一種新型八碳側鏈氫化異吲哚酮類化合物及其製備方法和用途的製作方法

2023-10-11 23:32:04 2

專利名稱：：一種新型八碳側鏈氫化異吲哚酮類化合物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用綺麗穗黴KLA03(S;,'ca〃'fle/ega"sKLA03)(保藏編號是CCTCCM205049)製備一種新型八碳側鏈氫化異吲哚酮類化合物開鏈10-苯基氫化異吲哚酮類化合物的方法；本發明還涉及該類化合物在製備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
：io-苯基取代的氫化異n引哚酮類化合物屬於細胞鬆弛劑類化合物，己有一些文獻報導，該類化合物顯示了多種生物活性，如對哺乳動物細胞的生長有顯著的抑制作用，顯示HIV-1蛋白激酶抑制活性，抗菌抗腫瘤活性等。該類化合物最重要的生物活性是能夠與肌動蛋白結合從而改變其聚合反應，並且已經成為研究肌動結合蛋白的工具藥。到目前為止已發現該類化合物80餘種，該類化合物的結構特徵是均具有氫化異吲哚酮母核，而IO位為苯基取代的佔絕大多數，少數為苯並吲哚基，另外該類化合物結構中C9處與Q側鏈形成不同的含氧大環，所包含的大環多為11、13和14元環。如Espada，A.Rivera-Sagredo,J.M.delaFuente,etal.NewCytochalasinsfromtheFungus々/an'a/^/cwy/亂r"ra,1997，53(18):6485-6492;YunjiangF.,JohnW.B.,AnthonyL丄，etal.ThreenovelcytochalsinsX,YandZfromi^eMdewrari蹈zo爐,./Ato./Voc/.2002,65,1274-1277.YuzoF.,HirokoT"MasakatuI.andHiromitsuN.,ZygosporinDandtwonewcytochalsinsproducedbythefUngusA/etorr/z/z/wOTawiop//ae.J!iVa,./Vod2000,63,132-135;另夕卜也有12、15禾tU6元環的報導，如MalcolmS.B.，ToshihiroH.,andYoshinoriA.,CytochalasinsfromaZ)a/c//w/asp.offungus.屍/^tocAe附/W^y,1996，41(3):821-828.Evidente,A.etal"Tetrahedron,1992,48，6317-6324;該類化合物C9與C8側鏈為開環結構在C-18位有羰基的未見任何報導。本發明人研究發現綺麗穗黴KLA03(5Wcar&We卵/7SKLA03)(保藏編號是CCTCCM205049)液體發酵產物經超聲破碎後的粗提物有很好的細胞壞死活性，遂對其活性成分進行了研究，結果發現了1個新的開鏈10-苯基氫化異吲哚酮類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見對該化合物的化學結構及細胞增殖抑制活性的報導，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。
發明內容本發明旨在提供一種結構獨特的具有細胞增殖抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的新化合物。本發明的目的還在於提供一類新化合物的製備方法及其新化合物在製備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發明首次從綺麗穗黴KLA03(S/^can'ae/egfl"sKLA03)發酵物中發現了結構新穎的開鏈10-苯基氫化異吲哚酮類化合物，如式I所示其中式IR!、R3和R4為氫、氨基、羥基、垸氧基、醯氧基或醯氨基；R2為氫、烴基、羥基或醯基。所述的式I化合物為化合物1，其中I^R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基。上述發明中最優選的式I化合物是由海洋來源的綺麗穗黴KLA030S]w'cw7'ae/ega附KLA03)的液體發酵物經矽膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，石油醚-丙酮5:5的洗脫物，再經正相矽膠柱層析，氯仿-甲醇9:2洗脫產物再經HPLC，以60%甲醇-水洗脫得化合物l(10mg)。本發明採用MTT法測試了化合物1對P388、A-549、HL60及BEL-7402細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，這個化合物對這四種腫瘤細胞均有增殖抑制作用。因此本發明的式I化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可製成抗腫瘤藥物，用於腫瘤的治療。式I化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用於生命科學研究，作為探針應用時，式I化合物可溶於甲醇、水或含水甲醇中，也可溶於二甲基亞碸的含水溶液中加以應用。本發明的式I化合物可通過微生物發酵培養，然後從發酵物中分離純化而得到；也可由上述優選化合物經本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經發酵微生物製取本發明式I化合物的方法可採用其它任何能生產該類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可作為生產菌用於製備式I化合物。本發明的實施例中列舉了利用綺麗穗黴KLA03株製備優選的本發明式I化合物的實例。該真菌KLA03株由從青島近海海泥樣品中分離，並經分類學研究鑑定為綺麗穗黴S//cw/fle/egara。該菌株已於2005年5月26日保藏在中國典型培養物保藏中心(保藏編號CCTCCM205049)。該綺麗穗黴KLA03(5^'can'ae/egaraKLA03)CCTCCM205049株具有如下微生物菌學特徵(見表l):表1kla03菌株的微生物菌學特徵檢測項目結果檢測項目結果菌落直徑Om)810澱粉+表面顏色白色一灰褐色，粉狀d-木糖+/-基質色素淺褐色麥芽糖+氣生菌絲分枝，豐茂a-d-葡萄糖+分生孢子長穗狀l-鼠李糖+/-孢子形態長圓形麥牙三糖一形成隔膜+蜜二糖—有核多核d-果糖+吐溫80-d-乳糖一阿東糖醇-d-棉子糖—d-甘露醇-d-阿酪醇糖一d-甘露糖-d-松三糖一d-阿拉伯糖-海藻糖+d-阿拉伯醇-溴化琥珀酸—d-纖維二糖-癸二酸半乳糖-/+琥珀酸+d-半乳糖醛酸-琥珀酸甲酯+m-肌醇-甘油-對苯二酚葡萄苷+l-脯氨酸+龍膽二糖-p-羥基苯乙酸+需要特別說明的是，經發酵微生物製取本發明式i化合物的方法可釆用其它任何能生產開鏈10-苯基取代的氫化異吲哚酮類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可用作產素菌用於製備式i化合物。具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物l的化學結構是(結構式中的阿拉伯數字是化學結構中碳原子的標位)r4r2HOR3式i5化合物l的R,R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基。實施例1化合物1的發酵生產及分離精製1發酵生產生產菌的發酵培養按培養微生物的常規方法，取綺麗穗黴KLA03(5^cfln》e/eg"mKLA03)(保藏編號為CCTCCM205049)適量，接種到PDA斜面培養基上，在28攝氏度培養箱中培養4天。取斜面培養4天的綺麗穗黴KLA03(Sp'ca〃'fle/egaraKLA03)適量，接種到裝有120mL培養液[培養基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白腖5.0，葡萄糖20.0,pH7.0]的500mL錐型瓶中，在28°C、120轉/分鐘條件下搖床培養48小時，獲得綺麗穗黴KLA03OS//o^'ae/egaraKLA03)的種子培養液。將該種子培養液按10%接種量分別接種於裝有300毫升生產培養液[培養基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白腖5.0，葡萄糖20.0,pH7.0]的1000mL三角燒瓶中，進行為期25天24°C的靜置生產發酵，獲得菌絲體和發酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合併乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發酵液減壓濃縮為四分之一體積後，用乙酸乙酯萃取三次，合併菌絲體和發酵液的浸膏，共15.0克。3化合物的分離精製浸膏(15.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶劑溶解後，加70克200-300目矽膠H(青島海洋化工集團公司產品)拌樣，減壓除去溶劑後，用矽膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，分為30個流份。Fr-15(l克，石油醚-丙酮5:5洗脫物)，再經正相矽膠柱層析，氯仿-甲醇9:2洗脫產物再經HPLC，以60%甲醇-水洗脫得化合物1(10mg)。化合物1黃色油狀物，分子式C28H34N06,HRESIMSm/z410.2337[M-H20+H]+，計算值410.2331。tH及"CNMR數據見表1表1化合物1的，H(600MHz)和"CNMR(150MHz)數據postion<5H(■/inHz)HMBC'H-'HCOSY1175.0s—2(NH)—5.49(brs)C-3,C-4，C-9356.9d3.48(m)lOb452.9d2.65(brd,5.2)C-3，C-5，C-9，C-103'10a，11124.9s—-6129.9s—673.0d3.83(brs)tableseeoriginaldocumentpage7實施例2抗腫瘤活性的測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配製測試樣品為上述實施例1中分離精製的純品化合物1。準確稱取適量樣品，用甲醇配製成所需濃度的溶液，供活性測試。細胞系及細胞的繼代培養活性測試採用P388、HL60、BEL-7402和A549細胞系。各種細胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養基，在37QC通入5%二氧化碳的培養箱中繼代培養。細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發明採用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。活細胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶於水的formazan,formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由於formazan的量與活細胞數成正比，所以可根據吸收度求出活細胞的數目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。活性測試時，取對數生長期的P388、HL60、BEL-7402和A549細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配製成密度為每毫升5><104個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種於96孔板中，在37。C下培養24小時後，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續培養72小時。然後加入20uL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養4小時，移出150uL培養液後加入150uLDMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR%=(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照xi00Q/。式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR%)。2實驗結果化合物l的細胞增殖抑制活性-表2.化合物l對四種細胞株的抑制率細胞株化合物/濃度(//M)io-410-510-610-7P38868.49.96.75.9"A-54956.17.74.85.08.1HL6062.020.625.326.115.1BEL-740258.114.708.78.93結論化合物1對包括人在內的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。因此，本發明的式i、式n化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用於腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用於探索生命現象本質的生命科學實驗研究中。權利要求1.式I化合物式I其中式IR1、R3和R4為氫、氨基、羥基、烷氧基、醯氧基或醯氨基；R2為氫、烴基、羥基或醯基。2.權利要求1所述的式I化合物為化合物1，其中R,R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基。3.權利要求2所述式I化合物的製備方法，其特徵是發酵培養綺麗穗黴KLA03GSp/cw/ae/egamKLA03)(菌種保藏號CCTCCM205049)，獲取含有上述式I化合物的發酵物，然後從發酵物中分離純化出式I化合物。4.權利要求3所述的製備方法，其中將所述發酵物經矽膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，石油醚-丙酮5:5的洗脫物，再經正相矽膠柱層析，氯仿-甲醇9:2洗脫產物再經HPLC，以60%甲醇-水洗脫得化合物1(9mg)。5.權利要求1所述的式I化合物在製備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。6.權利要求1所述的式I化合物在製備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的用途。7.權利要求1所述的式I化合物在製備抗腫瘤藥物中的用途。全文摘要本發明涉及一種新型八碳側鏈氫化異吲哚酮類化合物開鏈10-苯基氫化異吲哚酮類化合物及其製備方法和用途。本發明用從海洋樣品中分離得到的綺麗穗黴KLA03(SpicariaelegansKLA03)生產出結構新穎的上述類型的化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。文檔編號C07D209/46GK101508668SQ20081000815公開日2009年8月19日申請日期2008年2月14日優先權日2008年2月14日發明者蔣習斐,瑾鄭申請人:蔣習斐