)或表達顯性失活的Act IIB受體(見實施例)的轉基因非人生物體。這些生物體顯示肌肉質量的明顯增加，類似於在肌生長抑制素敲除小鼠中所看到的結果(見例如，美國專利號No.5,994,618，在此引入以供參考)。如在此所討論的，這種動物模型對識別用於因治療目的和農業應用的增加肌肉生長的製劑是重要的。產生轉基因非人類動物的方法是本領域已知的(見例如美國專利號No.6,140,552；5,998,698；6,218,596，其在此全部引入以供參考)。
本發明的肌生長抑制素多核苷酸來自任何生物體，包括小鼠、大鼠、乳牛、豬、人類、雞、羊、火雞、有鰭的水族、其它水生生物和其它物種。這些多核苷酸可以用於製備此處描述的轉基因動物。可以製備轉基因(並且從中獲得肌生長抑制素多核苷酸)的水生生物的實例包括那些屬於魚塘魚類的生物，如鮭魚、鮭魚、紅點鮭、香魚、鯉魚、鯽魚、金魚、昏白魚、銀魚、鱔魚、海鰻、沙丁魚、斑馬魚、飛魚、巴西刺鱸、鯛、鸚鵡鱸魚、紐西蘭真鯛、鯖、白腹鯖、鮪魚、金槍魚、鰹魚、鯡魚、巖魚、平魚(fluke)、鰨魚、比目魚、河豚、魨魚；那些屬於頭足類的生物，如魷魚、墨魚、章魚；那些屬於斧足類的生物，如蛤(如，硬殼蛤、蛤仔、圓蛤、海蛤蜊、軟殼蛤)；烏蛤、蛤貝、海螺；扇貝(如，海扇貝、海灣扇貝、calloo)；海螺、蝸牛、海參、赤貝；牡蠣(如貞潔巨牡蠣(C.virginica)，海灣牡蠣，紐西蘭牡蠣，太平洋牡蠣)；那些屬於腹足類的生物，如螺旋貝、鮑魚(如綠鮑魚、粉紅鮑魚、紅鮑魚)；和那些屬於甲殼類的生物，如龍蝦，包括但不限於刺蜥、巖蜥和美洲蜥；對蝦；河蝦，包括但不限於羅氏對蝦(M.rosenbergii)，P.styllrolls，印度對蝦(P.indicus)，日本對蝦(P.jeponious)，斑節對蝦(P.monodon)，P.vannemel，M.ensis，S.melantho，N.norvegious，冷水河蝦；蟹，包括但不限於藍蟹、白嘴蟹、石蟹、王蟹、雪花蟹、雪蟹、褐蟹、鄧傑內斯蟹、約拿蟹、紅樹蟹、軟殼蟹；蝦蛄、磷蝦、河蝥蝦(langostinos)；小龍蝦/龍蝦，包括但不限於藍色的、慄色的、紅爪的、紅沼澤的、軟殼的、白色的；環節動物門；脊索動物門，包括但不限於爬蟲類如美洲鱷魚和龜；兩棲類生物，包括蛙；和棘皮類，包括但不限於海膽。
已知有多種方法來產生轉基因動物。在一種方法中，將前核期的胚胎(「單細胞胚」)從雌性生物中取出，轉基因被微注射進該胚胎中，其中轉基因經染色體整合入所得成熟動物體的生殖細胞和體細胞中。在另一種方法中，分離胚胎幹細胞，轉基因通過電穿孔法、質粒轉染或微注射的方法摻入至幹細胞中；幹細胞然後再導入到胚胎中，在此它們定居並形成生殖細胞系。將多核苷酸微注射入哺乳動物物種中的方法在，例如美國專利4,873,191中進行了描述，該文在此引入作為參考文獻。仍然在另一個方法中，胚胎細胞用含有轉基因的逆轉錄病毒進行感染，其中胚胎的生殖細胞含有染色體上整合的轉基因。
當轉基因的動物是鳥類時，向受精卵的前核進行微注射是有問題的，因為鳥的受精卵一般在輸卵管中的第一個24小時進行細胞分裂，因此前核是不易接近的。因此，逆轉錄病毒感染的方法優選製備轉基因鳥類(見美國專利5,162,215，在此引入作為參考文獻)。但如果要在鳥類進行微注射，胚胎要在前次產卵後的大約2.5小時從處死的雌鳥中獲得，轉基因被微注射進入胚盤的細胞漿中，胚胎在宿主的殼中培育直至成熟(Love等，Biotechnology 12，1994)。當轉基因的動物是牛或豬時，微注射可因為卵不透明而受到妨礙，這樣使核很難被傳統的相差顯微鏡所鑑別。為了克服這種問題，卵首先被離心分離出前核以便更好的觀察。
本發明的非人轉基因動物可以是牛、豬、羊、魚、鳥或其它生物。轉基因可在不同的發育時期被引入胚胎靶細胞中，根據胚胎靶細胞的發育時期可選擇不同的方法。受精卵是最佳的微注射的靶標。使用受精卵作為基因轉移的靶標有一個主要的優勢是注射的DNA可在第一次分裂前整合入宿主的基因中(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA824438-4442，1985)。結果，所有轉基因非人動物的細胞可攜帶摻入的轉基因，因此可有效的將轉基因傳遞給轉基因者的後代，因為50％的生殖細胞可攜帶轉基因。
一種轉基因動物可通過雜交兩種嵌合動物而產生，每一種動物在用於繁殖的細胞中都包含外源基因物質。得到的後代25％將是具有純合的外源基因物質的轉基因動物，獲得的動物的50％是雜合的，剩餘的25％缺少外源基因物質，具有野生型的表現型。
在微注射方法中，轉基因例如通過凝膠電泳的方法被消化和純化而不含任何載體DNA。轉基因可含有一個有效相連的啟動子，它可與轉錄中涉及的細胞蛋白相互作用，並提供了組成型表達、組織特異性表達、發育期特異性表達、或類似情況。這樣的啟動子包括那些來自巨細胞病毒(CMV)、莫羅尼白血病病毒(MLV)和皰疹病毒，以及來自編碼金屬硫蛋白、骨骼激動蛋白、磷酸苯丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、二氫葉酸酶(DHFR)和胸苷激酶(TK)的基因。也可使用來自病毒長末端重複順序(LTR)的啟動子如羅斯肉瘤病毒LTR。當要轉基因的動物是鳥時，優選的啟動子包括那些來自雞□-球蛋白基因、雞溶菌酶基因和鳥造白細胞組織增生病毒。用於胚胎幹細胞質粒轉染的構建物將使用其它的調控元件，包括例如，刺激轉錄的增強子元件、剪接受體、終止和多腺苷酸化信號、允許轉錄的核糖體結合位點、和類似物。
在逆轉錄病毒感染方法中，發育中的非人胚胎可在體外培養至囊胚期。在此期間，分裂球可以是逆轉錄病毒的靶標(Jaenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260-1264，1976)。可通過酶學處理去除透明帶來有效感染分裂球(Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1986))。用來引入轉基因的病毒載體系統典型的是一個裝載轉基因的複製缺陷型逆轉錄病毒(Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826927-6931，1985；Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152，1985)。通過在一個產生病毒的細胞單層上培養分裂球可容易地和有效地獲得轉染(Van der Putten等人，見前，1985；Stewart等人，EMBO J.6383-388，1987)。可選擇的是，可在後面的時期中進行感染。病毒或產生病毒的細胞可注射進囊胚腔中(Jahner等人，Nature 298623-628，1982)。大多數原代轉基因細胞是轉基因的嵌合體，因為摻入作用僅發生在形成轉基因的非人動物的一個細胞亞群中。進一步，原代轉基因細胞可在基因組的不同位置上含有多種轉基因的逆轉錄插入物，它們通常在後代中發生分離。另外，還可能通過在子宮內對中期妊娠的胚胎進行逆轉錄病毒感染，將轉基因引入生殖細胞系中，儘管效率低(Jahner等人，見前，1982)。
胚胎幹細胞(ES)也可作為引入轉基因的靶標。ES細胞可從體外培養的植入前胚胎中獲得，並可與胚胎融合(Evans等人，Nature292154-156，1981；Bradley等人，Nature 309255-258，1984；Gossler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 839065-9069，1986；Robertson等人，Nature322455-448，1986)。轉基因可通過DNA轉染或通過逆轉錄病毒介導的轉導作用被有效地導入ES細胞中。這樣轉化的ES細胞然後可與來自非人動物的囊胚結合在一起。然後ES細胞定居到胚胎中，形成所得嵌合體動物的生殖細胞系(見Jaenisch，Science 2401468-1474，1988)。
如在此所公開的，肌生長抑制素可至少部分地通過Smad信號轉導通路發揮其活性，肌生長抑制素的表達與多種病理狀況是相關的。像這樣，本發明提供了治療多種與肌生長抑制素相關的病理狀況的新靶位，這些病理狀況包括代謝性狀況如肥胖症和II型糖尿病。相應地，本發明提供了通過調節受試者肌肉細胞或脂肪組織細胞中肌生長抑制素信號轉導作用來緩解一個受試者病理狀況嚴重性的方法，其中病理狀況的特徵至少部分地是肌肉或脂肪組織異常的重量、發育或代謝活性。
肌生長抑制素可作為肌肉生長的負性調節物(McPherron等人，見前，1997)。肌生長抑制素敲除小鼠的重量大約超出野生型同窩出生仔25％至30％，這種檢測到的小鼠體重增加完全是由於骨骼肌組織重量的大幅增加。在缺乏肌生長抑制素的小鼠中，骨骼肌的重量是相應野生型同窩出生仔的大約2至3倍。在純合子基因敲除小鼠中，這種肌肉量的增加是增生和肥大聯合作用的結果。
如在此所公開的，雜合肌生長抑制素敲除小鼠也有骨骼肌重量增加，儘管在程度上少於純合子突變體小鼠所觀察到的程度，這樣可證明肌生長抑制素在體內是劑量依賴性的(見實施例1)。而且，肌生長抑制素在動物中的過度表達對肌肉生長具有相反的效應。例如，荷載表達肌生長抑制素的腫瘤的裸鼠發展成消耗症候群，其特徵是肌肉和脂肪重量的大幅丟失(見實施例8)。這種在裸鼠中的症候群類似於患有慢性疾病如癌症或AIDS的患者中發生的惡病質狀態。
肌生長抑制素免疫反應物質的血清水平在肌肉消耗方面與患者的狀態是相關的(Gonzalez-Kadavid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA9514938-14943，1998，在此引入作為參考文獻)。因此，患有AIDS的患者，也顯示惡病質的徵象，測量只有全身體重的減輕，其肌生長抑制素免疫反應物質的血清水平較沒有AIDS的正常男性或沒有體重減輕的AIDS患者有輕微的升高。但是，這些結果的解釋是複雜的，因為在血清樣品中檢測到的肌生長抑制素免疫反應物質在SDS膠上沒有所預期的經可靠性加工的肌生長抑制素的遷移率。
如在此所公開的，肌生長抑制素不僅影響肌肉的重量，而且影響生物體的總體代謝。例如，肌生長抑制素在脂肪組織中表達，當動物年老時，肌生長抑制素缺陷小鼠的脂肪聚積有大幅降低(見實施例II和III)。儘管在此沒有提議肌生長抑制素作用的機制，但肌生長抑制素的作用可以是肌生長抑制素對脂肪組織的直接作用，或可以是由於缺少肌生長抑制素活性對骨骼肌組織引起的間接作用。不管何種機制，因肌生長抑制素活性降低導致的總體合成代謝對肌肉組織的影響，可改變生物體的總體代謝，並影響能量以脂肪的形式儲備，如通過在肥胖小鼠株(棕灰色的黃色致死(Ay)小鼠)中導入肌生長抑制素突變所顯示的，它的脂肪聚積可被抑制5倍(見實施例5)。在含有肌生長抑制素突變的刺鼠中，異常的葡萄糖代謝也被部分抑制。這些結果表明抑制肌生長抑制素的方法可用於治療或防止如肥胖症和II型糖尿病的代謝疾病。
例如，本發明的方法可用於減輕多種病理狀況的嚴重性，包括例如，與如癌症(見Norton等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.7289-327，1987)的慢性疾病相關的惡病質，以及如II型糖尿病、肥胖症和其它代謝性疾病的病態。如在此使用的，術語「病理狀況」是指一種疾病，其特徵在於至少部分是肌肉或脂肪組織異常的重量、發育或代謝活性。這樣的病理狀況，包括例如，肥胖症；與肥胖相關的狀況例如，動脈粥樣硬化、高血壓、和心肌梗塞；肌肉消耗性疾病如肌營養不良、神經肌肉疾病、惡病質和厭食症；和代謝性疾病如II型糖尿病，它通常但並不一定是與肥胖症相關，這些病理狀況對採用本發明方法的治療是特別有反應的。
如在此使用的，術語「異常」，當用於指肌肉或脂肪組織的數量、發育或代謝活性時，是與專業臨床醫生或其它相關的技術人員會認為正常的或理想的數量、發育或代謝活性相比較的相對意義而使用的。這種正常或理想的數值對於臨床醫生是已知的，是基於一般在相應人群中的健康個體中觀察到或需要的平均數值。例如，臨床醫生知道，一個具有特定高度和體型的人，肥胖症與體重大約超過「理想」體重範圍20％以上相關。但臨床醫生應當認識到，僅僅是體重超過相應人群中同樣高度和體型者期望體重20％或以上的健身者並不一定是肥胖的。類似地，技術人員會知道，通過例如讓患者接受多種力量檢測並與相應人群中平均的健康個體的期望結果進行比較，可確定一個表現出肌肉活動異常地減少的患者具有異常的肌肉發育。
本發明的一種方法可緩解一種病理狀況的嚴重性，該狀況的特徵至少部分是肌肉或脂肪組織異常的重量、發育或代謝活性，該法通過在與該狀況病因學相關的肌肉或脂肪細胞中調節肌生長抑制素信號轉導作用。如在此使用的，術語「減輕」，當用在關於病理狀況的嚴重性時，是指與該狀況相關的體徵或症狀被減輕。要監測的體徵或症狀是一種特定病理狀況的特徵，並為專業臨床醫生所熟知，監測該體徵或症狀的方法也一樣。例如，當病理狀況是II型糖尿病時，專業臨床醫生可檢測受試者的葡萄糖水平、葡萄糖清除率以及類似指標。當病理狀況是肥胖症或惡病質時，臨床醫生可簡單的監測受試者的體重。
要給與受試者的藥劑是在促進藥劑與靶細胞接觸的條件下用藥的，如果合適，可進入細胞中。例如，可通過將多核苷酸加入一個可感染細胞的病毒載體中推動多核苷酸藥劑進入細胞。如果不能得到對細胞類型特異的病毒載體，載體可被修飾以表達一種對靶細胞上表達的配體(或受體)特異的受體(或配體)，或可封裝在一個脂質體中，它也可被修飾以包含這樣一種配體(或受體)。一種肽藥劑可通過許多方法被引入細胞中，包括例如，通過將肽工程改造以含有一個蛋白轉導功能區如人免疫缺陷病毒TAT蛋白轉導功能區，它可加速肽轉運至細胞中(見Schwarze等人，見前，1999；Derossi等人，見前，1996)。
藥劑在靶細胞中的存在可被直接鑑定，例如通過可操作性地將一個可檢測的標記物連接到藥劑上，通過採用對藥劑、特別是一種肽藥劑有特異性的抗體，或通過檢測由於藥劑造成的下遊效應，例如細胞中Smad多肽磷酸化的減少。一種藥劑可被標記以便採用本領域已知的方法檢測到(Hermanson，「生物連接技術」(Bioconjugate Techniques)(Academic Press 1996)，在此引入作為參考；也見，Harlow和Lane，見前，1988)。例如，肽或多核苷酸藥劑可用多種可檢測到的部分標記，包括放射性標記、酶如鹼性磷酸酶、生物素、螢光色素和類似物。當藥劑包含在一個試劑盒中時，標記藥劑的試劑也可包含在該試劑盒中，或可單獨從商業渠道購買到該試劑。
用在本發明方法中的一種藥劑可被應用到病理狀況的位置，或用任何給靶細胞提供多核苷酸或肽的方法。如在此所使用的，術語「靶細胞」是指要接觸藥劑的肌肉細胞或脂肪細胞。為了給一個活的受試者用藥，藥劑一般被製成適合給與受試者的藥學組合物。因此，發明提供了含有一種藥劑的藥學組合物，該藥劑在藥學可接受的載體中被用來調節細胞內肌生長抑制素的信號轉導作用。像這樣，此藥劑可用作治療患有如在此定義的病理狀況的受試者的藥劑。
藥學可接受的載體是本領域中熟知的，包括例如，水溶液如水或生理緩衝鹽水或其它溶劑或媒介物如乙二醇、甘油、油如橄欖油、或可注射的有機酯。一種藥學可接受的載體可含有生理學可接受的化合物，其作用是例如穩定或增加綴合物的吸收。這樣的生理學可接受的化合物包括例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或穀胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白或其它的穩定劑或賦形劑。本領域的專業技術人員會了解，包括生理學可接受化合物的藥理學可接受載體的選擇，依賴於例如治療藥劑的生理-化學特性和組合物給藥的途徑，該途徑可以是，例如口服或胃腸外如靜脈內，通過注射、插管、或其它本領域已知的方法。藥學組合物也可包含第二種藥劑如診斷藥劑、營養物質、毒素、或治療藥劑如一種癌症化療藥劑。
藥劑可被併入封裝材料中，成為如水包油的乳劑、微乳劑、微膠粒、混合微膠粒、脂質體、微球體或其它聚合物基質(見，例如，Gregoriadis，Liposome Technology，第1卷(CRC出版社，Boca Raton，FL 1984)；Fraley等人，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每一篇在此均引入作為參考文獻)。例如由磷脂或其它脂類組成的脂質體是無毒的、生理學可接受的和可代謝的載體，相對易於製備和應用。「隱形」脂質體(見，例如，美國專利5,882,679；5,395,619；和5,225,212，每一篇都在此引入作為參考文獻)是這種特別用來製備藥學組合物的封裝材料的實施例，該組合物可用來實行本發明的方法，可使用其它類似的「掩蔽」脂質體，這種脂質體延長了治療藥劑保留在循環中的時間。例如陽離子脂質體也可被特異的受體或配體修飾(Morishita等人，J.Clin.Invest.，912580-2585(1993)，在此引入作為參考文獻)。另外，一種多核苷酸藥劑可採用例如腺病毒-聚賴氨酸DNA複合體被引入細胞中(見，例如，Michael等人，J.Biol.Chem.2686866-6869(1993)，在此引入作為參考文獻)。
含有改變肌生長抑制素信號轉導作用的藥劑的藥學組合物，其給藥途徑部分地依賴於該分子的化學結構。例如多肽和多核苷酸，當口服給藥時不是特別地有用，因為它們可在消化道中被降解。但是，例如化學修飾多肽的方法是熟知的，使它們對內源性蛋白酶的降解不太敏感，或在經過消化道時更易被吸收(見，例如，Blondelle等人，見前，1995；Ecker和Crook，見前，1995)。另外，肽藥劑可採用D-胺基酸來製備，或可含有一種或多種基於肽模擬體的功能區，肽模擬體是模擬了肽功能區結構的有機分子；或基於一種類肽如vinylogous類肽。
如在此所公開的藥學組合物可通過多種途徑分別給一個個體用藥，包括例如，經口服或胃腸外如靜脈內、肌肉內、皮下、眼窩內、囊內、腹膜內、直腸內、池內，或採用例如皮膚貼片或經皮電離子透入療法，經過皮膚被動的或易化吸收。此外，藥學組合物可通過注射、插管、口服或局部給藥，後者可以是被動的，例如通過直接塗敷一種藥膏，或例如採用一種鼻噴霧劑或吸入劑而起效，在這種情況下，組合物中的一個組分是一種合適的拋射劑。藥學組合物也可被用在病理狀況的部位，例如通過靜脈或動脈內進入供應腫瘤的血管中。
在實行本發明方法中要給與的藥劑總量可以單次劑量給與受試者，或者通過大丸劑或者在相對較短的時間內輸注，或可以採用分段治療方案給藥，其中可在較長的時間內多次用藥。本領域的技術人員會知道，在一個受試者中治療一種病理狀況所需的藥學組合物的量依賴於許多因素，包括受試者的年齡和一般健康狀況，以及給藥途徑和要給藥的治療次數。考慮到這些因素，本專業的技術人員會在必要時調整特定的劑量。一般來說，藥學組合物的劑型、給藥途徑和頻率，最初是採用I期和II期臨床試驗來確定的。
藥學組合物可被製成口服劑型，如片劑、或溶液或懸液形式；或可與一種有機或無機的載體、或適合腸或胃腸外應用的賦形劑組成混合物，並可例如與通常的無毒性的、藥學可接受的載體複合成片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液、乳劑、懸液、或其它適合應用的形式。除了以上公開的以外，載體還包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯樹膠、明膠、甘露醇、澱粉糊、三矽酸鎂、雲母、玉米澱粉、角質素、矽膠、馬鈴薯澱粉、尿素、中鏈甘油三酯、葡聚糖，和其它適合用於製造製劑的載體，其形式是固體、半固體或液體。另外的輔劑可使用穩定劑、增稠劑或著色劑和香料，例如一種穩定乾燥劑如triulose(見，例如，美國專利5,314,695)。
本發明也提供了一種在受試者體內調節肌肉組織或脂肪組織生長的方法。如在此所公開的，GDF受體如Act RIIA和Act RIIB參與了介導GDF的效應，GDF如肌生長抑制素，它參與了肌肉組織和脂肪組織的形成。因此，在一個實施方案中，調節肌肉組織或脂肪組織生長的方法包括影響來自GDF受體如一個激活素受體，例如Act RIIA或ActRIIB的信號轉導作用。這樣一種方法的實施可通過用突變體GDF受體接觸組織中的細胞，或在細胞中表達突變體GDF受體，它具有顯性失活活性、組成型活性、或類似活性。
在另一個實施方案中，在一個生物體中調節肌肉組織或脂肪組織生長的方法可通過給與該生物體一種藥劑來實施，該藥劑影響肌生長抑制素的信號轉導。優選地，該藥劑是一個或編碼一個肌生長抑制素功能前區或一個突變體原肌生長抑制素多肽，它們每一個都可包含肌生長抑制素的信號肽。如在此使用的，術語「生長」是以相對含義使用的，是指已經接受本發明方法的生物體中肌肉組織重量或脂肪組織重量與相應的未接受本發明方法的生物體相比較。因此，當本發明方法的實施使肌生長抑制素的信號轉導被減少或抑制時，將要認識到與相應的肌生長抑制素信號轉導作用沒有受影響的生物體(或生物體群體)的肌肉量相比，該生物體中肌肉組織的生長會導致肌肉量的增加。
本發明的一種方法可用來增加肌肉的重量或減少生物體的脂肪含量或兩者均有。例如，當這樣一種方法在一種可用作食物來源的生物體上實施時，食物的蛋白含量可被增加，膽固醇水平可被降低，食品的品質可被改善。本發明的一種方法也可被用來減少一種生物體中肌肉組織的生長，例如一種對環境有害的生物體，使該生物體在環境中幾乎不能進行競爭。因此，本發明的方法可在任何表達肌生長抑制素的真核生物上實施，包括脊椎動物生物例如哺乳動物、鳥類或魚類，或可以是無脊椎動物例如軟體動物、棘皮動物、腹足動物或頭足類動物。
藥劑可以是如在此所公開的任何可改變肌生長抑制素信號轉導的藥劑，並可以任何方便的方式給與生物體。例如當要處理的生物體是在水中養殖的魚、蝦、扇貝、或類似物時，藥劑可加到供養生物體的水中，或摻進它們的食物中，特別是當藥劑是一種可溶性的肽或是小的有機分子時。
當在本發明的方法中使用的藥劑是編碼一種肽藥劑、一種反義藥劑或類似物的多核苷酸時，可選擇含多核苷酸的非人生物體的生殖細胞，並可產生表達該藥劑的轉基因生物體。優選地，多核苷酸是在一個可誘導的調控元件的控制下，這樣被多核苷酸編碼的藥劑可在所需的時間和時間段內表達。相應地，本發明提供了轉基因的非人生物體，以及由這些生物體產生的食品。這樣的食品因為肌肉組織增加而具有增加的營養價值。轉基因的非人動物可以是在此公開的任何物種，包括脊椎動物生物如牛、豬、羊、雞、火雞和魚，以及無脊椎動物類如蝦、龍蝦、蟹、烏賊、牡蠣和鮑魚。
TGF-β家族成員的調節及其與細胞表面受體特異性相互作用將要被開始被闡明。因此TGF-β家族一個成員的功能前區和TGF-β家族另一個成員的成熟區的共同表達與細胞內二聚作用相關，並發生生物學活性的同型二聚體的分泌(Gray等人，Science 2471328，1990)。例如，BMP-2(骨形態發生蛋白-2)功能前區和BMP-4(骨形態發生蛋白-4)成熟功能區的一起使用可引起BMP-4成熟區的表達大幅度增加(Hammonds等人，Mol.Endocrinol.5149，1991)。對於已經研究的大多數家族成員來說，同型二聚體類是有生物學活性的，而對於其它家族成員如抑制素類(Ling等人，Nature 321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等人，Cell48409，1987)，雜二聚體也已經被檢測到且似乎與相應的同型二聚體具有不同的生物學特性。
受體-配體相互作用的研究已經揭示了大量關於細胞如何對外界刺激發生反應的信息，並已導致開發出治療性重要化合物，如紅細胞生成素、集落刺激因子和血小板源生長因子(PDGF)。因此在鑑定介導TGF-β家族成員作用的受體方面已經進行了不斷的努力。如在此所公開的，肌生長抑制素與一個激活素II型受體特異地相互作用。對這種相互作用的證實為檢定用於農業和人類治療目的的拮抗劑和激動劑提供了靶標，例如，治療多種病理狀況如肥胖症、II型糖尿病和惡病質。這種特異的相互作用的證實也為檢定其它的肌生長抑制素受體、以及其它生長分化因子的特異性受體提供了一種方法。相應地，本發明提供了GDF受體，它可與一種GDF或GDF的混合物，例如與肌生長抑制素、GDF-11、或兩者的混合物，發生特異地相互作用。
本發明的一個GDF受體在此以肌生長抑制素受體為例，特別是激活素II型受體，它特異地與肌生長抑制素和GDF-11相互作用。但是，包括在本發明中的還有，與肌生長抑制素特異地相互作用、但不與GDF-11相互作用的肌生長抑制素受體，以及特異地與GDF-11而不是肌生長抑制素相互作用的GDF-11受體，等。為了便於討論，本發明的受體在此一般地以「GDF受體」被提及，並以肌生長抑制素受體為例，它是至少與肌生長抑制素特異性相互作用的受體。像這樣，當文獻一般地提到肌生長抑制素與肌生長抑制素受體的特異性相互作用時，要認識到本公開書更廣泛的包括任何GDF受體，包括至少與GDF-11特異地相互作用的GDF-11受體。
也提供了一個表達GDF受體多肽的重組細胞系，以及特異地與受體結合的抗體，編碼受體的基本上純化的多核苷酸，和基本上純化的GDF受體多肽。也提供了GDF受體的肽部分，包括例如，GDF受體如肌生長抑制素受體的可溶性細胞外功能區，如在此所公開的，它可改變肌生長抑制素與細胞肌生長抑制素受體的特異性相互作用；GDF受體的組成型活性細胞內激酶功能區，它可在細胞內誘導、刺激，或者換句話是維持GDF信號轉導作用；或GDF受體的其它截短型部分，它具有調節肌生長抑制素或其它GDF信號轉導作用的能力。
本發明還提供了鑑定GDF受體多肽的方法，包括採用核苷酸探針或抗體探針篩選基因組或cDNA文庫的方法，該文庫是表達文庫；應用例如GDF，如肌生長抑制素或其功能性肽部分篩選對其有反應的細胞，從而表達該受體的方法；雙雜種體系試驗，如上所述，採用例如GDF肽作為一個雜交的組成成分，從表達GDF受體的細胞中製備的cDNA文庫表達的肽作為第二個雜交的組成成分，和類似的情況。
如上所述，與GDF受體，例如肌生長抑制素受體如Act RIIB，特異性相互作用的藥劑可以採用該受體鑑定，以篩選這種藥劑。相反地，已經被確定具有與肌生長抑制素受體如Act RIIB受體特異性相互作用的物質，可以被用於篩選其他的肌生長抑制素受體或其它GDF受體。這樣一種方法可包括，將諸如該物質(或肌生長抑制素或其它GDF)的成分與表達GDF受體的細胞，在足以使該物質(或GDF)與受體特異相互作用的條件下孵育，GDF受體可以是截短型膜結合受體或一個可溶性受體；測量結合到受體上的該物質(或GDF)；並分離受體。如上所述的製作分子模型方法也可以被用作篩選方法以鑑定一個GDF受體或其功能性肽部分。
還提供了非人轉基因動物，具有以表達GDF受體為特徵的表現型，其表現型是通過動物體細胞和生殖細胞中含有的轉基因賦予的。該轉基因含有編碼GDF受體如肌生長抑制素受體多肽的多核苷酸。產生這種轉基因動物的方法在這裡公開，或者為本領域已知。
本發明提供了一個基本純化的、編碼GDF受體全部或一個肽部分的多核苷酸。儘管GDF受體在這裡用一個激活素II型受體作為例證，但編碼激活素II型受體的多核苷酸以前曾經被描述過(美國專利No.5,885,794)。因此，應當認識到，這種激活素II型受體並不包含在本發明中(Massague，見前，1998；Heldin等人，見前，1997)。類似地，激活素I型受體，包括Act RIB；TGF-β受體，包括TGF-βRI和TGF-βRII；和BMP受體，包括BMP RIA、BMP RIB和BMP RII受體已經被描述過並為本領域熟知(Massague，見前，1998；Heldin等人，見前，1997)，因此不包含在本發明的GDF受體中。
本發明的一個多核苷酸可以編碼一個具有肌生長抑制素受體活性的多肽，例如肌生長抑制素結合活性，或可以編碼一個突變體肌生長抑制素受體，例如在激酶功能結構區中有突變的突變體肌生長抑制素受體，這樣使該突變體充當一個顯性失活的肌生長抑制素受體(見上)。因此，本發明的多核苷酸可以是天然存在的、合成的或有意操作的多核苷酸。例如，mRNA序列部分可以因RNA剪接方式的替換或替換RNA轉錄啟動子而被改變。作為另一個實施方案，多核苷酸可以接受定點誘變。多核苷酸也可以是反義核苷酸序列。本發明的GDF受體多核苷酸包括由於遺傳密碼的簡併而產生的序列。存在20種天然胺基酸，其中大多數由不止一個密碼子編碼。因此，假如由多核苷酸編碼的GDF受體多肽胺基酸序列在功能上沒有改變，那麼所有簡併的核苷酸序列都包括在本發明中。編碼肌生長抑制素受體多肽的核苷酸序列也包括在內。
編碼本發明GDF受體的多核苷酸的寡核苷酸部分也包括在本發明中。這種寡核苷酸通常至少大約15個鹼基長，它足以使寡核苷酸選擇性地雜交到一個編碼受體的多核苷酸上，而且長度可以是至少大約18個核苷酸或21個核苷酸或以上。如這裡所用的，術語「選擇性雜交作用」或「選擇性雜交」是指在中度嚴格或高度嚴格生理條件下的雜交，它可以區分相關的核苷酸序列和非相關的核苷酸序列。
在核酸雜交反應中，用於獲得特定嚴格水平的條件會因要雜交的核酸的特性而異。例如，長度、互補性程度、核苷酸序列組成(例如，相對GCAT含量)和核酸類型，即寡核苷酸或靶核酸序列是DNA或是RNA，都可以在選擇雜交條件中考慮。一個另外的考慮是核酸之一是否是固定化的，例如在濾器上。選擇合適嚴格條件的方法可以是根據經驗確定的或是用各種公式估計的，都是本領域熟知的(見，例如Sambrook等人，見前，1989)。
一個逐步增高的嚴格條件的實例如下2X SSC/0.1％SDS在大約室溫下(雜交條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約室溫下(低度嚴格條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約42℃下(中度嚴格條件)；和0.1X SSC在大約68℃下(高度嚴格條件)。可以僅用這些條件中的一個進行衝洗，例如高度嚴格條件，或可以使用每一個條件，例如每個10至15分鐘，按上面所列的順序，重複所列的任一或全部步驟。
本發明編碼GDF受體的多核苷酸可以通過幾種方法中的任一種來獲得。例如多核苷酸可以用雜交或以計算機為基礎的技術分離，如本領域所熟知的。這些方法包括但不限於1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢測同源的核苷酸序列；2)表達文庫的抗體篩選以檢測具有共用結構特徵的克隆DNA片段；3)採用能夠退火到目的DNA序列上的引物對基因組DNA或cDNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)；4)序列資料庫的計算機搜索以找到相似的序列(見上)；5)扣除DNA文庫差示篩選；和6)雙雜種體系試驗，採用例如一個成熟GDF肽作為雜交物之一。
根據本公開書，即一個激活素受體與肌生長抑制素特異性相互作用，寡核苷酸探針可以根據編碼激活素受體的序列而設計，例如編碼與肌生長抑制素結合的細胞外功能區的序列，並用於篩選從細胞中製備的文庫，如肌肉細胞或脂肪細胞，它們對肌生長抑制素起反應，從而加快編碼肌生長抑制素受體的多核苷酸的鑑定。選擇出的克隆可以被進一步篩選，例如通過將插入物亞克隆到一個表達載體中，並在克隆序列表達後用肌生長抑制素篩選表達的多肽。
本發明的多核苷酸，例如一個編碼肌生長抑制素受體的多核苷酸，可以來源自脊椎動物種屬，包括哺乳動物、鳥類或魚類，或來自無脊椎動物。如果可以獲得適合的探針，依賴核酸雜交的篩選步驟可以從任何生物體中分離任何基因序列。相對應於編碼所研究蛋白的序列一部分的寡核苷酸探針可以被化學合成。這需要知道胺基酸序列的短寡肽鏈。考慮到遺傳密碼的簡併性，編碼受體的多核苷酸序列可以從遺傳密碼的一段序列中推導出來。於是，當序列被簡併時，可以進行混合的加成反應。這包括變性雙鏈DNA的異種混合物。對於這種篩選，雜交作用優選地在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進行。當與有關目的多肽有關的mRNA序列存在極低量時，雜交作用在探測此來源的cDNA克隆中是特別有用的。因此，通過採用嚴格的雜交條件，以避免非特異結合，在與靶核酸完全互補的混合物中將靶DNA雜交到一個寡核苷酸探針上，使放射自顯影成像可被用於識別特異的cDNA克隆(Wallace等人，Nucl.Acid Res.，9879，1981，在此引入作為參考文獻)。可選擇地，一個扣除文庫因而可以被用來排除非特異的cDNA克隆。
當不知道所需多肽的整個胺基酸序列時，DNA序列的直接合成是不可能的，精選的方法是合成cDNA序列。分離目的cDNA序列的標準步驟之一是形成在質粒或噬菌體中製備的cDNA文庫，其中文庫來自mRNA的逆轉錄，後者在具有高水平基因表達的供體細胞中是豐富的。當與聚合酶鏈式反應技術聯合使用時，甚至極少表達的產物也可以被克隆。當已知多肽胺基酸序列的重要部分時，在已經變性成單鏈形式的cDNA克隆拷貝上進行的雜交過程可以使用標記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列，它們複製了推定在靶cDNA中存在的序列(Jay等人，Nucl.Acid Res.，112325，1983，在此引入作為參考文獻)。
可以用一個GDF受體特異的抗體，如抗-Act RIIB抗體，篩選cDNA表達文庫，如λgtl 1文庫尋找GDF受體肽。抗體可以是多克隆或單克隆的，並可被用於檢測指示GDF受體cDNA存在的表達產物。也可以用一個GDF肽篩選這樣一種表達文庫，例如用肌生長抑制素或其一個功能性肽部分鑑定一個克隆，後者編碼至少肌生長抑制素受體的肌生長抑制素結合功能區的一部分。
編碼突變體GDF受體和突變體GDF受體多肽的多核苷酸也包括在本發明中。編碼GDF受體的多核苷酸的改變可以是基因內突變，如點突變、無義(STOP)突變、錯義突變、剪接位點突變或移碼，或可以是雜合的或純合的缺失，可以是自發突變或可以是例如用重組DNA方法人工改造的。這種改變可以用本領域專業技術人員已知的標準方法檢測，包括但不限於核苷酸序列分析，Southern印跡分析，PCR為基礎的分析如多重PCR或序列標記位點(STS)分析、或原位雜交分析。GDF受體多肽可以用標準的SDS-PAGE、免疫沉澱反應分析、western印跡分析或類似方法來分析。突變體GDF受體的實例是截短型GDF受體，包括可溶性細胞外功能區，它可具有特異地結合其同源物GDF的能力但缺少激酶功能區；細胞內GDF受體激酶功能區，它可具有組成型激酶活性；以及含點突變體GDF受體，它破壞了受體的激酶活性或受體的配體結合能力；以及類似物。這種GDF受體突變體用於調節GDF信號轉導，並因而用於實施本發明的各種方法。
編碼GDF受體的多核苷酸可以通過將該多核苷酸導入適合的宿主細胞而在體外表達。「宿主細胞」可以是任何細胞，特定的載體可以在其中增殖，且在適當的時候載體中包含的多核苷酸可以在其中表達。術語「宿主細胞」包括一個原始宿主細胞的任何子代。應當理解，由於例如在複製過程中發生的突變，宿主細胞的所有子代與親代細胞可能是不相同的。然而，當使用「宿主細胞」時，這種子代也包括在其中。獲得宿主細胞的方法是本領域熟知的，宿主細胞短暫地或穩定地含有導入的本發明多核苷酸。
本發明的GDF受體多核苷酸可被插入一個載體中，該載體可以是克隆載體或重組表達載體。術語「重組表達載體」是指質粒、病毒或本領域已知的其它載體，它們已經通過插入或合併一個多核苷酸而被操作，特別是對於本發明，是編碼GDF受體的全部或一個肽部分的多核苷酸。這種表達載體含有一個啟動子序列，它加速該宿主的插入基因序列的有效轉錄。表達載體通常含有一個複製起點，一個啟動子，以及可以對轉化細胞進行表現型篩選的特殊基因。適合用於本發明的載體包括但不限於，在細菌中表達的以T7為基礎的表達載體(Rosenberg等人，基因(Gene)56125，1987)、在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的杆狀病毒來源的載體。DNA片段可以存在於載體中，可操作性地與調控元件連接，例如一個啟動子，它可以是T7啟動子、金屬硫蛋白I啟動子、多角體蛋白啟動子、或其它所需的啟動子，特別是組織特異性啟動子或誘導性啟動子。
編碼GDF受體的多核苷酸序列可以在原核細胞或真核細胞中表達。宿主可以包括微生物、酵母、昆蟲和哺乳動物生物體。在原核細胞中表達具有真核細胞或病毒序列的多核苷酸的方法是本領域熟知的，同樣的是能夠在宿主中表達和複製的有生物學功能的病毒和質粒DNA載體。含有本發明多核苷酸的表達載體的構建方法是熟知的，同樣的是在選擇轉錄或翻譯控制信號中要考慮的因素，包括例如，多核苷酸是否優選在特定的細胞類型中或在特定的條件下表達(見，例如，Sambrook等人，見前，1989)。
各種宿主細胞/表達載體系統可以被用來表達GDF受體編碼序列，包括但不限於，微生物如用重組細菌噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用重組酵母表達載體轉化的酵母細胞；用重組病毒表達載體如花椰菜花葉病毒或菸草花葉病毒感染，或用重組質粒表達載體如Ti質粒轉化的植物細胞系統；用重組病毒表達載體如杆狀病毒感染的昆蟲細胞；用重組病毒表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒或痘苗病毒載體感染的動物細胞系統；和為穩定表達而基因工程改造的轉化動物細胞系統。當表達的GDF受體是翻譯後修飾時，例如通過糖基化作用，選擇一個能夠影響所需修飾作用的宿主細胞/表達載體系統，例如哺乳動物宿主細胞/表達載體系統，可以是特別有益的。
依據所用的宿主細胞/載體系統，可以在表達載體中使用許多適合的轉錄和翻譯元件中的任何一個，包括組成型和誘導型啟動子、轉錄增強元件、轉錄終止子，以及類似物(Bitter等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987)。例如，當在細菌系統中克隆時，可以使用誘導型啟動子如細菌噬菌體λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜交啟動子)，以及類似啟動子。當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可以使用來自哺乳動物細胞基因組的啟動子如人或鼠金屬硫蛋白啟動子，或來自哺乳動物病毒的啟動子如逆轉錄病毒長末端重複順序、腺病毒晚期啟動子或痘苗病毒7.5K啟動子。由重組DNA或合成技術產生的啟動子也可以被用來提供插入GDF受體編碼序列的轉錄。
在酵母細胞中，可以使用許多含組成型或誘導型啟動子的載體(見Ausubel等人，見前，1987，見13章；Grant等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987；Glover，DNA克隆(DNA Cloning)第II卷(IRLPress，1986)，見第3章；Bitter，Meth.Enzymol.152673-684，1987；也見，酵母菌屬酵母菌的分子生物學(The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces)(Strathem等人主編，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1982)，第I和II卷)。可以使用組成型酵母啟動子如ADH或LEU2，或誘導型啟動子如GAL(Rothstein，DNA克隆第II卷(見前，1986)，第3章)。可選擇地，可以使用促進外源DNA序列整合進酵母染色體的載體。
真核細胞系統，特別是哺乳動物表達系統，使表達的哺乳動物蛋白得到適當的翻譯後修飾。具有正確加工初級轉錄物、糖基化、磷酸化和基因產物方便地插入質膜的細胞機制的真核細胞可被用作表達GDF受體多肽或其功能性肽部分的宿主細胞。
使用重組病毒或病毒元件以指導表達的哺乳動物細胞系統可被改造。例如，當應用腺病毒表達載體時，GDF受體編碼序列可被連接在一個腺病毒轉錄/翻譯控制複合體上，如晚期啟動子和三聯前導序列。可選擇地，可以使用痘苗病毒7.5K啟動子(Mackett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 797415-7419，1982；Mackett等人，J.Virol.49857-864，1984；Panicali等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA794927-4931，1982)。特別有用的是牛乳頭狀瘤病毒載體，它可以作為染色體外遺傳因子複製(Sarver等人，Mol.Cell.Biol.1486，1981)。此DNA進入小鼠細胞後不久，質粒複製到大約每個細胞100至200個拷貝。插入的cDNA的轉錄不需該質粒整合進宿主細胞染色體，因而產生了高水平的表達。通過在質粒中包含一個選擇性標記，如新基因，這些載體可被用於穩定表達。可選擇地，逆轉錄病毒基因組可被修飾以用作能夠導入和指導GDF受體基因在宿主細胞中表達的載體(Cone和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 816349-6353，1984)。也可以用誘導型啟動子獲得高水平表達，包括但不限於金屬硫蛋白IIA啟動子和熱休克啟動子。
為長期、高產量生產重組蛋白，優選穩定的表達。宿主細胞可以用GDF受體cDNA轉化，而不是使用含病毒複製起點的表達載體，GDF受體cDNA由合適的表達控制元件調控，如啟動子、增強子序列、轉錄終止子和聚腺苷酸化位點，以及一個選擇性標記。在重組質粒中的選擇性標記可帶來對這種選擇的抗性，使細胞穩定地將質粒整合進其染色體中並生長形成集落，集落反過來可以被克隆並發展成細胞系。例如，在導入外源DNA後，可以讓基因工程改造過的細胞在富集培養基中生長1至2天，然後轉移到選擇性培養基中。可以使用許多選擇系統，包括但不限於，單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(Wigler等人，細胞(Cell)11223，1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 482026，1982)、和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人，細胞(Cell)22817，1980)。這些基因可分別被用在tk-、hgprt-或aprt-細胞中。此外，抗代謝物抗性可被用作選擇下列基因的基礎dhfr賦予對氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 773567，1980；O』Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA781527，1981)；gpt賦予對黴酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 782072，1981)；neo賦予對氨基糖苷類G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501，1981)；和hygro賦予對潮黴素的抗性(Santerre等人，基因(Gene)30147，1984)。還有對另外的選擇性基因的描述，包括trpB使細胞應用吲哚代替色氨酸；hisD使細胞應用histinol代替組氨酸(Hartman和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA858047，1988)；和ODC(鳥氨酸脫羧酶)賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑，2-(氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO的抗性(McConlogue，Curr.Comm.Mol.Biol.(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1987))。
當宿主是真核細胞時，可以使用這些DNA轉染方法，如鈣磷共沉澱法，常規的機械方法如微注射、電穿孔、插入包封在脂質體中的質粒，或病毒載體。真核細胞也可以用編碼本發明GDF受體的DNA序列和第二個外源DNA分子共轉化，後者編碼選擇性表型如單純皰疹胸腺嘧啶核苷激酶基因。另一個方法是使用真核細胞病毒載體，如猿病毒40(SV40)或牛乳頭狀瘤病毒，以暫時地感染或轉化真核細胞並表達蛋白(Gluzman，真核病毒載體(Eukaryotic Viral Vectors)(Cold SpringHarbor Laboratory出版社，1982))。
本發明還提供了穩定的重組細胞系，該細胞系的細胞表達GDF受體多肽並含有編碼GDF受體的DNA。適合的細胞類型包括但不限於，NIH 3T3細胞(小鼠)、C2C12細胞、L6細胞和P19細胞。C2C12和L6成肌細胞在培養基中自行分化並依賴特定的生長條件形成肌管(Yaffe和Saxel，Nature 270725-727，1977；Yaffe，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 61477-483，1968)。P19是一個胚胎癌細胞系。這些細胞被描述在例如美國模式菌種收藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))的細胞系目錄中。這些細胞可以用已知的方法穩定地轉化(見，例如，Ausubel等人，見前，1995，見9.5.1-9.5.6節)。
GDF受體可以用誘導型或組成型調節元件從本發明的重組多核苷酸表達，如在此所述。所需的蛋白編碼序列和一個可操作地連接的啟動子可以作為非複製型DNA(或RNA)分子被導入受體細胞，它可以是線性分子或共價閉合環狀分子。所需分子的表達可以是由於導入序列的臨時性表達，或者是由於穩定地保存在細胞中的多核苷酸，例如通過整合進宿主細胞染色體，因而引起永久表達。因此，細胞可以是穩定地或暫時地轉化的(轉染的)細胞。
一個可用的載體的實例是能夠整合所需的基因序列進入宿主細胞染色體的載體。已穩定地在其染色體中整合了導入DNA的細胞也可以通過導入一個或多個標記來篩選，這些標記可以篩選含有表達載體的宿主細胞。標記可以補充宿主的營養缺陷如leu2或ura3，它們是常見的酵母營養缺陷型標記；可以賦予殺生物劑的抗性，例如對抗生素或重金屬離子如銅或類似物的抗性。選擇性標記基因可以被直接連接到要表達的DNA基因序列上，或通過共轉染被導入同一個細胞。
導入的序列可被合併進能夠在受體宿主內自主複製的質粒或病毒載體中。各種載體中的任何一個可被用於此目的。選擇特定質粒或病毒載體中的重要因素包括含載體的受體細胞可以容易地被識別並從不含載體的細胞中挑選出來；在特定宿主細胞中所需載體的拷貝數量；和是否是需要載體能夠在不同種屬的宿主細胞間「穿梭」。
對於哺乳動物宿主，用於表達的載體系統有幾種。一類載體應用DNA元件，提供了在自主複製的染色體外質粒，質粒來自動物病毒如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、或SV40病毒。第二類載體包括痘苗病毒表達載體。第三類載體依靠所需的基因序列整合進宿主染色體。已穩定地在其染色體中整合了導入DNA的細胞也可以通過導入一個或多個標記基因(如上所述)來選擇，這些標記基因可以選擇含有表達載體的宿主細胞。選擇性標記基因可以被直接連接到要表達的DNA序列上，或通過共轉染被導入同一個細胞。可以包括另外的元件以提供編碼的mRNA或肽的最佳合成，包括例如剪接信號、轉錄啟動子或增強子，和轉錄或翻譯終止信號。插入了適當的調控元件的cDNA表達載體是本領域熟知的(見，例如，Okayama，Mol.Cell.Biol.3280，1983)。
一旦製備了用於表達的含構建物的載體或DNA序列，該DNA構建物就可以被導入合適的宿主。可以用各種方法將多核苷酸導入細胞中，包括例如轉染或轉化的方法，如原生質體融合、鈣磷沉澱、和電穿孔或其它常規的技術，例如當載體是病毒載體時的感染。
本發明還提供了具有表達重組GDF受體的細胞的轉基因動物。這種轉基因動物可以被選擇為具有脂肪含量下降或肌肉重量增加，或兩者都有，因而這些動物可以被用作高肌肉和蛋白含量、低脂肪和膽固醇含量的食品的來源。它們在生殖細胞和體細胞中已經在染色體上發生了改變，以致GDF特別是肌生長抑制素的產生保持在「正常」水平，但肌生長抑制素受體的產生數量減少或完全破壞，使得動物細胞結合肌生長抑制素的能力下降，結果肌肉組織超過正常水平，優選地脂肪或膽固醇水平沒有升高。因此，本發明也包括由動物提供的食品。這種食品因肌肉組織增加而提高了營養價值。本發明的轉基因非人動物包括牛、豬、綿羊和禽類動物，以及其它脊椎動物，進一步包括轉基因無脊椎動物。
本發明也提供了一種產生具有高肌肉含量的動物食品的方法。這種方法可包括修飾動物原核胚胎生殖細胞的遺傳結構，將胚胎植入假妊娠雌性的輸卵管中，因而使胚胎成熟為正常分娩子代，檢測子代存在的轉基因以鑑定轉基因陽性的子代，雜交轉基因陽性的子代以獲得進一步轉基因陽性的子代，並加工子代以獲得食品。生殖細胞的修飾包括改變遺傳組成，以減少或抑制天然存在的、編碼產生肌生長抑制素受體蛋白的基因表達。例如，轉基因可以包括一個對編碼肌生長抑制素受體的多核苷酸特異的反義分子；可以包括一個無功能序列，替換或插入內源性肌生長抑制素受體基因或轉基因中；或可以編碼一個肌生長抑制素受體拮抗劑，例如，顯性失活肌生長抑制素受體如顯性失活Act RIIB。
如這裡所用的，術語「動物」是指除人之外任何的鳥、魚或哺乳動物，並包括任何發育階段，包括胚胎和胎兒階段。農場動物如豬、山羊、綿羊、母牛、馬、兔或類似動物；嚙齒類如小鼠；和家養寵物如貓和狗包括在術語「動物」的意思內。此外，在這裡使用的術語「生物體」包括如上所述的動物，以及其它真核細胞，包括例如，其它脊椎動物如爬行類和兩棲類，以及如上所述的無脊椎動物。
如這裡所用的，術語「轉基因」，當用來指動物或生物體時，是指動物或生物體的細胞已經被遺傳學操作，以獲得一個被細胞穩定地保留的外源多核苷酸序列。操作可以是例如，微注射一個多核苷酸，或用含多核苷酸的重組病毒感染。因此，這裡所用的術語「轉基因」是指其中一個或多個細胞獲得重組多核苷酸的動物(生物體)，重組多核苷酸可以在細胞內被整合進染色體，或可以保留為染色體外複製多核苷酸，這樣可能被改造成為酵母人工染色體。術語「轉基因動物」也包括「生殖細胞系」轉基因動物。生殖細胞系轉基因動物是遺傳信息已經被攝取並合併進生殖系細胞的轉基因動物，因而具有將信息傳遞給子代的能力。如果這種子代事實上具有一些或全部該信息，那麼該子代也被認為是轉基因動物。本發明進一步包括轉基因生物體。
轉基因生物體可以是任何生物體，其基因組已經通過對早期階段胚胎或受精卵的體外操作而被改變，或通過任何轉基因技術導致特異基因敲除。術語「基因敲除」是指細胞內或體內基因的定向破壞，導致其功能完全喪失。可以通過在要使之無功能的基因中的插入而使轉基因動物的靶基因無功能，例如通過同源重組，或通過任何其它在細胞內破壞基因功能的方法。
可被用於實施本題述發明的轉基因可以是一個含修飾的GDF受體編碼序列的DNA序列。優選地，修飾的GDF受體基因是通過在胚胎幹細胞中的同源定向破壞的基因。例如，可以刪除GDF受體基因的整個成熟C-末端區(見實施例13)。任選地，破壞(或刪除)可以帶有另一個多核苷酸如無功能的GDF受體序列的插入或替換。還可以在生物體的一個細胞中導入或表達反義GDF受體多核苷酸、或通過在細胞中表達抗體或顯性失活GDF受體，而使之成為「敲除」表現型。在適當時，可以在此使用編碼具有GDF受體活性的蛋白，但在核苷酸序列上由於基因編碼的簡併性而不同於天然存在的GDF基因序列的多核苷酸，同樣可使用截短的形式、等位基因突變體和種間同源物的多核苷酸。
本發明還提供了特異地結合GDF受體並從而阻斷GDF與受體結合的抗體。這種抗體可被用於，例如緩解諸如與肌肉組織有關的細胞增殖性異常的病理狀況。
與GDF受體，特別是肌生長抑制素受體特異結合的單克隆抗體可以增加骨骼肌的發育。在所述要求保護的方法的優選實例中，GDF受體單克隆抗體、多肽、或多核苷酸被給予有病理狀況的患者，如肌肉消耗性疾病、神經肌肉紊亂、肌肉萎縮、衰老、或類似情況。GDF受體抗體，特別是抗肌生長抑制素受體抗體，也可以給予有病理狀況的患者，如肌肉營養不良症、脊髓損傷、外傷性損傷、充血性阻塞性肺病(COPD)、AIDS或惡病質。
在一個優選的實施方案中，抗肌生長抑制素受體抗體經靜脈內、肌肉內或皮下注射給予有肌肉消耗性疾病或異常的患者；優選地，單克隆抗體以大約0.1ug/kg至大約100mg/kg的劑量範圍給藥；更優選地在大約1ug/kg至75mg/kg之間；最優選地從大約10mg/kg至50mg/kg。抗體可以通過例如使用大藥丸或通過緩慢輸注給藥。緩慢輸注優選在30分鐘至2小時之內。抗肌生長抑制素受體抗體，或其它抗GDF受體抗體，可以被製成適於給予患者的製劑。這種製劑是本領域已知的。
給藥方案要由主治醫生考慮各種因素來確定，這些因素可改變肌生長抑制素受體蛋白的作用，例如需要形成的組織量、組織損傷部位、損傷組織的狀況、傷口大小、損傷組織的類型、患者的年齡、性別、和飲食、任何感染的嚴重性、給藥時間和其它臨床因素。劑量可以因重製中使用的基質和要在組合物中使用的藥劑類型而不同，例如藥劑是抗肌生長抑制素受體抗體。通常全身性或可注射的用藥，如靜脈內、肌肉內或皮下注射。用藥通常以最小有效劑量開始，在預先選擇的時間內增加劑量直至觀察到陽性效果。然後，劑量的逐步增加要限制在這種逐步遞增可產生相應的效果增加的水平上，同時顧及可能出現的任何不利影響。在最終組合物中添加可以幫助增加肌肉量的其它已知生長因子，如IGF I(胰島素樣生長因子I)、人、牛或雞生長激素，也可能影響劑量。在給予抗肌生長抑制素受體抗體的實例中，抗體通常在大約0.1ug/kg至大約100mg/kg的劑量範圍給藥；更優選地在大約10mg/kg至50mg/kg之間。
如這裡所用的，術語「抗體」以其廣義使用，包括多克隆和單克隆抗體，以及這些抗體的抗原結合片段。用於本發明方法的抗體或其抗原結合片段具有如下特徵，例如具有對GDF受體如肌生長抑制素受體的抗原決定簇的特異性結合活性。此外，如上討論的，本發明的抗體可以是與原肌生長抑制素多肽的一個肽部分，特別是肌生長抑制素功能前區或其功能性肽部分，特異地結合的抗體。應當認識到，下面的方法舉例說明了GDF受體抗體的製備和定性，該方法進一步可應用於本發明中其他抗體的製備和定性，包括特異地結合肌生長抑制素功能前區的抗體、特異地結合原肌生長抑制素多肽並減少或抑制原肌生長抑制素蛋白水解地切割為肌生長抑制素的抗體，和類似情況。
當術語「特異地結合」或「特異性結合活性」用於抗體時，指抗體和特定抗原決定簇間相互作用的解離常數至少大約1×10-6，一般地至少大約1×10-7，通常至少大約1×10-8，特別是至少大約1×10-9或1×10-10或以下。同樣地，保留對GDF受體抗原決定簇的特異性結合活性的抗體片段Fab、F(ab』)2、Fd和Fv，包括在抗體的定義中。對本發明的目的來說，如果同TGF-β受體或BMP受體相比，抗體對肌生長抑制素受體的結合親合力至少大2倍，一般至少大5倍，特別地至少大10倍，那麼該特異地與肌生長抑制素受體抗原決定簇起反應的抗體被認為基本上不與TGF-β受體或BMP受體反應。
如這裡所用的術語「抗體」包括天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括例如單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體和人源化抗體，及其抗原結合片段。這些非天然存在的抗體可以用固相肽合成法構建，可以重組地產生，或通過例如篩選由重鏈可變區和輕鏈可變區組成的組合文庫而獲得(見Huse等人，Science 2461275-1281(1989)，在此引入作為參考文獻)。製造例如嵌合抗體、人源化抗體、CDR-移植抗體、單鏈抗體和雙功能抗體的這些和其它方法是本領域專業技術人員熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14243-246，1993；Ward等人，Nature 341544-546，1989；Harlow和Lane，抗體實驗室指南(AntibodiesAlaboratory manual)(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1988)；Hilyard等人，蛋白工程實用方法(Protein EngineeringA practical approach)(IRL出版社1992)；Borrabeck，抗體工程(Antibody Engineering)，第2版，(牛津大學出版社1995)；每一篇文章在此均引入作為參考文獻)。
與GDF受體特異地結合的抗體可以應用該受體作為免疫原，並通過使用激活素受體如Act RIB、Act RIIA或Act RIIB、或BMP受體如BMP RII、BMP RIA和BMP RIB去除與受體例如TGF-βI型或II型受體發生交叉反應的抗體(見Messague，見前，1998)而產生。本發明的抗體可很方便地用肌生長抑制素受體的肽部分產生，該部分在TGF-β、激活素或BMP受體中不存在。類似地，特異地結合肌生長抑制素功能前區的抗體可以用功能前區或其功能性肽部分作為免疫原而產生。當這種肽無免疫原性時，可以通過下面的方法使之具有免疫原性，將此半抗原偶聯到一個載體分子上如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍素(KLH)，或以融合蛋白的方式表達肽部分。偶聯半抗原到載體分子上的各種其它載體分子和方法是本領域熟知的(見，例如，Harlow和Lane，見前，1988)。
如果需要，可以製備用於本發明方法的含有抗體或其它藥劑的試劑盒。這種除藥劑外，試劑盒可以含有一個藥學組合物，其中藥劑可以經重製以給受試者用藥。試劑盒也可以含有，例如檢測抗體或檢測抗體與GDF受體特異結合的試劑。這些用於標記的試劑或另外識別抗體在這裡被描述，並為本領域已知。
在例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物中產生多克隆抗體的方法是本領域熟知的(見，例如，Green等人，「多克隆抗血清的產生」(Productionof Polyclonal Antisera)，在免疫化學規程(Immunochemical Protocols)中(Manson主編，Humana出版社1992)，第1-5頁；Coligan等人，「在兔、大鼠、小鼠和倉鼠中生產多克隆抗血清」(Production of PolyclonalAntisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters)，在Curr.ProtocolsImmunol.(1992)中，第2.4.1節；每一篇文章均在此引入作為參考文獻)。此外，單克隆抗體可以用本領域熟知和常規的方法獲得(Harlow和Lane，見前，1988)。例如，用肌生長抑制素受體或其抗原決定簇片段免疫小鼠，將脾細胞與一個合適的骨髓瘤細胞系如SP/02骨髓瘤細胞融合，以產生雜交瘤細胞。可以用標記抗原篩選克隆的雜交瘤細胞系，以識別分泌具有合適特異性的單克隆抗體的克隆，表達具有所需特異性和親合力的抗體的雜交瘤可以被分離並用作抗體的持續來源。可以進一步篩選不能與肌生長抑制素受體特異地結合的抗體。例如，這種抗體用於製備臨床應用的標準化試劑盒。表達例如抗肌生長抑制素受體單鏈抗體的重組噬菌體，也提供了可用於製備標準化試劑盒的抗體。
製備單克隆抗體的方法是熟知的(見，例如，Kohler和Milstein，Nature 256495，1975，在此引入作為參考文獻；又見，Coligan等人，見前，1992，見第2.5.1-2.6.7節；Harlow和Lane，見前，1988)。簡要地，單克隆抗體可以通過以下步驟獲得用含抗原的組合物給小鼠注射，通過取出血清樣本證實抗體產生的存在，取出脾臟以獲得B淋巴細胞，用骨髓瘤細胞融合B淋巴細胞以產生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇對抗原產生抗體的陽性克隆，並從雜交瘤培養物中分離抗體。
單克隆抗體可以通過各種廣為接受的技術從雜交瘤培養物中分離和純化，例如包括，蛋白-A瓊脂糖凝膠親合層析、尺寸排除層析和離子交換層析(Coligan等人，見前，1992，見第2.7.1-2.7.12節和第2.9.1-2.9.3節；又見，Barnes等人，「免疫球蛋白G(IgG)的純化」，在Meth.Molec.Biol.1079-104(Humana出版社1992)中，在此引入作為參考文獻)。體外和體內操作單克隆抗體的方法為本領域專業技術人員熟知。體外操作可以在適合的培養基中進行，如Dulbecco改進的Eagle培養基或RPMI1640培養基，任選地補充一種哺乳動物血清如胎牛血清或微量元素和生長支持添加劑(growth sustaining supplement)如正常小鼠腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞。體外生產提供了相對純的抗體製劑，可以大規模生產大量的所需抗體。大規模雜交瘤的培養可以通過均相懸浮培養在氣升式反應器、連續攪拌反應器、或固定化或細胞截留培養器中進行。體內操作可以通過將細胞克隆注射進與親代細胞組織相容的哺乳動物中，例如同系基因小鼠中進行，以引起產抗體腫瘤的生長。任選地，動物在注射前用烴類，特別是油，例如降植烷(四甲基十五碳烷)進行預致敏。1至3周後，從動物體液中回收所需的單克隆抗體。
這裡公開的抗體的治療應用也是本發明的一部分。例如，本發明的抗體也可以來自低於人類的靈長類的抗體。在狒狒中產生治療用抗體的一般技術可發現於，例如Goldenberg等人，國際專利出版物WO91/11465(1991)；和Losman等人，Int.J.Cancer 46310，1990中，每一篇文章在此均引入作為參考文獻。
治療用抗GDF受體抗體也可以來自「人源化」單克隆抗體。通過將來自小鼠免疫球蛋白的重鏈可變區和輕鏈可變區的小鼠互補性決定區移入人的可變區中，然後在小鼠對應物的框架區內替代以人的殘基，產生了人源化單克隆抗體。使用來自人源化單克隆抗體的抗體成分消除了小鼠恆定區免疫原性帶來的潛在問題。克隆小鼠免疫球蛋白可變區的一般技術是已知的(見，例如，Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA863833，1989，在此整體引入作為參考文獻)。生產人源化單克隆抗體的技術也是已知的(見，例如，Jones等人，Nature 321522，1986；Riechmann等人，Nature 332323，1988；Verhoeyen等人，Science 2391534，1988；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 894285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotechnol.12437，1992；和Singer等人，J.Immunol.1502844，1993；每一篇文章均在此引入作為參考文獻)。
本發明的抗體也可以來自從組合免疫球蛋白文庫中分離的人抗體片段(見，例如，Barbas等人，方法免疫學方法手冊(METHODSACompanion to Methods in Immunology)2119，1991；Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12433，1994；每一篇文章在此引入作為參考文獻)。用於產生人免疫球蛋白噬菌體文庫的克隆和表達載體可以從例如STRATAGENE克隆系統(La Jolla，CA)中獲得。
本發明的抗體也可以來自人單克隆抗體。這種抗體從轉基因小鼠中獲得，該小鼠已經被「改造」以對抗原激發反應產生特異的人抗體。在此技術中，人的重鏈基因座和輕鏈基因座元件被導入來自胚胎幹細胞系的小鼠株中，後者含有靶向破壞的內源性重鏈基因座和輕鏈鏈基因座。轉基因小鼠可以合成對人抗原特異的人抗體，且小鼠可被用於產生分泌人抗體的雜交瘤。從轉基因小鼠中獲得人抗體的方法已被描述，例如，Green等人，Nature Genet.713，1994；Lonberg等人，Nature368856，1994；和Taylor等人，Int.Immunol.6579，1994；每一篇文章均在此引入作為參考文獻。
本發明的抗體片段可以通過抗體的蛋白水解或通過編碼片段的DNA在大腸桿菌中的表達來製備。抗體片段可以用傳統的方法，經胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個抗體來獲得。例如，抗體片段可以用胃蛋白酶通過抗體的酶裂解產生，以提供一個表示為F(ab』)2的5S片段。此片段可以進一步用巰基還原劑裂解，和任選具有一種對由二硫鍵斷裂所產生的巰基基團具有封阻作用的基團，裂解以產生3.5S Fab』單價片段。可選擇地，用胃蛋白酶的酶裂解直接地產生了2個單價Fab』片段和一個Fc片段(見，例如，Goldenberg，美國專利4,036,945和美國專利4,331,647，每一篇文章在此引入作為參考文獻，以及其中包含的參考文獻；Nisonhoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89230.1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman等人，Meth.Enzymol.，1422(AcademicPress 1967)，每一篇文章在此引入作為參考文獻；又見，Coligan等人，見前，1992，見2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4節)。
假如片段特異地與被完整抗體識別的抗原結合，也可以使用其它裂解抗體的方法，如分離重鏈以形成單價輕鏈/重鏈片段，進一步裂解片段，或其它酶學的、化學的或遺傳學的技術。例如，Fv片段包括VH和VL鏈的聯合。此聯合可以是非共價的(Inbar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 692659，1972)。可選擇地，可變區鏈可以被一個分子間二硫鍵連接，或被一個化學藥品如戊二醛交聯(Sandhu，見前，1992)。優選地，包括VH和VL鏈的Fv片段由肽接頭連接。這些單鏈抗原結合蛋白(sFv)通過構建一個結構基因而製備，結構基因包括編碼VH和VL功能區的DNA序列，通過一個寡核苷酸連接。結構基因被插入一個表達載體中，隨後被導入一個宿主細胞如大腸桿菌中。重組宿主細胞合成單一的多肽鏈，有接頭肽橋接兩個V功能區。產生sFvs的方法被描述於，例如Whitlow等人，方法酶學方法手冊(MethodsA Companion to Methodsin Enzymology)297，1991；Bird等人，Science 242423-426，1988；Ladner等人，美國專利4,946,778；Pack等人，Bio/Technology 111271-1277，1993；每一篇文章均在此引入作為參考文獻；又見，Sandhu，見前，1992。
抗體片段的另一個形式是編碼單一互補性決定區(CDR)的肽。CDR肽(「最小識別單位」)可以通過構建編碼目的抗體CDR的基因來獲得。這種基因通過採用例如聚合酶鏈式反應來製備，以從產抗體細胞的RNA合成可變區(見，例如，Larrick等人，方法酶學方法手冊(MethodsA Companion to Methods in Enzymology)2106，1991，在此引入作為參考文獻)。
本發明還提供了一個鑑定GDF受體多肽的方法。這樣一種方法可以通過下面的步驟進行，例如，將含GDF多肽的成分，與表達全長受體或截短受體的細胞，在足以令GDF結合到受體上的條件下孵育；檢測GDF多肽與受體的結合；並分離受體。GDF可以是任何已知的GDF(如GDF-1-16)，優選地是GDF-8(肌生長抑制素)或GDF-11。分離受體的方法在下面的實施例章節中被更詳細地描述。因此，本發明也提供了一個基本純化的GDF受體，以及比天然存在的GDF受體有較少胺基酸殘基的GDF受體肽類和肽衍生物。這種肽類和肽衍生物可在研究肌肉消耗性疾病並開發更有效的治療方法中用於作為研究和診斷工具。
本發明進一步提供了GDF受體變異體。如這裡所用的，術語「GDF受體變異體」是指模仿GDF受體至少部分結構的分子。GDF受體變異體可用於減少或抑制GDF結合，從而如這裡公開的，緩解一種病理狀況。GDF受體變異體的實例包括但不限於，截短型GDF受體如GDF受體的可溶性細胞外功能區；顯性失活的GDF受體如顯性失活的ActRIIB受體，它缺少激酶活性；或其它截短型或突變體GDF受體。
本發明不僅涉及天然存在的GDF受體的肽類和肽衍生物，而且涉及GDF變異體，包括突變體GDF受體，和化學合成的、特異地結合GDF，如肌生長抑制素，的GDF受體衍生物。例如，本發明設想改變GDF受體的胺基酸序列。GDF受體可以通過改變編碼蛋白的DNA而改變。優選地，採用具有相同或相似特性的胺基酸，僅進行保守胺基酸的改變。胺基酸取代的實例包括丙氨酸改變為絲氨酸；精氨酸改變為賴氨酸；天門冬醯胺改變為穀氨醯胺或組氨酸；天門冬氨酸改變為穀氨酸；半胱氨酸改變為絲氨酸；穀氨醯胺改變為天門冬醯胺；穀氨酸改變為天門冬氨酸；甘氨酸改變為脯氨酸；組氨酸改變為天門冬醯胺或穀氨醯胺；異亮氨酸改變為亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸改變為纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸改變為精氨酸、穀氨醯胺或穀氨酸；蛋氨酸改變為亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸改變為酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；絲氨酸改變為蘇氨酸；蘇氨酸改變為絲氨酸；色氨酸改變為酪氨酸；酪氨酸改變為色氨酸或苯丙氨酸；纈氨酸改變為異亮氨酸或亮氨酸。
用於本發明的變異體包括GDF受體的類似體、同系物、突變蛋白質和模擬體，它們保留了與其各自的GDF特異地結合的能力。在另一個實施方案中，還設想了具有顯性失活活性的變異體GDF受體，不管此變異體是否也與其GDF特異地起作用。GDF受體肽類指具有這些活性的GDF受體的胺基酸序列部分。變異體可以通過化學修飾、蛋白水解酶消化、或兩者聯合，從GDF受體本身直接產生。此外，可以使用遺傳工程技術，以及直接從胺基酸殘基合成多肽的方法。
肽類可以用這種常用的方法合成，如α-氨基的t-BOC或FMOC保護。兩種方法包含通過從肽的C末端開始每一步加入一個胺基酸而逐步合成(Coligan等人，現代免疫學手冊(Current Protocols inImmunology)(Wiley Interscience，1991)，第9單元，在此引入作為參考文獻)。本發明的肽類也可以採用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，其中每克聚合物含0.1-1.0mMol胺，通過熟知的固相肽合成方法合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149，1962；Stewart和Young，固相肽合成(Solid Phase Peptides Synthesis)(Freeman，舊金山，1969)，見27-62頁，每一篇文章在此均引入作為參考文獻)。在化學合成完成時，該肽類可以解保護，並通過用液態HF-10％苯甲醚在0℃處理大約1/4-1小時而從聚合物上裂解。在藥劑蒸發後，用1％醋酸溶液從聚合物中提取肽類，然後凍乾產生粗原料。通常地，這樣可以在Sephadex G-15上，用5％醋酸作為溶劑，通過如凝膠過濾技術而純化。柱中的適當組分凍幹將產生均一的肽或肽衍生物，它們然後通過標準的技術而被定性，如胺基酸分析、薄層層析、高效液相色譜、紫外吸收光譜法、摩爾旋光、溶解度，並通過固相埃德曼降解來定量。
模擬GDF受體的結合和功能的非肽化合物(「模擬體(mimetics)」)可以用Saragovi等人概括的方法產生(Science 253792-95，1991，在此引入作為參考文獻)。模擬體是模擬蛋白二級結構成分的分子(Johnson等人，「肽全長模擬體」(Peptide Turn Mimetics)，在生物技術和藥劑學(Biotechnology and Pharmacy)(Pezzuto等人主編；Chapman和Hall，紐約1993)中，在此引入作為參考文獻)。應用肽模擬體的基本原理是，蛋白的肽骨骼主要地以使胺基酸側鏈促進分子間相互作用的方式存在。對於本發明來說，一個合適的模擬體可以認為相當於一個GDF受體的等同物。
較長的肽類可以通過「天然化學」連接技術將肽類連接在一起而產生(Dawson等人，Science 266776，1994，在此引入作為參考文獻)。變異體可以通過應用基因組或cDNA克隆方法的重組技術而產生。可以應用位點特異和區域定向誘變技術(Ausuble等人，見前，1989和1990至1993增刊)，見第1卷，第8章；蛋白工程(Protein Engineering)(Oxender和Fox主編，A.Liss，Inc.，1987))。此外，可以應用接頭掃描和PCR介導技術來誘變(Erlich，PCR技術(Stockton出版社1989)；Ausuble等人，見前，1989至1993)。應用上面任何技術的蛋白測序、結構和建模方法公開在上面引用的參考文獻中。
本發明還提供了阻斷GDF特異結合到其受體上的GDF受體結合劑。例如，這種結合劑在研究上面描述的肌肉消耗性疾病中，作為研究和診斷的工具以及用於有效的治療方法中，並可以用這裡公開的方法鑑定，例如製作分子模型方法。此外，含GDF受體結合劑的藥學組合物可以代表有效的療法。在本發明的上下文中，詞組「GDF受體結合劑」表示GDF受體的天然存在的配體，例如GDF-1至GDF-16；GDF受體的合成配體，或天然或合成配體的適當衍生物。配體的確定和分離是本領域熟知的(Lerner，Trends Neurosci.17142-146，1994，在此引入作為參考文獻)。
在另一個實施方案中，本發明涉及阻礙GDF受體和GDF間結合的GDF受體結合劑。這種結合劑可以通過競爭性抑制、非競爭性抑制或無競爭性抑制進行阻礙。GDF受體和一個或多個GDF間正常結合的阻礙可以產生有用的藥理學效果。
本發明還提供了一個鑑定與GDF受體結合的組合物的方法。此方法包括，將含該組合物的成分與GDF受體在足以使組成成分特異地相互作用的條件下孵育，並檢測組合物與GDF受體的結合。如上所述，結合到GDF受體上的組合物包括肽類、肽模擬體、多肽、化學化合物和生物藥劑。孵育包括將反應物置於使所測組合物與GDF受體接觸的條件下，並如會在體內發生的那樣，提供適於特異性相互作用的條件。接觸可以在溶液中或在固相內進行。如上所述，所測的配體/組合物可以任選地是一個組合文庫，以篩選大量組合物。在本發明方法中鑑定的組合物，在溶液中或在結合到一個固體支持物上之後，通過一般用於檢測特定DNA序列的任一方法如PCR、寡聚物限制性(Saiki等人，Bio/Technology 31008-1012，1985，在此引入作為參考文獻)、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針分析(Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 80278，1983，在此引入作為參考文獻)、寡核苷酸連接測定(OLA)(Landegren等人，Science 2411077，1988，在此引入作為參考文獻)、和類似方法(見Landegren等人，Science 242229-237，1988.在此引入作為參考文獻)，被進一步評價、檢測、克隆、測序等。
為確定一個組合物是否可以功能性地與受體蛋白複合，可以通過監測外源基因編碼蛋白的蛋白水平的改變，或通過這裡公開的任何其它方法，監測外源基因的誘導。當鑑定一個組合物可以誘導外源基因的轉錄時，可以得出的結論是，此組合物可以特異地結合到受體蛋白上，該受體蛋白由編碼原始樣本測定組合物的核酸編碼。
外源基因的表達可以通過例如功能試驗或蛋白產物分析來監測。因此，外源基因是一個提供可分析/可測定的表達產物的基因，以使外源基因的表達可以檢測。這種外源基因包括但不限於，報告基因如氯黴素乙醯基轉移酶基因、鹼性磷酸酶基因、β-半乳糖激酶、螢光素酶基因、綠色螢光蛋白基因、鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶、鹼性磷酸酶，和抗生素抗性基因如新黴素磷酸轉移酶(見上)。
外源基因的表達表示組合物和GDF受體特異性的相互作用；因此，結合性或阻斷性組合物可以被鑑定和分離。本發明的組合物可以用已知的、常用的蛋白純化技術，如提取、沉澱、離子交換層析、親合層析、凝膠過濾和類似方法，從培養基或細胞中提取和純化。組合物可以用結合到柱基質上的、修飾的受體蛋白細胞外功能區，通過親合層析，或通過肝素層析而分離。
如上所述，組合化學方法也包括在本發明的篩選方法中，該法可鑑定結合到GDF受體上的化合物。因此，篩選方法也具有鑑定變異體、結合劑或阻斷劑等的用途，它們如果不是物理地(如，空間地)，就是功能性地作為所需要的拮抗劑或激動劑起作用。
下面的實施例試圖舉例說明，但並不限制本發明。
實施例1肌生長抑制素以劑量依賴的方式起作用此實施例表明，肌生長抑制素抑制肌肉生長的活性依賴於肌生長抑制素的體內表達水平。
肌生長抑制素是骨骼肌質量的負性調節物(McPherron等人，見前，1997；McPherron和Lee，見前，1997)。屬肌生長抑制素基因缺失純合子的肌生長抑制素敲除小鼠，總體重增加25-30％。對純合子敲除小鼠的檢查顯示，肌肉量的增加是由於全身骨骼肌大約增加100-200％。
肌生長抑制素突變雜合子的小鼠，總體重也增加。然而，雜合子增加的量小於純合子增加的量，且在許多檢測中僅有一個年齡和性別組有統計學顯著性。為確定雜合子小鼠是否在野生型小鼠和純合子小鼠之間具有中間的表現型，對肌肉重量的分析擴展到雜合子小鼠。雜合子小鼠的單個肌肉標本比野生型小鼠重大約25-50％。這些結果顯示，肌生長抑制素基因缺失的雜合小鼠在野生型小鼠和純合的肌生長抑制素敲除小鼠之間具有一個中間的表現型，表明肌生長抑制素在體內產生一個劑量依賴的效應。
這些結果提示，肌生長抑制素活性的調節可以用於治療肌肉消耗性疾病和其它伴隨肌生長抑制素活動的代謝性異常。而且，肌生長抑制素的劑量依賴作用提示，可以在肌生長抑制素活性沒有達到完全抑制的情況下獲得治療效果，因此，假如例如某種活性水平產生了受試者不需要的作用，可以調節肌生長抑制素的活性。
實施例2肌生長抑制素的作用隨敲除小鼠的年齡而下降此實施例表明，伴隨著突變體小鼠肌肉重量的下降，野生型小鼠和純合的肌生長抑制素敲除小鼠間體重的差異減小。
肌生長抑制素敲除小鼠在5月齡時比野生型小鼠重大約25-30％(McPherron等人，見前，1997)。然而，當動物變老時，這個總體重的差異顯著地變小或完全地消失。為了確定此效果是否是由於敲除小鼠體重的相對丟失，因為例如肌肉衰退，或因為野生型小鼠獲得的體重相對較大，將肌肉重量作為年齡的函數對其進行了詳細分析。
在從2個月到17個月檢測的所有年齡中，純合突變的小鼠胸肌重量顯著高於同窩出生的野生型小鼠。在5個月時觀察到最顯著的差異，此時突變體小鼠的胸肌重量大約多200％。儘管在較大的年齡，胸肌重量略有下降，但突變體小鼠此肌肉的重量仍然比野生型小鼠大2倍。在檢測的所有其它肌肉中觀察到同樣的基本傾向，包括肱三頭肌、四頭肌、腓腸肌和蹠肌、和脛骨前肌。在雄性和雌性小鼠中都觀察到相似的傾向。這些結果表明，突變體和野生型小鼠間隨年齡觀察到的總體重差別的下降，是由於突變體小鼠肌肉重量的輕度下降。
實施例3肌生長抑制素以劑量依賴的方式影響脂肪聚積此實施例表明，肌生長抑制素敲除小鼠不能聚積脂肪，且脂肪聚積的減少與肌生長抑制素體內表達的水平相關。
如實施例2所示，由於肌生長抑制素突變體肌肉重量的下降沒有完全解釋所觀察到的，野生型動物最終重量與突變體小鼠大致相同，於是檢測了野生型和突變體小鼠脂肪聚積的量。檢測雄性小鼠腹股溝、附睪和腹膜後的脂肪墊。在2月齡時，這些脂肪墊中任何一個的重量在野生型和突變體小鼠間沒有差異。到5至6月齡時，野生型和雜合的敲除小鼠都具有較大範圍的脂肪墊重量，平均，當動物達到9至10月齡時，脂肪墊重量增加大約3至5倍。由於在這些動物中觀察到的大範圍脂肪墊重量，一些動物顯示比其它動物更大的增加(高達10倍)。
與野生型和雜合的敲除小鼠相反，肌生長抑制素純合突變體小鼠的脂肪墊重量在相對窄的範圍內，在2月齡小鼠與9至10月齡小鼠中實際上是相同的。因此，野生型小鼠中隨著年齡而增加的脂肪聚積在純合的肌生長抑制素敲除小鼠中觀察不到。在純合突變體小鼠中，此脂肪聚積的差異與肌肉重量輕度下降一起，作為年齡的函數，完全解釋了觀察到的野生型動物最終與突變體動物具有相同的總體重。
在9至10月齡，雜合敲除小鼠的平均脂肪墊重量介於野生型小鼠和純合突變體小鼠的中間。儘管由於在這些小鼠和野生型小鼠中脂肪墊的重量範圍寬，使這個差異沒有統計學顯著性，但這些結果仍然提示肌生長抑制素對脂肪聚積具有劑量依賴的作用，與其對肌肉生長的作用相似。
實施例4肌生長抑制素對代謝的影響此實施例表明，血清胰島素和葡萄糖水平、以及代謝活動受肌生長抑制素表達水平的影響。
為確定肌生長抑制素突變體小鼠中的骨骼肌肥大和缺少脂肪聚積是否是由於對總體代謝的影響，檢測了突變體小鼠的代謝概況。同野生型對照小鼠相比(表1)，肌生長抑制素突變體小鼠的血清甘油三酯和膽固醇水平顯著地降低。肌生長抑制素突變體小鼠的血清胰島素水平也顯示較低。但在純合突變體小鼠和野生型小鼠之間，餵食和空腹葡萄糖水平都沒有區別(表1)，且兩組小鼠在糖耐量試驗中都有正常的反應。結果顯示，儘管純合肌生長抑制素敲除小鼠的血清胰島素水平低於野生型動物，但它能夠保持血清葡萄糖的正常水平。
表1.血清參數+/+ -/-甘油三酯(mg/dl)131.5+/-16.5 66.8+/-11.4 p＝0.012膽固醇(mg/dl) 138.3+/-8.1 94.5+/-6.8 p＝0.0034
餵食葡萄糖(mg/dl) 114.0+/-4.8 119.3+/-5.2 n.s.(p＝0.43)空腹葡萄糖(mg/dl) 86.5+/-3.8103.3+9.3 n.s.(p＝0.13)+/+代表野生型小鼠；-/-代表純合敲除小鼠為確定代謝率的差異是否可以解釋突變體小鼠缺少脂肪聚積，用熱量計比較了野生型和突變體小鼠的耗氧率。突變體小鼠的基礎代謝率和總代謝率比野生型對照小鼠低。這些結果提示，突變體小鼠缺少脂肪聚積不是由於代謝活動率較高。
實施例5肌生長抑制素在遺傳肥胖的小鼠中影響脂肪聚積此實施例表明，在肥胖遺傳學模型小鼠中，肌生長抑制素表達缺乏抑制脂肪的聚積。
為確定肌生長抑制素活性缺乏是否不僅在正常小鼠，而且在肥胖小鼠中抑制脂肪聚積，檢測了代表肥胖遺傳學模型的棕灰色的黃色致死(Ay)小鼠(Yen等人，FASEB J.8479-488，1994)中肌生長抑制素突變的影響。產生致死性黃色和肌生長抑制素突變的雙重雜合小鼠，並檢測這些雙重雜合小鼠雜交的子代小鼠。
與Ay/a，肌生長抑制素+/+小鼠相比，Ay/a，肌生長抑制素-/-雙突變小鼠的總體重令人注目地下降(大約9克)。考慮到Ay/a，肌生長抑制素-/-雙突變體的骨骼肌比Ay/a，肌生長抑制素+/+小鼠多大約2至3倍，此總體重的下降更突出。雙突變體的肌肉比Ay/a，肌生長抑制素+/+小鼠多大約10克，因此，其餘組織的總重量減少大約是19克。
總體重下降由總體脂肪含量減少引起。如表2所示，與Ay/a，肌生長抑制素+/+小鼠相比，Ay/a，肌生長抑制素-/-雙突變體的子宮旁和腹膜後脂肪墊重量減少5倍至6倍。這些結果提示，肌生長抑制素突變的存在顯著地抑制肥胖症的脂肪聚積。
肌生長抑制素突變的存在也顯著地影響葡萄糖代謝。缺少肌生長抑制素突變的野灰色致死性小鼠有很不正常的糖耐量試驗結果，其血糖水平常常達到450至600mg/dl並在4個小時時間內僅僅慢慢恢復到基線水平。如前所述，對雌性野灰色致死性小鼠的影響小於雄性小鼠，一些雌性在此試驗中的反應幾乎正常(見，Yen等人，見前，1994)。相反，儘管Ay/a，肌生長抑制素-/-小鼠的糖耐量試驗輕度異常，但在Ay/a，肌生長抑制素+/+小鼠中沒有一隻觀察到很大的異常。
這些結果提示，肌生長抑制素突變在野灰色致死性小鼠中至少部分地抑制異常糖代謝的形成。顯著地，肌生長抑制素突變雜合子的小鼠同肌生長抑制素+/+和肌生長抑制素-/-小鼠相比，具有中間的反應，因此證實了肌生長抑制素的劑量依賴作用。
實施例6重組肌生長抑制素的純化此實施例提供了一個製備和分離重組肌生長抑制素的方法。
為闡明肌生長抑制素的生物學活性，純化了大量肌生長抑制素蛋白以進行生物試驗。穩定的產生高水平肌生長抑制素蛋白的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，採用甲氨喋呤選擇方案，通過共擴增一個含二氫葉酸還原酶盒的肌生長抑制素表達盒來產生(McPherron等人，見前，1997)。通過在羥磷灰石、刀豆植物血凝素瓊脂糖凝膠、DEAE瓊脂糖和肝素瓊脂糖凝膠上的連續分級分離，從最高生產細胞系的條件培養基中純化肌生長抑制素。銀染色分析顯示，在這4個柱層析步驟後獲得的純化蛋白(稱作「肝素洗脫物」)，由分子量大約35千道爾頓(kDa)和12kDa的兩種成分組成。
純化的蛋白製劑用各種標準測定，表明是兩個肌生長抑制素功能前區肽的複合體，和一個二硫鍵連接的肌生長抑制素肽成熟C末端的二聚體。首先，western印跡分析，用針對原肌生長抑制素序列特異部分而產生的抗體鑑定作為功能前區的35kDa帶和作為成熟C末端肽的12kDa帶。其次，在非還原條件下，與直接抗成熟C末端肽的抗體起作用的種類，具有與二硫鍵連接的二聚體一致的電泳遷移率。第三，功能前區與成熟C末端肽的摩爾比率大約為1∶1。第四，功能前區和成熟C末端肽也能經過4柱層析步驟共純化。最後，即使C末端區不含公認的N-連接的糖基化信號，成熟的C末端肽結合到刀豆植物血凝素柱上，提示成熟的C末端肽由於其與功能前區肽相互作用而結合到該柱上，功能前區含有潛在的N-連接的糖基化位點。
這些結果提示，由遺傳學修飾的CHO細胞產生的肌生長抑制素，以蛋白酶水解加工的形式分泌，得到的功能前區和成熟C末端區非共價地聯合，以形成一個複合體，它含有兩個功能前區肽和一個二硫鍵連接的C末端蛋白水解片段二聚體，與TGF-β的描述相似。在TGF-β複合體中，C末端二聚體以無活性的潛在形式存在(Miyazono等人，J.Biol.Chem.2636407-6415，1988)，通過用酸、離液劑、活性氧類、或纖溶酶處理，或通過與其它蛋白相互作用包括血小板反應蛋白和整連蛋白Ivβ6，可以從此潛在複合體中釋放活性種類(Lawrence等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1331026-1034，1985；Lyons等人，J.Cell.Biol.1061659-1665，1988；Schultz-Cherry和Murphy-Ullrich，J.Cell.Biol.122923-932，1993；Barcellos-Hoff和Dix，Mol.Endocrinol.101077-1083，1996；Munger等人，細胞(Cell)96319-328，1999)。進一步，將純化的功能前區肽(還已知為潛伏期伴隨肽或LAP)加到TGF-β複合體中抑制了純化的C末端二聚體在體外和體內的生物學活性(Gentry和Nash，生物化學296851-6857，1990；Bottinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935877-5882，1996)。
由功能前區和成熟C末端肽組成的肝素洗脫物用HPLC C4反相柱進一步純化。C末端二聚體早於功能前區從HPLC柱上洗脫，因此，可以分離不含功能前區的C末端二聚體。也可以獲得主要含功能前區的級分，儘管這些級分含有少量的C末端二聚體。這些蛋白中的一些也表現為高分子量複合體。高分子量複合體的性質尚不清楚，但根據有或無還原劑的western印跡分析，這些複合體可至少含有一個功能前區肽和一個C末端成熟肌生長抑制素肽，兩者由一個或更多二硫鍵連接。事實上，在富含前肽的HPLC級分(HPLC級分35-37)中出現的成熟C末端肽，大多數存在於這些高分子量複合體中。這些較高分子量的複合體似乎代表由遺傳學修飾的CHO細胞分泌的不正確摺疊的蛋白。
實施例7肌生長抑制素與激活素受體特異地相互作用此實施例表明，肌生長抑制素特異地結合一個在培養的細胞上表達的激活素II型受體，且此特異性結合被肌生長抑制素功能前區抑制。
已經鑑定了一些TGF-β家族成員的受體，大多數是單一的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶(Massague和Weis-Garcia，Cancer Surveys2741-64，1996)。例如，已知激活素II型受體(Act RIIA和/或Act RIIB)結合TGF-β超家族的成員。缺少Act RIIB受體小鼠的表現型顯示前/後軸型缺陷和腎臟異常，與GDF-11敲除小鼠中觀察到的非常相似(McPherron等人，Nat.Genet.22260-264，1999；Oh和Li，Genes Devel.111812-1826，1997)。因為在成熟C末端區，GDF-11和肌生長抑制素(GDF-8)的胺基酸序列有90％同一性，所以檢測了肌生長抑制素特異地與激活素II型受體相互作用的能力。
肌生長抑制素通過放射性碘化作用標記，用轉染了Act RIIB表達構建物的COS細胞進行結合性研究。肌生長抑制素特異地與轉染的COS細胞相互作用。肌生長抑制素的結合性被過量未標記的肌生長抑制素以劑量依賴的方式競爭，且在用空載體轉染的對照COS細胞中顯著地降低。對用BMP RII或TGF-βRII表達構建物轉染的細胞沒有發生有效的結合。肌生長抑制素對Act RIIB轉染細胞的結合是可飽和的，通過斯卡查德分析測定的結合親合力為大約5nM。
受體結合試驗也被用於檢測肌生長抑制素功能前區抑制成熟C末端二聚體與此系統中Act RIIB特異地相互作用的能力。添加純化的功能前區肽以劑量依賴的方式阻斷了C末端二聚體結合Act RIIB轉染的COS細胞的能力。這些結果提示，肌生長抑制素功能前區是肌生長抑制素的天然抑制劑。
實施例8增高的肌生長抑制素水平導致重量減輕此實施例表明，體內肌生長抑制素水平升高可以引起相當大的重量減輕。
在一組實驗中，表達肌生長抑制素的CHO細胞被注射給裸鼠。有表達肌生長抑制素的CHO細胞瘤的裸鼠，在細胞注射後大約12至16天的過程中顯示出嚴重的消瘦。此消瘦症狀在注射了任何各種對照CHO細胞系的裸鼠中沒有觀察到，這些對照細胞系經過了相似的選擇處理但不表達肌生長抑制素。此外，用於轉染CHO細胞的構建物中的肌生長抑制素編碼序列是受金屬硫蛋白啟動子控制的，當給帶肌生長抑制素表達瘤的小鼠供應含硫酸鋅的水時，消瘦症狀加重。Western印跡分析顯示，帶有表達肌生長抑制素的CHO細胞的裸鼠，血清中有高水平的肌生長抑制素蛋白。這些結果提示，裸鼠的消瘦症狀是對肌生長抑制素水平升高而引起的反應，如下面討論的，用純化的肌生長抑制素注射小鼠觀察到的相似作用證實了此結果。
在帶有表達肌生長抑制素的CHO細胞的裸鼠中觀察到的令人注目的體重減輕，主要地是由於脂肪和肌肉重量都不成比例的減輕。同帶對照CHO細胞瘤的小鼠相比，白脂肪墊重量(肩胛內白、子宮和腹膜後脂肪)減少超過90％。肌肉重量也嚴重地下降，在16天時，表達肌生長抑制素小鼠的單個肌肉重量大約是對照小鼠的一半。此肌肉重量的減輕反映在纖維體積和蛋白含量的相應下降。
帶有表達肌生長抑制素的CHO細胞瘤的小鼠還形成了嚴重的低血糖症。然而，體重減輕和低血糖症不是由於進食的差異，因為在16天研究過程中的每一個檢測時間段內，所有小鼠消耗相同量的食物。這些結果提示，肌生長抑制素過度表達引起顯著的體重減輕，這與患有慢性疾病，如癌症或AIDS，的病人中發生的惡病質消瘦症狀是相似的。
隨著用低劑量肌生長抑制素的更慢性的給藥，觀察到了脂肪重量的改變。例如，每天2次注射1μg肌生長抑制素蛋白7天，導致許多不同白脂肪墊(肩胛內白、子宮和腹膜後脂肪墊)的重量下降大約50％，而對褐色脂肪(肩胛內褐)沒有顯著影響。這些結果證實，肌生長抑制素可以引起體重減輕，並在極端的情況下，引起活體消瘦症狀。
實施例9結合到激活素受體的肌生長抑制素的定性此實施例描述了在體內鑑定肌生長抑制素結合激活素受體與肌生長抑制素產生的生物學作用之間關係的方法。
Act RIIA或Act RIIB敲除小鼠可被用於在體內證實Act RIIA或Act RIIB是肌生長抑制素的受體。對這些小鼠詳細的肌肉分析可以確定激活素受體敲除是否與肌肉纖維數量或大小的改變有關。由於ActRIIA/Act RIIB雙純合突變體在胚胎形成過程中早期死亡(Song等人，Devel.Biol.213157-169，1999)，因此只能檢測各種純合/雜合的組合。但是，可以產生組織特異的或條件性敲除小鼠，使得兩種基因可以僅在肌肉中都「刪除」，因而可以在出生後檢測雙純合的敲除小鼠。
可以隨小鼠的年齡檢測對脂肪組織的作用，以確定在敲除小鼠中脂肪細胞數量或這些脂肪細胞中的脂質聚積是否改變。用從膠原酶處理的組織中製備的細胞懸液測定脂肪細胞數量和大小(Rodbell，J.Biol.Chem.239375-380，1964；Hirsch和Gallian，J.Lipid Res.9110-119，1968)。通過測量乾屍重量以及提取脂質後殘餘的乾屍重量來確定動物的總脂質含量(Folch等人，J.Biol.Chem.226497-509，1957)。
還可以檢測各種血清參數，包括餵食和空腹葡萄糖和胰島素、甘油三酯、膽固醇和苗條蛋白。如上面公開的，血清甘油三酯和血清胰島素在肌生長抑制素突變體動物中下降。還可以用糖耐量試驗檢測激活素受體敲除小鼠對外源葡萄糖負荷的反應能力。如上面公開的，5月齡野生型和肌生長抑制素突變體小鼠對葡萄糖負荷的反應基本上是相同的。通過測量小鼠年老時的這些參數可以擴展此觀察。在糖耐量試驗過程中的不同時間還可以測量血清胰島素水平。
也可以用一個熱量計(Columbus Instruments)監測基礎代謝率。如上面公開的，3月齡時，肌生長抑制素突變體小鼠的代謝率較其對應的野生型低。此分析可以擴展到年老小鼠，而且還可以測量這些動物的呼吸商。通過測量基礎體溫以及當置於4℃時它們保持體溫的能力，可以確定保持正常生熱作用的能力。也可以檢測褐色脂肪的重量，及UCP1、UCP2和UCP3在褐色脂肪、白脂肪、肌肉和其它組織中的表達水平(Schrauwen等人，1999)。
可以監測相對於體重增加的食物攝取量，並可以計算餵養效率。此外，可以監測在高脂膳食下動物的體重增加。保持高脂膳食的野生型小鼠迅速地聚積脂肪，然而這裡公開的結果提示，激活素受體突變動物將相對地保持瘦態。
這些研究的結果可以提供肌生長抑制素對小鼠影響的更完全的概觀，特別是有關其總體代謝狀態，從而理解關於肌生長抑制素敲除小鼠抑制脂肪聚積的能力是否是肌肉中肌生長抑制素突變的合成代謝作用，它引起能量應用的變換，使得很少能量可被用來以脂肪的形式儲存。例如，脂肪聚積的減少可以是由於生熱作用速度增加。這些結果也會提供一個基礎，以比較在肥胖症和II型糖尿病的不同遺傳學模型範圍內，肌生長抑制素活性的作用。
實施例10在肥胖症和II型糖尿病遺傳學模型中，肌生長抑制素作用的特性此實施例描述了確定肌生長抑制素在治療肥胖症或II型糖尿病中的作用的方法。
同野生型小鼠相比，肌生長抑制素突變體小鼠的總體脂肪聚積令人注目地減少，提示可以改變肌生長抑制素活性以治療或預防肥胖症或II型糖尿病。可以在這些代謝性疾病的幾個特性清楚的小鼠模型背景中檢測肌生長抑制素突變的作用，這些模型包括，例如「肥胖」小鼠(ob/ob)、「糖尿病」小鼠(db/db)、和野灰色黃色致死性(Ay)突變品系。上面描述的每個參數和試驗在所有這些品系實際上是異常的(見，例如，Yen等人，見前，1994，Friedman和Halaas，Nature 395763-770，1998)。通過構建雙重突變體，然後對雙重突變體動物與合適的僅攜帶ob/ob、db/db、或野灰色黃色致死性突變的對照同窩出生仔一起進行各種試驗，可以檢測肌生長抑制素突變在攜帶這些其它突變的小鼠中減緩或抑制這些異常形成的能力。
如上面公開的，Ay小鼠中肌生長抑制素突變與肌生長抑制素突變Ay小鼠大約5倍的脂肪聚積抑制相關，並如糖耐量試驗所評定的，與部分抑制糖代謝異常的形成有關。這些結果可以擴展到包括另外各種年齡的動物，且可以用ob/ob和db/db突變體進行相似的研究。由於這些突變都是隱性的，可以產生肌生長抑制素突變和ob或db突變雙重純合的小鼠。為檢測肌生長抑制素功能部分缺失在這些遺傳學模型系統中的作用，也檢測了ob或db突變純合和肌生長抑制素突變雜合的小鼠。已經產生了肌生長抑制素和ob突變雙重雜合的小鼠，可以檢測來自這些雙重雜合小鼠交配的子代，特別是關於脂肪聚積和糖代謝。在肥胖突變體中，這些異常之一或兩者都部分抑制，可能提示肌生長抑制素是治療肥胖症和II型糖尿病的靶標。
實施例11表達能夠影響肌生長抑制素活性的顯性失活多肽的轉基因小鼠的特性此實施例描述了通過表達顯性失活多肽，在出生後鑑定肌生長抑制素作用的方法，該顯性失活多肽可以阻斷肌生長抑制素表達或肌生長抑制素信號轉導。
肌生長抑制素抑制劑在出生後調節肌生長抑制素活性，可被用來確定肌生長抑制素對肌肉纖維數量(增生)和肌肉纖維大小(肥大)的作用。條件性肌生長抑制素敲除小鼠，其肌生長抑制素基因在動物生命的限定時間被刪除，可被用於這些研究。tet調節物和cre重組酶一起提供了產生這種小鼠的系統。在此系統中，cre的表達是由給予強力黴素進行誘導的。
也可以產生一個從可誘導的啟動子表達肌生長抑制素抑制劑的轉基因小鼠，這樣可以在動物生命過程中的限定時間減弱或抑制肌生長抑制素的活性。四環素調節物被用於產生這種轉基因小鼠，其中肌生長抑制素的表達由強力黴素誘導。
一個tet系統的修飾，應用雜交逆向tet-反式激活劑(VP16活化功能區與突變體逆向tet阻遏物的融合蛋白)和雜交逆向tet-反式阻遏物(哺乳動物Koxl的KRAB阻遏物功能區與天然tet阻遏物的融合蛋白)的共表達，可以特別地用來產生轉基因小鼠(Rossi等人，Nat.Genet.20389-393，1998；Forster等人，Nucl.Acids Res.27708-710，1999)。在此系統中，雜交逆向tet-反式阻遏物結合tet操縱基因序列，並僅在四環素存在時激活轉錄；雜交逆向tet-反式阻遏物結合tet操縱基因序列並僅在沒有四環素時抑制轉錄。通過這兩個融合蛋白的共表達，靶啟動子的基礎活性在沒有四環素時被tet-反式阻遏物沉默，並在給予四環素時被逆向tet-反式激活劑激活。
可以產生兩型轉基因系。在第一型中，在肌肉特異的啟動子，例如肌肉肌酸激酶啟動子(Sternberg等人，見前，1988)或肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子(Donoghue等人，見前，1991)的控制下，轉基因編碼肌生長抑制素抑制劑多肽。篩選在骨骼肌中tet調節物特異性表達的單個轉基因系，為兩個啟動子中的每一個選擇幾個獨立的系並檢測，以證實觀察到的任何作用不是由於例如整合位點特異的作用。已經構建了一個含2個在肌球蛋白輕鏈啟動子/增強子控制下的tet調節物的構建物，並可以用於前核注射。在第二型系中，轉基因含有在最小CMV啟動子控制下的肌生長抑制素抑制劑多肽，它進一步含有tet操縱基因序列。
肌生長抑制素抑制劑可以是顯性失活形式的肌生長抑制素，或肌生長抑制素功能前區，如這裡公開的，後者可以抑制肌生長抑制素活性。TGF-β家族成員的顯性失活形式已經被描述(見，例如，Lopez等人，Mol.Cell Biol.121674-14679，1992；Wittbrodt和Rosa，Genes Devel.81448-1462，1994)，並含有例如突變的蛋白水解切割位點，從而防止蛋白被加工成生物活性形式。當在細胞內與內源性野生型基因共表達時，突變體蛋白與野生型蛋白一起形成無功能雜合二聚體，因此作為顯性失活起作用。已經構建了一個在原肌生長抑制素切割位點內含有突變的突變體肌生長抑制素多肽，並在293細胞中，通過以不同的比率與野生型肌生長抑制素共表達，可以檢測顯性失活的作用。可以用western印跡分析檢測暫時轉染了構建物的293細胞的條件培養基，並可以檢測突變體阻斷成熟C末端二聚體形成的能力。
還可以使用僅編碼肌生長抑制素功能前區的表達構建物。如上面公開的，功能前區與成熟C末端二聚體形成一個緊密的複合體，並阻斷成熟C末端肌生長抑制素二聚體在表達受體的培養細胞中結合ActRIIB的能力。通過與TGF-β類比，肌生長抑制素功能前區也能夠以無活性潛在複合體形式在體內保留成熟C末端二聚體。
這些轉基因動物可以與表達tet調節物的動物一起培育，產生含tet調節物和抑制劑靶標的構建物的雙重轉基因系。這些雙重轉基因系可以被篩選，以找到其中所有不同的成分都合適地表達的系。在飲水中給予強力黴素前和後，採用獲取自各系中有代表性小鼠的各種肌肉和對照組織的RNA，進行Northern印跡分析，可以用來鑑定這種轉基因系。在沒有強力黴素的情況下不表達任何轉基因，而有強力黴素時僅在肌肉中表達轉基因的轉基因系將被選擇。
對選擇的轉基因動物給予強力黴素並檢測其對肌肉量的影響。給懷孕的母體使用強力黴素以在胚胎形成過程中誘導抑制劑的表達。在轉基因動物發育過程中，阻斷肌生長抑制素活性的效果可以與肌生長抑制素敲除小鼠中觀察到的效果相比。由於同肌生長抑制素最初表達的時間相比，驅動tet調節物表達的啟動子可以在發育過程的較晚時間被誘導，因此對轉基因小鼠肌肉量的影響可以與肌生長抑制素敲除小鼠中發生的效果相比。
通過在出生後不同的時間給雙重轉基因小鼠使用強力黴素，可以檢測出生後抑制肌生長抑制素活性的效果。強力黴素處理可以在例如3周齡時開始，並可以在5月齡時分析動物，此時，肌生長抑制素敲除小鼠與野生型小鼠肌肉重量的差異最大。檢測了抑制劑對動物肌肉量的影響。也可以對肌肉進行組織學檢測以確定對纖維數量和纖維大小的影響。此外，可以進行轉基因動物各種肌肉的纖維類型分析，以確定對I型和II型纖維是否具有選擇性作用。
強力黴素可以用不同的劑量並在不同的時間用藥，以鑑定肌生長抑制素抑制劑的作用。雙重轉基因小鼠也可以被慢性地維持使用強力黴素，然後如上所述檢測對脂肪墊和其它相關代謝參數的影響。這些研究的結果可以證實，出生後調節肌生長抑制素活性可以增加肌肉量或減少脂肪聚積，因而提示，靶向肌生長抑制素可以用於臨床治療各種肌肉消耗性和代謝性疾病。
肌生長抑制素也可以檢測含肌生長抑制素轉基因的轉基因小鼠，並可以將肌生長抑制素表達產生的影響與含表達肌生長抑制素的CHO細胞的裸鼠中的觀察效果進行比較。與上面描述的相似，肌生長抑制素可被置於條件性(tet)和組織特異性調控元件的控制之下，可以檢測轉基因小鼠中肌生長抑制素的表達以確定發生的消瘦症狀是否與裸鼠中的觀察相似。肌生長抑制素轉基因可以包括例如來自SV40的加工信號，使轉基因能夠與內源性肌生長抑制素基因相區別。
在給予強力黴素後的各時間點，可以從肌生長抑制素轉基因小鼠中分離血清樣本，並可以測定血清中肌生長抑制素轉基因產物的水平。隨著時間監測動物的總體重以確定動物是否表現顯著的重量減輕。此外，分離和稱重了單個肌肉和脂肪墊，並在選擇的肌肉樣本中測定肌肉纖維的數量、大小和類型。
肌生長抑制素轉基因表達的水平可以因給予動物的強力黴素的劑量不同而變化。轉基因表達可以被監測，採用例如，肌肉中轉基因RNA水平的northern印跡分析，或血清中肌生長抑制素蛋白的水平。測定肌生長抑制素轉基因表達的特定水平可以確定與肌生長抑制素引起的消瘦程度的相關性。轉基因系也可以與肌生長抑制素敲除小鼠雜交，以產生轉基因為唯一肌生長抑制素表達源的小鼠。可以監測發育過程中各時間點的肌生長抑制素表達，並確定肌生長抑制素對纖維數量、纖維大小、和纖維類型的影響。獲得可精確和迅速控制肌生長抑制素表達的小鼠提供了一個有力的工具，以進一步鑑定肌生長抑制素信號轉導通路，並檢測各種潛在地可能用於調節肌生長抑制素信號轉導的藥劑的效果。
肌生長抑制素信號轉導的效應物可以產生含肌生長抑制素信號轉導通路任一顯性失活形式的轉基因小鼠，該信號轉導通路可以包括TGF-β信號轉導通路的成分，它特異地在骨骼肌中表達。如這裡公開的，通過由激活素II型受體誘導的通路介導信號轉導的Smad蛋白，可能涉及肌生長抑制素信號轉導。
Act RIIB可以結合與肌生長抑制素高度相關的GDF-11(McPherron等人，見前，1997；Gamer等人，見前，1999；Nakashima等人，Mech.Devel.80185-189，1999)，且能夠結合抑制Smad2、Smad3、和Smad4的c-ski的表達令人注目地影響肌肉生長(Sutrave等人，見前，1990；Berk等人，見前，1997；又見，Luo等人，見前，1999；Stroschein等人，見前，1999；Sun等人，見前，1999a和b；Akiyoshi等人，見前，1999)。如這裡公開的，肌生長抑制素特異地與Act RIIB相互作用，因此能夠發揮其生物學作用，至少部分通過體內結合激活素II型受體並激活Smad信號通路。
採用在Act RIIB/Smad信號轉導通路的特定點上阻斷或能夠被阻斷的轉基因小鼠系，可以檢測Smad信號轉導通路在調節肌肉生長中的作用。肌肉肌酸激酶啟動子或肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子可被用於驅動Smad信號轉導通路各種抑制劑的表達。
用於此系統中的抑制劑可以包括例如，濾泡素抑制素；顯性失活的Act RIIB受體；顯性失活的Smad多肽如Smad3；c-ski；或抑制性Smad多肽如Smad7。濾泡素抑制素可以結合併抑制某種TGF-β家族成員的活性，包括GDF-11(Garmer等人，見前，1999)。例如通過表達截短的GDF受體，例如通過表達細胞外功能區，特別是Act RIIB細胞外功能區的可溶性形式，或通過表達缺少激酶功能區或含有使突變體受體缺少激酶活性的突變的截短型Act RIIB受體，可以獲得顯性失活形式的激活素II型受體。Smad7作為一個抑制性Smad起作用，它可以阻斷由激活素、TGF-β、和BMP誘導的信號轉導通路。例如，通過突變Smad3的C末端磷酸化位點可以構建Smad3的顯性失活形式，從而阻斷Smad3的功能(Liu等人，見前，1997)。在轉基因小鼠中，c-ski過度表達已經發現與肌肉肥大有關聯(Sutrave等人，見前，1990)。
可以製備轉基因小鼠並檢測每一個起始系，以使轉基因適當的、肌肉特異性的表達。檢測被選擇小鼠的總體重、個體肌肉重量、及肌肉纖維大小、數量和類型。如上所述，那些顯示對肌肉量有明顯影響的系可以進一步檢測脂肪聚積和其它相關的代謝參數。應用這些不同的藥劑尋靶激活素受體/Smad信號轉導通路中的特定步驟，是特別有信息價值的，因為不同藥劑的信號轉導通路在不同的步驟中有重疊。例如，濾泡素抑制素結合併抑制激活素和GDF-11活性但不影響TGF-β，而顯性失活的Smad3可以通過激活素和TGF-β受體阻斷信號傳導。Smad7可能是更多向性的，因為它還阻斷通過BMP受體的信號傳導。本研究可使調節肌生長抑制素活性的特定靶位得以確定，從而提供了開發藥劑和其它藥劑的各種策略，這些藥劑和藥劑調節肌生長抑制素的信號轉導並進而調控肌生長抑制素的活性。
特別地，這裡描述的轉基因系可以用於確定出生後阻斷肌生長抑制素功能或Smad信號轉導通路對形成肥胖症或II型糖尿病的作用。例如，抑制性轉基因可以雜交進ob/ob、db/db和Ay突變體小鼠中。在沒有強力黴素時，抑制劑轉基因不表達，因此動物與每個親代突變體小鼠沒有差別。在強力黴素存在的情況下，抑制劑被表達並可以阻斷肌生長抑制素活性。可以檢測在這些突變體動物中阻斷肌生長抑制素活性對形成代謝性異常的影響。
抑制劑的表達可以在較早年齡時誘導，例如在3周齡，以使效果最大化。此外，可以在代謝性異常嚴重到不可逆轉之前阻斷肌生長抑制素活性。動物可以維持給予強力黴素，並在不同的年齡用上面描述的試驗測評，包括涉及脂肪聚積和葡萄糖代謝的試驗。在ob/ob、db/db和Ay突變體動物中，可以發現在一個或多個試驗結果出現異常的年齡組中存在延遲。可以用已經形成一些肥胖症或II型糖尿病跡象的老年動物進行相似的研究，並測定肌生長抑制素活性阻斷對各種參數的影響，包括脂肪重量和葡萄糖代謝。這些研究結果可以進一步確定特異性靶標，它們在預防或治療肥胖症或II型糖尿病的努力中可以被操作控制。
實施例12肌生長抑制素特性對誘導惡病質的影響此實施例描述了確定肌生長抑制素信號轉導在惡病質形成和進展中的作用的方法。
在正常個體中，激活素受體和Smad通路可以構成涉及介導肌生長抑制素活性的至少部分信號轉導通路，因此，可以涉及介導個體中因肌生長抑制素過高水平而發生的影響。如這裡公開的，例如惡病質，至少可以部分地通過異常的高水平肌生長抑制素介導。如此，通過Smad通路調控信號轉導的方法可以提供一個開發藥劑的新策略，以開發治療全身肌肉消耗、特別是惡病質的藥劑。
Smad信號轉導通路在惡病質中的作用，可以通過檢測上面描述的各種轉基因系對惡病質的易感性而確定，惡病質可以由以下因子誘導，如白介素-6(IL-6；Black等人，內分泌學1282657-2659，1991，在此引入作為參考文獻)、腫瘤壞死因子-I(TNF-I；Oliff等人，細胞50555-563，1987，在此引入作為參考文獻)、或某種腫瘤細胞。就IL-6和TNF-I來說，抑制劑轉基因可被雜交進裸鼠背景中，然後用產生IL-6或TNF-I的CHO細胞激發動物，當IL-6或TNF-I以此方式過度表達時，導致裸鼠消瘦。可以採用上面描述的、用於製備過度產生肌生長抑制素的細胞的方法，製備過度產生IL-6或TNF-I的CHO細胞。例如，TNF-I cDNA可被克隆進pMSXND表達載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521-3527，1988)，然後可以在逐漸增加甲氨喋呤濃度的情況下，逐步選擇攜帶表達構建物擴增拷貝的細胞。
腫瘤細胞如Lewis肺癌細胞(Matthys等人，Eur.J.Cancer27182-187，1991，在此引入作為參考文獻)或結腸26腺癌細胞(Tanaka等人，J.Cancer Res.502290-2295，1990，在此引入作為參考文獻)，可以導致小鼠惡病質，也可被用於這些研究。當這些細胞系在小鼠中長成腫瘤時，引起嚴重的消瘦。於是，可以在這裡描述的各種轉基因小鼠中檢測這些腫瘤的影響。應當認識到，各種腫瘤細胞將僅在一定的遺傳背景下生長。例如，Lewis肺癌細胞常規地在C57 BL/6小鼠中生長，而結腸26癌細胞常規地在BALB/c小鼠中生長。因此，轉基因可被回交進這些或其它遺傳學背景中，以使腫瘤細胞生長。
可以監測各種參數包括總體重、單個肌肉重量、肌纖維大小和數量、食物攝取量和血清參數包括葡萄糖水平。此外，可以檢測血清肌生長抑制素水平和肌肉中肌生長抑制素RNA的水平，以證實增高的肌生長抑制素表達與惡病質相關。這些研究的結果可以證實，在這些實驗模型中，肌生長抑制素的作用是惡病質誘導劑的下遊。結果還可證實，在這些模型中，Smad信號轉導通路對於惡病質的形成是必須的，並可表明通過調節Smad信號傳送可以在惡病質的治療中獲得治療益處。
實施例13生長分化因子-8(GDF-8)和GDF-11受體的鑑定和特性描述此實施例描述了GDF-8(肌生長抑制素)和GDF-11的細胞表面受體鑑定和特性描述的方法。
純化的GDF-8和GDF-11蛋白將主要用於評定生物學活性。為鑑定GDF-8和GDF-11作用的潛在靶細胞，要尋找表達其受體的細胞。為此，純化的蛋白將用氯胺T方法進行放射性碘化，此方法已成功地用於標記此超家族的其它成員如TGF-β(Cheifetz等人，見前，1987)、激活素(Sugino等人，J.Biol.Chem.26315249-15252，1988)和骨形態發生蛋白(Paralkar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 883397-3401，1991)，以進行受體結合研究。每個成熟加工形式的GDF-8和GDF-11都含有多個酪氨酸殘基。將採用兩個不同的方法鑑定這些蛋白的受體。
一個方法將確定受體的數量、親合力和分布。在細胞培養中生長的全細胞、胚胎或成年組織的冷凍切片、或從組織或培養的細胞中製備的全膜組分將與標記的蛋白孵育，並將測定結合蛋白的數量或分布。對於涉及細胞系或細胞膜的試驗，結合量的測定將通過在數次衝洗後測量結合到培養皿上的細胞上的放射活性，或就細胞膜而言，在離心或用濾器保留膜後，測量與膜一起沉積的放射活性。對於涉及原代培養的試驗，細胞數量可以更有限，將通過用照相乳劑覆蓋而直接地顯示結合部位。對於涉及冷凍切片的試驗，將通過暴露這些切片於高分辨Beta-max超級膠片而顯示配體結合部位；如果需要更好的定位，將把切片浸泡於照相乳劑中。對於所有這些試驗，將通過添加過量未標記蛋白作為競爭者來確定特異性結合(例如，見Lee和Nathans，見前，1988)。
第二個方法將用生物化學的方法描述受體的特性。細胞膜製劑或在細胞培養中生長的潛在靶細胞將與標記的配體一起孵育，受體/配體複合物將用雙琥珀醯亞胺辛二酸酯共價地交聯，雙琥珀醯亞胺辛二酸酯已經被普遍地用於鑑定各種配體的受體，包括TGF-β超家族成員的受體(Massague和Like，J.Biol.Chem.2602636-2645，1985)。交聯的複合體通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳被分離，以尋找過量未標記蛋白的條帶，在沒有過量未標記蛋白存在時不會有該標記條帶；而在過量未標記蛋白存在時會有該標記條帶。推定受體的分子量將通過減去配體的分子量而估算。這些試驗將解決的一個重要問題是，GDF-8和GDF-11是否像其它TGF-β超家族成員一樣，通過I型和II型受體傳遞信號(Massague和Weis-Garcia，見前，1996)。
一旦檢測這些分子的受體的一個方法已經完成，將進行更詳細的分析以確定結合親合性和特異性。將使用斯卡查德分析確定結合部位的數量和解離常數。通過進行GDF-8和GDF-11之間的交叉競爭分析，將有可能確定它們是否能夠結合到同一個受體上及它們的相對親合性。這些研究將給出關於分子是否經過相同或不同的受體發送信號的提示。將用其它TGF-β家族成員進行競爭試驗以確定特異性。這些配體中的某一些從商業途徑獲得，其它一些從Genetics Institute，Inc.獲得。
對於這些試驗，將檢測各種胚胎和成年組織以及細胞系。根據GDF-8特異地表達在骨骼肌上和GDF-8敲除小鼠的表現型，最初的研究集中在胚胎和成年的肌肉組織以製備細胞膜，並用冷凍切片研究受體。此外，如所述，將在妊娠期的不同天數從胚胎中分離和培養成肌細胞，或從成年肌肉中分離和培養衛星細胞(Vivarelli和Cossu，Devel.Biol.117319-325，1986；Cossu等人，Cell Diff.9357-368，1980)。在細胞培養後各天，將在這些原代細胞上進行結合研究，通過放射自顯影定位結合部位，使得結合部位可以與各種肌原性的標記物如肌肉肌球蛋白共同被定位(Vivarelli等人，J.Cell.Biol.1072191-2197，1988)，並將與細胞的分化狀態如多核肌小管的形成與結合相關聯。除應用原代細胞以外，將應用細胞系尋找受體。特別是，最初集中在3個細胞繫上，C2C12、L6和P19。C2C12和L6成肌細胞在細胞培養中自發分化並依賴特定的生長條件形成肌小管(Yaffe和Saxel，見前，1977；Yaffe，見前，1968)。P19胚胎瘤細胞可被誘導分化成各種細胞類型，包括在有DMSO的情況下分化成骨骼肌細胞(Rudnicki和McBurney，畸胎癌和胚胎幹細胞一個實用方法(Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellA practical approach)(E.J.Robertson，IRL出版社，劍橋1987)。將在各種生長條件下及各種分化階段對這些細胞系進行受體結合研究。儘管最初的研究集中在肌肉細胞上，但也將檢測其它組織和細胞類型的GDF-8和GDF-11受體的存在情況。
重組人GDF-8(rhGDF-8)同型二聚體將被用在這些結合研究中。RhGDF-8用CHO細胞表達，並純化到大約90％的純度。rhGDF-8具有期望的25kDa至27kDa的分子量，一旦還原，還原成12kDa的單體。在受體-配體結合試驗中採用I-125標記的GDF-8，兩個成肌細胞系，L6和G-8，與GDF-8結合。結合是特異性的，因為非標記的GDF-8有效地競爭標記配體的結合。解離常數(Kd)是370pM，且L6成肌細胞具有較高數量(5,000受體/細胞)的細胞表面結合蛋白。GDF-11(BMP-11)與GDF-8是高度同源的(＞90％)。受體結合研究顯示，GDF-8和GDF-11結合到L6成肌細胞上的相同結合蛋白上。重要的是要確立GDF-8是否與已知的TGF-β受體結合。TGF-β不競爭GDF-8的結合，提示GDF-8受體與TGF-β受體不同。GDF-8受體不在所有的成肌細胞系上表達，包括4個成肌細胞系，C2C12、G7、MLB13MYCc14和BC3H1，它們不結合GDF-8。
可以獲得編碼GDF-8和GDF-11受體的基因。作為理解GDF-8和GDF-11發揮其生物學作用的機制的第一步，重要的是克隆編碼其受體的基因。從上面的實驗中，對GDF-8和GDF-11是否結合相同的或不同的受體將會更清楚。還會有關於這些受體的組織和細胞類型分布的重要信息。應用此信息，將採取兩個不同的方法克隆受體基因。
第一個方法將使用表達克隆策略。事實上，這是最初由Mathews和Vale(細胞65973-982，1991)及Lin等人(細胞68775-785，1992)用來克隆第一個激活素和TGF-β受體的策略。從表達最高相對數目的高親合力結合部位的組織或細胞類型中將獲得Poly-A選擇的RNA，並用於在哺乳動物表達載體pcDNA-1中製備一個cDNA文庫，pcDNA-1含有一個CMV啟動子和SV40複製起點。文庫將被鋪平板，來自每個平板的細胞將匯入肉湯並冷凍。來自每個庫的等分試樣將生長以製備DNA。每一個庫將在小室玻片中被暫時地轉染進COS細胞，轉染的細胞將與碘化的GDF-8或GDF-11一起孵育。在衝走未結合的蛋白後，配體結合部位將通過放射自顯影顯示。一旦識別一個陽性庫，來自該庫的細胞將以較低的密度重新鋪平板，並將重複此步驟。然後將陽性庫鋪平板，將每個克隆精選進並如所述再分析(Wong等人，Science228810-815，1985)。
最初，將使用大小為1500個菌落的庫進行篩選。為確信在這樣複雜的混合物中鑑定出一個陽性克隆，將進行採用TGF-β和克隆的II型受體的對照實驗。編碼TGF-βII型受體的編碼序列將被克隆進pcDNA-1載體中，用此構建物轉化的細菌將與來自我們文庫的細菌以各種比例混合，包括1∶1500。然後，由此混合物製備的DNA將轉染進COS細胞，與碘化的TGF-β一起孵育，並通過放射自顯影顯示。如果在1∶1500比例下觀察到陽性信號，那麼將篩選含有1500個克隆的庫。否則，將使用與相應比率相對應的較小的庫，在這種情況下，在對照實驗中，該操作過程足以敏感到鑑定到一個陽性信號。
大多數TGF-β超家族成員的受體已經被鑑定屬於跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶家族(Massague和Weis-Garcia，見前，1996)，利用此事實還將使用第二個相似的嘗試克隆GDF-8和GDF-11受體的策略。由於這些受體的胞漿功能區在序列上相關，將使用簡併PCR探針以克隆此受體家族的成員，它們在含有GDF-8和GDF-11結合部位的組織中表達。事實上，這是已經被用於鑑定此受體家族大多數成員的方法。一般的策略將是，設計與已知受體保守區相應的簡併引物，將這些引物用於對製備自合適的RNA樣本(最可能來自骨骼肌)的cDNA進行PCR，亞克隆PCR產物，最後對單個亞克隆測序。當序列被鑑定時，它們將被用作雜交探針以從進一步分析中消除重複的克隆。然後，將測試被鑑定的受體結合純化的GDF-8和GDF-11的能力。由於此篩選將僅產生小的PCR產物，因此將從製備自合適組織的cDNA文庫中獲得每個受體的全長cDNA克隆，插入pcDNA-1載體中，轉染進COS細胞，並將測試轉染的細胞結合碘化GDF-8或GDF-11的能力。理想地，在此篩選中鑑定的每一個受體將檢測與這些配體結合的能力。然而，被鑑定受體的數量可以很大，分離所有全長cDNA，檢測它們需要相當大的努力。幾乎肯定地說，一些被鑑定受體會相當於已知的受體，對於它們，或者從其它研究者那裡獲得全長cDNA克隆，或者根據公開發表的序列通過PCR擴增編碼序列，應當是簡單的。對於新的序列，將通過northern印跡分析確定組織分布，最優先考慮的事是指向那些表達方式與上面確定的GDF-8和/或GDF-11結合部位的分布最緊密相似的受體。
特別地，已知這些受體分成兩類，I型和II型，它們可以根據序列區分並均需完全的活性。某些配體在沒有II型受體時不能結合I型受體，而其它則能夠與兩型受體都結合(Massague和Weis-Garcia，見前，1996)。上面概述的交聯實驗應當給出有關I型和II型受體是否也都涉及GDF-8和GDF-11信號發送的一些指示。如果如此，為全面理解GDF-8和GDF-11如何傳輸其信號，克隆這兩個受體亞型將是重要的。由於不能預測在沒有II型受體時，I型受體是否能夠與GDF-8和GDF-11相互作用，所以將首先克隆II型受體。只有當這些配體的至少一個II型受體已經被鑑定後，才會進行鑑定GDF-8和GDF-11I型受體的嘗試。一般的策略將是，II型受體與PCR篩選中鑑定的每一個I型受體共轉染，然後通過交聯檢測轉染的細胞。如果I型受體是GDF-8或GDF-11受體複合體的一部分，將在轉染的細胞中應當探測到兩個交聯的受體種類，一個相當於I型受體，另一個相當於II型受體。
由於至少一個稱作GDNF的TGF-β超家族成員能夠通過一個完全不同類型的、涉及GPI-聯成分(糖基磷脂醯肌醇聯成分)(GDNFR-α)和受體酪氨酸激酶(c-ret；Trupp等人，Nature 381785-789，1996；Durbec等人，Nature 381789-793，1996；Treanor等人，Nature 38280-83，1996；Jing等人，細胞851113-1124，1996)的受體複合體發送信號，對GDF-8和GDF-11受體的尋找進一步複雜化。儘管GDNF是TGF-β超家族成員在相關性上最遙遠的，其它TGF-β家族成員也能通過類似的受體系統發送信號肯定是可能的。如果GDF-8和GDF-11確實通過相似的受體複合體發送信號，表達篩選方法應當至少能夠鑑定出此複合體中GPI-聯成分(實際上，GDNFR-α採用表達篩選方法來鑑定)。就GDNF來說，GDNF-和c-ret-缺陷型小鼠的相似表現型提示c-ret是GDNF的潛在受體。
實施例14
GDF-11敲除小鼠的製備和特性GDF-11敲除小鼠的表現型在許多方面與攜帶一種對某些TGF-β超家族成員受體的受體的存在缺失的小鼠表現型相似，包括激活素IIB型受體(Act RIIB)。為確定GDF-11的生物學功能，GDF-11基因胚胎幹細胞被同源定位破壞。
根據Stratagene(La Jolla，CA)提供的產品說明書，在λFIXII中製備小鼠129 SvJ基因組文庫。GDF-11基因的結構從限制性圖譜和從文庫中分離的噬菌體克隆的部分測序中推導。製備靶向構建物的載體由Philip Soriano和Kirk Thomsa惠贈。為保證得到的小鼠不具有GDF-11功能，去除了完整的成熟C末端區並置換成一個neo基因盒。用靶向構建物轉染R1 ES細胞，用9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(2uM)和G418(250ug/ml)選擇，並通過Southern印跡分析法分析。
GDF-11基因的同源定位在8/115 9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤/G418雙重抗性ES細胞克隆中觀察到。在將幾種靶向克隆注射進C57BL/6J胚胎後，從一個ES克隆中獲得了嵌合體，當與雌性C57BL/6J和129/SvJ雜交時，產生雜合仔。C57BL/6J/129/SvJ雜種F1雜合體的雜交產生49個野生型(34％)、94個雜合子(66％)，沒有純合突變體成年子代。相似地，在129/SvJ背景中沒有見到成年純合無效動物(32個野生型(36％)和56個雜合子突變體(64％)動物)。
為確定純合突變體死亡的年齡，在不同妊娠年齡，從曾經與雜合雄性交配的雜合雌性中分離成窩胚胎，測定基因型。在檢測的所有胚胎階段，純合突變體胚胎以接近預期的頻率25％出現。在雜種新生小鼠中，不同基因型也以預期的孟德爾比率出現，1∶2∶1(34+/+(28％)，61+/-(50％)和28-/-(23％))。純合突變體小鼠活著出生並能夠呼吸和餵奶。但所有純合突變體在出生後第一個24小時內死亡。準確的死亡原因不清楚，但死亡率可能與純合突變體的腎臟嚴重的發育不良或完全缺失有關。
純合突變體動物可以通過其極短或缺失的尾巴而被容易地識別。為進一步鑑定這些純合突變體動物的尾巴缺陷，檢測了它們的骨骼以確定尾椎骨破壞的程度。但是，對胚胎晚期和新生小鼠的野生型和突變體骨骼標本的比較顯示，差異不僅存在於動物的尾部區域，而且也存在於許多其它區域。幾乎在記錄了差異的每一例中，異常看起來表現為脊柱節段一致的變形，其中特定的節段看起來具有更前面節段的形態特徵。這些變形在從頸部區域到尾部區域的整個軸向骨骼中是明顯的。除軸向骨骼中見到的缺陷以外，骨骼的其餘部分，如頭蓋骨和四肢骨看起來是正常的。
突變體新生動物中的脊柱前變形最容易表現在胸區，那裡有顯著的胸椎(T)節段數量的增加。所有檢測的野生型動物顯示典型的13個胸椎，每一個伴有一對肋骨。相反，純合突變體小鼠顯示胸椎數量驚人的增加。所有檢測的純合突變體有另外4至5對肋骨，總共17至18對，儘管在這些動物當中，超過1/3當中，第18肋顯示為不發育。因此，正常應當對應於腰椎(L)的L1至L4或L5節段在突變體動物中看起來已經變形為胸椎節段。
此外，胸部區域內的變形也是明顯的，其中一個胸椎具有另一個胸椎的形態學特徵。例如，在野生型小鼠中，第7對肋骨與胸骨附著，剩下的6對不附著或游離。在純合突變體中，附著和游離的肋骨對數量分別增加至10-11和7-8。因此，在野生型動物中都有游離肋骨的胸椎節段T8、T9、T10，在某些情況下甚至有T11，在突變體動物中都變形為具有更前面的胸椎的典型特徵，即出現肋骨附著到胸骨上。與此發現一致，正常在野生型動物的T10上發現的過渡性棘突和過渡性關節突，在純合突變體中發現在T13上。在某些突變體動物中還記錄了胸部區域內另外的變形。例如，在野生型小鼠中，來自T1的肋骨一般地接觸到胸骨的頂端。但是，在檢測的2/23雜種和2/3 129/SvJ純合突變體小鼠中，T2看起來已經變形為具有與T1相似的形態；即，在這些動物中，來自T2的肋骨延長到與胸骨頂端接觸。在這些情況下，來自T1的肋骨看起來與第二對肋骨融合。最後，在82％的純合突變體中，一般出現在T2上的長棘突移到T3位置上。在某些其它純合突變體中，見到在其它的胸椎水平有脊柱胸骨肋骨對的不對稱融合。
前變形不限於胸部區域。我們觀察到的前部的最大變形在第6頸椎(C6)水平。在野生型小鼠中，通過腹側存在的兩個前結節可以容易地識別C6。在幾個純合突變體小鼠中，儘管這兩個前結節中的一個存在於C6上，但另一個卻出現在C7的位置。因此，在這些小鼠中，C7看起來已經部分變形為具有與C6相似的形態。另外一個純合突變體在C7上有2個前結節，但在C6上保留了一個前結節，成為一個完全的C7到C6變形，但部分的C6到C5變形。
軸向骨骼的變形也延伸到腰部區域。野生型動物一般地僅有6個腰椎，而純合突變體有8至9個。由於上面描述的數據提示，4至5個腰椎節段變形成胸椎節段，所以在突變體中，至少有6個腰椎一定來自通常由骶椎和尾椎產生的節段。因此，純合突變體小鼠具有總共33-34個骶前椎骨，相比在野生型小鼠中一般存在26個骶前椎骨。最常見的骶前椎骨類型是，突變體小鼠C7/T18/L8和C7/T18/L9，相比野生型小鼠是C7/T13/L6。由於後肢相對於前肢的位置後移了7至8個節段，因此甚至在沒有詳細的檢查骨骼的情況下，就觀察到在突變體動物中存在額外的骶前椎骨。
在純合突變體小鼠中，儘管骶椎和尾椎也被影響，但每個變形的確切性質不是容易識別的。在野生型小鼠中，尾部節段S1和S2同S3和S4相比，具有典型的寬橫突。在突變體中，沒有看起來是可識別的S1或S2椎骨。取而代之，突變體動物有幾個看起來具有與S3形態相似的椎骨。此外，所有4個骶椎的橫突通常相互融合在一起，儘管在新生時經常僅見到前3個椎骨的融合。然而，在純合突變體中，骶椎的橫突通常是不融合的。在最尾的區域，所有突變體動物還有嚴重的椎骨畸形及廣泛的軟骨融合。儘管融合的嚴重性使計數尾部區域椎骨的數量很困難，但在幾個動物中數出高達15個橫突。不能確定這些是否代表了突變體的骶或尾椎，因為區分S4和尾椎的形態學標準即使在野生型新生動物中也沒有建立。不管其身份，此區域椎骨的總數量顯著地少於大約30的正常數量。因此，儘管突變體較野生型小鼠有顯著多的胸椎和腰椎，但由於尾巴的截短，突變體節段的總數量是減少的。
雜合小鼠在軸向骨骼中也顯示異常，儘管其表現型比純合小鼠更像野生型。雜合小鼠中最明顯的異常是存在一個額外的帶有一對肋骨的胸椎節段。此變形存在於受檢的每一個雜合動物中，且在每一例中額外的肋骨對都附著在胸骨上。因此，T8，其伴隨的肋骨一般不與胸骨接觸，看起來已變形為更前胸椎的形態學特徵，且L1看起來已變形為後胸椎的形態學特徵。在雜合小鼠中也見到各種程度的表現出前變形的其它異常。這些包括，T2特徵性的長棘突移動一個節段到T3，關節突和棘突從T10移到T11，C6上的前結節移到C7，T2變形到T1，T2伴隨的肋骨與胸骨頂端接觸。
為理解GDF-11突變體小鼠中見到的軸向型異常的基礎，檢測了在發育各階段分離的突變體胚胎，並與野生型胚胎比較。通過大體形態學檢查，直到妊娠期第9.5天分離的純合突變體胚胎不易與相應的野生型胚胎區分。特別地，在任何特定的發育年齡，存在的體節數目在突變體和野生型胚胎間是一樣的，提示體節形成的速率在突變體中是沒有改變的。在妊娠期後第10.5-11.5天，通過後肢後移7-8體節，可以容易地區分突變體胚胎和野生型胚胎。在此階段，尾部發育異常也容易顯現。合起來看，這些數據提示，在突變體骨骼中觀察到的異常代表了節段本身的真正變形，而不是通過例如增加體節生成速率插入額外的節段。
已知含同源異形框的基因表達改變引起果蠅和脊椎動物的變形。為了解Hox基因(脊椎動物含同源異形框的基因)的表達模式在GDF-11零突變體中是否改變，在妊娠期後第12.5天的野生型、雜合子和純合子突變體胚胎中，通過全樣原位雜交，測定了3個代表性Hox基因，Hoxc-6、Hoxc-8和Hoxc-11的表達模式。Hoxc-6的表達模式在野生型胚胎中橫跨原脊椎8-15，對應於胸部節段T1-T8。但在純合突變體中，Hoxc-6表達模式向後遷移並延伸至原脊椎9-18(T2-T11)。用Hoxc-8探針見到相似的遷移。在野生型胚胎中，Hoxc-8在原脊椎13-18(T6-T11)中表達，但在純合突變體胚胎中，Hoxc-8在原脊椎14-22(T7-T15)中表達。最後，Hoxc-11表達也向後遷移，因為表達的前界從野生型胚胎中的原脊椎28改變到突變體胚胎中的原脊椎36(注意到，由於後肢的位置在突變體胚胎中也向後遷移，Hoxc-11的表達模式在野生型和突變體中相對於後肢看起來是相似的)。這些數據提供了進一步的證據，即突變體動物中見到的骨骼異常代表著相同的改變。
GDF-11小鼠的表現型提示，GDF-11在胚胎形成的早期作為軸向結構的整體調節物起作用。為開始調查GDF-11發揮其作用的機制，通過全樣原位雜交在小鼠早期胚胎中檢測了GDF-11的表達模式。在這些階段，GDF-11表達的原始部位與已知的中胚層細胞產生的位置準確地相關。GDF-11的表達首先在妊娠期後第8.25-8.5天(8-10體節)的原條區探測到，這是內移細胞形成發育胚胎的中胚層的部位。在8.75天時，表達保持在原條中，但在妊娠期後第9.5天時，尾芽代替原條成為新的中胚層細胞來源，GDF-11的表達遷移到尾芽。因此，在這些早期階段，GDF-11看起來在發育中的胚胎區域內合成，在此新的中胚層細胞產生並可能獲得其位置的認同。
GDF-11敲除小鼠的表現型在幾個方面與TGF-β超家族某些成員的受體，如激活素IIB型受體(Act RIIB)，缺失小鼠的表現型相似。與GDF-11敲除小鼠的情況一樣，Act RIIB敲除小鼠具有額外的肋骨對，且腎臟缺陷的範圍從腎臟發育不良到完全缺失。這些小鼠表現型的相似性提出了Act RIIB可以是GDF-11受體的可能性。但是，Act RIIB可能不是GDF-11的唯一受體，因為GDF-11敲除小鼠的表現型比ActRIIB小鼠的表現型更嚴重。例如，儘管GDF-11敲除動物有4-5對額外的肋骨並在整個軸向骨骼上顯示相同的變形，但Act RIIB敲除動物僅有3對額外的肋骨且不在其它軸水平顯示變形。此外，數據提示，GDF-11敲除小鼠的腎臟缺陷也比Act RIIB敲除小鼠更嚴重。Act RIIB敲除小鼠在左/右軸形成中顯示缺陷，如肺異構和心臟範圍的缺陷，這些我們還沒有在GDF-11敲除小鼠中觀察到。儘管產生的這些配體的敲除小鼠中沒有一個顯示左/右軸形成的缺陷，但Act RIIB可以結合激活素和某些骨形態發生蛋白(BMP)。
如果GDF-11確實直接作用於中胚層細胞以建立位置認同，那麼這裡給出的數據將與GDF-11作用的短範圍或形態發生素模式一致。即，當中胚層細胞在GDF-11表達的部位產生時，GDF-11可以作用在中胚層前體上以建立Hox基因表達的模式，或可選擇地，在胚胎後端產生的GDF-11可以擴散以形成形態發生素梯度。無論GDF-11的作用機制是什麼，在GDF-11敲除動物中仍然出現大體的前/後結構圖式發育，提示GDF-11可能不是前/後結構特化的唯一調節物。不過，GDF-11作為軸向結構圖式發育的整體調節物而發揮重要作用是明確的，對此分子的進一步研究將導致關於脊椎動物胚胎中如何沿前/後軸建立位置認同的重要的新認識。
預期在GDF-8敲除動物中有相似的表現型。例如，當與野生型比較時，預期GDF-8敲除動物有肋骨數目增加、腎臟缺陷和解剖差異。
實施例15表達肌生長抑制素前肽、濾泡素抑制素或負顯性ACT RIIB的轉基因小鼠的產生肌生長抑制素的純化 用furin蛋白酶PACE表達構建體(由Monique Davies惠贈)轉染攜帶肌生長抑制素表達載體的擴增拷貝的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系以改善前體蛋白的加工。條件介質(由Cell Trends，Middletown，MD製備)連續通過羥磷灰石(用200mM磷酸鈉洗提，pH7.2)、lentil植物凝集素sepharose(用50mM pH7.4的Tris、500mM的NaCl、500mM的甲基甘露糖)、DEAE瓊脂糖(通過50mMpH7.4的Tris、50mM NaCl的柱收集的物質)和Sepharose肝素(用50mM mM pH7.4的Tris、200mM NaCl洗提)。然後將從肝素柱獲得的洗提物與反相C4 HPLC柱結合併用0.1％三氟乙酸中的乙肼洗提。抗成熟C-末端蛋白抗體見前述(見美國專利號5,827,733，在此引入以供參考)。為了升高抗前肽抗體，人肌生長抑制素蛋白全長胺基酸122-261部分使用RSET載體(Invitrogen，San Diego，CA)在細菌中表達，通過鎳螯合色鐠儀純化，並給兔注射。通過Spring Valley Labs(Woodbine，MD)進行免疫分析。
受體結合.使用氯胺T方法(Frolik，C.A.，Wakefild，L.M.，Smith，D.M. Spom，M.B.(1984)J Biol Chem 259，10995-11000)對純化的肌生長抑制素進行放射性碘示蹤。生長在6或12孔板的COS-7細胞用1-2μgpCMV5或pCMV5/受體構建物利用脂胺法(Gibco，Rockville，MD)進行轉染。轉染後進行2天交叉實驗，見(Franzen，P.，ten Dijke，P.，Ichijo，H.，Yamashita，H.，Schultz，P.，Heldin，C.-H. Miyazono，K.(1993)Cell75，681-692)的描述。對定量受體結合測定，用含有1mg/ml BSA的PBS洗2次細胞單層，在4℃，有或沒有多種濃度的未標記肌生長抑制素、前肽或濾泡素抑制素存在下與標記的肌生長抑制素孵育。然後用相同的緩衝液衝洗細胞3次，在0.5N NaOH中溶解，並在γ計數儀中計數。在用Act RIIB轉染的細胞和用載體轉染的細胞之間結合肌生長抑制素的差異計算特異性結合。計算特異性結合的方法在評價前肽的效果中特別重要，因為加入前肽也降低濃度-依賴方式中的非特異性結合。
轉基因小鼠.編碼截短形式的小鼠Act RIIB全長胺基酸1-174、小鼠肌生長抑制素前肽全長胺基酸1-267以及人濾泡素抑制素短形式的DNA被克隆進MDAF2載體中，該載體中含有肌球蛋白輕鏈啟動子和1/3的增強子(McPherron，A.C. Lee，S.-J(1993)J Biol Chem 268，3444-3449)。包含肌球蛋白輕鏈調節序列和SV40加工區的純化的轉基因用於微注射。所有的微注射和胚胎轉染物由Johns Hopkins School ofedicine Transgenic Core Facility進行。雜交體SJL/C57BL/6背景的轉基因標記配進野生型C57BL/6小鼠中，使用F1子代進行所有的研究。為了分析肌肉重量，從幾乎所有的動物的兩側分離個體肌肉標本，使用左側和右側肌肉重量的平均值。根據描述(McPherron，A.C.，Lawler，A.M. Lee，S.-J.(1997)Nature 387，83-90)分析縣委的數目和大小。如所述(McPherron，A.C. Lee，S.-J.(1993)J Biol Chem 268，3444-3449)進行RNA分離和Northern分析。
為了過多的產生肌生長抑制素蛋白，產生攜帶擴增的肌生長抑制素表達構建體的CHO細胞系(McPherron，A.C.，Lawler，A.M. Lee，S.-J.(1997)Nature 387，83-90)。通過在羥磷灰石、Ientil植物凝集素sepharose(用50mM pH7.4的Tris、500mM的NaCl、500mM的甲基甘露糖)、DEAE瓊脂糖和Sepharose肝素上連續分離，從該細胞系的條件介質純化肌生長抑制素。純化蛋白製備的銀染分析顯示存在29kd和12.5kd的兩種蛋白種類。多種數據表明，該純化蛋白是由與二硫化物-連接的C-末端二聚體結合的兩種前肽分子的非共價複合物組成的。首先，通過Western，29kd和12.5kd的兩種蛋白種類與抗體有免疫反應，該抗體分別是抗細菌表達的肌生長抑制素全長前肽和C-末端成熟區片段。其次，在沒有還原藥劑下，C-末端區域與二聚體一致的電泳移動。第三，兩種種類存在的摩爾比大約為1∶1。第四，C-末端二聚體保留在植物凝集素柱上，可以用甲基甘露糖洗脫，即使該蛋白部分沒有含有潛在的N-連接糖苷化區域；這些數據的最簡要的解釋就是，C-末端區域通過與前肽緊密複合物內存在間接與有糖苷化信號的植物凝集素結合。
因為C-末端二聚體已知是其他TGF-β家族成員的活性分子，所以通過反相HPLC將C-末端肌生長抑制素二聚體從其前肽中純化出來。含有純化的C-末端二聚體(32-34)部分似乎是同源物。然而，最富含前肽(35-37)的部分被少量的C-末端二聚體和最代表未摺疊蛋白的高分子量複合物汙染。
TGF-β超家族的大多數成員傳遞信號是通過結合絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，然後激活Smad蛋白進行的(Heldin，C.-H.，Miyazono，K. tenDijke，P.(1997)Nature 390，465-471；Massague，J.，Blain，S.W. Lo，R.S.(2000)cell 103，295-309)。觸發信號通路的初始事件配體與II型受體結合。為了決定肌生長抑制素是否能使任何已知的II型受體與相關配體結合，交叉研究用放射碘示蹤用TGF-β、BMP或激活素II型受體的表達構建體轉染的COS-7細胞肌生長抑制素C-末端二聚體進行。測定表達Act RIIA或ActRIIB的預定大小(與肌生長抑制素結合的全長受體)的交叉複合物。在交叉和標準受體結合實驗中觀察到與ActRIIB結合的水平比與Act RIIA結合的水平高，因此受體結合實驗集中在ActRIIB進行。肌生長抑制素與ActRIIB的結合是特異的(可以通過過量未標記肌生長抑制素競爭結合)和可飽和的，假設所有的肌生長抑制素蛋白是有生物活性的，我們估計通過Scatchard分析的解離常數是大約10nM。已知在TGF-β情況下，II型受體的親和力在合適的I型受體存在存在下明顯高，並且其他分子參與了將配體提呈給受體。
為了確定激活素II型受體參與了體內肌生長抑制素信號通路，研究了小鼠表達ActRIIB負顯性形式的作用。為了這一目的，我們產生了一個構建體，其中，將缺少激酶區的ActRIIB截短形式放入骨骼肌特異的肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子的下遊。將該構建體前核注入，識別了總共7個轉基因的標記陽性動物。這些標記動物在7月時的分析顯示，所有的7個動物的骨骼肌重量明顯增加，這些標記動物的個體肌肉與來自相同注射的對照非轉基因動物相比增重125％(表2)。
三組數據表明，這些標記動物的肌肉重量增加來自轉基因的表達。首先，三個標記動物與野生型C57BL/6小鼠交配子代分析(其他4個標記動物沒有產生足夠用於分析數目的子代)顯示與轉基因存在相關的肌肉重量的增加(表3)。第二，雖然在不同的轉基因系中肌肉重量有不同，增加的程度在任何給定的動物系中高度一致，不管是對所有的肌肉或對雄性或雌性(表3)。例如，來自C5系的雄性和雌性小鼠的所有肌肉比對照動物重大約30-60％，而來自C11小鼠的所有肌肉大約重110-180％。第三，從轉基因動物製備的RNA標本的Northern分析顯示，轉基因的表達局限於骨骼肌，轉基因表達的相對水平與肌肉重量增加的相對程度相關(表3)。例如，來自C11系的動物的轉基因表達水平最高，C11系的肌肉重量增加最多。
這些數據顯示，ActRIIB的負顯性形式的表達可以引起肌肉重量的增加，類似於在肌生長抑制素敲除小鼠中觀察到的那樣。在肌生長抑制素敲除小鼠中，肌肉重量的增加顯示可以獲得纖維數目和纖維長短的增加。為了確定ActRIIB表達是否還引起增生和肥大，分析了來自C27系的動物的腓腸肌和蹠肌切片。對對照肌肉相比，C27動物的肌肉顯示總橫切面積的明顯增加。該面積增加部分是由於纖維數目的增加。在更廣意義上，腓腸肌和蹠肌在C27系(n＝3)動物共有10015+1143纖維，而對照動物(n＝3)中為7871+364纖維。然而，肌肉纖維肥大也歸因於總面積的增加。在C27系動物的平均纖維直徑為51μm，對照動物為43μm。因此，肌肉重量的增加似乎是由於纖維數目增加大約27％，纖維直徑增加大約19％(假設纖維大致是圓柱形，該直徑的增加導致橫切面積增加了大約40％)。然而，除了纖維數目和大小的增加，轉基因動物的肌肉看起來總體正常。特別是，沒有明顯的退化指徵，如纖維大小廣泛改變(對照和轉基因動物之間的纖維大小的標準偏差相似)或廣泛的纖維變性或脂肪浸潤。
這些方法是用來探索其他抑制肌生長抑制素的可能的策略。首先，我們研究了肌生長抑制素前肽的作用。在TGF-β情況下，已知C-末端二聚體是在無活性、潛在的與其他蛋白的複合物中存在的，包括其前肽，TGF-β的前肽可以對TGF-β的體內和體外活性有抑制作用(Miyazono，K.，Hellman，U.，Wemstedt，C. Heldin，C.-H.(1988)J BiolChem 263，6407-6415；Gentry，L.E. Nash，B.W.(1990)Biochem.29，6851-6857；B6ttinger，E.P.，FactoV.M.，Tsang，M.L.-S.，Weatherbee，J.A.，Kopp，J.B.，Qian，S.W.，Wakefield，L.M.，Roberts，A.B.，Thorgeirsson，S.S. Sporn，M.B.(1996)Proc Natl Acad Sci，USA 93，5877-5882)。對肌生長抑制素C-末端二聚體和前肽共純化的觀察增加了肌生長抑制素可以正常在相似的潛在的複合物中存在的可能以及肌生長抑制素前肽可能有抑制活性。第二，我們測定了濾泡素抑制素的作用，其已經顯示能結合併抑制多種TGF-β家族。特別是，濾泡素抑制素可以阻斷GDF-11的活性，GDF-11與肌生長抑制素高度相關，而且已經顯示濾泡素抑制素敲除小鼠在出生時肌肉量減少，這與肌生長抑制素過度活性一致(Gamer，L.，Wolfman，N.，Celeste，A.，Hattersley，G，Hewick，R.Rosen，V.(1999)Dev BioI 208，222-232；Matzuk，M.M.，Lu，N.，Vogel，H.，Sell.heyer，K.，Roop，D.R. Bradley，A.(1995)Nature 374，360-363)。
前肽和濾泡素抑制素在體外的作用進行了研究。肌生長抑制素前肽和濾泡素抑制素二者都能阻斷C-末端二聚體與Act RIIB的結合。估計濾泡素抑制素的Ki大約是470pM，高於其前肽至少50倍。然而，前肽Ki的計算被認為是代表生物活性前肽在最終製備的所有的蛋白，因此似乎被過度估計了。如上所述，前肽的製備被少量的C-末端二聚體和錯誤摺疊的高分子量物質汙染。
為了確定這些分子能否在體內阻斷肌生長抑制素活性，產生了轉基因小鼠，其中肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子被用於驅動肌生長抑制素前肽或濾泡素抑制素的表達。從前肽構建體的前核注射，鑑定了三種顯示肌肉增加的轉基因小鼠系(其中兩個是B32A和B32B，獨立代表一個原始標記動物的分離的轉基因插入區)。如表3所示，與未轉基因對照動物相比，每一系動物的肌肉重量增加了大約20-110％。從每一系的代表性動物製備的RNA標本的Northern分析顯示，轉基因表達水平與肌肉重量增加的程度相關。特別地，來自B32A系的動物的肌肉量僅增加了大約20-40％，其具有最低的轉基因表達，而來自B32B和B53系的動物的肌肉量增加了大約70-110，其具有最高的轉基因表達。也許，儘管成倍轉基因動物似乎具有更高的轉基因表達水平的事實，對B32A和B32B插入區的成倍轉基因動物的肌肉重量明顯類似於僅有B32B插入區的轉基因動物中所觀察到的(表3)。這些發現提示，在B32B(和B53系)中看到的效果從過度表達前肽中最大。如在表達負顯性形式的Act RIIB表達動物的情況，表達前肽的動物顯示肌纖維數目和大小的增加。來自成倍轉基因的B32A和B32B插入區的兩隻動物的腓腸肌和蹠肌的分析顯示，纖維數目增加了大約40％(這兩種動物有11940和10420纖維)，與對照動物相比，纖維直徑增加了大約21％(至52μm)。
使用濾泡素抑制素構建體獲得了最驚人的骨骼肌效果。兩個標記動物(F3和F6)顯示增加的肌肉生成(表2)。在這些動物(F3)的一個中，與對照組相比，其肌肉的重量增加了194-327％，來自增生(66％纖維數目增加，在腓腸肌/蹠肌中增加至13051)和肥大(纖維直徑增加了28％至55μm)。雖然我們沒有分析在肌生長抑制素敲除小鼠雜交體SJL/C57BL/6背景的肌肉重量，在F3標記動物上觀察的肌肉量的增加明顯大於在其他基因背景的肌生長抑制素無效動物中看到的增加。這些結果提示知道部分濾泡素抑制素的功能來自除了肌生長抑制素的其他配體的抑制。明顯地，其他濾泡素抑制素轉基因系的分析在確定其他配體是否參與肌肉生長的負調節中起了關鍵作用。
在水解加工以後，肌生長抑制素C-末端二聚體似乎保持在與其前肽或也許其他蛋白的潛在複合物中。肌生長抑制素也能被濾泡素抑制素負調節，濾泡素抑制素與C-末端二聚體結合，抑制了其與受體結合的能力。通過已知的機制從這些抑制蛋白中釋放C-末端二聚體使肌生長抑制素與激活素II型受體結合。通過模擬其他家族成員，我們假設這些受體活化，然後導致I型受體和Smad蛋白的激活。
不僅此此處描述的數據，而且其他遺傳數據所觀察到的總的肌生長抑制素和信號模型都是一致的。如前所述，已經顯示濾泡素抑制素敲除小鼠的肌肉量在出生時降低，而這種降低可能排除了未被抑制的肌生長抑制素活性。類似的肌肉表型已經在ski缺乏小鼠被報告，而這種小鼠已經顯示能抑制Smad2和3的活性，而名稱為過多骨骼肌的相反的表型已經在過度表達ski的小鼠中觀察到。基於這些發現，可以假設的是，這些觀察到的表型反映了這些小鼠中的高活性和低活性。
雖然體外和基因數據與我們此處展示的總模型是一致的，但是這些數據與參與其他受體和配體模型也是一致的。例如，我們不知道通過截短形式的Act RIIB機制在我們的轉基因小鼠中增加了肌肉生長。可能截短的受體對阻斷靶細胞的信號起作用，而僅僅是作為衰竭的胞外肌生長抑制素濃度的下降物(sink)。可能其他截短的受體阻斷了除了肌生長抑制素以外其他的配體。從這一點來說，已經顯示負顯性形式的II型激活素受體可以阻斷其他屬的多種不同的TGF-β相關配體的信號。相似地，我們的數據並不明確顯示濾泡素抑制素阻斷體內肌生長抑制素活性促進肌肉的生長。從這一點來說，在其中一個濾泡素抑制素表達標記動物中觀察到的肌肉生長的矛盾程度提示其他濾泡素抑制素-敏感配體可能參與了肌肉生長的調節。
然而，迄今為止，肌生長抑制素是僅有的顯示在體內調節肌肉量中有負作用分泌蛋白。雖然可能需要其他的實驗證明該總體模型方面，並鑑定其他信號成分，但是我們的數據顯示肌生長抑制素拮抗劑，如濾泡素抑制素和肌生長抑制素前肽或激活素II型受體拮抗劑可能是有效的肌肉增加劑，可以用於人和農業應用。
表2.肌肉量(mg)轉基因動物 胸肌 三肉肌 四頭肌腓腸肌/蹠肌雄性對照(7mo.，n＝10) 100.8±5.4 115.6±5.5 243.8±12.5 168.1±7.6顯性失活Act RIIB(7mo.)C5雄性標記 148 155 318 252C11雄性標記 227 250 454 338C33雄性標記 158 176 352 244C42雄性標記 196 212 309 269雌性對照(7mo.，n＝10) 68.9±2.796.9±3.5208.3±7.1140.3±4.3顯性失活Act RIIB(7mo.)C5雄性標記 104 163 352 263C5雄性標記 103 139 303 194C5雄性標記 135 117 181 256雄性對照(4mo.，n＝12) 98.3±3.3110.9±2.9 251.7±8.5169.3±4.7濾泡素抑制素(4mo.)F3雄性標記 296 494 736 568
F66雄性標記 169 263 421 409所有的動物(包括對照組)代表來自注射的胚胎的雜交體SJL/C57BL/6F0小鼠。
表3肌肉量(mg)1.雄性

2.雌性

*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。所有的動物(包括對照)代表與野生型C57B1/6小鼠交配的轉基因標記(SJL/C57BL/6)的4月齡子代。
儘管本發明根據上面的實施例中已經得到描述，應當理解，修飾和變化都包含在本發明的精神和範圍內。因此，本發明僅僅被以下的權利要求所限制。
序列表110約翰斯霍普金斯大學120應用卵泡素抑制素增加肌肉質量130JHU1470-215009/485,0461512000-01-31150PCT/US98/155981511998-07-2815060/054,4611511997-08-0116029170FastSEQ for Windows Version 4.021012112743212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(59)...(1183)4001aagaaaagta aaaggaagaa acaagaacaa gaaaaaagat tatattgatt ttaaaatc58atg caa aaa ctg caa ctc tgt gtt tat att tac ctg ttt atg ctg att106Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1 5 10 15gtt gct ggt cca gtg gat cta aat gag aac agt gag caa aaa gaa aat154Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt act tgg aga caa aac act202Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45aaa tct tca aga ata gaa gcc att aag ata caa atc ctc agt aaa ctt250Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgt ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gtt ata aga caa ctt298Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu65 70 75 80tta ccc aaa gct cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tat gat gtc346Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95
cag agg gat gac agc agc gat ggc tct ttg gaa gat gac gat tat cac394Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110gct aca acg gaa aca atc att acc atg cct acs gag tct gat ttt cta442Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125atg caa gtg gat gga aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct490Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140aaa ata caa tac aat aaa gta gta aag gcc caa cta tgg ata tat ttg538Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160aga ccc gtc gag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc586Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175atc aaa cct atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg634Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg682Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc730Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220att gaa ata aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc778Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccg ttt tta gag gtc aag826Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys245 250 255gta aca gac aca cca aaa aga tcc aga agg gat ttt ggt ctt gac tgt874Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270gat gag cac tca aca gaa tca cga tgc tgt cgt tac cct cta act gtg922Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285gat ttt gaa gct ttt gga tgg gat tgg att atc gct cct aaa aga tat970Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gta ttt tta caa aaa1018Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320tat cct cat act cat ctg gta cac caa gca aac ccc aga ggt tca gca1066Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335
ggc cct tgc tgt act ccc aca aag atg tct cca att aat atg cta tat1114Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcg atg gta1162Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365gta gac cgc tgt ggg tgc tca tgagatttat attaagcgtt cataacttcc 1213Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375taaaacatgg aaggttttcc cctcaacaat tttgaagctg tgaaattaag taccacaggc 1273tataggccta gagtatgcta cagtcactta agcataagct acagtatgta aactaaaagg 1333gggaatatat gcaatggttg gcatttaacc atccaaacaa atcatacaag aaagttttat 1393gatttccaga gtttttgagc tagaaggaga tcaaattaca tttatgttcc tatatattac 1453aacatcggcg aggaaatgaa agcgattctc cttgagttct gatgaattaa aggagtatgc 1513tttaaagtct atttctttaa agttttgttt aatatttaca gaaaaatcca catacagtat 1573tggtaaaatg caggattgtt atataccatc attcgaatca tccttaaaca cttgaattta 1633tattgtatgg tagtatactt ggtaagataa aattccacaa aaatagggat ggtgcagcat 1693atgcaatttc cattcctatt ataattgaca cagtacatta acaatccatg ccaacggtgc 1753taatacgata ggctgaatgt ctgaggctac caggtttatc acataaaaaa cattcagtaa 1813aatagtaagt ttctcttttc ttcaggtgca ttttcctaca cctccaaatg aggaatggat 1873tttctttaat gtaagaagaa tcatttttct agaggttggc tttcaattct gtagcatact 1933tggagaaact gcattatctt aaaaggcagt caaatggtgt ttgtttttat caaaatgtca 1993aaataacata cttggagaag tatgtaattt tgtctttgga aaattacaac actgcctttg 2053caacactgca gtttttatgg taaaataata gaaatgatcg actctatcaa tattgtataa 2113aaagactgaa acaatgcatt tatataatat gtatacaata ttgttttgta aataagtgtc 2173tcctttttta tttactttgg tatattttta cactaaggac atttcaaatt aagtactaag 2233gcacaaagac atgtcatgca tcacagaaaa gcaactactt atatttcaga gcaaattagc 2293agattaaata gtggtcttaa aactccatat gttaatgatt agatggttat attacaatca 2353ttttatattt ttttacatga ttaacattca cttatggatt catgatggct gtataaagtg 2413aatttgaaat ttcaatggtt tactgtcatt gtgtttaaat ctcaacgttc cattatttta 2473atacttgcaa aaacattact aagtatacca aaataattga ctctattatc tgaaatgaag 2533aataaactga tgctatctca acaataactg ttacttttat tttataattt gataatgaat 2593atatttctgc atttatttac ttctgttttg aaattggga ttttgttaat caaatttatt 2653gtactatgac taaatgaaat tatttcttac atctaatttg tagaaacagt ataagttata 2713ttaaagtgtt ttcacatttt tttgaaagac 27432102211375212PRT213智人(Homo sapiens)4002Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1 5 10 15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu65 70 75 80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
115 120 125Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys245 250 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 37521032112676212DNA213小家鼠(Mus musculus)220
221CDS222(104)...(1231)4003gtctctcgga cggtacatgc actaatattt cacttggcat tactcaaaag caaaaagaag 60aaataagaac aagggaaaaa aaaagattgt gctgattttt aaa atg atg caa aaa115Met Met Gln Lys1ctg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttc atg ctg att gct gct ggc163Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile Ala Ala Gly5 10 15 20cca gtg gat cta aat gag ggc agt gag aga gaa gaa aat gtg gaa aaa211Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys25 30 35gag ggg ctg tgt aat gca tgt gcg tgg aga caa aac acg agg tac tcc259Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn Thr Arg Tyr Ser40 45 50
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Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser180 185 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 37521052111131212DNA213褐家鼠(Rattus norvegicus)220
221CDS222(1)...(1128)4005atg att caa aaa ccg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttt gtg ctg48Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu1 5 10 15att gct gct ggc cca gtg gat cta aat gag gac agt gag aga gag gcg96
Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala20 25 30aat gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gcg tgt gcg tgg aga caa aac144Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45aca agg tac tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agt aaa192Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60ctc cgc ctg gaa aca gcg cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa240Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80ctt ctg ccc aga gcg cct cca ctc cgg gaa ctg atc gat cag tac gac288Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95gtc cag agg gat gac agc agt gac ggc tct ttg gaa gat gac gat tat336Val Gln Arg Asp Asp Set Ser Asp Gly Set Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110cac gct acc acg gaa aca atc att acc atg cct acc gag tct gac ttt384His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125cta atg caa gcg gat gga aag ccc aaa tgt tgc ttt ttt aaa ttt agc432Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140tct aaa ata cag tac aac aaa gtg gta aag gcc cag ctg tgg ata tat480Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160ctg aga gcc gtc aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga528Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175ctc atc aaa ccc atg aaa gac ggt aca agg tat acc gga atc cga tct576Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Set180 185 190ctg aaa ctt gac atg agc cca ggc act ggt att tgg cag agt att gat624Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205gtg aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aac tta672Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220ggc att gaa atc aaa gct ttg gat gag aat ggg cat gat ctt gct gta720Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240acc ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc768Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255aaa gta aca gac aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac816
Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270tgc gat gaa cac tcc acg gaa tcg cgg tgc tgt cgc tac ccc ctc acg864Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285gtc gat ttc gaa gcc ttt gga tgg gac tgg att att gca ccc aaa aga912Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300tat aag gct aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gtg ttc tta caa960Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320aaa tat ccg cat act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggc tcg1008Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335gca ggc cct tgc tgc acg cca aca aaa atg tct ccc att aat atg cta1056Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350tat ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg1104Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365gta gta gac cgg tgt ggg tgc tcg tga1131Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 3752106211376212PRT213褐家鼠(Rattus norvegicus)4006Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu1 5 10 15Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala20 25 30Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175
Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser180 185 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 37521072111128212DNA213紅原雞(Gallus gallus)220
221CDS222(1)...(1125)4007atg caa aag ctg gca gtc tat gtt tat att tac ctg ttc atg cag atc48Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile1 5 10 15gcg gtt gat ccg gtg gct ctg gat ggc agt agt cag ccc aca gag aac96Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn20 25 30gct gaa aaa gac gga ctg tgc aat gct tgt acg tgg aga cag aat aca144Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45aaa tcc tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agc aaa ctg192Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgc ctg gaa caa gca cct aac att agc agg gac gtt att aag cag ctt240Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu65 70 75 80tta ccc aaa gct cct cca ctg cag gaa ctg att gat cag tat gat gtc288Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95
cag agg gac gac agt agc gat ggc tct ttg gaa gac gat gac tat cat336Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110gcc aca acc gag acg att atc aca atg cct acg gag tct gat ttt ctt384Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125gta caa atg gag gga aaa cca aaa tgt tgc ttc ttt aag ttt agc tct432Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140aaa ata caa tat aac aaa gta gta aag gca caa tta tgg ata tac ttg480Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160agg caa gtc caa aaa cct aca acg gtg ttt gtg cag atc ctg aga ctc528Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175att aag ccc atg aaa gac ggt aca aga tat act gga att cga tct ttg576Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt atc tgg cag agt att gat gtg624Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205aag aca gtg ctg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aat tta ggc672Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220atc gaa ata aaa gct ttt gat gag act gga cga gat ctt gct gtc aca720Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240ttc cca gga cca gga gaa gat gga ttg aac cca ttt tta gag gtc aga768Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg245 250 255gtt aca gac aca ccg aaa cgg tcc cgc aga gat ttt ggc ctt gac tgt816Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270gat gag cac tca acg gaa tcc cga tgt tgt cgc tac ccg ctg aca gtg864Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285gat ttc gaa gct ttt gga tgg gac tgg att ata gca cct aaa aga tac912Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300aaa gcc aat tac tgc tcc gga gaa tgc gaa ttt gtg ttt cta cag aaa960Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320tac ccg cac act cac ctg gta cac caa gca aat ccc aga ggc tca gca1008Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335
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Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly325 330 335Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe340 345 350Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val355 360 365Asp Arg Cys Gly Cys Ser37021092111128212DNA213狒狒220
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213火雞(Meleagris Gallopavo)220
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Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg245 250 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375210192111125212DNA213斑馬魚(Danio rerio)220
221CDS222(1)…(1122)40019atg cat ttt aca cag gtt tta att tct cta agt gta tta att gca tgt48Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys1 5 10 15ggt cca gtg ggt tat gga gat ata acg gcg cac cag cag cct tcc aca96Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr20 25 30gcc acg gag gaa agc gag ctg tgt tcc aca tgt gag ttc aga caa cac144Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His35 40 45
agc aag ctg atg aga ctg cat gcc atc aag tcc caa att ctt agc aaa192Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60ctc cga ctc aag cag gct cca aac atc agc cgg gac gtg gtc aag cag240Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln65 70 75 80ctg tta ccc aaa gca ccg cct ttg caa caa ctt ctg gat cag tac gat288Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp85 90 95gtt tta gga gat gac agt aag gat gga gct gtg gaa gag gac gat gaa336Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu100 105 110cat gcc acc aca gag acc atc atg acc atg gcc aca gaa cct gac ccc384His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro115 120 125att gtt caa gta gat cgg aaa ccg aag tgt tgc ttt ttc tcc ttc agt432Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser130 135 140ccg aag atc caa gcg aac cgg atc gta aga gcg cag ctc tgg gtt cat480Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His145 150 155 160ctg aga ccg gcg gag gag gcg acc acc gtc ttc tta cag ata tct cgg528Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg165 170 175ctg atg ccc gtt aag gac gga gga aga cac cga ata cga tcc ctg aaa576Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys180 185 190atc gac gtg aac gca gga gtc acg tct tgg cag agt ata gac gta aag624Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys195 200 205cag gtg ctc acg gtg tgg tta aaa caa ccg gag acc aac cga ggc atc672Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile210 215 220gag att aac gca tat gac gcg aag gga aac gac ttg gcc gtc act tca720Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser225 230 235 240acc gag act ggg gag gat gga ctg ctc ccc ttt atg gag gtg aaa ata768Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile245 250 255tca gag ggc cca aaa cga atc cgg agg gac tcc gga ctg gac tgc gat816Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp260 265 270gag aat tcc tca gag tct cgc tgc tgc agg tac cct ctc act gtg gac864Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp275 280 285
ttc gag gac ttt ggc tgg gac tgg att att gct cca aaa cgc tat aag912Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys290 295 300gcg aat tac tgt tca gga gaa tgc gac tac atg tac ctg cag aag tat960Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr305 310 315 320ccc cac acc cat ctg gtg aac aag gcc agt ccg aga gga acg gct ggg1008Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly325 330 335ccc tgc tgc act ccc acc aag atg tct ccc atc aac atg ctt tac ttt1056Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe340 345 350aac ggc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc cct tcg atg gta gta1104Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val355 360 365gac cgc tgt ggc tgc tca tga1125Asp Arg Cys Gly Cys Ser37021020211374212PRT213斑馬魚(Danio rerio)40020Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys1 5 10 15Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr20 25 30Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His35 40 45Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro115120 125Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser130 135 140Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His145 150 155 160Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg165 170 175Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys180 185 190Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys195 200 205Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile210 215 220
Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser225 230 235 240Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile245 250 255Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp260 265 270Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp275 280 285Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys290 295 300Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr305 310 315 320Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly325 330 335Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe340 345 350Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val355 360 365Asp Arg Cys Gly Cys Ser370210212114212PRT213人工序列220
223蛋白質水解反應裂解位點221VARIANT222(0)...(0)223Xaa＝任意胺基酸40021Arg Xaa Xaa Arg1210222114212PRT213真核細胞220
221SITE222(0)...(0)223蛋白質水解應加工位點40022Arg Ser Arg Arg1210232114212PRT213真核細胞220
221SITE222(0)...(0)223蛋白質水解反應加工位點
40023Arg Ile Arg Arg1210242111393212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(54)...(1274)223GDF-1140024ccgcgggact ccggcgtccc cgccccccag tcctccctcc cctcccctcc agc atg 56Met1gtg ctc gcg gcc ccg ctg ctg ctg ggc ttc ctg ctc ctc gcc ctg gag104Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu Glu5 10 15ctg cgg ccc cgg ggg gag gcg gcc gag ggc ccc gcg gcg gcg gcg gcg152Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala20 25 30gcg gcg gcg gcg gcg gca gcg gcg ggg gtc ggg ggg gag cgc tcc agc200Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser Ser35 40 45cgg cca gcc ccg tcc gtg gcg ccc gag ccg gac ggc tgc ccc gtg tgc248Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val Cys50 55 60 65gtt tgg cgg cag cac agc cgc gag ctg cgc cta gag agc atc aag tcg296Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys Ser70 75 80cag atc ttg agc aaa ctg cgg ctc aag gag gcg ccc aac atc agc cgc344Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser Arg85 90 95gag gtg gtg aag cag ctg ctg ccc aag gcg ccg ccg ctg cag cag atc392Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Ile100 105 110ctg gac cta cac gac ttc cag ggc gac gcg ctg cag ccc gag gac ttc440Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp Phe115 120 125ctg gag gag gac gag tac cac gcc acc acc gag acc gtc att agc atg488Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Met130 135 140 145gcc cag gag acg gac cca gca gta cag aca gat ggc agc cct ctc tgc536Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu Cys150 155 160
tgc cat ttt cac ttc agc ccc aag gtg atg ttc aca aag gta ctg aag584Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu Lys165 170 175gcc cag ctg tgg gtg tac cta cgg cct gta ccc cgc cca gcc aca gtc632Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr Val180 185 190tac ctg cag atc ttg cga cta aaa ccc cta act ggg gaa ggg acc gca680Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr Ala195 200 205ggg gga ggg ggc gga ggc cgg cgt cac atc cgt atc cgc tca ctg aag728Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu Lys210 215 220 225att gag ctg cac tca cgc tca ggc cat tgg cag agc atc gac ttc aag776Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe Lys230 235 240caa gtg cta cac agc tgg ttc cgc cag cca cag agc aac tgg ggc atc824Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly Ile245 250 255gag atc aac gcc ttt gat ccc agt ggc aca gac ctg gct gtc acc tcc872Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr Ser260 265 270ctg ggg ccg gga gcc gag ggg ctg cat cca ttc atg gag ctt cga gtc920Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg Val275 280 285cta gag aac aca aaa cgt tcc cgg cgg aac ctg ggt ctg gac tgc gac968Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp290 295 300 305gag cac tca agc gag tcc cgc tgc tgc cga tat ccc ctc aca gtg gac1016Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp310 315 320ttt gag gct ttc ggc tgg gac tgg atc atc gca cct aag cgc tac aag1064Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys325 330 335gcc aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag tac atg ttc atg caa aaa tat1112Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr340 345 350ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gcc aat cca aga ggc tct gct ggg1160Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly355 360 365ccc tgt tgt acc ccc acc aag atg tcc cca atc aac atg ctc tac ttc1208Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe370 375 380 385aat gac aag cag cag att atc tac ggc aag atc cct ggc atg gtg gtg1256Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met val val390 395 400
gat cgc tgt ggc tgc tct taagtgggtc actacaagct gctggagcaa 1304Asp Arg Cys Gly Cys Ser405agacttggtg ggtgggtaac ttaacctctt cacagaggat aaaaaatgct tgtgagtatg 1364acagaaggga ataaacaggc ttaaagggt139321025211407212PRT213智人(Homo sapiens)40025Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala20 25 30Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser35 40 45Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val50 55 60Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys65 70 75 80Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser85 90 95Arg Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln100 105 110Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp115 120 125Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser130 135 140Met Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu145 150 155 160Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu165 170 175Lys Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr180 185 190Val Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr195 200 205Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu210 215 220Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe225 230 235 240Lys Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly245 250 255Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr260 265 270Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg275 280 285Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys290 295 300Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val305 310 315 320Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr325 330 335Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys340 345 350Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala355 360 365Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
370 375380Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val385 390 395 400Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser40521026211476212DNA213鮭魚-1220
221CDS222(3)...(473)40026gg cag ccg gag acg aat tgg ggg atc gag att aat gcg ttc gac tcg 47Gln Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser1 5 10 15aag gga aat gat ctg gcc gtt acc tca gca gaa gcg gga gaa gga ctg95Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser Ala Glu Ala Gly Glu Gly Leu20 25 30caa ccc ttc atg gag gtg acg att tca gag ggc ccg aag cgc tcc agg143Gln Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg35 40 45aga gac tcg ggc ctg gac tgt gac gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgt191Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys50 55 60tgc cgc tac ccc ctc acg gta gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg239Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp65 70 75att att gcc ccc aag cgc tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgt287Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys80 85 90 95gag tac atg cac ctg cag aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag335Glu Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys100 105 110gct aac cct cgc ggc acc gca ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg383Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met115 120 125tcc ccc atc aac atg ctc tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac431Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr130 135 140ggc aag atc ccc tcc atg gtg gtg gac cgt tgc gga tgc tcg473Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser145 150 155tga47621027211157
212PRT213鮭魚-140027Gln Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser Lys1 5 10 15Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser Ala Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln20 25 30Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg35 40 45Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys50 55 60Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile65 70 75 80Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu85 90 95Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala100 105 110Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser115 120 125Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly130 135 140Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser145 150 15521028211412212DNA213鮭魚-2220
221CDS222(2)...(409)40028g gtt acc tca act gaa gcc gga gaa gga ctg caa ccc ttc atg gag gtg 49Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val1 5 10 15aag att tcg gag ggc ccg aag cgc tcc agg aga gat tcg ggc ctg gac97Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp20 25 30tgt gat gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgc tgc cgg tac ccc ctc acg145Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr35 40 45gtg gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg att att gcc ccc aag cgc193Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg50 55 60tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgc gag tac atg cac ctg cag241Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln65 70 75 80aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag gct aac cct cgc ggc acc289Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr85 90 95gcg ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg tcc ccc atc aac atg ctc337
Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu100 105 110tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc ccc tcc atg385Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met115 120 125gtg gtg gac cgc tgc ggc tgc tcg tga12Val Val Asp Arg cys Gly Cys Ser130 13521029211136212PRT213鮭魚-240029Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val1 5 10 15Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp20 25 30cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr35 40 45Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg50 55 60Tyr Lys Ala Asu Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln65 70 75 80Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr85 90 95Ala Gly Pro cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu100 105 110Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met115 120 125Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser130 1權利要求
1.一種轉基因非人類動物，其基因組含有一段包含截短的激活素II型受體基因和可操作連接至並整合進動物基因組的肌肉特異啟動子的序列，其中所述的核酸序列的表達使得與相應的非轉基因動物相比，轉基因動物中截短的激活素II型受體水平升高，肌肉量增加。
2.根據權利要求1所述的轉基因動物，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
3.根據權利要求1所述的轉基因動物，其中所述的激活素II型受體是RIIA或RIIB。
4.根據權利要求3所述的轉基因動物，其中所述的截短的激活素RIIB受體缺乏激酶活性。
5.根據權利要求1所述的轉基因動物，其中所述的截短的激活素RIIB受體含有激活素RIIB的胺基酸殘基1-174。
6.一種非人類轉基因動物，其基因組含有一段包含肌生長抑制素前區和可操作連接至並整合進動物的基因組的肌肉特異啟動子的核酸序列，其中所述的核酸序列的表達使得與相應的非轉基因動物相比，轉基因動物中肌生長抑制素前區水平升高，肌肉量增加。
7.根據權利要求6所述的轉基因動物，其中所述的肌生長抑制素前區含有選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的前肌生長抑制素多肽的大約1-262胺基酸殘基。
8.根據權利要求6所述的轉基因動物，其中所述的肌生長抑制素前區包含選自以下的胺基酸序列如SEQ ID NO4列出的大約20-263胺基酸殘基；如SEQ ID NO2列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO10列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO12列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO8列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO6列出的大約20-263胺基酸殘基；如SEQ ID NO18列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO14列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO16列出的大約20-262胺基酸殘基；如SEQ ID NO20列出的大約20-262胺基酸殘基；及其功能肽部分。
9.根據權利要求6所述的轉基因動物，其中所述的肌生長抑制素前區進一步包括肌生長抑制素信號肽。
10.根據權利要求6所述的轉基因動物，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
11.一種非人類轉基因動物，其基因組含有一段包含濾泡素抑制素基因和可操作連接至並整合進動物的基因組的肌肉特異啟動子的核酸序列，其中所述的核酸序列的表達使得與相應的非轉基因動物相比，轉基因動物中濾泡素抑制素水平升高，肌肉量增加。
12.根據權利要求11所述的轉基因動物，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
13.一種表達盒，其包括編碼可操作連接至肌肉特異控制序列的截短的激活素RIIB受體基因的DNA片段。
14.根據權利要求13所述的表達盒，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
15.一種表達盒，其包括編碼可操作連接至肌肉特異控制序列的肌生長抑制素前區基因的DNA片段。
16.根據權利要求15所述的表達盒，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
17.一種表達盒，其包括編碼可操作連接至肌肉特異控制序列的濾泡素抑制素基因的DNA片段。
18.根據權利要求17所述的表達盒，其中所述的肌肉特異啟動子是肌動蛋白輕鏈啟動子/增強子。
19.一種使濾泡素抑制素在轉基因動物中組織特異表達的方法，包括在轉基因動物的細胞中表達如權利要求17所述的表達盒，其中所述的表達盒被整合進動物的基因組，其中所述的盒的表達使得與相應的非轉基因動物相比，在轉基因動物中的濾泡素抑制素水平升高，因此導致其肌肉量增加。
20.一種從權利要求1、6或11中的任一項所述的動物中分離的細胞或細胞系，其中所述的細胞分別表達截短的激活素II型受體、肌生長抑制素前區或濾泡素抑制素。
21.一種抑制肌生長抑制素與激活素II型受體結合的方法，包括將肌生長抑制素與濾泡素抑制素接觸，因此抑制與所述受體的結合。
22.根據權利要求21所述的方法，其中抑制結合是通過肌生長抑制素的C-末端實現的。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述的激活素受體是Act RIIA或Act RIIB。
24.一種非人類轉基因動物，其基因組包含含有能在肌細胞中表達的編碼濾泡素抑制素蛋白的可操作連接至與內源性濾泡素抑制素基因異源的啟動子上的DNA片段的DNA構建體，其中所述的DNA構建體在肌細胞中的表達導致所述的動物的肌肉量增加。
25.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的DNA構建體已經被引入所述動物的祖細胞中。
26.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的DNA構建體是在胚胎期被引入所述的動物或所述的動物的祖細胞中。
27.根據權利要求24所述的非人類動物，其中與野生型相比，所述的濾泡素抑制素蛋白是截短的、突變的或濾泡素抑制素蛋白的其他變體形式。
28.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的構建體是在含有編碼濾泡素抑制素蛋白的所述的DNA片段的MDAF2表達質粒中。
29.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的動物是哺乳動物。
30.根據權利要求29所述的非人類動物，其中所述的哺乳動物是小鼠。
31.根據權利要求29所述的非人類動物，其中所述的哺乳動物是豬。
32.根據權利要求29所述的非人類動物，其中所述的哺乳動物是牛。
33.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的動物是鳥類。
34.根據權利要求33所述的非人類動物，其中所述的鳥類是雞或火雞。
35.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的動物是水生動物。
36.根據權利要求35所述的非人類動物，其中所述的水生動物是有鰭的水族。
37.根據權利要求36所述的非人類動物，其中所述的有鰭水族是鮭魚、鱒魚、紅點鮭、香魚、鯉魚、鯽魚、金魚、昏白魚、銀魚、鱔魚、海鰻、沙丁魚、斑馬魚、飛魚、巴西刺鱸、鯛、鸚鵡鱸魚、紐西蘭真鯛、鯖、白腹鯖、鮪魚、金槍魚、鰹魚、鯡魚、巖魚、平魚(fluke)、鰨魚、比目魚、河豚或魨魚。
38.根據權利要求35所述的非人類動物，其中所述的水生動物是蛤、烏蛤、蛤貝、海螺；扇貝、海螺、蝸牛、海參、赤貝、牡蠣、螺旋貝、鮑魚、龍蝦、對蝦、河蝦、蟹、蝦蛄、磷蝦、河蝥蝦(langostinos)、小龍蝦/龍蝦、環節動物門動物、美洲鱷魚、龜、蛙或海膽。
39.根據權利要求24所述的非人類動物，其中所述的動物是羊。
40.一種產生嵌合非人類動物的方法，所述方法包括從動物卵巢獲得卵子；體外成熟卵子；體外受精成熟的卵子以形成合子；在合子內，體外引入一含有可操作連接的編碼截短的激活素II型受體、肌生長抑制素前肽或濾泡素抑制素的DNA序列，和促進編碼多肽的DNA序列表達的調節序列的核酸構建體；體外成熟合子成為移植前期的胚胎；和將胚胎移植入受體雌性動物中，其中所述的雌性動物妊娠胚胎以產生嵌合動物。
41.一種產生具有增加的肌肉量的動物食物產品的方法，包括a)將編碼濾泡素抑制素、肌生長抑制素前肽或截短的激活素II型受體的轉基因引入動物前核胚胎的生殖細胞中；b)將胚胎植入假孕雌性的輸卵管中，因此使胚胎成熟成懷孕足月子代；c)測試子代存在轉基因以鑑別轉基因陽性子代；d)雜交轉基因陽性子代以獲得進一步的陽性子代；和e)加工子代以獲得食品。
42.一種產生具有增加的肌肉量的鳥、豬、魚、或牛類食品的方法，包括a)將編碼濾泡素抑制素、肌生長抑制素前肽或截短的激活素II型受體的轉基因引入鳥、豬、魚、或牛的動物的胚胎中；b)在孵育子代的條件下培養胚胎；c)測試子代存在轉基因以鑑別轉基因陽性子代；d)雜交轉基因陽性子代；和e)加工子代以獲得食品。
全文摘要
本發明提供了一種基本上純化的生長分化因子(GDF)受體，包括GDF－8(肌生長抑制素(myostatin))受體，以及其功能性肽部分。另外，本發明提供了GDF受體或其功能性肽部分的一種虛擬表現(virtual representation)形式。本發明還提供了一種通過將細胞與影響肌生長抑制素在細胞中信號轉導的藥劑接觸調節肌生長抑制素細胞效應的方法。另外，本發明提供了一種通過在受者肌肉細胞或脂肪組織細胞中調節肌生長抑制素信號轉導改善嚴重病理狀況的方法，該病理狀況至少部分地以受者肌肉或脂肪組織中異常的量、發育或代謝活性為特徵。本發明也提供了一種在真核細胞生物體中，通過給生物體使用一種影響肌生長抑制素信號轉導的藥劑，調節肌肉組織或脂肪組織生長的方法。
文檔編號C12N15/85GK1520256SQ02812610
公開日2004年8月11日 申請日期2002年4月24日 優先權日2001年4月24日
發明者李瑟瑾, A·C·麥克弗倫, 麥克弗倫 申請人:約翰斯·霍普金斯大學, 約翰斯 霍普金斯大學