癌症療法的製作方法

2023-10-17 06:26:44

專利名稱：癌症療法的製作方法
技術領域：
本發明涉及治療癌症的方法。本發明尤其涉及導致腫瘤細胞的破壞的免疫調節。
背景技術：
雖然近些年來我們對於癌症的機制和可能的治療的理解已經有了增加，但是癌症仍就是遍及這個發達世界的死亡的主要原因。癌症治療的非特異性途徑，例如外科手術、放射療法和全身化療，已經能成功地治療某些循環的和緩慢生長的實體瘤。然而，許多種類的癌症對於標準治療通常有極大的抗性。因此，對於更多的並且更有效的癌症療法有需求。
免疫療法也已經被研究作為治療癌症的方法。免疫療法的一般原理是使被治療的患者獲得發動實際上是排斥應答，特別是抵抗腫瘤細胞的能力。現有許多研究中的免疫策略包括利用各種類型被刺激的自體細胞的過繼免疫療法；同種異體的淋巴細胞的全身遷移；免疫反應細胞的腫瘤內移植；和在遠點接種來產生全身腫瘤特異性免疫應答。
過繼T-細胞療法包括將抗原反應T細胞被動轉移至患腫瘤的宿主以便啟動腫瘤排斥。這些細胞與患者是組織相容的，並且通常從早先的自體給予獲得。
過繼免疫療法的一個途徑是用與腫瘤相關的抗原體外刺激自體的淋巴細胞來使它們成為腫瘤特異性的。自體的淋巴細胞和殺傷細胞也可以被非特異性地刺激。在一個例子中，能夠調節抗體依賴性細胞-調節的細胞毒性反應的表達白細胞的Fc受體是通過用IL-2和IFN-γ的組合培養產生的(US5,308,626)。在另一個例子中，在IL-2型淋巴因子-活化殺傷(LAK)細胞中培養的外周血來源的淋巴細胞，其對廣泛腫瘤細胞是溶細胞的，但是對於普通細胞不是溶細胞的。LAK主要來源於表達CD56抗原的天然殺傷細胞，而不是來源於CD3。這種細胞可以通過IL-2誘導的對培養平板的附著從外周血白細胞純化而得(A-LAK細胞；見US5,057,423)。
同種異體的淋巴細胞的過繼性轉移依賴於一般水平免疫刺激的建立，並且由此克服阻止宿主免疫系統抵制腫瘤的無反應性。儘管最初的實驗是十年前做的，此策略還是沒有獲得普遍的接受，尤其是用於治療實體瘤。
腫瘤內植入是直接將抗腫瘤的免疫細胞傳遞至作用部位的策略。因為被移植的細胞不循環，所以他們與宿主不必是組織相容的。同種異體細胞的腫瘤內移植會促進被移植的細胞與腫瘤反應的能力，並且引發有力的移植物對腫瘤的響應。例如，Kruse等(1990)證明了同種異體的細胞毒T淋巴細胞(CTL)向在Fischer大鼠中生長的腦腫瘤的直接腫瘤內植入，導致超過其它淋巴細胞種群的顯著的生存優勢，包括同源的CTL、LAK細胞、粘附的-LAK細胞或單獨的IL-2。
最終，宿主源的活性系統性腫瘤-特異性免疫應答的發生也已被用於控制癌生長的嘗試。此響應通過在腫瘤的遠端給予免疫組合物從患者自己的免疫系統引發。在宿主中引出的特異性抗體或免疫細胞有希望會遷移向腫瘤，然後根除癌細胞，無論這些癌細胞在機體中的何處。已經提出了各種類型的疫苗，包括分離的腫瘤抗原疫苗和抗獨特性抗體疫苗。對於抗腫瘤疫苗的可選擇的途徑是利用來自被治療的患者的腫瘤細胞，或這種細胞的衍生物。然而，對於許多患者沒有檢測到響應它們自己的腫瘤抗原的腫瘤退化，甚至當包含在疫苗製劑中時也沒有。
在一些增加免疫原性的途徑中，自體的或同源的腫瘤細胞被在遺傳上改變來產生協同刺激分子。協同刺激分子的例子包括細胞表面受體，例如B7-1協同刺激分子、同種異體的組織相容性抗原或細胞因子。
已經顯示CD4+T細胞的種群能調節自反應性T細胞，並因此抵禦自身免疫性疾病(Sakaguchi等，2001)。消除或控制這種自反應性細胞的無力在許多自身免疫性痰病中起作用。然而，哺乳動物免疫系統典型地控制這種自反應性淋巴細胞的能力限制了當腫瘤表達自體抗原時免疫系統控制腫瘤生長的能力。許多腫瘤抗原會被認為是自體抗原，因為他們通常來自胚胎發育的蛋白。因此，癌症患者抗癌的免疫反應應該被認為是自身免疫反應。這一反應通過調節機制自我限制。
儘管癌症治療尤其是癌症免疫治療取得了進展，但是仍然存在對於治療癌症的有效方法的需求。本發明提供能用來治療癌症的另一種免疫療法。
發明概述本發明指出，響應於腫瘤抗原的存在，產生至少兩種免疫細胞種群。更特別地，患有不受控制的細胞生長(癌症)的哺乳動物的免疫系統能夠通過一組此處通常稱作「效應細胞」的細胞引發抗腫瘤的免疫反應，然而，也產生第二種群的細胞，其調節「效應細胞」，此處通常稱作「調節細胞」，限制哺乳動物有效地控制或根除腫瘤的能力。
進一步，本發明也指出在調節細胞擴張前，響應於腫瘤抗原的效應細胞的相對數目擴張。這提供了阻止「調節細胞」的產生、限制其功能或破壞它的機會，同時維持「效應細胞」。
雖然在某些情況下，可能會篩選由於遺傳缺陷會易於感染癌症的個體，但是對於由腫瘤細胞產生的腫瘤抗原的最初的免疫響應難於追蹤，只有在事件開始發生後才能檢測到腫瘤生長，實際上，在很多情況下，在檢測前腫瘤的生長就已在進行了。
當效應細胞通過哺乳動物免疫系統產生時，其能夠控制腫瘤生長，它們的活性由調節細胞的產生而被損害，調節細胞對於效應細胞群具有負性影響。為了最優化效應細胞功能，本發明的發明者設計了癌症治療方法，至少部分地「重置」對腫瘤抗原的免疫反應，因此提供利用「效應細胞」種群來控制腫瘤生長的方法。
因此，在第一方面，本發明提供治療哺乳動物患者癌症的方法，此方法包括i)減少患者的腫瘤負荷，ii)使定向於抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞基於腫瘤抗原的刺激而增加，和iii)隨後給予患者藥物，此藥物抑制調節細胞的產生，限制其功能和/或破壞調節細胞，其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
基於步驟i)的結論，如果任何腫瘤細胞殘留，腫瘤細胞增殖會重新開始，其反過來會導致定向於由腫瘤細胞產生的腫瘤抗原的效應細胞的擴張。
在患者腫瘤負荷減少後，需要監測患者來決定何時應該給予藥物。可以被監測的因素包括，但不限於，腫瘤抗原水平、CD8+CD4-T細胞水平、CD4+CD8-T細胞水平和急性期炎症標記例如c-反應性蛋白水平。
在優選的具體實施方案中，監測患者c-反應性蛋白水平的波動來決定何時給予藥物。優選地，大約當c-反應性蛋白的水平開始減少時給予藥物。在這種情況下，效應細胞的產生和/或活性導致c-反應性蛋白水平增加。在調節細胞的同種細胞擴張時，效應細胞的活性下調導致c-反應性蛋白水平減少。
在第一個方面的優選具體實施方案中，大約在步驟i)後響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時給予藥物。
由於在步驟i)後基於腫瘤抗原的刺激導致效應細胞產生，在調節細胞產生前這些細胞會穩定和/或導致腫瘤細胞數目減少。因此，在進一步優選的具體實施方案中，大約當腫瘤細胞數目減少和當調節細胞數目增加時給予藥物。典型地，通過分析合適的腫瘤細胞標記物的水平測定腫瘤細胞數目。
自然，如果進行手術，有希望移除所有的腫瘤細胞。然而，由於腫瘤的定位和/或至少一些腫瘤細胞會被遺漏，這有時是不可能的。在優選的具體實施方案中，通過手術移除至少一些腫瘤細胞來減少患者的腫瘤負荷。優選地，通過手術移除至少50％，更優選至少75％，更優選至少90％，甚至更優選至少95％的腫瘤細胞。
在替代的優選實施方案中，通過給予抗癌化合物來減少腫瘤負荷。
抗癌化合物可以是任何已知的分子，它特異性地或非特異性地(例如，一般性抗有絲分裂藥物)破壞患者的腫瘤細胞或限制患者腫瘤細胞的功能。優選的抗癌化合物包括，但不限於長春鹼和去水長春鹼。
在進一步替代的優選實施方案中，通過使患者接受放射治療來減少腫瘤負荷。
通過給予由患者的腫瘤細胞產生的抗原能提高效應細胞的產生。
因此，在進一步優選的實施方案中，本方法進一步包括，在步驟i)後，給予由患者的腫瘤細胞產生的抗原。
在第二個方面，本發明提供治療哺乳動物患者的癌症的方法，其已經接觸了抗癌化合物，或已經通過手術至少除去了部分腫瘤，或已經接受了放射治療，此方法包括給予患者藥物，此藥物抑制調節細胞的產生、限制其功能，和/或破壞調節細胞，其中選擇藥物的給藥時間，以使效應細胞的活性不會顯著地降低。
通過增加患者內腫瘤抗原的數量，可以獲得患癌症的哺乳動物患者的效應細胞的再刺激。增加更多的腫瘤抗原可增強效應細胞響應，由此提供切除或抑制這些新效應物的調節物的機會。
因此，在第三個方面，本發明提供治療哺乳動物患者癌症的方法，此方法包括i)給予腫瘤抗原，其導致定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活化產物增加，和ii)隨後給予患者藥物，其抑制調節細胞的產生，限制其功能，和/或破壞調節細胞，其中，選擇藥物給藥的時間，以便效應細胞的活性不會顯著地降低。
在第三個方面的優選的實施方案中，大約當響應於給予的腫瘤抗原的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時給予藥物。
在第三個方面的進一步優選的實施方案中，大約當在給予腫瘤抗原後腫瘤細胞數目開始穩定或減少的時候給予藥物。
在第三個方面的另一個優選的實施方案中，大約當在給予腫瘤抗原後循環的腫瘤抗原的數目開始穩定或減少時給予藥物。
優選地，抗原是通過給予包含腫瘤抗原和可藥用載體的疫苗提供給患者。更優選地，疫苗進一步包含輔劑。
在另一個實施方案中，抗原是通過給予編碼抗原的DNA疫苗提供給患者。
在另一個實施方案中，抗原是通過食用表達抗原的轉基因植物提供給患者。
優選地，在調節細胞切除中使用的藥物選自抗增殖藥物、輻射劑和抑制調節細胞下調活性的抗體。優選地，抗增殖藥物選自長春鹼和去水長春鹼。值得注意地，在某些情況下，尤其是關於第一方面，抗癌化合物和藥物實際上可以是相同的分子。
優選的抗體的例子包括，但不限於抗-CD4+、抗-CTLA-4(細胞毒的與淋巴細胞有關的抗原-4)、抗-GITR(糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體)、抗-CD28和抗-CD25。
本領域技術人員會容易地理解這一點，本發明的方法可以被重複來提供更完全的治療。
優選地，哺乳動物患者是人。
在另一方面，本發明提供抑制調節細胞的生產、限制其功能和/或破壞調節細胞的藥物在製備對患癌症的哺乳動物患者給藥的藥物中的應用，其中在患者的腫瘤負荷已經減少後給予藥物，其使得定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激增加，並且其中選擇藥物給藥的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
在另一方面，本發明提供抗癌化合物在製備對患癌症的哺乳動物患者給藥的藥物中的應用，其中抗癌化合物減少腫瘤負荷，其使得定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激增加，並且其中患者被隨後給予抑制調節細胞的產生和/或破壞調節細胞的藥物，並且其中選擇藥物給藥的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
在另一個方面，本發明提供抑制調節細胞的產生、限制其功能和/或破壞調節細胞的藥物在製備對患癌症的哺乳動物患者給藥的藥物中的應用，其中哺乳動物患者已經接觸過抗癌化合物，或已經通過手術移去了至少部分腫瘤，或已經接受過放射療法，其中選擇藥物給藥的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
在另一個方面，本發明提供抑制調節細胞的產生、限制其功能和/或破壞調節細胞的藥物在製備對患癌症的哺乳動物患者給藥的藥物中的應用，其中患者已經預先被給予了腫瘤抗原，其導致定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目增加和/或激活效應細胞，其中選擇藥物給藥的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
在另一個方面，本發明提供腫瘤抗原在製備對產生抗原的患癌症的哺乳動物給藥的藥物中的應用，其中腫瘤抗原導致定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目增加和/或激活效應細胞，並且其中隨後給予患者抑制調節細胞產生、限制其功能和/或破壞調節細胞的藥物，並且其中選擇藥物的給藥時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
在上面概述的各方面中，「調節」種群的切除使得「效應」種群能減少或消滅腫瘤細胞，因為任何效應下調已經被除去。
這一點是顯然的，即本發明一方面的優選的特點和特徵被應用於本發明的許多其它方面。
貫穿這一說明書，詞語「包含(comprise)」或變體例如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」應該被理解為意味著包含陳述的元素、整體或步驟，或元素、整體或步驟的組，但是不排除任何其它元素、整體或步驟，或元素、整體或步驟的組。
在下文中通過下面的非限制性實施例和根據附圖來描述本發明。
附圖簡述

圖1在間皮瘤區域上Vb治療的效果。第0天＝間皮瘤接種，在時間點第14天和之後用測徑器測量。顯示了腫瘤面積平均值和平均值的標準差。
發明詳述定義此處使用的術語「治療」或「治療」指獲得了腫瘤負荷的減少。在本發明的某些方面，一個步驟包括通過已知技術例如手術、放射療法或化療的應用來減少腫瘤負荷，然後在合適的時間給予藥物。在這些方面中，術語「治療」或「治療」被用來指通過本發明的方法進一步減少患者的腫瘤負荷。最優選地，腫瘤負荷被完全根除。
此處使用的術語「腫瘤負荷」通常指在任何給定的時間患者癌細胞的數目。
「調節細胞」包括，但不必限於CD4+T細胞的亞群。這種細胞在本領域中也可以被稱作「抑制細胞」。調節細胞可以定向作用於效應細胞或可以通過其它機制表現它們對效應細胞的影響。
CD4+細胞表達在本領域中已知作為CD4的標記。典型地，當在這裡使用時術語「CD4+T細胞」不指也表達CD8的細胞。然而，這一術語包括也表達其它抗原標記例如CD25的T細胞。
「效應細胞」包括，但不必限於已知為CD8+細胞的T細胞種群。
在這裡使用時，當提到「調節細胞」與藥物接觸時，術語「切除」或「切除(名詞)」指通過藥物下調調節細胞的數目和/或活性。最優選地，通過藥物徹底根除調節細胞的數目和/或活性。
這一點在本領域是已知的，即癌症通常被看作是不受控制的細胞生長。本發明的方法可以被用來治療任何癌症包括，但不限於惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這種癌症的更具體的例子包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、鱗狀上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、間皮瘤、腎癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、皮膚癌、黑素瘤、腦癌、卵巢癌、成神經細胞瘤、骨髓瘤、各種類型的頭和頸癌、急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、尤因肉瘤和周圍神經上皮樣瘤。
除非另外指出，在本發明中使用的重組DNA和免疫技術是標準程序，本領域技術人員公知。這種技術在下列文獻中有描述和解釋，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，JohnWiley and Sons(1984)，J.Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(編者)，Essential Molecular BiologyAPractical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)，D.M.Gloverand B.D.Hames(編者)，DNA CloningA Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(編者)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今的所有補充更新材料)，Ed Harlow和David Lane(編者)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coligan等(編者)Current Protocols in Immunology，John Wiley Sons(包括至今的所有補充更新材料)，在這裡被引入作為參考。
抑制調節細胞產生、限制調節細胞功能和/或破壞調節細胞的藥物藥物可以是選擇性地或非選擇性地導致調節細胞的破壞或抑制調節細胞的產生的任何因子或治療。例如，CD4+特異性抗體尤其可以被用來特異性靶向CD4+T細胞。然而，在某些情況下，可以使用非選擇性藥物，例如抗增殖藥物或輻射，它們都破壞分裂細胞。
術語「抗增殖藥物」是本領域公知的術語，指任何破壞分裂細胞或抑制它們不進行進一步增殖的化合物。抗增殖藥物包括，但不限於氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、六甲密胺、噻替哌、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈佐星、達卡巴嗪、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁、長春鹼、去水長春鹼、長春新鹼、依託泊苷、替尼泊苷、放線菌素、柔紅黴素、阿黴素、博來黴素、普卡黴素、絲裂黴素、L-門冬醯胺酶、順鉑、米託蒽醌、羥基脲、丙卡巴肼、米託坦、氨魯米特、潑尼松、己酸羥孕酮、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、二乙基己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、丙酸睪丸酮、放射性同位素、篦麻毒蛋白A鏈、紫杉醇、白喉毒素和假單胞菌外毒素A。
藥物可以如在本領域中使用的標準劑量給藥。在一個實施方案中，作為單次快速濃注注射劑給藥。在另一個具體實施方案中，經一段時期例如24小時通過輸注給藥。
最近的研究說明CD4+CD25+T細胞在調節定向抗自身抗原的免疫細胞中起重要作用(Salomon等，2000；SuriPayer和Cantor，2001)。此外，CD4+CD25+T細胞的靶向切除已經顯示能提高動物控制腫瘤生長的能力(Onizuka等1999；Shimizu等，1999；Sutmuller等，2001)。因此，當在這裡使用時，CD4+CD25+T細胞可以被用作調節細胞。通過抗-GITR、抗-CD28和/或抗-CTLA-4能下調CD4+CD25+T細胞的活性(Read等，2000；Takahashi等，2000；Shimizu等，2002)。因此，這些抗體可以用作藥物用在本發明的方法中。
患者與藥物接觸的時間如上面的概述，本發明依賴於觀察到在調節細胞前響應於抗原的效應細胞的相對數目擴張。因此，當在這裡使用時，術語「效應細胞的活性不會顯著地降低」意味著藥物給藥的時間是這樣，即與效應細胞相比，藥物具有抗調節細胞的相應的較大的效應。顯然地優選的是在當抗調節細胞的效應與抗效應細胞的效應的比率最大時給藥。
本發明的一些方面依賴於在為效應細胞選擇前減少腫瘤負荷。存在許多通過切除調節細胞使效應細胞能被選擇的途徑。一條途徑包括在通過技術例如但不限於放射療法、化療和手術減少腫瘤負荷後，大約當響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時給予藥物。另一條途徑包括在通過技術例如但不限於放射療法、化療和手術減少腫瘤負荷後，大約當腫瘤數目減少且當響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激的調節細胞數目增加時給予藥物。
在大多數情況下，藥物被給予的時間點需要在患者癌症的不同階段經驗性地給予，因為他們的免疫響應動力學會變化。其它因素例如患者的一般健康狀況和/或患者的遺傳天性也會影響何時是給予藥物的合適的時間。
在本領域中已知的技術可用來在腫瘤負荷減少後監測效應細胞的生長種群，或通過令患者與更多的腫瘤抗原接觸來刺激免疫反應。例如，急性期蛋白例如c-反應性蛋白(例如在Price等，1987中公開的)的產生會指示存在對腫瘤抗原的免疫響應。
在本領域中已知的技術也能被用來在腫瘤負荷減少後監測調節細胞的生長種群，或通過令患者與更多的腫瘤抗原接觸來刺激免疫反應。這些技術中的一些在下面討論。
收集系列的血樣並通過FACS分析定量地篩選所有CD4+亞型。需要維持這一FACS監測，直到調節細胞響應於腫瘤抗原開始同種細胞地擴張，無論此腫瘤抗原是通過腫瘤產生的或是給予患者的。監測調節細胞生長種群的其它可能分析法包括淋巴細胞增殖/激活分析法和各種細胞因子水平分析法(例如分析IL-4、IL-6或IL-10的方法)。
測定給藥時間點的另一途徑是監測腫瘤負荷。人們想像腫瘤負荷下降是由於效應細胞的活性，然而，調節細胞的隨後的增加會下調效應細胞，導致腫瘤負荷下降緩慢。因此，大約可以在腫瘤負荷下降緩慢之前給予藥物。在本領域中已知的技術，例如由腫瘤表達的標記RT-PCR或抗體的檢測，可以用來測量這些情況下的腫瘤負荷。適合的腫瘤抗原標記分析法的例子包括，但不限於AFP(肝細胞癌和生殖細胞瘤的標記)、CA 15-3(包括乳腺癌的眾多癌症的標記)、CA 19-9(包括胰腺癌和膽道腫瘤的眾多癌症的標記)、CA 125(包括卵巢癌的各種癌症的標記)、降鈣素(包括甲狀腺髓樣癌的各種腫瘤的標記)、兒茶酚胺和代謝物(嗜鉻細胞瘤)、CEA(包括結腸直腸癌和其它胃腸癌症的各種癌症的標記)、hCG/βhCG(包括生殖細胞瘤和絨毛膜癌的各種癌症的標記)、尿中的5HIAA(類癌瘤綜合症)、PSA(前列腺癌)、sertonin(類癌瘤綜合症)和甲狀腺球蛋白(甲狀腺癌)。
監測可能需要頻繁進行，例如頻繁到每幾小時，以確保選擇給藥的正確時間點。優選地，至少每48小時進行監測。更優選地，至少每24小時進行監測。
最理想地，持續進行監測以測定藥物的效果。切除不足、調節細胞再度出現或腫瘤負荷增加意味著應當重複本發明的方法。這種治療的重複周期會產生免疫記憶。因此，可能的是本發明以重複模式使用，會提供一些預防性保護效應。
C-反應性蛋白C-反應性蛋白(CRP)是重要的急性期反應蛋白，並且在急性期反應期間其在血清中的濃度會增加1000倍。CPR是由五個相同的亞單位構成的五聚體，每一個的分子量為約23,500。
CRP水平先前被顯示為癌症重現的標記(Hosotsubo等2000；Mahmoud和Rivera，2002)。C-反應性蛋白的水平可以利用本領域已知的技術測定，這些技術包括但不限於在Senju等(1983)，Price等(1987)和Eda等(1998)中公開的那些。
腫瘤抗原當在這裡使用時，「抗原」是任何包含表位的多肽序列，其能夠產生抗癌的免疫響應。優選地，抗原會包含對於癌細胞有高度選擇性的序列。人們想像特定癌細胞能被表徵並且產生能匹配癌症序列的抗原以便最大化產生有效免疫響應的可能。
能夠引起抗癌細胞的免疫響應的抗原在本領域是公知的。特定的腫瘤抗原可以通過免疫系統被識別和靶向。這一特性可能是由於腫瘤組織的過表達。在普通組織中可以監測到這些抗原中的一些。被T細胞靶向的腫瘤抗原通常是細胞內加工的蛋白質，並且呈現作為被CD8+細胞毒性T淋巴細胞識別的在腫瘤MHC類I分子的溝中結合的短肽片斷。僅存在腫瘤抗原不總是足以觸發免疫響應。有時需要共刺激分子例如B7.1。一旦抗原特異性T細胞被刺激，它們能識別和破壞腫瘤。對於激活抗原特異性T細胞所需的環境是嚴格的，但是對於靶向腫瘤細胞和T細胞的基因操作是不限制的。
可以按照本領域已知的導致免疫響應的任何方式提供抗原。抗原可以是例如天然的、重組的或合成的。天然的抗原可以通過例如提供腫瘤細胞的細胞溶解產物來製備。
抗原可以作為在疫苗組合物中的分離的多肽被提供。在這一情況下，抗原可以從腫瘤細胞純化，從重組細胞表達和分離，或利用肽合成儀合成產生。
疫苗疫苗可以從一種或多種抗原製備。包含抗原的疫苗的製備對於本領域技術人員是已知的。典型地，這種疫苗被製備為可注射的、或口服的，作為液體溶液或混懸液；也可以製備適合於在注射或口服前溶解入或混懸入液體的固體形式。製劑也可以是乳化的或包裹在脂質體中的蛋白質。抗原通常與載體/賦形劑混合，它們是可藥用的和與活性成分相容的。適合的載體/賦形劑是例如水、鹽水、右旋糖苷、甘油、乙醇等和它們的組合。
此外，如果需要，疫苗可以包括少量輔助的物質例如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝劑，和/或增強疫苗有效性的輔劑。
當在這裡使用時，術語「輔劑」指非特異性地增強對抗原的免疫響應的物質。可能有效的輔劑的例子包括但不限於N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯-正-胞壁醯-L-丙氨醯-D-異谷醯胺(CGP 11637，稱作正-MDP)，N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱作MTP-PE)和RIBI，其在2％角鯊烯/吐溫80乳劑中包含三種提取自細菌、單磷醯脂質A，海藻糖二真菌酯(trehalose dimycolate)和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)的成分。輔劑的進一步的例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁(明礬)、細菌性內毒素、脂質X、小棒狀桿菌(Propionobacteriumacnes)、百日咳桿菌、多核糖核苷酸、海藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、皂角甙、脂質體、左旋咪唑、二乙氨乙基右旋糖苷、嵌段共聚物或其它合成的輔劑。這些輔劑可以從不同的來源商購得到，例如MerckAdjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或Freund′s Incomplete Adjuvant和Complete Adjuvant(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。
抗原和輔劑的比例可以在一個寬範圍上變化，只要它們都以有效量存在。例如氫氧化鋁可以按照佔疫苗混合物(基於Al2O3)約0.5％的量存在。方便地，疫苗被製成包含抗原多肽的最終濃度在0.2-200μg/ml範圍內，優選5-50μg/ml，最優選15μg/ml。
在製成製劑後，疫苗可以被裝入無菌容器，然後將此容器密封並儲存在低溫，例如4℃，或者其可以冷凍乾燥。冷凍乾燥允許以穩定形式長期儲存。
疫苗被方便地胃腸外給予，通過注射，例如皮下或肌內注射。適於其它給藥方式的另外的製劑包括栓劑，和在某些情況下，口服製劑。對於栓劑，傳統的粘合劑和載體可以包括，例如聚烯基乙二醇或甘油三酯；這種栓劑可以從含有0.5％-10％，優選1％-2％的活性成分的混合物形成。口服製劑包括這種通常使用的賦形劑如，例如藥用等級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物採用溶劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或粉劑形式，並包含10％-95％的活性成分，優選25％-70％。其中疫苗組合物是凍幹的時，凍幹的物質可以在給藥前重新配製，例如作為混懸液。重新配製優選在緩衝液中完成。
可以提供帶有腸溶衣的對患者口服給藥的膠囊、片劑和丸劑，腸溶衣包括例如Eudragit″S″、Eudragit″L″、醋酸纖維素、醋酞纖維素或羥丙甲基纖維素。
DNA接種DNA接種包括在體內直接向患者的組織引入編碼抗原的DNA來通過患者的組織細胞表達抗原。這種疫苗在這裡稱作「DNA疫苗」或「基於核苷酸的疫苗」。DNA疫苗在US 5,939,400、US 6,110,898、WO95/20660和WO 93/19183中有描述，這些公開文獻在此被全文引入作為參考。已經在眾多實驗系統中證明了編碼抗原以引發保護免疫響應的直接注射的DNA的能力(例如見Conry等，1994；Cardoso等，1996；Cox等，1993；Davis等，1993；Sedegah等，1994；Montgomery等，1993；Ulmer等，1993；Wang等，1993；Xiang等，1994；Yang等，1997)。
迄今為止，大部分在哺乳動物系統中的DNA疫苗依賴於來自細胞巨化病毒(CMV)的病毒啟動子。它們在許多哺乳動物物種的肌肉和皮膚接種中有良好的功效。影響通過DNA免疫法引發的免疫響應的已知因素是DNA傳輸方法，例如腸胃外途徑會產生低速率的基因轉移並且產生相當大的基因表達變異性(Montgomery等，1993)。利用基因槍高速度地接種質粒增強了小鼠的免疫響應(Fynan等，1993；Eisenbraun等，1993)，大概是因為DNA轉染的較高的效率和通過樹狀突細胞的更有效的抗原表達。包含本發明的基於核苷酸的疫苗的載體也可以通過其它本領域已知的方法被引入需要的宿主，例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、二乙氨乙基右旋糖苷、磷酸鈣沉澱、脂轉染(溶酶體融合)或DNA載體運載體。
來自轉基因植物的疫苗產生抗原性多肽的轉基因植物可以利用本領域公知的方法構建。目前正在開發對於動物和人類病原體的許多植物衍生的可食用的疫苗(Hood和Jilka，1999)。免疫響應也可來自用產生病毒樣顆粒(VLPs)的轉基因植物產生的口服免疫。已經有人指出這些VLPs或嵌合體病毒的微粒形式會導致抗原在胃中的更大的穩定性，有效地增加在腸中攝取可用的抗原的量(Mason等1996，Modelska等1998)。
實施例實施例1人類惡性間皮細胞瘤是石棉誘導的、難以治癒的腫瘤，其尤其具有預後不良。從診斷到死亡的平均時間只有八個月(Musk和Woodward，1982)。西澳大利亞大學醫學部的研究者開發了鼠類模型以進一步研發適合的介入(Davies等，1992)。鼠類腫瘤顯示與人類臨床表現一致的形態學特徵、分布和在體腔內擴散的模式。
第0天被定義為腫瘤細胞接種日，用1×106AE 17細胞皮下接種。AE 17腫瘤細胞系來源於C57/B16小鼠並被接種回相同的菌株。這一點今後將被稱作腫瘤激發。每組5隻的三組小鼠都以此方式被激發。隨後，在腫瘤激發後第14天，第一組小鼠被給予單ip劑量的長春鹼(Vb)，6mg/kg體重(Vb 19/11/01組)。第二組的5隻小鼠在下一天被相似地處理；腫瘤激發後第15天(Vb 20/11/01)。第三組不接受yb治療(未治療/對照組)。
從第14天起用測徑器進行腫瘤測量(直角測量2個直徑，以mm計)。然後將這兩個直徑相乘以給出mm2值，從過去的經驗已知其與腫瘤體積和腫瘤質量都相關。從這一實驗得到的數據列在表1和圖1中。
很明顯在激發後第14天接受單Vb治療的小鼠得到了很好的保護以避免腫瘤發展。相反，對照和第15天Vb治療組在五分之四的小鼠中顯示顯著的腫瘤發展。來自於此的數據顯示Vb治療顯示狹窄的治療窗且在這一時間點有80％的效果。
表1治療 動物#19-Nov20-Nov23-Nov26-Nov29-Nov 30-Nov 3-Dec5-Dec 7-Dec24#15#19#21#24#25#24#30#37#Vb19/11/01 1 4 0.5 0 0.5 0 000 0第14天 2 4 0.5 2 0.5 6 10.5 0 03 4 0.5 1 1 4 0.5 4070704 4 0 0 0 0 000 05 0.5 0 0.5 0 0 000 03.5 0.5 0.7 0.4 2 0.3 0.1 14 14Vb20/11/01 1 0.5 1 4 9 1620 42 56 81第15天 2 0.5 0.5 0.5 0.53 0.5 0 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.54 4 0.5 0.5 8 2530 5690905 9 0.5 0 0.5 12259090902.9 0.5 1 3.7 13.4 18.9 47.1 59.165.4未處理 1 0.5 0.5 0.5 1 3020 42 22 22對照 2 0.5 0 0 2 6 20 20 42 1003 40 0.5 0 0 000 04 40.5 1 4 2030 4220225 41 9 1240368484842.6 0.4 2.2 3.8 15.2 21.237.66374.6實施例2使有與癌症相關的PSA升高的前列腺癌患者接受包括環磷醯胺的標準化療療法(例如，如Casciato和Lowitz描述的，1995)。一完成化療就監測患者的PSA標記。這種監測優選應該在化療完成後至少每24小時進行，並持續至少一個月。
如果PSA標記水平開始增加，顯然是化療沒有完全成功。持續監測PSA水平直到PSA的水平減少。這表明效應細胞開始控制新的癌細胞。大約在這一點以標準劑量例如3-4mg/m2靜脈給予患者長春鹼(Casciato和Lowitz，1995)。長春鹼會靶向分裂細胞，例如調節細胞，其開始同種細胞地擴張以控制效應細胞水平。
進一步監測患者的PSA水平以確保癌症被控制。如果需要，重複治療。
實施例3使具有與癌症相關的CA15-3(多形態上皮粘蛋白的表位)水平升高的乳腺癌患者接受手術以嘗試除去腫瘤。一完成化療就監測患者的CA 15-3標記。這種監測優選應該在手術後至少每24小時進行，並持續至少一個月。
如果CA 15-3標記水平開始增加，顯然通過手術沒有除去所有的腫瘤細胞。持續監測CA 15-3水平直到CA 15-3的水平減少。這表明效應細胞開始控制新的癌細胞。然後使患者接受放射治療以靶向分裂細胞，例如向整個乳腺提供巨電壓γ輻射(大約4500-5000cGy)(Casciato和Lowitz，1995)進一步監測患者的CA 15-3水平以確保癌症被控制。如果需要，重複治療。
實施例4使急性成淋巴細胞性白血病患者接受包括長春新鹼和強的松的標準化療療法(Casciato和Lowitz，1995)。化療一完成，就大體如Price等的描述(1987)監測患者的c-反應性蛋白水平。這種監測優選應該在化療完成後至少每24小時進行，並持續至少一個月。
如果c-反應性蛋白水平開始增加，其指示患者免疫系統對抗原有了免疫響應，並且通過化療沒有根除所有癌細胞。自然，患者應被檢查任何會促使c-反應性蛋白水平增加的病症，例如病毒或細菌感染。如果沒有這種病症，持續監視c-反應性蛋白的水平，直到c-反應性蛋白的水平達到峰值並開始減少。這指示效應細胞開始控制新的癌細胞。在這一點以標準劑量例如300mg給予患者至少靶向部分調節細胞種群的抗-CD4+抗體。
進一步監測患者的c-反應性蛋白水平以確保癌症被控制。如果需要，重複治療。
實施例5檢驗黑素瘤患者的MAGE-3，其在大約76％的黑素瘤患者中表達。如果檢測到了MAGE-3表達，大體如Coulie等的描述(2001)給患者注射在疫苗組合物中的適合的MAGE-3肽。
然後監測患者的CD8+CD4-T細胞數目，優選至少每24小時一次持續至少一個月。大約當響應於效應細胞的基於腫瘤抗原刺激的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時，以標準劑量例如3-4mg/m2靜脈內給予患者長春鹼。長春鹼會靶向分裂細胞，例如調節細胞，其同種細胞地擴張以控制效應細胞水平。
進一步監測患者的癌細胞，例如利用S100蛋白作為標記(Casciato和Lowitz，1995)。如果進一步檢測到黑素瘤細胞，可以重複治療。
有經驗的閱讀者會意識到這一點，即通常被用來減少腫瘤負荷、靶向調節細胞和確定給藥時間點的一般方法對於任何給定的治療是典型可互換的。自然，標準技術例如化療、放射療法、手術和治療細胞標記檢測，優選地如已經在本領域中使用的進行(例如見Casciato和Lowitz，1995)。
本領域技術人員會理解，可以對本發明做大量的改變和/或修正，如在特定具體實施方案中顯示的，而不偏離如廣義描述的本發明的精神和範圍。因此，本發明的這些實施方案應從各方面被認為是例證性而不是限制性的。
所有上面討論的出版物都被全文引入此處。
包括在本說明書中的對文獻、行為、材料、裝置、物品或類似物的任何討論僅是為了提供本發明背景的目的。不應認為任何或所有這些內容形成現有技術的部分或成為相應於本發明的領域的常識，僅因為其存在於本申請各權利要求的優先權日之前。
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權利要求
1.治療哺乳動物患者癌症的方法，此方法包括i)減少患者的腫瘤負荷，ii)使定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激而增加，並且iii)隨後給予患者抑制調節細胞產生、限制其功能和/或破壞調節細胞的藥物，其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
2.權利要求1的方法，其中監測患者的c-反應性蛋白水平的波動以決定何時給予藥物。
3.權利要求2的方法，其中當c-反應性蛋白的水平開始降低的時候給予藥物。
4.權利要求1的方法，其中大約當在步驟i)後響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時給予藥物。
5.權利要求1的方法，其中大約當腫瘤細胞數目下降且當調節細胞數目增加時給予藥物。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中通過手術除去至少一些癌細胞來減少患者的腫瘤負荷。
7.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中通過給予抗癌化合物來減少腫瘤負荷。
8.權利要求7的方法，其中抗癌化合物是長春鹼或去水長春鹼。
9.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中通過使患者接受放射療法來減少腫瘤負荷。
10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中此方法進一步包括在步驟i)後給予通過患者的腫瘤細胞產生的抗原。
11.治療哺乳動物患者癌症的方法，此患者已經接觸過抗癌化合物，或已經通過手術除去了至少部分腫瘤或已經接受過放射治療，此方法包括給予患者抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物，其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
12.治療哺乳動物患者癌症的方法，此方法包括i)給予腫瘤抗原，其導致定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目增加和/或活化效應細胞，和ii)隨後給予患者抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物，其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
13.權利要求12的方法，其中監測患者的c-反應性蛋白水平的波動以決定何時給予藥物。
14.權利要求13的方法，其中當c-反應性蛋白的水平開始減少的時候給予藥物。
15.權利要求12的方法，其中大約當響應於腫瘤抗原的給予的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時給予藥物。
16.權利要求12的方法，其中大約當在給予腫瘤抗原後腫瘤細胞的數目開始穩定或減少時給予藥物。
17.權利要求12的方法，其中大約當在給予腫瘤抗原後循環的腫瘤抗原的數目開始穩定或減少時給予藥物。
18.根據權利要求12-17中任一項的方法，其中通過給予包含腫瘤抗原和可藥用載體的疫苗組合物來提供給患者抗原。
19.權利要求18的方法，其中疫苗組合物進一步包含輔劑。
20.根據權利要求12-17中任一項的方法，其中通過給予編碼抗原的DNA疫苗來提供給患者抗原。
21.根據權利要求12-17中任一項的方法，其中通過食用表達抗原的轉基因植物來提供給患者抗原。
22.根據權利要求1-21中任一項的方法，其中藥物選自抗增殖藥物、輻射和抑制調節細胞下調活性的抗體。
23.權利要求22的方法，其中抗體是抗-CD4+。
24.根據權利要求1-23中任一項的方法，其中方法重複至少一次。
25.根據權利要求1-24中任一項的方法，其中哺乳動物患者是人。
26.抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物在製備給予患癌症的哺乳動物患者的藥物中的應用，其中在患者的腫瘤負荷已經減少後給予藥物，其使得定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激而增加，並且其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
27.抗癌化合物在製備給予患癌症的哺乳動物患者的藥物中的應用，其中抗癌化合物減少腫瘤負荷，其使得定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性響應於效應細胞的基於腫瘤抗原的刺激而增加，並且其中隨後給予患者抑制調節細胞產生、和/或破壞調節細胞的藥物，並且其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
28.抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物在製備給予患癌症的哺乳動物患者的藥物中的應用，其中哺乳動物患者已經接觸過抗癌化合物，或已經通過手術至少部分地除去了腫瘤，或已經接受了放射療法，並且其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
29.抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物在製備給予患癌症的哺乳動物患者的藥物中的應用，其中患者已經被預先給予了腫瘤抗原，其使得定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性增加，並且其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
30.腫瘤抗原在製備給予產生腫瘤抗原的患癌症的哺乳動物患者的藥物中的應用，其中腫瘤抗原導致定向抗腫瘤抗原的效應細胞的數目和/或活性增加，並且其中患者被隨後給予抑制調節細胞產生、限制其功能、和/或破壞調節細胞的藥物，並且其中選擇給予藥物的時間，使得效應細胞的活性不會顯著地降低。
全文摘要
本發明提供治療癌症患者的方法。此方法依賴於對在「調節」或「抑制」細胞下調靶向腫瘤細胞的免疫細胞的活性前，靶向腫瘤細胞(「效應細胞」)的免疫系統的細胞同種細胞地擴張的觀察。此處提供在治療癌症中刺激效應細胞產生的方法，並且也提供抑制調節細胞產生、限制其功能，和/或破壞調節細胞的方法。
文檔編號A61K48/00GK1646155SQ03808204
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月14日 優先權日2002年2月14日
發明者M·L·阿什當 申請人:免疫援助有限公司