鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷在製備防治急性肝損傷藥物中的應用的製作方法
2023-10-09 02:59:49
專利名稱：鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷在製備防治急性肝損傷藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及鬼針聚炔苷的用途，尤其是製備防治急性肝損傷藥物中的應用。
背景技術：
鬼針草又名金盞銀盤、鬼釵草、盲腸草、引線包、針包草、一把針、豆渣菜、脫力草， 分布於東北、華北、華東、西南及陝西、甘肅等地區，生長於路邊、荒地、山坡及田間。該藥始載於《本草拾遺》「鬼釵草，味苦平，無毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵絞汁服。生地畔，有椏，方莖，子作釵腳，著人如衣針，北方呼之為鬼針」。《中藥大辭典》記載鬼針草「苦、平、無毒。功能清熱解毒、散瘀消腫。主治瘧疾、腹瀉、痢疾、肝炎、急性腎炎、胃痛、 噎膈、腸癰、咽喉腫痛、跌打損傷、蛇蟲咬傷」。《泉洲本草》和《本草推除》對鬼針草的功效均記載。鬼針草所含化學成分主要為黃酮類、烯炔類、香豆素類、有機酸及其酯類、三萜、甾醇、揮髮油等，其中黃酮類化合物和多炔是鬼針草中的主要成分，其次還含有胺基酸和微
量元素等。從鬼針草分離的黃酮類化合物主要包括查耳酮類、噢挵類、黃酮醇類、二氫黃酮類和黃酮類等，其中以查耳酮類和噢挵類為特徵性成分。目前已分離出的黃酮分別為金絲桃苷(hyptroside)、奧卡寧(okanin)、異奧卡寧7_ 0-β-D-葡萄糖苷、海生菊苷 (maritimetin) ,6-0-(6 『乙醯基- β -D-吡喃葡萄糖基)_6，7，3，4-四羥基噢挵、槲皮素3-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3- 0-α- L鼠李糖苷。已分離、鑑定的鬼針草屬植物中活性成分以查耳酮類化合物奧卡寧類最多，有25種；噢挵類化合物8種；黃酮醇類化合物 8種；二氫黃酮類5種；黃酮類4種。從鬼針草分離的多炔主要有I9種，包括4個微量的聚乙炔類化合物以及具有抗炎作用的鬼針聚炔苷2-β-D -吡喃葡萄糖基-1，13-二羥基-3 (反)，11 (反) -十三二烯-5，7，9-三炔。同時從鬼針草分離的還有有香豆素(如七葉苷等)、生物鹼、蒽醌苷、糖、胡蘿蔔素、多元酚丁香苷、維生素、鞣質、揮髮油、苦味質、膽鹼。另有16種胺基酸天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、穀氨酸、丙氨酸、頡氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸等，其中8種為人體必需胺基酸；還含有9種人體必需無機元素，其中4種常量元素中以鈣含量最高，5種微量元素中鐵含量最高，其次是銅、鋅、鋰、鎢。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供鬼針聚炔苷的用途，是製備防治急性肝損傷藥物中的應用。本發明是通過以下技術方案來實現的。肝損傷是由各種肝臟疾病所產生的病變結果。臨床上造成急性肝損傷的原因主要
3有病毒感染、服用藥物不當、食物添加劑、乙醇攝入過量、誤服有毒食物、放射線損傷等。近年來，隨著臨床用藥種類的迅速增加及患者自行服藥或隨意加大藥物劑量的概率增加，藥物性肝損傷的發生率亦相應增加。全國多中心急性藥物性肝損傷住院病歷調查分析發現， 我國急性藥物性肝損傷發病呈逐年增加趨勢，急性藥物性肝損傷發病率佔黃疸住院患者的 2^-5%,佔爆發性肝功能衰竭患者的15% 30%，佔非病毒性慢性肝炎的20% 50%。目前對肝損傷的治療方法很多，且均有一定的療效，但也存在著明顯的不足。肝移植療法受患者年齡、人類白細胞抗原相同供者來源不足、感染等併發症多、移植物抗宿主病治療難度大、病死率高等限制。西醫對肝損傷的藥物治療療效並不十分肯定，同時又具有較大的毒副作用。還有一些療法雖然對肝損傷有效，但因其價格昂貴，使患者經濟上難以承受，因而極不利於臨床推廣。為此，研究價格便宜、療效好的中藥，發揮中醫藥治療肝損傷的優勢，日漸成為研究熱點。迄今報導，對實驗性肝損傷有效的中藥單味藥和有效組分有茵陳、核桃仁、鵝不食草、白背葉根、決明子、枸杞、丹參、五味子、絞股藍、三七、半枝蓮、黃芩、三稜、莪朮、黃芪提取物、金針菇提取物、火棘果實提取物、氧化苦參鹼、沙苑子黃酮、白藜蘆醇苷、苯丙素苷、葛根紊、胡盧巴多糖、紅毛五加多糖、玉米須多糖、玉郎傘多糖、知母總黃酮、胡黃連總苷、芒果苷、鯊肝肽等。鬼針草在中醫學上具有清熱解毒、祛風除溼、活血消腫的功效，我們從鬼針草中提取了活性成分鬼針聚炔苷，研究其在治療各種原因引起的急性肝損傷中的作用以及作用機制。首先，我們通過以下方法在鬼針草中提取鬼針聚炔苷，我們選取的實驗原料來源於菊科鬼針草屬植物金盞銀盤Bidens biternata (Lour.) Merr. et Sheff乾燥地上的部分。粗品提取
1)取金盞銀盤30kg加70%乙醇10倍量回流提取2次；
2)合併提取液，回收乙醇至無醇味，0.1 μ m陶瓷膜過濾；
3)過濾後的濾液通過大孔吸附樹脂HPD-100，然後先以1.5倍柱體積的水洗去雜質，再用3倍柱體積的70%乙醇進行洗脫，收集乙醇洗脫液回收乙醇至無醇味；
4)乾燥，獲得粗品，大約45g; 精製
5)將粗品加約20倍量乙醇超聲提取30min，提取液濾過回收乙醇；
6)進行真空乾燥或噴霧乾燥，獲得提純物，大約27g；
7)將27g提純物用200ml甲醇使用熱超聲溶解；
8)用大孔樹脂吸附，然後用分別10%、35%、45%以及70%的乙醇進行梯度洗脫，初步分為 4個部分，分別得到大約2. 5g、7. 0g、6. 0g、5. 5g的粗分物；
9)將4個部分分別柱層析，依次用石油醚、(石油醚乙酸乙酯)、(乙酸乙酯甲醇)、氯仿、(氯仿甲醇)梯度洗脫；
10)再依次用100-200目、200-300目，300-400目矽膠分離；
11)通過葡聚糖凝膠分離；
12)最後經過製備液相製備得到鬼針聚炔苷，即2-β -D -吡喃葡萄糖基-1，13- 二羥基-3 (反)，11 (反)-十三二烯_5，7，9-三炔。
我們將製備獲得的鬼針聚炔苷進行動物實驗。動物實驗的對象選取為經CCl4誘導急性肝損傷的實驗小鼠。實驗使用了包括
a實驗小鼠選用昆明種小鼠60隻，6-8周，體重20士2g，$，普通級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供；
b試劑選用丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)試劑盒 (南京建成生物工程研究所提供，批號20110521)，超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)試劑盒(廠商，同上，批號20110524)；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(廠商，同上，批號20110521)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，產品編號ZLI-9032)、兔抗人NF-KB(p65)多抗(廠商，同上，產品編號SC_109)，免疫組織化試劑盒(S-P)試劑盒(廠商，同上，產品編號SP-9000)；
c儀器選用GL20A全自動高速冷凍離心機(湖南儀器儀表總廠)；MDF-382E三洋超低溫冰箱(日本三洋)；FSH-2型可調高速勻漿器(江蘇省金壇市容體儀器製造有限公司)；MK3型酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；BI2000生物醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)； BX50型倒置顯微鏡(日本Olympus)，Nikon 80i螢光生物顯微鏡(新飛達光學儀器公司)。實驗方法為將60隻小鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、鬼針聚炔苷BPC 給藥組(12. 5、25、50 mg · kg—1) 3組和陽性對照藥即水飛薊素(200 mg · kg—1)組，其中BPC 和水飛薊素均以0. 3%羧甲基纖維素鈉生理鹽水溶解。除正常組和模型組灌胃給予0. 3%羧甲基纖維素鈉生理鹽水外，其餘各組分別按0.1 ml - (10 g)—1體積分別灌胃給予不同劑量BPC和水飛薊素，每天1次，連續6d。末次給藥後2h，除正常組外，其餘各組均腹腔注射 0. 2% CCl4橄欖油溶液IOmL · kg—1。禁食16h後自小鼠後眼眶靜脈叢採血置1. 5mL離心管中，3000r · miiT1離心lOmin，製備血清，做相關指標檢測。拉頸處死動物，立即摘取肝臟稱重，計算相對肝重量。相同部位取肝組織0. 5g，以預冷的0. 9%生理鹽水製成10%肝組織勻漿，2500r· HiirT1離心lOmin，上清液置4°C保存備用。另取相同部位肝臟小葉，切取組織塊5X5X2mm，置於10%福馬林中固定24h後進行病理學檢查。我們制定的指標檢測如下
肝臟指數分別剖取肝臟，稱重，按肝臟指數=[肝臟重量(g)/體重(g)]X100計算肝臟指數；
血清生化指標血清中ALT、AST的測定參照改良賴氏法-，按試劑盒說明書的具體步驟進行，於酶標儀上測定血清中的ALT、AST ；
肝組織生化指標肝組織中的S0D、GSH_Px、MDA、N0的活性和含量按試劑盒說明書的具體步驟進行測定，其中MDA的含量採用硫代巴比妥酸(TBA)法測定；
組織病理學和免疫組化學觀察肝組織於10%福馬林固定液中固定Mh，用水衝洗後經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋處理後切成4Mm厚的薄片，HE染色觀察病理切片；採用免疫組化S-P法顯色系統，按照試劑盒說明依次切片脫蠟和水化、抗原修復、 滴加一抗、37°C孵育、DAB顯色，最後二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察蛋白表達情況；
統計學分析採用SPSS13. 0統計學軟體進行數據分析，多樣本的均數比較採用單因素方差分析，組間比較用One-Way ANOVA檢驗。
我們得到的實驗結果如下
(1)表1所示，鬼針聚炔苷BPC (12.5,25,50 mg .kg—1) ig給藥能夠不同程度的降低肝指數，抑制ALT、AST活性，與模型組比較有顯著性差異。表1鬼針聚炔苷對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝指數、血清ALT和AST的影響( ，n=10)
權利要求
1.鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷在製備防治急性肝損傷藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷的新用途，具體是在製備防治急性肝損傷藥物中的應用。本發明通過動物實驗明確了鬼針聚炔苷能夠對CCl4誘導急性肝損傷的實驗小鼠起到保護作用，鬼針聚炔苷能顯著降低血清中ALT、AST的水平、肝組織MDA含量，顯著增強肝組織SOD、GSH-Px活性，明顯降低肝組織中NO含量，並可抑制肝細胞NF-κB的表達，因此鬼針聚炔苷在製備預防治療急性肝損傷的藥物中具有較理想的前景。
文檔編號A61P1/16GK102335183SQ20111029496
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者劉建軍, 吳繁榮, 葛金榮, 許慧, 陳飛虎 申請人:安徽醫科大學