針對混合、微量檢材進行個體識別的方法
2023-10-08 13:06:09 1
專利名稱：針對混合、微量檢材進行個體識別的方法
技術領域：
本發明涉及一種針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，尤其涉及一種通過提取單個細胞中的DNA，針對混合、微量檢材中不同來源人精確分離檢驗，進行個體識別的方法，屬於生物技術以及法醫學領域。
背景技術：
DNA檢驗技術通過對犯罪現場遺留的血跡、精斑、唾液斑、毛髮等生物檢材的檢驗來進行個體識別，進而認定和排除嫌疑人，在案件偵破過程中發揮著至關重要的作用。但在實際檢案中經常會遇到一些疑難生物檢材，應用現有技術無法很好解決，如案發現場的混合樣品。性侵害案件在暴力犯罪中佔很大的比重，在此類案件中混合斑，咬痕等是比較常見的混合檢材，經常會由於女性物質過多男性物質相對較少，使用常規檢測方法只能得到兩個人DNA樣本的混合圖譜。雖然通過計算峰面積有可能推斷出各個供者的圖譜，但是其過程很複雜，結論也很難確定。並且當遇到三個或三個以上的供者時，通過計算峰面積來區分每個人的DNA分型就幾乎不可能了。對於即使只有兩個供者的情況，由於檢驗過程中多種因素的影響，這種推斷也極易出錯，往往只能給出模糊結論，不能給出作為直接認定的證據，現有檢測方法針對混合、微量檢材不能進行有效的個體識別。
發明內容
本發明提供了一種針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，可獲得良好的個體識別效果。本發明提供的針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，包括利用顯微操作法捕獲檢材細胞的單個細胞；利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型；對擴增分型後的產物進行檢測，以進行個體識別。其中所述顯微操作法包括顯微操作儀捕獲法或雷射顯微切割法。其中所述擴增分型包括應用低體積擴增反應玻片，以及STR MiniFiler或STR MiniFiler螢光標記複合擴增試劑盒對DNA進行擴增分型。當目標細胞為口腔上皮細胞時，操作如下(1)顯微操作捕獲口腔上皮細胞將含口腔上皮細胞的檢材放入含有ImL TNE的1. 5mL Eppendorf離心管中，使其上的細胞充分脫落。振蕩離心管，使溶液中的細胞儘量離散開。將滅菌後的載玻片置於顯微鏡載物臺上，吸取30 μ L細胞懸液滴加到載玻片上， 並用槍頭使懸液展平，靜置2分鐘，讓細胞充分沉降到載玻片表面在4Χ 10倍鏡下調整顯微操作儀吸針(直徑80 μ m)進入細胞懸液並位於視野中央，然後在IOX 10倍鏡下微調吸針， 使之接近分散良好、膜完整而輪廓清晰的上皮細胞。通過小心調整油泵的吸吐旋鈕，在捕獲細胞的同時進行計數。將吸針抬離液面，獲得捕獲出的單細胞，也可重複如上步驟，獲得多個單細胞。(2)對所述檢材的細胞DNA擴增分型把捕獲的細胞置於低體積擴增反應玻片上，加入0. 75μ L蛋白酶K(0. 4mg/mL)， 5yL封閉液密封，56°C孵育lh，99°C孵育lOmin，然後利用加樣尖穿過封閉液再加入 0.75 μ L Master mix，按照所述STR Identif iler試劑盒或所述STR Minif iler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增。擴增結束後將1. 5 μ L擴增產物及5 μ L封閉液全部吸走，使用3130XL型遺傳分析儀檢測，檢測操作按照儀器說明書進行。當目標細胞為精子細胞時，操作如下(1)顯微操作捕獲精子細胞剪取適量精斑檢材，剪碎後放入1. 5mL Eppendorf離心管中，加一定量的TE至能淹沒檢材為準，再加入SDS和1 使其終濃度為Iwt %和0. lmg/mL, 56°C浸泡濁以上，期間用消毒鑷翻轉擠壓載體使精子細胞最大限度地從檢材上洗脫下來；漩渦震蕩後套管離心去除檢材，棄上清，沉澱物用純水重懸，再離心，並重複3-4 次，以充分去除液體中游離DNA ；將沉澱物重懸，獲得未染色的精子細胞懸液；或加入5μ L左右的酸性品紅染色液染色Imin獲得經染色的精子細胞懸液；取50 μ L左右的未染色或染色的精子細胞懸液滴加到乾淨載玻片上，將其放置於顯微鏡載物架上，靜置約anin左右，讓精子細胞能夠充分沉降到載玻片表面，以利於精子細胞的提取；選擇好合適的視野，調節毛細針管，將其移至精子細胞附近，並通過調節油泵的細螺旋，控制精子細胞的吸入同時計數；將吸針輕輕抬離液面，將針頭慢慢浸入含有裂解液的1. 5mL印pendorf管中，輕調油泵細螺旋，將細胞緩慢打出，觀察直至針頭上方的空氣柱進入到液體中，有小氣泡冒出為止；獲得捕獲出的單細胞，重複如上步驟，獲得多個單細胞。(2)對所述檢材的細胞DNA擴增分型把捕獲的精子細胞置於低體積擴增反應玻片上，加入0. 75 μ L精子細胞裂解液 (PK 0. lmg/mL 和 DTT 5mmol/L)，5 μ L 封閉液密封，56°C孵育 lh，99°C孵育 lOmin，然後利用加樣尖穿過封閉液再加入0. 75 μ L Master mix,按照所述STRIdentifiler試劑盒或所述 STRMinifiler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增。擴增結束後將1. 5 μ L擴增產物及5 μ L封閉液全部吸走，使用3130XL型遺傳分析儀檢測，檢測操作儀器說明書進行。其中，捕獲口腔上皮細胞的步驟(1)以及捕獲精子細胞的步驟(1)均可按MMI公司雷射顯微切割法或PALM公司的雷射顯微切割法進行。同一個體的各個組織細胞的DNA具有相同的序列特徵，即個體組織同一性。單個細胞的分析，即使來源於多人的混合細胞，也可以確保獲得的信息是來自一個單獨的個體， 因此可以利用單細胞的DNA分析來解決混合斑的問題，同樣也可以對微量檢材進行單個細胞的提取、富集，進行有效的分型鑑定。單細胞捕獲和擴增技術在醫學和神經生物學研究領域應用較多，但其在法醫學中的應用尚屬少數。目前獲取微量甚至單個細胞的常見的方法有流式細胞儀分離法、雷射捕獲顯微切割分離法、顯微操作儀捕獲法等。如何在保證使用現有PCR-STR分型技術基礎上，提高檢測的靈敏度，達到單個細胞的水平(Pg級)，從而真正的解決混合斑的個人識別問題，同時也在單細胞水平提高微量生物物證的最大限度的利用率，其最根本的問題就在於最大限度的保存DNA信息，同時進行無汙染的有效擴增。最近幾年發展起來的微量化反應擴增，即低體積擴增(lowvolume-polymerase chain reaction，LV-PCR)成為提高靈敏度，經濟而有效的方法。AmpliGrid 1微升PCR系統是基於顯微鏡玻片平面印刷的專利技術，玻片表面構建48個1 μ L親水性基因座，使DNA模板、反應混合物錨定在此特定位置上，形成具有最佳半球狀結構的反應空間，疏水性位點使覆蓋在反應試劑上的油性封閉液互相隔離，保證PCR反應過程中無氣溶膠產生、無交叉汙染；AmpliSpeed熱循環儀針對以玻片為載體的PCR反應系統而設計，採用高平整度的矽晶平面具有極好的熱傳導性能，同時1 μ L半球狀的空間構象，提供了微量反應最佳的環境， 使靈敏度大大提高。Ampligrid 1微升PCR系統不僅可以應用於法醫案例分析中的LCN DNA 樣本，還可以進行單細胞PCR反應，以解決混和檢材問題。本發明應用顯微技術從混合樣品中分離特定細胞進行同一認定，具有以下技術效果1.建立了基於顯微操作儀捕獲法或雷射顯微切割法的單細胞捕獲方法與LV-PCR 法聯用的針對混合、微量檢材的通過對單個細胞中的DNA擴增分型以進行個體識別的方法，並成功地用於口腔上皮細胞和精子細胞的分離和檢測。通過對模擬混合斑的檢驗研究， 發現當精子細胞數目較少時，採用本發明的方法優於差異裂解法。2.以口腔上皮細胞為檢測模型，建立了低體積擴增技術平臺。目前可以成功檢測出3個新鮮口腔上皮細胞的IdentifiIer和MiniFiler試劑盒的全部分型，1個口腔上皮細胞進行60次Identifiler擴增檢測，其中沈次獲得13個以上的位點4% )，1個口腔上皮細胞進行70次MiniFiler擴增檢測，其中34次獲得完整分型08.6%)。將該平臺應用到精子細胞檢測中，可以成功檢測出20個精子細胞的Identifiler試劑盒的全部分型。3.通過模擬案例和實際案例檢材的檢測進一步證明了本發明方法的有效性和優勢，選擇常規方法檢測不理想的混合、微量檢材，可以成功獲得單個個體的DNA圖譜，有效的解決現有檢測方法的不足。4.本發明的方法靈敏度較高；與常規方法相比，顯微操作分離單細胞法與LV-PCR 法聯用的檢驗用於混合、微量樣品檢驗有優勢，這種優勢在混合樣品檢驗中更為明顯。
圖IA和圖IB示出了顯微捕獲法捕獲精子細胞(X400)；圖IA為接近精子細胞， 圖IB為捕獲精子細胞。圖2示出了 PALM雷射顯微切割分離、收集精子細胞的圖；a為塗片上的精子細胞， b為精子細胞的切割，c為精子細胞被彈射，d為玻片收集到的帶有精子細胞的薄膜。圖3A、圖;3B示出了顯微操作捕獲口腔上皮細胞成功獲得了所需數目的細胞；顯微吸針吸取口腔上皮細胞，箭頭所指處為口腔上皮細胞。圖4示出了 ID擴增的單個口腔上皮細胞圖。
圖5示出了 Minifiler擴增的單個口腔上皮細胞圖。圖6示出了 Minifiler擴增的口杯上的脫落細胞。圖7示出了 Minifiler擴增的口香糖上的脫落細胞(圖示出現異常增高的 Stutter峰和非特異性擴增產物)。圖8示出了門把手上的脫落細胞。圖9-圖11分別示出了 20、10、1個精子細胞的ID分型結果。圖12-圖13分別示出了實施例4中檢材的常規方法檢測結果以及顯微操作檢測結果。圖14-圖15分別示出了實施例5中檢材的常規方法檢測結果以及顯微操作檢測結果。圖16-圖18分別示出了實施例7中差異裂解法提取得到混合分型圖譜、PALM聯合低體積擴增提取精子細胞分型結果、以及嫌疑人血樣的分型結果。圖19-圖21分別示出了實施例8中差異裂解法提取得到混合分型圖譜、PALM聯合低體積擴增提取精子細胞分型結果以及嫌疑人血樣的分型結果。
具體實施例方式下述實施例中健康志願者含口腔上皮細胞的檢材樣本的採集單位為中國人民公安大學；健康志願者精液以及健康志願者陰道拭子的提供單位為北京民航總醫院檢驗科和山西省柳林縣人民醫院檢驗科；案件檢材提供單位為公安部物證鑑定中心。所用方法如無特別說明均為常規方法。所用試劑如下表所示QIAamp DNA Micro-kitHilden 公司
蛋白酶KMerck公司
コ充蘇糖醇(DTT)Merck公司
AmpFlSTR Identifiler 試劑盒AB 公司
AmpFlSTR MiniFiler 試劑盒AB 公司
QIAgen DNA REPLI-g Qiagen 公司
95%去離子甲《AB公司
P0P-4液態膠AB公司
瓊脂糖(Type I: Low EED)SIGMA 公司
硼酸北京新光化學試劑廠
EB顯色液IOmg/ mL北京天為時ィ物公司
DNAMarker DL15000寶生物工程(大連)有限公司
6xLoading buffer北京天為時イ物公司 實施例1、針對精子細胞進行個體識別的方法
一、顯微操作捕獲精子細胞1.剪取適量精斑檢材，剪碎後放入1. 5mL Eppendorf離心管中，加一定量的TE至能淹沒檢材為準，再加入SDS和1 使其終濃度為1 %和0. lmg/mL, 56°C浸泡池以上，期間用消毒鑷翻轉擠壓載體使精子細胞最大限度地從載體上洗脫下來。2.漩渦震蕩後套管離心去除載體，棄上清，沉澱物用純水重懸，再離心，並重複 3-4次，以充分去除液體中游離釋放的女性DNA。3.將沉澱物重懸，加入5 μ L左右的酸性品紅染色液染色，約lmin;(由於精子細胞折光性較好，不染色也可以)。4.取50 μ L左右的染色後的精液滴加到乾淨載玻片上，將其放置於顯微鏡載物架上，靜置約aiiin左右，讓細胞能夠充分沉降到載玻片表面，以利於細胞的提取。5.選擇好合適的視野，調節毛細針管，將其移至精子附近，並通過調節油泵的細螺旋，控制精子的吸入同時計數。6.將吸針輕輕抬離液面，將針頭慢慢浸入含有裂解液的印pendorf管中，輕調油泵細螺旋，將細胞緩慢打出，觀察直至針頭上方的空氣柱進入到液體中，有小氣泡冒出為止。二、精子細胞DNA的LV-PCR擴增分型1. DNA 提取將精子細胞置於LV-PCR反應玻片上加入0. 75 μ L精子裂解液(PK 0. lmg/mL和 DTT 5mmol/L)；然後用5 μ L封閉液密封，56°C孵育lh，99°C孵育lOmin，然後加樣尖穿過封閉液再加入0. 75 μ L PCR反應MIX，將微量反應玻片放在AmpliSpeed熱循環儀上。Identifiler 反應體系
試劑_Master mix混合用量(pL)實際用量(pL)
Reactionmix4.2
Primer Set2.20.75
GoIdTaq i|(5U^L) 0.4
H2O—0.75
總絲體積(pL)_-_L5_95°C Ilmin ；94°C 20sec，59°C Imin 15sec，72°C Imin 15sec，28 個循環；60°C延伸 45min ；4°C 保存。2. Minifiler試劑盒擴增的體系和擴增程序同前。3. PCR產物檢測擴增結束後將1. 5 μ L擴增產物及5 μ L封閉液全部吸走，3130XL型遺傳分析儀檢測，檢測操作按照試劑和儀器說明書進行。三、顯微操作捕獲精子細胞的基因分型①顯微操作法和差異裂解法比較用顯微操作法(圖IA和圖1Β)製備兩組包含不同精子數目的混合斑70、93、126、159、177、201、232、258、觀4、325、347，製備方法見實驗方法5。然後分別用傳統的差異裂解法和顯微操作法提取精子細胞(用QIAamp DNAMicro-kit試劑盒提取精子DNA)。將13個以上的位點分型正確、各位點的等位基因峰高於lOORFUs的樣本判定為分型成功的樣本(表 1-1)。對所得數據採用四格表卡方檢驗法進行統計學分析(表1-2)。表1-1差異裂解法和顯微操作法分型結果比較
權利要求
1.一種針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，其特徵在於，包括利用顯微操作法捕獲檢材細胞的單個細胞；利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型；對擴增分型後的產物進行檢測，以進行個體識別。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述顯微操作法包括顯微操作儀捕獲法或雷射顯微切割法。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述檢材細胞為口腔上皮細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，利用顯微操作儀捕獲法捕獲檢材細胞的單個細胞包括將含口腔上皮細胞的檢材放入含有ImL TNE的1. 5mL Eppendorf離心管中，使其上的細胞充分脫落；振蕩離心管，使溶液中的細胞儘量離散開；將滅菌後的載玻片置於顯微鏡載物臺上，吸取30 μ L細胞懸液滴加到載玻片上，並用槍頭使懸液展平，靜置2分鐘，讓細胞充分沉降到載玻片表面，在4Χ 10倍鏡下調整顯微操作儀吸針進入細胞懸液並位於視野中央，然後在10X 10倍鏡下微調吸針，使之接近分散良好、膜完整而輪廓清晰的上皮細胞；通過調整油泵的吸吐旋鈕，在捕獲細胞的同時進行計數；將吸針抬離液面，獲得捕獲出的單細胞；重複如上步驟，獲得多個單細胞。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型包括利用所述低體積擴增系統，以及STR Identifiler或STR MiniFiler螢光標記複合擴增試劑盒對所述單個細胞的DNA進行擴增分型。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型具體包括把捕獲的細胞置於低體積擴增反應玻片上，加入0. 4mg/mL的蛋白酶K 0. 75 μ L，5 μ L 封閉液密封，56°C孵育lh，99°C孵育lOmin，然後利用加樣尖穿過封閉液再加入0. 75 μ L Master mix，按照所述STR Identifiler試劑盒或所述STRMinifiler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增分型。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述檢材細胞為精子細胞。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，利用顯微操作儀捕獲法捕獲檢材細胞的單個細胞包括剪取適量精斑檢材，剪碎後放入1. 5mL Eppendorf離心管中，加一定量的TE至能淹沒檢材為準，再加入SDS和1 使其終濃度為和0. lmg/mL, 56°C浸泡池以上，期間用消毒鑷翻轉擠壓載體使精子細胞最大限度地從檢材上洗脫下來；漩渦震蕩後套管離心去除檢材，棄上清，沉澱物用純水重懸，再離心，並重複3-4次，以充分去除液體中游離DNA ；將沉澱物重懸，獲得未染色的精子細胞懸液；或加入5 μ L左右的酸性品紅染色液染色Imin獲得經染色的精子細胞懸液；取50 μ L的未染色或染色的精子細胞懸液滴加到乾淨載玻片上，將其放置於顯微鏡載物架上，靜置2min，讓精子細胞能夠充分沉降到載玻片表面，以利於精子細胞的提取；選擇好合適的視野，調節毛細針管，將其移至精子細胞附近，並通過調節油泵的細螺旋，控制精子細胞的吸入同時計數；將吸針抬離液面，將針頭浸入含有裂解液的1. 5mL印pendorf管中，油泵細螺旋，將精子細胞緩慢打出，觀察直至針頭上方的空氣柱進入到液體中，有小氣泡冒出為止；獲得捕獲出的單細胞，重複如上步驟，獲得多個單細胞。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型包括利用所述低體積擴增系統，以及STR Identifiler或STR MiniFiler螢光標記複合擴增試劑盒對所述單個細胞的DNA進行擴增分型。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型具體包括把捕獲的精子細胞置於低體積擴增反應玻片上，加入0. 75 μ L精子細胞裂解液，5 μ L 封閉液密封，56°C孵育lh，99°C孵育lOmin，然後利用加樣尖穿過封閉液再加入0. 75 μ L Master mix，按照所述STR Identifiler試劑盒或所述STRMinifiler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增分型。
全文摘要
本發明提供了一種針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，聯合應用了顯微操作法和LV-PCR系統，具體包括以下步驟利用顯微操作法捕獲細胞，將捕獲的細胞直接置於LV-PCRs反應玻片上進行擴增分型，擴增結束後進行PCR產物檢測。本發明利用顯微操作技術和LV-PCR體系對混合、微量檢材進行檢驗，成功解決針對混合、微量檢材中不同來源人的精確分離檢驗問題。
文檔編號C12Q1/02GK102311992SQ20101022534
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月5日 優先權日2010年7月5日
發明者李彩霞, 胡蘭 申請人:公安部物證鑑定中心