一種厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法
2023-10-08 15:24:54 2
專利名稱：一種厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法
技術領域：
本發明涉及一種厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法，屬真菌學技術領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是一種世界範圍內普遍發生的植物病害，每年對農作物造成巨大的損失。在線蟲的生物防治中，厚垣孢輪枝孢是一類重要的真菌，目前利用厚垣孢輪枝孢研製開發的線蟲生物製劑已經上市。本發明人前期申請的「一種微生物及其生產生物殺線蟲製劑的方法」專利就是利用以厚垣孢輪枝孢為出發菌株，研製開發了一種防治根結線蟲的生物農藥，目前開發的產品一線蟲必克已經大量上市。
在利用厚垣孢輪枝孢研製開發的線蟲生物農藥中，產生厚垣孢子的能力是非常重要的一個指標。因為研究發現厚垣孢子內含豐富的內源營養，可使其在土壤中定殖而不需添加外源營養。
厚垣孢子是侵染線蟲最有效的接種體，其抗逆性大大高於分生孢子和菌絲體。因此，線蟲生防製劑中，液體發酵大量產生厚垣孢子一直是本領域的技術關鍵。但在液體發酵生產中，大量產生的主要是芽生孢子和分生孢子，一般不產生厚垣孢子。在固體發酵中，可產生較多的厚垣孢子，但固體發酵又因難以實現工業化，生產規模小而限制其應用。世界上研究厚垣孢輪枝孢的權威，英國的Kerry曾指導他的學生對液體發酵產生厚垣孢子進行研究，但仍未突破。
參考文獻Kerry B.R.A manual for research on Verticillium chlamydosporium，a potentialbiological control agent for root-knot nematodes.2002，IOBC/WPRS Publication，UK.1-8
發明內容
本發明的目的就是在前項發明的基礎上，研究克服液體發酵不產生厚垣孢子的缺點，研究開發一厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法。
本發明通過在發酵過程中添加抑制劑，以及將液體發酵所用的液體菌種改為固體菌種兩種方式，啟動厚垣孢輪枝孢產生厚垣孢子的調控基因，創造大量產生厚垣孢子的條件，改變了常規下液體發酵不產生厚垣孢子的狀況。本發明在現有設備條件下，只需通過改變接種及在培養基中添加抑制劑即可大量產生厚垣孢子，具有很大的實用價值。
本項發明採用的真菌為厚垣孢輪枝孢Verticillium chlamydosporium的ZK7菌株，該菌株已於1999年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC NO.0418。以該菌研製開發的微生物殺線蟲劑——線蟲必克已獲國家臨時農藥登記(登記號LS 20011571)和國家發明專利(專利號99117391.0)。
本發明的抑制劑由下述組分製成(用量為重量份，1份用量)40％甲基託布津1-4毫克50％多菌靈2-6毫克硅藻酸鈉5-15毫克本發明抑制劑即用即配，每100毫升液體培養基用1份抑制劑。在配製液體培養基時加入，滅菌後使用。
固體菌種製備常規液體發酵生產中，其種子是試管、搖瓶、發酵罐逐級擴大的液體種。本發明利用固體發酵產生大量厚垣孢子，其控制厚垣孢子產生的基因已經開啟，用固體發酵後獲得的菌絲和孢子進行接種，將有利於液體發酵過程中產生厚垣孢子。
固體培養基配方為(以下為重量百分比)紅薯粉20％，玉米粉15％，麩皮30％，玉米芯30％，過磷酸鈣1％，碳酸鈣1％，豆餅粉3％，pH自然，含水量60％。
培養基配製好後，按1∶0.2的比例(體積比)與40目細沙混合，裝入三角瓶中滅菌，然後接入培養好試管種，於22℃下培養15-20天獲得固體菌種，然後按5-10％比例接入到液體發酵培養基中。
具體實施例方式以下是本發明的具體實施例，但本發明的內容並不局限於此。
實施例一1、固體菌種製備將紅薯粉100克，玉米粉75克，麩皮150克，玉米芯150克，過磷酸鈣5克，碳酸鈣5克，豆餅粉15克充分混合後加入清水，水份為60％。按1∶0.2的比例(體積比)與40目細沙混合後，裝入三角瓶中120℃滅菌40分鐘，然後接入培養好試管種V.chlamydosporium ZK7，於22℃下培養18天獲得固體菌種。
2、抑制劑製備(按培養基10000毫升配製100份抑制劑)
40％甲基託布津250毫克，50％多菌靈450毫克，硅藻酸鈉1000毫克，充分混合後待用。
3、製備本發明的生防製劑10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸銨，40克氯化鈉，10克硫酸二氫鉀，20克檸檬酸三鈉，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配製的抑制劑，滅菌後接入上述1配製的固體菌種。28℃下，搖床(轉速170rpm)培養10天，從第3天起每天鏡檢發酵液1次，觀察其厚垣孢子形成的情況。
另外，採用上述液體培養基配方配製500毫升培養基，不加抑制劑，接入液體菌種作對照。
4、產生厚垣孢子的結果從第3天開始用顯微鏡觀察菌絲變化和產孢情況，鏡檢結果清楚表明，從3天本發明產品部份菌絲開始膨大，逐步形成厚垣孢子，到第7天達到高峰，同時基本不形成分生孢子；而對照則始終未出現菌絲膨大現象，從第4天開始形成分子孢子，未見厚垣孢子。
鏡檢結果同時觀察到，本發明產品產生厚垣孢子的過程是首先菌絲局部膨大，然後形成厚垣孢子，而所形成的厚垣孢子相互粘在一起形成串。對照菌絲始終是光滑，並可見大量分生孢子。
表1厚垣孢子產生情況 注因厚垣孢子成串難以計數，故用描述記載實施例二1、固體菌種製備與實施例1相同。
2、抑制劑製備(按培養基10000毫升計配製100份抑制劑)40％甲基託布津100毫克，50％多菌靈200毫克，硅藻酸鈉500毫克，充分混合後待用。
3、製備本發明的生防製劑10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸銨，40克氯化鈉，10克硫酸二氫鉀，20克檸檬酸三鈉，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配製的抑制劑，按與實施例1相同的方法，滅菌接種後培養，鏡檢觀察其厚垣孢子形成的情況。
另外，採用上述液體培養基配方配製500毫升培養基，不加抑制劑，接入液體菌種作對照。
4、產生厚垣孢子的結果鏡檢結果表明，第3天無論是本發明產品還是對照，未見菌絲膨大，第4天後開始觀察到本發明產品已有菌絲開始膨大，逐步形成厚垣孢子，隨後幾天能鏡檢觀察到厚垣孢子，但厚垣孢子的數量低於實施例1；而對照則始終未出現菌絲膨大現象，從第4天開始形成分子孢子，未見厚垣孢子。
實施例三1、固體菌種製備與實施例1相同2、抑制劑製備(按培養基10000毫升計配製100份抑制劑)40％甲基託布津400毫克，50％多菌靈600毫克，硅藻酸鈉1500毫克，充分混合後待用。
3、製備本發明的生防製劑10000毫升PDA中添加120克糖蜜、30克硫酸銨，40克氯化鈉，10克硫酸二氫鉀，20克檸檬酸三鈉，80克蔗糖，80毫升甘油。再加入上述2配製的抑制劑，按與實施例1相同的方法，滅菌接種後培養，鏡檢觀察其厚垣孢子形成的情況。
另外，採用上述液體培養基配方配製500毫升培養基，不加抑制劑，接入液體菌種作對照。
4、產生厚垣孢子的結果鏡檢結果表明，從第4天後開始觀察到本發明產品菌絲膨大並逐步形成厚垣孢子，但厚垣孢子的數量比較少，低於實施例1；而對照則始終未出現菌絲膨大現象，從第4天開始形成分子孢子，未見厚垣孢子。
權利要求
1.一種厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法，按現有方法製備，其特徵在於液體發酵採用的菌種為固體菌種；在液體發酵生產生物製劑中，在液體培養基中添加抑制劑；其中1.1、固體菌種培養基配方為紅薯粉20％，玉米粉15％，麩皮30％，玉米芯30％，過磷酸鈣1％，碳酸鈣1％，豆餅粉3％，pH自然，含水量60％；按體積比1∶0.2的比例添加40目細沙；1.2、抑制劑的配方為40％甲基託布津1-4毫克、50％多菌靈2-6毫克、硅藻酸鈉5-15毫克。
全文摘要
本發明涉及一種厚垣孢輪枝孢液體發酵大量產生厚垣孢子的方法，屬真菌學技術領域。本發明在前期技術的基礎上，通過將液體菌種改變為固體菌種，同時添加由甲基託布津、多菌靈、硅藻酸鈉組成的抑制劑，創造了有利於厚垣孢輪枝孢Verticillium chlamydosporium的ZK7菌株產生厚垣孢子的條件，生產了大量產生厚垣孢子的線蟲生防菌劑，而厚垣孢子將有利於提高和穩定其對線蟲的防效。
文檔編號C12N1/38GK1513975SQ0313513
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月3日 優先權日2003年6月3日
發明者莫明和, 張克勤, 周薇 申請人:雲南大學