區別表達的胚胎或母源基因組區的鑑定及其用途的製作方法

2024-04-05 14:15:05

專利名稱：：區別表達的胚胎或母源基因組區的鑑定及其用途的製作方法區別表達的胚胎或母源基因組區的鑑定及其用途
技術領域：
：本申請要求2010年7月23日提交的美國臨時申請No.61/367，254的優先權。美國臨時申請No.61/367，254的公開通過引用以其整體在本文合併。
背景技術：
：母源循環中無細胞胚胎DNA的分子分析已顯示為在胚胎非整倍性，其他胚胎遺傳異常和懷孕併發症的非-侵襲性出生前診斷中許諾的方法。許多既有的診斷方法和技術一般在臨床病例中良好實施，其中母源血漿中無細胞胚胎DNA的級分超過25%。但是，當治療性幹預不再是選項時，該水平的胚胎DNA—般僅在懷孕晚期達到。已觀察到，母源血漿中的無細胞胚胎DNA的級分在妊娠的9和13周之間懷孕的頭三個月內在0%到510%之間改變。為了在懷孕的頭三個月內達到臨床有用的精確度，任何目前開發的測定通常需要胚胎物質的顯著富集。發明概述本發明提供用於母源循環中區別表達的(例如，過表達的或亞表達的)胚胎或母源基因組區的鑑定和表徵的新方法。尤其是，本發明的母源循環中過表達的胚胎基因組區的鑑定可允許不富集或純化地胚胎DNA的精確的分析，導致更簡單的，更精確的和有效的出生前診斷測定。本發明是對於早期懷孕期間(例如，頭三個月期間)非侵襲出生前診斷特別有用的。在一些實施方式中，本發明提供鑑定母源樣品中的區別表達的胚胎或母源基因組區的方法，包括下列步驟定量存在於母源樣品中的胚胎或母源基因組區；測定相比參照量的胚胎或母源基因組區的相對豐度，由此測定是否胚胎或母源基因組區在母源樣品中區別表達；其中胚胎或母源基因組區不對應於非整倍性區。在一些實施方式中，參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的平均表達。在一些實施方式中，測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信不同於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中區別表達。在一些實施方式中，參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的過表達。在一些實施方式中，測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信基本上相同於或大於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中過表達。在一些實施方式中，參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的亞表達。在一些實施方式中，測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信基本上相同於或小於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中亞表達。在一些實施方式中，本發明的方法定量胚胎基因組區。在一些實施方式中，參照量指示母源樣品中胚胎核酸的平均表達。在一些實施方式中，胚胎核酸的平均表達是5%。在一些實施方式中，如果定量的量在參照量以上，胚胎基因組區被鑑定為以統計學置信在母源樣品中過表達。在一些實施方式中，本發明的方法定量母源基因組區。在一些實施方式中，參照量指示母源樣品中母源核酸的平均表達。在一些實施方式中，母源核酸的平均表達是95%。在一些實施方式中，如果定量的量在參照量以下，母源基因組區被鑑定為以統計學置信在母源樣品中亞表達。在一些實施方式中，本發明的方法的定量步驟包括定量胚胎基因組區和對應母源基因組區。在一些實施方式中，胚胎基因組區的相對豐度通過比較胚胎基因組區的定量的量與對應母源基因組區的定量的量來測定。在一些實施方式中，胚胎基因組區自對應母源基因組區特殊地可檢測。在一些實施方式中，胚胎基因組區含有父源地貢獻的序列。在一些實施方式中，胚胎基因組區含有不同於對應母源基因組區的序列。在一些實施方式中，胚胎基因組區含有至少一個不同於對應母源基因組區多態核苷酸。在一些實施方式中，胚胎基因組區含有不同於對應母源基因組區的甲基化模式。在一些實施方式中，胚胎基因組區相比對應母源基因組區含有拷貝數變異(CNV)。在一些實施方式中，本發明的方法以高通量形式實施。在一些實施方式中，本發明的方法同時定量多個胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，本發明的方法還包括下列步驟首先自母源樣品製備總DNA。在一些實施方式中，本發明的方法還包括下列步驟首先自母源樣品製備無細胞DNA。在一些實施方式中，本發明的方法還包括下列步驟首先產生含有待定量的胚胎或母源基因組區的核酸片段。在一些實施方式中，適合於本發明的母源樣品選自細胞，組織，全血，血漿，血清，尿，糞便，唾液，臍帶血，絨毛膜絨毛樣品，絨毛膜絨毛樣品培養物，羊水，羊水培養物，經子宮頸灌洗液，及其組合。在特定實施方式中，適合於本發明的母源樣品是母源血。在一些實施方式中，適合於本發明的母源樣品從一個個體得到。在一些實施方式中，適合於本發明的母源樣品從多個個體得到。在一些實施方式中，本發明的方法的定量步驟包括DNA測序步驟。在一些實施方式中，DNA測序步驟包括高-通量單分子測序步驟。在一些實施方式中，DNA測序步驟包括無偏的DNA測序步驟。在一些實施方式中，DNA測序步驟覆蓋大於1，5，10，20，30，40，50，60,70,80,90或100個基因組當量。在一些實施方式中，DNA測序步驟包括下列步驟用光信號標記胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，光信號選自突光和/或發光信號。在一些實施方式中，突光信號由花青苷-3和/或花青苷-5產生。在一些實施方式中，本發明的方法還在測序步驟之前包括下列步驟將含有待定量的胚胎或母源基因組區的核酸分子(例如，核酸片段)捕獲到固體表面。在一些實施方式中，本發明的定量步驟涉及獲得可歸因於胚胎或母源基因組區的個體序列讀取計數。在一些實施方式中，本發明的定量步驟還涉及比較可歸因於胚胎基因組區的個體序列讀取計數與可歸因於對應母源基因組區的個體序列讀取計數。在一些實施方式中，本發明的定量步驟包括下列步驟實施數字PCR。在一些實施方式中，本發明的定量步驟包括下列步驟實施橋式PCR。在一些實施方式中，本發明的定量步驟包括下列步驟使用經與胚胎或母源基因組區特異性結合的納米報告子標記的探針雜交個體核酸分子。根據本發明的實施方式的納米報告子描述於美國專利公開No.20100047924，其內容通過引用併入。在一些實施方式中，本發明的定量步驟包括下列步驟實施基於陣列的比較性基因組雜交(aCGH)。在一些實施方式中，aCGH步驟使用與胚胎或母源基因組區特異性結合的探針。在一些實施方式中，探針用光信號標記。在一些實施方式中，光信號選自螢光和/或發光信號。在一些實施方式中，aCGH步驟涉及測定可歸因於胚胎或母源基因組區的信號水平。在一些實施方式中，在本發明的方法中使用的統計學置信通過N-因素AN0VA，Student氏t檢驗，Fisher氏精確測試,或多測試修正測定。在一些實施方式中，本發明的方法還包括下列步驟測定胚胎基因組區的過表達因數。在一些實施方式中，本發明的方法還包括在不同個體間比較鑑定的區別表達的胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，本發明的方法還包括下列步驟確認鑑定的區別表達的胚胎或母源基因組區(例如，由數字PCR或再測序)。在特定實施方式中，本發明提供鑑定在母源樣品中通常過表達的胚胎基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的胚胎基因組區及對應母源基因組區；測定相比對應母源基因組區的胚胎基因組區的相對豐度；及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以上，將胚胎基因組區鑑定為在母源樣品中過表達，其中胚胎基因組區不是非整倍性區。在特定實施方式中，本發明提供鑑定在母源樣品中通常亞表達的母源基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的母源基因組區及對應胚胎基因組區；測定相比對應胚胎基因組區的母源基因組區的相對豐度；及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以下，將母源基因組區鑑定為在母源樣品中亞表達，其中對應胚胎基因組區不是非整倍性區。在特定實施方式中，本發明提供鑑定在母源樣品中通常過表達的胚胎基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的胚胎基因組區；測定相比參照的胚胎基因組區的相對豐度；及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以上，將胚胎基因組區鑑定為在母源樣品中過表達，其中胚胎基因組區不是非整倍性區。在特定實施方式中，適合於本發明的參照指示母源樣品中胚胎核酸的平均表達。在特定實施方式中，本發明提供鑑定在母源樣品中通常亞表達的母源基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的母源基因組區；測定相比參照的母源基因組區的相對豐度；及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以下，將母源基因組區鑑定為在母源樣品中亞表達，其中母源基因組區不對應於非整倍性區。在特定實施方式中，適合於本發明的參照指示母源樣品中母源核酸的平均表達。在一些實施方式中，本發明也提供各種非侵襲診斷的方法，包括下列步驟表徵通過使用本文所述的方法鑑定的過表達的胚胎基因組區。本發明的其他特徵，目的和優勢將在以下發明詳述，圖和權利要求中顯而易見。但是，應明白，發明詳述，圖和權利要求，儘管指示本發明的實施方式，僅以例證，而非限制方式給出。本發明的範圍之內的各種變化和修飾對於本領域技術人員而言是顯而易見的。定義為了本發明更容易明白，以下首先定義特定術語。以下術語和其他術語的另外的定義貫穿說明書給出。在本申請中，使用「或」是指「和/或」，除非另外陳述。如在本申請中使用，術語「包含(comprise)」和該術語的變異，諸如「包含(comprising)」和「包含(comprises)」,不旨在排除其他添加劑，組分，整體或步驟。如在本申請中使用，術語「約」和「大致」將用作相當體。本申請中使用的有或無約/大致的任何數字意指涵蓋由關聯領域中的普通技術人員同意的任何正常波動。在特定實施方式中，術語「大致」或「約」指稱以任意方向(大於或小於)落入陳述的參照值的25%,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,11%,10%,9%,8%,7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小的一系列值，除非另外陳述或自情景另外明白(除非其中該數會超過可能的值的100%)。等位基因如本文所用，短語「等位基因」與「等位基因變體」互換使用，及指稱座位或基因的變體。在一些實施方式中，不同等位基因或等位基因變體是多態的。擴增如本文所用，術語「擴增」指稱本領域知道的用於拷貝靶核酸，由此增加選擇的核酸序列的拷貝數的任何方法。擴增可為指數或線性的。靶核酸可為DNA或RNA。一般而言，以此方式擴增的序列形成「擴增子」。擴增可用各種方法實現，包括但不限於聚合酶鏈反應(「PCR」)，基於轉錄的擴增，等溫擴增，滾環擴增，等。擴增可用相對近似量的引物對的各引物實施，以產生雙鏈擴增子。但是，不對稱PCR可用於擴增主要或完全單鏈產物，如為本領域所熟知(例如，Poddaretal.Molec.AndCell.Probes14:25-32(2000))。此可通過使用各對引物通過相對於所述對的另一引物顯著減少一個引物的濃度(例如，100倍差異)來達到。由不對稱PCR的擴增通常是線性的。本領域技術人員會明白，不同擴增方法可一起使用。非整倍性如本文所用，術語「非整倍性」指稱異常數的全染色體或部分染色體。一般而言，非整倍性導致可為在發育的早期階段致死，導致隨後懷孕中流產或導致活的但異常懷孕的遺傳不平衡。最頻繁的和臨床顯著非整倍性涉及單數染色體(嚴格地「非整倍體性」)，其中有3組(「三體性」)或僅I組(「單體性」)，代替正常對的染色體。動物如本文所用，術語「動物」指稱動物界的任何成員。在一些實施方式中，「動物」指稱在發育的任何階段的人。在一些實施方式中，「動物」指稱在發育的任何階段的非-人動物。在特定實施方式中，非-人動物是哺乳動物(例如，齧齒動物，小鼠，大鼠，兔，猴，狗，貓，綿羊，牛，靈長類動物，和/或豬)。在一些實施方式中，動物包括，但不限於，哺乳動物，鳥，爬行動物，兩棲動物，魚，昆蟲和/或蠕蟲。在一些實施方式中，動物可為轉基因動物，遺傳-加工的動物和/或克隆。大致如本文所用，術語「大致」或「約」，如應用於一個或更多目標值，指稱近似於陳述的參照值的值。在特定實施方式中，術語「大致」或「約」指稱以任意方向(大於或小於)落入陳述的參照值的25%,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,11%，10%,9%,8%,7%,6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小的一系列值，除非另外陳述或自情景另外明白(除非其中該數會超過可能的值的100%)。生物學樣品如本文所用，術語「生物學樣品」包括自生物學源獲得的任何樣品。在特定實施方式中，生物學源是受試者。生物學樣品可，以非限制性例的方式，包括血，羊水，血清，尿，糞便，表皮樣品，皮膚樣品，頰拭子，精子，羊水，培養的細胞，骨髓樣品和/或絨毛膜絨毛自受試者。方便的生物學樣品可通過，例如，自口腔前庭表面刮細胞來獲得。任何生物學樣品的細胞培養物也可用作生物學樣品，例如，絨毛膜絨毛樣品的培養物和/或羊水培養物諸如羊水細胞培養物。生物學樣品也可為，例如，自任何器官或組織(包括活組織檢查或屍檢樣本)獲得的樣品，可包含細胞(無論原代細胞或培養的細胞)，為任何細胞，組織或器官，組織培養物調節的培養基。在一些實施方式中，適合於本發明的生物學樣品是已處理而釋放或另外使本文所述的核酸檢測可利用的樣品。適合的生物學樣品可從生命的階段諸如胎兒，年輕成年，成年(例如，懷孕的女性)等得到。也可使用固定的或冷凍的組織。術語「生物學樣品」和「生物學樣本」互換使用。拷貝數如本文所用，短語「拷貝數」當參照座位使用時，指稱每基因組或基因組當量存在的該座位的拷貝數。「正常拷貝數」當參照座位使用時，指稱正常個體中存在的正常或野生型等位基因的拷貝數。在特定實施方式中，拷貝數為02，包括端點。在特定實施方式中，拷貝數為03，04，06，07，或0多於7拷貝，包括端點。在座位的拷貝數在群中個體之間大大改變的實施方式中，估計的中位拷貝數可被取為用於計算和/或比較目的的「正常拷貝數」。對應胚胎或母源基因組區如本文所用，術語「對應胚胎或母源基因組區」指稱自胚胎或母源核酸，但定位於相同的染色體位置的基因組區。補體如本文所用，術語「補體」，「互補」和「互補性」，指稱核苷酸序列根據Watson/Crick配對規則的配對。例如，序列5』-GCGGTCCCA-3』具有5』-TGGGACCGC-3』的互補序列。補體序列也可為與DNA序列互補的RNA序列。通常不見於天然的核酸的特定鹼基可包括在互補核酸中，包括但不限於肌苷，7-脫氮鳥嘌呤，鎖核酸(LNA)，及肽核酸(PNA)。互補不需求是完美的；穩定的雙聯體可含有錯配的鹼基對，簡併體或不匹配的鹼基。核酸技術的本領域技術人員可考慮許多變量包括，例如，寡核苷酸長度，寡核苷酸的鹼基組成和序列，離子強度和錯配的鹼基對的發生率依經驗確定雙聯穩定性。對照如本文所用，術語「對照」具有是針對其結果比較的標準物的本領域-明白的含義。一般而言，對照用於通過分離變量以便製造關於該變量的結論來增加實驗中的完整性。在一些實施方式中，對照是與測試反應或測定同時實施以提供比較的反應或測定。在一實驗中，應用「測試」(即，被測試的變量)。在第2實驗中，「對照」，未應用被測試的變量。在一些實施方式中，對照是歷史對照(即，之前實施的測試或測定，或之前知道的量或結果)。在一些實施方式中，對照是或包含列印的或另外保存的記錄。對照可為陽性對照或陰性對照。在一些實施方式中，對照也被稱為參照。粗產物如本文所用，術語「粗產物」，當關聯生物學樣品使用時，指稱處於基本上未精製的狀態的樣品。例如，粗產物樣品可為細胞裂解物或活組織檢查組織樣品。粗產物樣品可存在於溶液中或作為幹製備物。區別表達的如本文所用，術語「區別表達的」指稱自基線偏離的基因組區(例如，胚胎或母源)的表達水平。一般而言，基線指示母源循環(例如，母源血)中胚胎或基因組核酸的平均表達。區別表達的區可為過表達的或亞表達的區。如本文所用，術語「過表達的」或「過表達」指稱以統計學置信在基本上基線以上的基因組區的表達水平。如本文所用，術語「亞表達的」或「亞表達」指稱以統計學置信在基本上基線以下的基因組區的表達水平。缺失如本文所用，術語「缺失」包括自天然存在的核酸移出一個或更多核苷酸的突變。基因如本文所用，術語「基因」指稱負責離散細胞(例如，細胞內或細胞外)產物和/或功能的離散核酸序列。更特別是，術語「基因」指稱包括編碼蛋白的部分和任選地包括涉及由目標基因編碼的蛋白的表達的調節的調控序列，諸如啟動子，增強子，終止子，等的核酸。如本文所用，術語「基因」也可包括不編碼蛋白而是提供功能RNA分子諸如tRNA，rRNA，等的轉錄用模板的核酸。或者，基因可限定用於特定事件/功能的基因組位置，諸如蛋白和/或核酸結合位點。基因型如本文所用，術語「基因型」指稱生物的遺傳體質。更特別是，術語指稱存在於個體的等位基因的同一性。基因分型是用生物學測定闡明個體的基因型的過程。個體或DNA樣品的基因分型一般指稱在知道的多態位點由個體具有的2個等位基因的關於核苷酸鹼基的同一丨I"生性質。雜交如本文所用，術語「雜交」或「雜交」指稱2個互補核酸鏈在適當嚴格條件下彼此退火的過程。適合於雜交的寡核苷酸或探針一般含有長度10100個核苷酸(例如，長度1850，1270，1030，1024，1836個核苷酸)。核酸雜交技術為本領域所熟知。見，例如，Sambrook，等人，1989，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，Plainview,N.Y。本領域技術人員明白如何估計及調整雜交條件的嚴格度，使得具有至少期望的水平的互補的序列會穩定地雜交，而那些具有更低互補的則不會。例如關於雜交條件和參數，見，例如，Sambrook,等人，1989，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港出版社，Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.etal.1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons,Secaucus,N.J.。個別解析的如本文所用，術語「個別解析的」在本文所用，指示，當可視化時，可能區別一個聚合物或克隆和其相鄰聚合物或克隆。可視化可通過使用其信號個別解析的報告子標記物，例如螢光團實現。個體解析度的需求確保可在各合成步驟檢測個體單體併合。插入或添加如本文所用，術語「插入」或「添加」指稱導致相比天然存在的分子，一個或更多胺基酸殘基或核苷酸的添加的胺基酸或核苷酸序列的變化。體外如本文所用，術語「體外」指稱在人工環境，例如，在試管或反應容器，在細胞培養物，等中，而非在多-細胞生物之內發生的事件。體內如本文所用，術語「體內」指稱在多-細胞生物諸如非-人動物之內發生的事件。分離的如本文所用，術語「分離的」指稱已(I)自起初產生時與其關聯的組分的至少一些分離的(無論在天然和/或在實驗環境中)，和/或(2)人工產生的，製備的和/或生產的物質和/或實體。分離的物質和/或實體可從至少約10%，約20%，約30%，約40%，約50%,約60%，約70%，約80%，約90%，約95%，約98%，約99%，基本上100%或100%的與它們起初關聯的其他組分分離。在一些實施方式中，分離的劑是大於約80%，約85%，約90%，約91%，約92%，約93%，約94%，約95%，約96%，約97%，約98%，約99%，基本上100%或100%純。如本文所用，如果其是基本上無其他組分，則物質是「純」的。如本文所用，術語「分離的細胞」指稱不含在多-細胞生物中的細胞。標記的術語「標記的」和「用可檢測的劑或部分標記的」在本文所用互換，以表明實體(例如，核酸探針，抗體，等)可，例如通過與另一實體(例如，核酸，多肽，等)結合來可視化。可檢測的劑或部分可選擇為使得其產生可測量的信號，且其強度涉及(例如，比例於)結合的實體的量。用於標記和/或檢測蛋白和肽的廣泛的系統為本領域所知。標記的蛋白和肽可製備通過併合，或綴合於，由光譜，光化學，生物化學，免疫化學，電，光學，化學品或其他手段可檢測的標記物。標記物或標記部分可為直接可檢測的(即，其不需要可檢測的任何進一步反應或操作，例如，螢光團是直接可檢測的)或其可為間接可檢測的(即，其使得通過與與可檢測的另一實體，例如，在與包含報告子諸如螢光團的適當的抗體反應之後通過免疫染色可檢測的半抗原反應或結合來可檢測的)。適合的可檢測的劑包括，但不限於，放射性核素，螢光團，化學發光劑，微粒，酶，比色標記物，磁標記物，半抗原，分子Ih標，適體標等。座位如本文所用，術語「座位」指稱染色體上特定DNA序列的特定位置。如本文所用，特定DNA序列可具有任何長度(例如，1，2，3，10，50或更多核苷酸)。在一些實施方式中，座位是或包含基因或部分基因。在一些實施方式中，座位是或包含基因的外顯子或部分外顯子。在一些實施方式中，座位是或包含基因的內含子或部分內含子。在一些實施方式中，座位是或包含基因的調控元件或部分調控元件。在一些實施方式中，座位相關於疾病，病症和/或病情。例如，在座位的突變(包括缺失，插入，剪接突變，點突變，等)可與疾病,病症和/或病情相關。核型分析如本文所用，術語「核型分析」包括真核生物細胞中染色體數的確定。母源樣品如本文所用，術語「母源樣品」指稱自懷孕的女性獲得的生物學樣品。見生物學樣品的定義。正常如本文所用，術語「正常」，當用來修飾術語「拷貝數」或「座位」或「基因」或「等位基因」時，指稱以最高百分率存在於群中的拷貝數或座位，基因或等位基因，例如，野生型數或等位基因。當用來修飾術語「個體」或「受試者」時，它們指稱攜帶以最高百分率存在於群中的拷貝數或座位，基因或等位基因的個體或個體組，例如，野生型個體或受試者。一般而言，正常「個體」或「受試者」不具有特定疾病或病情，且也不是疾病或病情的攜帶者。術語「正常」也在本文用來定性自正常或野生型個體或受試者分離的生物學樣本或樣品，例如，「正常生物學樣品」。多重PCR:如本文所用，術語「多重PCR」指稱各通過使用不同引物對引發的2個或更多區的擴增。弓丨物如本文所用，術語「引物」指稱能與核酸樣品中的互補序列雜交的短單鏈寡核苷酸。一般而言，引物作為模板依賴性DNA合成的起始點。脫氧核糖核苷酸可由DNA聚合酶加入引物。在一些實施方式中，該脫氧核糖核苷酸添加到引物也被稱為引物延伸。術語引物，如本文所用，包括可為合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物，鎖核酸引物，硫代磷酸酯修飾的引物，標記的引物等。用於PCR反應的「引物對」或「引物組」一般指稱一組引物，其一般包括「正向引物」和「反向引物」。如本文所用，「正向引物」指稱退火到dsDNA的反義鏈的引物。「反向引物」退火到dsDNA的正義鏈。多態性如本文所用，術語「多態性」指稱多於一種形式的基因或其部分的共存。探針如本文所用，術語「探針」，當參照核酸用探針使用時，指稱具有可與目標核酸結合或雜交的特定核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的核酸分子。一般而言，探針通過一種或更多類型的化學鍵，通常通過氫鍵合形成與互補或基本上互補序列的核酸特異性結合(或特異性雜交)。在一些實施方式中，在實時PCR反應中探針可與DNA擴增子的核酸結合。相對豐度如本文所用，術語「相對豐度」指稱相比參照量的目標基因組區的量。任何適當的參照量可用於測定目標基因組區的相對豐度。見，參照量的定義。一般而言，相對豐度包括尤其是2個基因組區(例如，胚胎DNA對比對應母源基因組DNA)的量之間的比，百分率(例如，DNA總量中胚胎DNA的百分率)，倍數變化，標準化的量。術語「相對豐度」與「相對量」互換使用。參照量如本文所用，術語「參照量」指稱可用作比較標準物或對照以計算目標基因組區的相對豐度的任何量。一般而言，參照量可為指示總量，平均量，過表達的或亞表達的量的量。例如，參照量可為量指示關聯母源樣品(例如，母源血)中的核酸總量，胚胎核酸總量，母源核酸總量，知道的不過表達或亞表達的對照區的量或多個對照區的平均量，知道的過表達的區的量或多個過表達的區的平均量，知道的亞表達的區的量或多個過表達的區的平均量，或對應於目標區的基因組區(例如，胚胎或母源)的量。參照量可為自與目標區同時實施以提供比較的定量反應或測定獲得的量；歷史參照(即，自之前實施的測定的量或結果，或之前知道的量或結果)；列印的或另外保存的記錄；或預定的閾值。在一些實施方式中，參照量指示母源血中胚胎核酸的平均表達(例如，3%，5%,10%,15%或20%)。在一些實施方式中，參照量指示母源血中母源核酸的平均表達(例如，97%,95%,90%,85%或80%)。正義鏈對比反義鏈如本文所用，術語「正義鏈」指稱包括功能蛋白的至少部分編碼序列的雙鏈DNA(dsDNA)的鏈。如本文所用，術語「反義鏈」指稱是正義鏈的反向互補體的dsDNA的鏈。信號如本文所用，術語「信號」指稱可檢測的和/或可測量的實體。在特定實施方式中，信號是由人眼可檢測的，例如，可見。例如，信號可為或可涉及可見光譜中色彩的強度和/或波長。該信號的非限制性例包括自化學反應諸如酶促反應得到的著色的沉澱物及著色的可溶性產物。在特定實施方式中，信號是使用設備可檢測的。在一些實施方式中，信號從當激發時發射螢光的螢光團產生，其中光是用螢光檢測器可檢測的。在一些實施方式中，信號是或涉及由分光光度計可檢測的光(例如，可見光和/或紫外線光)。例如，可將由化學發光反應產生的光用作信號。在一些實施方式中，信號是或涉及輻射，例如，由放射性同位素髮射的輻射，紅外線輻射，等。在特定實施方式中，信號是物理實體的性質的直接或間接指示物。例如，信號可用作生物學樣品中和/或反應容器中核酸的量和/或濃度的指示物。特定如本文所用，術語「特定」，當關聯寡核苷酸引物使用時，指稱，在適當的雜交或洗滌條件下，能與目標靶雜交及基本上不與不是目標的核酸雜交的寡核苷酸或引物。優選更高水平的序列同一性及包括至少60%，65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%,99%或100%序列同一性。在一些實施方式中，當將寡核苷酸和核酸比對時，特定寡核苷酸或引物含有與待雜交或擴增的部分核酸至少4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45,50,55,60,65,70或更多序列同一性喊基。受試者如本文所用，術語「受試者」指稱人或任何非-人動物(例如，小鼠，大鼠，兔，狗，貓，牛，豬，綿羊，馬或靈長類動物)。人包括出生前和出生後形式。在許多實施方式中，受試者是人。受試者可為患者，其指稱提供給用於疾病的診斷或治療的醫療提供者的人。術語「受試者」在本文與「個體」或「患者」互換使用。受試者可患或易受疾病或病症，但可或可不顯示疾病或病症的症狀。基本上如本文所用，術語「基本上」指稱呈現總和或接近-總程度或目標特徵或性質的程度的定性條件。生物學領域的普通技術人員會明白，生物學和化學現象罕見，即便有，接近完成和/或進行到完全或達到或避免絕對結果。本文所用的術語「基本上」因此旨在捕獲許多生物學和化學現象中固有的完全性的潛在缺乏。基本上互補如本文所用，術語「基本上互補」指稱可在嚴格雜交條件下雜交的2個序列。本領域技術人員會明白，基本上互補序列不需求沿著它們的全長雜交。在一些實施方式中，「嚴格雜交條件」指稱至少如以下嚴格的雜交條件在50%甲醯胺，5XSSC，50mMNaH2P04,pH6.8,0.5%SDS,0.lmg/mL超聲處理鮭魚精子DNA，及5XDenhart氏溶液中於42°C雜交過夜；用2XSSC，0.1%SDS於45°C洗滌；及用0.2XSSC，0.1%SDS於45V洗滌。在一些實施方式中，嚴格雜交條件應不允許在20個連續的核苷酸的延伸物上多於2個鹼基不同的2個核酸雜交。取代如本文所用，術語「取代」指稱，相比天然存在的分子，一個或更多胺基酸或核苷酸分別被不同胺基酸或核苷·酸取代。野生型如本文所用，術語「野生型」指稱自然界存在的典型或最常見的形式。發明詳述本發明提供，尤其是，鑑定及表徵母源循環中區別表達的(例如，過表達的或亞表達的)胚胎或母源基因組區的方法。本發明包括識別自胎兒DNA的特定基因組區可通常在母源循環中過表達，且該過表達的胚胎基因組區的鑑定可允許基於該過表達的區，無需胚胎DNA的顯著富集或純化而精確的出生前診斷。需知，胚胎基因組區的過表達可由多因素諸如DNA結構，細胞細節，在凋亡期間的DNA斷裂過程，及血中DNA酶可接近性導致。—般而言，本發明的方法涉及定量存在於母源循環中的一種或更多目標胚胎或母源基因組區，及測定相比適當的參照量，個體胚胎或母源基因組區的相對豐度。各種參照量可用於測定相對豐度。在一些實施方式中，指示母源循環中胚胎或母源核酸的平均表達的參照量用於測定相對豐度，且如果基因組區的相對豐度以統計學置信不同於參照量，基因組區被鑑定為區別表達。指示過表達或亞表達的參照量也可用於測定相對豐度。一般而言，根據本發明鑑定的區別(例如，過或亞)表達的區不對應於非整倍性區。區別表達的區，尤其是，相對過表達的胚胎基因組區，可用於無需顯著胚胎DNA富集或純化而開發出生前診斷測定。在特定實施方式中，相對過表達的胚胎基因組區對於基於至少以下2特性鑑定出生前診斷有用(I)相比其他胚胎區，母源循環中的胚胎基因組區的標準化的量的過表達；和/或(2)胚胎基因組區和對應母源區之間的分裂(S卩，比)。關於後者特性，需知，母源循環中特定胚胎基因組區的相對過表達可為對應母源區的相對亞表達的結果。這2個特性的分析可展示，例如，特定胚胎基因組區是相比對應母源區相對過表達的，但可相比其他胚胎基因組區相對亞表達。理想情況下，出生前診斷測定中使用的胚胎基因組區是相比對應母源區相對過表達的，且是相比其他胚胎基因組區相對過表達的。本發明的各種方面在以下部分描述詳細。這些部分未意指限制本發明。各部分可應用於本發明的任何方面。在本申請中，「或」是指「和/或」，除非另外陳述。多態區的鑑定為了輔助區別表達的胚胎或母源基因組區的精確的確定，本發明的方法一般利用可區別胚胎基因組區和對應母源基因組區的表徵測定。因此，在一些實施方式中，本發明涉及首先鑑定自它們的對應母源基因組區特殊地可檢測的那些胚胎基因組區的步驟。此步驟也被稱為鑑定多態區的步驟。如本文所用，術語「多態區」包括含有序列變異(諸如SNP)的那些區和具有同一序列、但由於表觀遺傳修飾(諸如甲基化)另外特殊地可檢測的區二者。一般而言，自它們的對應母源區特殊地可檢測的胚胎基因組區含有父源地貢獻的序列。在一些實施方式中，父源地貢獻的序列(或信息來源的由其)作為胚胎核酸(或由其來源的信息)的標記物。例如，包括比較胚胎核酸與母源核酸的方法的描述旨在包括將父源地貢獻的核酸與母源核酸比較的實施方式。在分析或使用父源地貢獻的核酸的實施方式中，父源地貢獻的核酸旨在包括胚胎核酸。在一些實施方式中，胚胎基因組區是特殊地可檢測的，因為其含有不同於對應母源基因組區(例如，一個或更多多態核苷酸)的序列。在一些實施方式中，胚胎基因組區是特殊地可檢測的，因為其相比對應母源區含有拷貝數變異(CNV)0在一些實施方式中，胚胎基因組區是特殊地可檢測的，因為其含有甲基化模式或不同於對應母源基因組區的其他表觀遺傳修飾。檢測甲基化的方法為本領域所知，且可適於根據本發明使用。一般而言，為檢測不同甲基化模式，可處理核酸以將甲基化的及未甲基化的核苷酸轉變為不同核苷酸。例如，在一些DNA甲基化檢測測定中，核酸用轉變未甲基化的鳥嘌呤鹼基但不轉變甲基化的鳥嘌呤鹼基，或反之亦然的劑處理。例如，亞硫酸氫鈉將未甲基化的鳥嘌呤轉變為胸腺嘧啶，但不轉變甲基化的鳥嘌呤。由此，甲基化可通過用該劑處理核酸(例如，DNA)，然後實施一種或更多測定處理的核酸的序列的技術來檢測，由此測定是否核酸中的一個或更多鳥苷被甲基化。例如，可將硫酸氫鈉處理與測序方法(例如，單分子測序)，或引物延伸方法組合，以便測定在一個或更多位點的DNA甲基化。替代性地或另外地，DNA甲基化可通過使用區別甲基化的及未甲基化的位點的抗體，例如，甲基化-特異性抗CpG抗體來檢測。各種方法可用於鑑定多態區。在一些實施方式中，多態區可通過基因分型母源核酸來鑑定。需知，基因型可在任何個體座位測定。各種基因分型測定或技術是在本領域中可利用的，且可適應於實踐本發明。例示基因分型測定包括，但不限於PCR，DNA片段分析，等位基因特定寡核苷酸(ASO)探針，DNA測序及與DNA微陣列或珠核酸雜交。在一些實施方式中，適合的基因分型技術包括限制性片段長度多態性(RFLP)，末端限制性片段長度多態性(t-RFLP)，擴增的片段長度多態性(AFLP)，及多重連接-依賴性探針擴增(MLPA)。一般而言，適合於本發明的基因分型測定是足夠敏感的，以鑑定母親和胎兒之間的多態區的實質性數。在一些實施方式中，根據本發明鑑定多於100，500，I,000,2,000，4，000，6，000，8，000或10,0000多態區/染色體。在一些實施方式中，對鑑定的多態區測序，及測定多態性(例如，SNP)的特定性質。多態區然後根據本發明表徵和/或定量，以鑑定各種母源樣品中區別表達的基因組區。母源樣品和其製備任何各種母源樣品可適宜於隨本文公開的方法使用。一般而言，可使用含有胚胎和母源核酸的任何母源樣品。母源樣品的類型包括，但不限於，細胞，組織，全血，血漿，血清，尿，糞便，唾液，臍帶血，絨毛膜絨毛樣品羊水，及經子宮頸灌洗液。也可根據發明的方法使用任何前述母源樣品的細胞培養物，例如，絨毛膜絨毛培養物，羊水和/或羊水細胞培養物，血細胞培養物(例如，淋巴細胞培養物)，等。在一些實施方式中，從懷孕的女性由非-侵襲性方法得到適合的母源樣品。例如，適合的母源樣品可為自懷孕的女性獲得的母源血，血清，血漿或羊水。在特定實施方式中，適合的母源樣品是母源血(例如，外周靜脈血)。適合的母源樣品可從在懷孕的各階段(例如，在第I個月，第2個月或頭三個月期間)的個體得到。在一些實施方式中，適合的母源樣品在頭三個月期間獲得，例如，在妊娠的413周之間(例如，在613周之間，在813周之間，在913周之間)。一般而言，適合的母源樣品從正常懷孕的個體得到。在一些實施方式中，適合的母源樣品從一個個體得到。在一些實施方式中，適合的母源樣品是自多個個體合併的樣品。在一些實施方式中，從母源樣品製備總DNA。在一些實施方式中，從母源樣品製備無細胞的DNA。製備總DNA或無細胞的DNA的各種方法和試劑盒是在本領域中可利用的和可用於實踐本發明。例如，核酸可從母源樣品由各種技術諸如由Maniatis，等人，分子克隆實驗室手冊，冷泉港，N.Y，pp.280-281(1982)描述的那些提取。可用於自母源樣品製備無細胞的DNA的例示商業試劑盒包括,但不限於，QIAampDNABloodMidiKit(Qiagen),HighPurePCR模板製備試劑盒(RocheDiagnostics),及MagNAPureLCCRocheDiagnostics)。可使用各種量的母源樣品。在一些實施方式中，適合的母源樣品含有具有多於I(例如，多於2，5，10，15，20，25，50，100，200，500，I,000，5，000或10，000)個基因組當量的總或無細胞的DNA。需知，在頭三個月期間1020ml的母源血含有總DNA的約10，000個基因組當量。由此，在一些實施方式中，適合的母源樣品可含有約20ml,15ml,10ml,5ml,4ml,3ml,2ml,lml,0.5ml,0.lml,0.Olml或0.OOlml的母源血。在一些實施方式中，將DNA製備物隨機片段化，以產生適合的長度的片段用於分析。待表徵的核酸可具有可變的長度。例如，它們可為至少50bp長度。在一些實施方式中，它們可為1504000bp長度。各種方法可用於產生核酸片段諸如超聲處理，限制酶消化，鳥槍法，及其他。例示方法描述於2003年10月9日公開的美國專利申請2002/0190663A1，其教導以它們的整體併入本文。在一些實施方式中，片段可進一步處理，使得不同片段的端全部含有相同的DNA序列。具有通用端的片段可然後用單對的擴增引物在單反應中擴增。具有通用端的片段也可由通用捕獲探針捕獲到固體支持物。在一些實施方式中，為獲得無偏的定量，在它們通過，例如，測序或雜交表徵之前，不對母源樣品中的核酸實施克隆或擴增。需知，雖然本說明書通篇說到DNA，也可分析見於母源血的胚胎RNA。如描述於Ng等人，「mRNAofplacentaloriginisreadilydetectableinmaternalplasma,』Troc.Nat.Acad.Sc1.，100(8):4748_4753，(2003)，可在母源血漿中檢測hPL(人胎盤催乳激素)和hCG(人絨毛膜促性腺激素)mRNA轉錄物。例如，可使用編碼在胎盤中表達的及在目標染色體上存在的基因的mRNA。在此情況中，RNA酶Hminus(RNA酶H—)反轉錄酶(RT)可用於製備檢測用cDNA。表徵及定量基因組區各種測定可用於表徵和/或定量目標胚胎或母源基因組區。例如，適合的方法可涉及計數含有目標胚胎或母源基因組區的個體核酸分子/片段，或測量在微陣列上多態探針(例如，SNP特異性探針)的信號強度變化(例如，使用基於陣列的比較性基因組雜交(aCGH)技術)。各種方法可用於計數個體核酸分子，包括但不限於尤其是DNA測序(例如，高通量單分子測序)，數字PCR，橋式PCR，乳劑PCR，納米串技術。例示方法在以下描述更多細節。單分子測序在本發明的特定實施方式中，方法包括母源樣品中核酸的單分子測序，例如，為了表徵和/或定量具有特定序列組成的胚胎和/或母源基因組區。尤其是，單分子測序技術允許具有多態核苷酸的個體核酸分子的評估，及獲得可歸因於不同多態區的序列讀取計數。各種單分子測序方法已描述於本領域和可用於實踐本發明。見,例如,Braslayskyetal.,(2003),Proc.Natl.Acad.Sc1.,100:3960-64;Greenleafetal.,(2006),Science,313:801;Harrisetal.,(2008)Science,320:106-109;Eidetal.,(2009),Science,323:133-138;Pushkarevetal.,(2009),NatureBiotechnology,27:847-850;Fanetal.,(August2008),Proc.Natl.Acad.Sc1.,EarlyEdition;各文獻的整個內容通過引用在本文合併。一般在單分子測序技術中，將核酸片段，其在測序反應期間作為模板，固定到固體支持物，使得至少部分核酸片段是個別光學-可解析的。適合於本發明的固體支持物可為核酸可共價附接的任何固體表面，諸如，例如膠乳珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯醯胺凝膠，金表面，玻璃表面和矽晶片。在一些實施方式中，固體支持物是玻璃表面。在一些實施方式中，固體支持物是載玻片，例如，玻璃載玻片。將核酸附接到本文所用的固體支持物的手段指稱任何化學或非-化學附接方法，包括可化學修飾的官能團。「附接」涉及核酸由共價連接或經不可逆被動吸附或經分子之間的親和性固定到固體支持物(例如，由生物素化的分子固定到親和素-包被的表面)。一般而言，附接具有無法通過用水或水性緩衝劑在DNA-變性條件下洗滌來移出的足夠的強度。「本文所用的可化學修飾的官能團」指稱基團諸如，例如，磷酸基團，羧酸或醛部分，氫硫基或氨基。在一些實施方式中,適合於本發明的固體支持物具有衍生的表面。在一些實施方式中，固體支持物的衍生的表面隨後用雙功能交聯基團修飾，以提供官能化的表面，優選用反應性交聯基團修飾。本文所用的「衍生的表面」指稱已用化學反應性基團，例如氨基，氫硫基或丙烯酸基團修飾的表面。本文所用的「官能化的表面」指稱已用特定官能團，例如馬來酸或琥珀酸官能部分修飾的衍生的表面。在一些實施方式中，將核酸片段(其可包含全部或部分胚胎或母源基因組區)的各分子在不同位置附接於固體支持物。在一些實施方式中，固定到固體支持物的核酸片段可檢測標記(例如，用可產生光信號的可檢測的部分標記)。例如，核酸片段可退火到可檢測標記的寡核苷酸引物。固體支持物上各單分子的位置可由檢測標記物(例如，可檢測的部分)和記錄的各分子的位置的儀器讀。在一些實施方式中，核酸片段的可檢測的標記物在記錄位置之後移出。例如，在可檢測的標記物包含螢光部分的實施方式中，可檢測的標記物可通過光漂白螢光部分移出。替代性地或另外地，可檢測的標記物可自核酸片段切割。在一些實施方式中，捕獲寡核苷酸固定到固體或半固體支持物，以輔助核酸片段(例如，多核苷酸)的捕獲及固定，如在本文進一步描述。通過使用固定的核酸片段作為模板來實施測序反應。將引物與核酸片段雜交，以形成引物/模板雙聯體。在一些實施方式中，將核酸片段修飾為包括互補於使用的引物的適配體。在一些實施方式中，將引物固定到固體表面，且將核酸片段經它們與引物的雜交附接於固體表面。在一些實施方式中，實施焦磷酸測序(S卩，由合成測序)。特別是，在一種或更多核苷酸或核苷酸類似物(例如，dNTP)及一種或更多核酸聚合酶的存在下，在對於允許引物延伸至少一個鹼基適合的條件下實施模板-依賴性引物延伸。一般而言，在測序反應期間合併的核苷酸被可檢測標記(例如，用可產生光信號的可檢測的部分標記)。檢測及記載自標記物發出的信號；特定信號可相關於特定核苷酸或核苷酸類似物的特性，由此揭示模板核酸片段上對應互補核苷酸的特性。在一些實施方式中，可檢測的信號在一輪併合之後移出和/或毀壞(例如，如在本文描述)，由此輔助標記的核苷酸或核苷酸類似物的進一步延伸和檢測。可優化測序，以達到將正確的核苷酸快速和完全添加到引物/模板複合物中的引物，同時限制不正確的核苷酸的錯合併。例如，可降低dNTP濃度以減少不正確的核苷酸錯合併到引物。不正確的dNTP的Km值可高至相比正確的核苷酸的Km值1000倍更高，指示dNTP濃度的減小可減少核苷酸錯合併的速度。由此，在一些實施方式中，測序反應中dNTP的濃度是大致520iiM。此外，相對短反應時間可用於減少錯合併的概率。例如，對於接近約400個核苷酸/s的最大速度的併合速度而言，大致25ms的反應時間會足以確保99.99%的弓I物鏈的延伸。可檢測的部分可根據需要直接或間接合併到核苷酸，核苷酸類似物，多核苷酸或其他分子。適合的可檢測的部分包括，尤其是，螢光部分和發光部分。在一些實施方式中，螢光部分包含花青苷染料，例如，花青苷-3和/或花青苷5。適合的可檢測的部分的例在本文進一步描述。在一些實施方式中，單分子測序以高-通量樣式，例如，用平行實施的許多測序反應實施。例如，適合於本發明的高通量單分子測序測定可同時表徵達數千，數百萬或數十億的分子。並行測序反應不需要同步實施；可實施異步反應，且與本發明的方法相容。根據本發明的方法，在一些實施方式中，獲得個體序列讀取計數，其歸因於胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，基於胚胎和母源核酸之間的多態性的知識，和與多態核苷酸關聯的不同標記物的檢測實現將序列讀取計數歸因於胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，對大部分(例如，多於10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,99%或大於99%)的基因組測序。在一些實施方式中，以平均至少10倍(IOX基因組當量)覆蓋測序的至少一個基因組區，S卩，有平均10個讀數或更多給定基因組區。在一些實施方式中，覆蓋是至少20X，至少30x，至少40x，至少50x,至少60x,至少70x,至少80x,至少90x,至少IOOx,至少IlOx,至少120x,或更多時間。在一些實施方式中，覆蓋是100倍(100X基因組當量)或更高。在一些實施方式中，採用無偏的核酸測序方法。即，在全部測序讀數之中的特定序列的表達反映母源樣品中對應核酸的表達。在一些實施方式中，通過不在測序反應之間擴增模板核酸來至少部分達到無偏的核酸測序。在一些實施方式中，模板核酸在測序反應期間也不擴增。在一些實施方式中，無偏的DNA序列使用亮螢光團和雷射激發，以自固定到表面的個體DNA分子檢測焦磷酸測序事件，消除對擴增的需求。在一些實施方式中，以確保群中的全部物種核酸等同擴增的方式，通過擴增(在測序反應期間和/或在測序反應之前)模板核酸至少部分達到無偏的核酸測序。例如，乳劑PCR可用於以無偏的方式擴增核酸。見討論乳劑PCR部分。本領域知道及已描述適合的序列分析的試劑(例如，核苷酸和/或核苷酸類似物，核酸聚合酶，等)，固體支持物，設備和方法。見，例如，美國專利No.7，169,560;7，220，549；7，276，720;7，279，563;7，282，337;7，397，546;7，424，371;7，476，734;7，482，120；7，491，498;7，501，245;7，593，109;7，635，562;7，666，593;7，678，894；及7，753，095，各整個內容通過引用在本文合併。各種可商購的試劑盒諸如真單分子測序(tSMS)(HeliC0S)可用於實踐本發明。數字PCR在一些實施方式中，數字PCR用於表徵及定量多態胚胎或母源基因組區。一般而言，數字PCR涉及自最低限度稀釋的樣品擴增單DNA模板，因此產生完全來源自一種模板的擴增子，且可用不同螢光團檢測，以區別及計數不同多態區(例如，胚胎對比母源區)。由此，數字PCR將自常規PCR獲得的指數，模擬信號轉化為線性，數位訊號，允許PCR產物的統計學分析。數字PCR技術在本領域良好描述。見，VogelsteinB.andKinzlerK.W.,(1999),Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,Vol.96,pp9236-9241;PohlG.andShihL.M.,(2004),Expert.Rev.Mol.Diagn.,4(1),41-47,其教導通過引用在此合併。在一些實施方式中，將自母源樣品製備的DNA首先稀釋到多-孔(例如，96-孔，384-孔)板，平均每2孔一種模板(即，平均0.5個模板分子(基因組當量)/孔)。為了測定最佳稀釋，可首先定量DNA，以測定原母源樣品中基因組當量的量。自單模板分子的擴增的PCR產物基本上在序列上均質，各種技術可用於表徵各孔中的序列含量。一般而言，基於螢光探針的檢測方法是特別有用的。例如，為定量胚胎或母源多態區，設計一對PCR引物和一對分子信標用於各SNP。一般而言，分子信標是分別在它們的5』和3』端含有螢光染料和猝滅劑的單鏈寡核苷酸。除了對應於SNP和螢光標記物(綠色或紅色)的核苷酸之外，兩種信標是同一的。一般而言，分子信標包括發卡結構，其導致螢光團更接近猝滅劑，及當不與PCR產物雜交時不發射螢光。與它們的互補核苷酸序列雜交之後，猝滅劑自螢光團遠離，導致增加的螢光。一般而言，計算具有綠色或紅色螢光的2種等位基因-特異性信標的螢光強度的比，以測定各個體孔中的等位基因類型。用計數的數百或數千孔，可測定母源和胚胎(或父源)等位基因的相對豐度。各種數字PCR方法，試劑和設備為本領域所知，情況可適應於實踐本發明。見，例如，美國專利No.6，143，496,6,440，706,6,753，147和7，704，687，各整個內容通過引用在本文合併。橋式PCR在一些實施方式中，橋式PCR用於表徵和/或定量胚胎或母源基因組區。橋式PCR也被稱為固相PCR或2-維PCR。一般而言，橋式PCR在固體表面或凝膠之內發生，由此產生可同時測序或與多態探針雜交的大數的「PCR集落」(聚合酶產生的集落)。在一些實施方式中，橋式PCR涉及一般擴增反應，其中DNA樣品被隨機片段化，然後處理，使得不同片段的端全部含有相同的DNA序列。例如，DNA片段可連接到通用適配體序列。具有通用端的片段可然後在單反應中用單對的擴增引物擴增。一般而言，DNA片段首先在擴增之前在各反應位點，在表面上，或凝膠之內個別解析到單分子水平，其確保，擴增的分子形成可然後進一步分析的離散集落。在一些實施方式中，這些並行擴增反應在為好幾千並行化學反應提供大表面積的「流動池」(基本上水-密性的顯微鏡載玻片)表面發生。流動池表面用對應於在樣品製備階段期間連接的適配體的序列的單鏈寡核苷酸包被。單鏈，適配體-連接的片段結合到暴露於用於基於聚合酶的延伸的試劑的流動池表面。引發由連接到表面上的互補寡聚體的片段「橋」的游離/遠端發生。可使用各種其他固體表面代替流動池表面。例如，適合於本發明的固體表面可包括，但不限於，膠乳珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯醯胺凝膠，金表面，玻璃表面和矽晶片。橋式擴增的各種方法為本領域所熟知。見，例如，2010年6月7日提交的美國臨時申請系列No.61/352，062，美國專利No.7，115，400，美國公開No.20090226975，及BingD.H.等人,「BridgeAmplification:ASolidPhasePCRSystemfortheAmplificationandDetectionofAllelicDifferencesinSingleCopyGenes,，，SeventhInternationalSymposiumonHumanIdentification(在Promega網站可利用)，全部通過引用在此合併。各種方法可用於表徵由橋式PCR產生的擴增的核酸的序列內容。在一些實施方式中,可由合成測序含有擴增的核酸的百萬PCR集落。例如，Illumina氏Solexa測序技術可適應於根據本發明表徵及定量胚胎或母源區。例如，可使含有百萬簇的固體表面經歷用延伸及成像的自動化的循環測序。測序的第I循環涉及首先併合單螢光核苷酸，之後是整個表面的高解析度成像。這些像表示對於第I鹼基收集的數據。任何背景以上的信號鑑定簇(或PCR集落)的物理位置，及螢光發射鑑定4種鹼基中的哪個合併在該位置。重複此循環，一次一個鹼，產生一系列像，各表達在特定簇的單鹼基延伸。鹼基判定用經時鑑定發射色彩的算法來衍化。由此，可歸因於特定胚胎或母源基因組區的個體序列讀取計數可獲得。在一些實施方式中，含有擴增的核酸的簇可通過使用螢光探針雜交來表徵。例如，為區別及定量胚胎或母源多態區，可對於各SNP設計一對分子信標。一般而言，分子信標是分別在它們的5』和3』端含有螢光染料和猝滅劑的單鏈寡核苷酸。除了對應於SNP和螢光標記物(綠色或紅色)的核苷酸之外，兩種信標相同。一般而言，分子信標包括發卡結構，其導致螢光團更接近猝滅劑，及當不與PCR產物雜交時不發出螢光。在與它們的互補核苷酸序列雜交之後，猝滅劑自螢光團遠離，導致增加的螢光。一般而言，計算具有綠色或紅色螢光的2種等位基因-特異性信標的螢光強度的比，以測定各簇中的等位基因類型。用計數的數百或數千簇，可測定母源和胚胎/父源等位基因的相對豐度。乳劑PCR在一些實施方式中，乳劑PCR用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。一般而言，乳劑PCR可用於產生具有克隆擴增的DNA的小珠，即，各珠含有自單分子模板由PCR產生的一種類型的擴增子。例示乳劑PCR描述於2005年I月3日公開的Dressmanetal,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.,100,8817(Jul.22,2003)andDressmanetal.PCTpublicationW02005010145,「METHODANDCOMPOSITIONSFORDETECTIONANDENUMERATIONOFGENETICVARIATIONS,」，且就其基於珠的過程的描述通過引用在此合併。例如，將用捕獲寡核苷酸(或集落引物)包被的珠與具有互補銜接子或標記序列的核苷酸混合。將含有對於PCR的全部必需組分的水性混合物加結合引物的珠和模板DNA與油/去汙劑混合物一起攪拌，以產生微乳劑。水性隔室(其可被例證為在油層中的小滴)含有平均〈I個模板分子和〈I個珠。可在一或更少滴中描繪不同模板(母源和胚胎)，以表示其序列一個或許多核苷酸不同的2個模板分子。使微乳劑如在常規PCR中一樣溫度循環。如果DNA模板和珠在單水性隔室中在一起存在，珠結合的寡核苷酸作為擴增用引物。由各種材料及以各種尺寸製造的珠可用於本發明。例如，適合的珠可為磁珠，塑料珠，金粒子，纖維素粒子，聚苯乙烯粒子，等。適合的珠可為小，例如。I2，到幾百，例如，200IOOOiim直徑的尺寸範圍的微粒。在一些實施方式中，可商購的控制的-孔隙玻璃(CPG)或聚苯乙烯支持物在本發明中用作固相支持物。該支持物用鹼不穩定接頭和附接的初始核苷可利用，例如，AppliedBiosystems(FosterCity,Calif.)在一些實施方式中，含有克隆擴增的核酸的珠可通過焦磷酸測序(即，由合成測序)表徵。例如，可使含有擴增的DNA的珠與測序需要的酶一起經歷含有大量的Pl-體積孔(其對於單珠足夠大)的測序機。在一些實施方式中，焦磷酸測序使用螢光素酶以產生光作為讀取，·及測序機對每個添加的核苷酸取孔的圖像，及記錄。可獲得可歸因於胚胎或母源基因組區的序列讀取計數。適合的測序機是可商購的，包括454LifeSciences’sGenomeSequencerFLX0與標條碼的探針的單分子雜交在一些實施方式中，使用與標條碼的探針的單分子雜交的技術可用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。一般而言，該技術使用分子「條碼」和單分子成像，以不擴增地在單反應中檢測及計數特定核酸靶。一般而言，將各色彩-編碼的條碼附接於對應於目標基因組區的單靶-特異性探針。與對照混合在一起，它們形成多重化的CodeSet。在一些實施方式中，2種探針用於雜交各個體靶核酸。報告子探針攜帶信號；捕獲探針允許複合物固定用於數據收集。在雜交之後，過量探針移出，及可由數據收集用數字分析儀分析固定的探針/靶複合物。對色碼計數及對各靶分子(例如，目標胚胎或母源基因組區)列表。適合的數字分析儀包括由NanostringTechnologies提供的nCoilIlter分析系統。方法，包括分子「條碼」的試劑，適合於納米串技術的設備還描述於美國申請公開No.20100112710，20100047924，20100015607，各整個內容通過引用在本文合併。半導體測序在一些實施方式中，半導體測序方法用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。本文所用的術語「半導體測序，""半導體PH敏感測序，""複製檢測測序，""直接複製檢測測序〃和〃半導體複製檢測測序〃是同義的，且通常指稱Pourmand及同事們的方法。見例如，Pourmandetal.，2006，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA103:6466-6470。例不半導體測序的系統在此情景中包括，例如，IonTorrent技術(LifeTechnologies,Guilford,CT)。如同由本領域知道的及在本文描述的合成測序的其他方法，半導體測序方法對於測序固定到固體支持物，即，合併電荷傳感器的大規模並行陣列上的核酸片段是有用的，以檢測在DNA複製期間質子的實時釋放。一般而言，將樣品DNA片段化，例如，1050，50150，50100，100200，200400，4004000bp序列，優選約100個核苷酸。序列製備為含由具有適配體序列的設計的PCR引物連接或合併的側接適配體的庫。庫片段然後通過使用乳劑PCR克隆擴增，以形成用模板DNA包被的粒子。將粒子沉積在大規模並行陣列上，其在對於DNA複製適合的條件下，在DNA聚合酶的存在下依次接觸脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)。dNTP各併合到生長的雙聯DNA導致質子釋放，導致由電荷傳感器可檢測的電荷變化。由此，大規模並行陣列的特定孔中的電荷變化(即，PH變化)指示特定dNTP的併合。電荷無變化指示特定dNTP未合併。多質子釋放(例如，2，3，4或更多)質子釋放指示合併特定dNTP的對應序列。大規模並行陣列中各孔的電荷變化與特定dNTP的存在的關聯由此提供DNA樣品的序列。單向測序需要僅一個融合引物對，且會自擴增子的僅一端產生讀數。可進行雙向的測序用於最佳結果，自擴增子的兩端及全長產生高質量讀數。靶區的長度可優化。例如，用具有100個核苷酸的典型讀長，序列的頭2025個核苷酸對應於PCR引物的靶特定序列，且不會產生信息性的數據。因此，在一些情況中，採用約75bp的祀區。覆蓋需求的深度依賴於樣品突變的預期的頻度，及決定每大規模並行陣列給出的固定的量的序列通量包括的擴增子數。例如，對於根據標準孟德爾遺傳模式的生殖系突變，100%或50%的讀數預期含有給定序列變體。認為，在這些情況中，100200X的覆蓋的平均深度提供足夠數量的讀數，以用統計學置信檢測變體。對於異源樣品，例如，異源癌樣品中以可變的和一般低頻度存在的體細胞突變的高置信檢測，達1000-2000X的更深覆蓋被認為需要。方法，試劑和設備還描述於Pourmand及同事的精細工作，例如，US7，785，785，通過引用以其整體及為全部目的在本文合併。可檢測的實體任何廣泛的可檢測的劑可在本發明的實踐中使用。適合的可檢測的劑包括，但不限於各種配體，放射性核素；螢光染料；化學發光劑(諸如，例如，吖啶鎗酯，穩定化的二氧雜環丁烷等)；生物發光劑；光譜可分辯的無機螢光半導體納米晶體(即，量子點)；微粒；金屬納米粒子(例如，金，銀，銅，鉬，等);納米簇；順磁金屬離子；酶；比色標記物(諸如，例如，染料，膠體金，等);生物素；地高辛配基；半抗原；及抗血清或單克隆抗體可對其利用的蛋白。在一些實施方式中，可檢測的部分是生物素。生物素可結合到親和素(諸如鏈黴親和素)，其一般綴合(直接或間接)到本身可檢測的其他部分(例如，螢光部分)。除了關聯本文所述的各種方法描述的例示可檢測的實體之外，以下描述了一些其他可檢測的部分的非限制性例。螢光染料在特定實施方式中，可檢測的部分是螢光染料。具有廣泛的化學結構和物理特徵的多種知道的螢光染料適宜於在本發明的實踐中使用。螢光可檢測的部分可由雷射器用由檢測器捕獲的發射的光刺激。檢測器可為電荷耦合裝置(CCD)或共聚焦顯微鏡，其記錄其強度。適合的螢光染料包括,但不限於,螢光素和螢光素染料(例如，螢光素異硫代花青苷或FITC，萘並螢光素，4』，5』-二氯-2』，7』-二甲氧基螢光素，6-羧基螢光素或FAM，等)，羰基花青苷，部花青苷，苯乙烯基染料，氧鎗醇染料，藻紅蛋白，赤蘚紅，伊紅，若丹明染料(例如，羧基四甲基若丹明或TAMRA，羧基若丹明6G，羧基-X-若丹明(ROX)，麗絲胺若丹明B，若丹明6G，若丹明綠，若丹明紅，四甲基若丹明(TMR)，等)，香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素，二烷基氨基香豆素，羥基香豆素，氨基甲基香豆素(AMCA)，等)，俄勒網綠染料(例如，俄勒網綠488，俄勒網綠500，俄勒網綠514，等)，德克薩斯紅，德克薩斯紅-X，譜RED,譜GREEN,花青苷染料(例如，CY-3,CY-5,CY-3.5,CY-5.5,等)，ALEXAFLUOR染料(例如，ALEXAFLU0R350,ALEXAFLU0R488,ALEXAFLUOR532,ALEXAFLUOR546,ALEXAFLUOR568,ALEXAFLUOR594,ALEXAFLUOR633,ALEXAFLU0R660,ALEXAFLU0R680,等)，BODIPY染料(例如，BODIPYtmFL,B0DIPYR6G,BODIPYtmTMR,BODIPYtmTR,B0DIPY530/550,B0DIPY558/568,B0DIPY564/570,B0DIPY576/589,BODIPYtm581/591，B0DIPYtm630/650，B0DIPY650/665，等)，IRDyes(例如，IRD40,IRD700,IRD800,等)，等。對於適合的螢光染料和將螢光染料偶聯到其他化學實體諸如蛋白和肽的方法的更多例，見，例如，「TheHandbookofFluorescentProbesandResearchProducts，，，9thEd.,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR。突光標記劑的有利的性質包括高摩爾吸收係數，高突光量子產率，及光穩定性。在一些實施方式中，標記突光團在可見光譜(即，在400和750nm之間)而非在光譜的紫外線範圍(即，少於400nm)內呈現吸收和發射波長。可檢測的部分可包括多於一個化學實體，諸如在螢光共振能量轉移(FRET)中。共振轉移導致發射強度的總體增強。例如，見Juet.al.,(1995),Proc.NafIAcad.Sc1.(USA)，92:4347，整個內容通過引用在本文合併。為了達到共振能量轉移，第I螢光分子(「供體」氟)吸收光，及通過激發的電子的共振將其轉移到第2螢光分子(「受體」氟)。在一方法中，供體和受體染料可連接在一起及附接到寡引物。將供體和受體染料連接到核酸的方法已之前描述於，例如，Lee等人的美國專利No.5，945，526，整個內容通過引用在本文合併。可使用的染料的供體/受體對包括，例如，螢光素/四甲基若丹明，IAEDANS/螢光素，EDANS/DABCYL，螢光素/螢光素，BODIPYFL/B0DIPYFL，及螢光素/QSY7染料。見，例如，Leeetal的美國專利No.5，945，526。許多這些染料也是可商購的，例如，自MolecularProbesInc.(Eugene,OR)。適合的供體突光團包括6-羧基突光素(FAM),四氯-6-羧基突光素(TET),2』-氣_7』-苯基_1，4_二氣-6-竣基突光素(VIC),等。酶在特定實施方式中，可檢測的部分是酶。適合的酶的例包括，但不限於，在ELISA中使用的那些，例如，辣根過氧化物酶，3-半乳糖苷酶，螢光素酶，鹼性磷酸酶，等。其他例包括3-葡萄糖醛酸糖苷酶，3-D-葡萄糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶，等。可將酶使用接頭基團諸如碳二亞胺，二異氰酸酯，戊二醛，等綴合於分子。放射性同位素在特定實施方式中，可檢測的部分是放射性同位素。例如，分子可為同位素-標記的(即，可含有已由具有不同於通常見於自然界的原子質量或質量數的原子質量或質量數的原子取代的一個或更多原子)或可將同位素附接於分子。可合入分子的同位素的非限制性例包括氫，碳，氟，磷，銅，鎵，乾，鎝，銦，碘，錸，銘，秘，破，衫和鑥的同位素(即，3H,13C,14C，18F,19F,32P,35S,64Cu,67Cu,67Ga,90Y,99mTc,111In,1251,1231,1291,1311,1351,186Re,187Re,201Tl,212Bi,213Bi，211At，153Sm,177LuX在一些實施方式中，信號擴增通過使用標記的樹狀聚體作為可檢測的部分來達到(見，例如，PhysiolGenomics,3:93-99，2000)，整個內容通過引用以它們的整體在本文合併。突光標記的樹狀聚體可獲自Genisphere(Montvale,N.J.)。這些可由本領域知道的方法化學綴合於寡核苷酸弓I物。測定相對豐度各種方法可用於測定胚胎或母源區的相對豐度。如本文所用，術語「相對豐度」指稱相比參照量的目標基因組區的量。相對豐度可測定為尤其是比，百分率，倍數變化，標準化的量。一般而言，為測定相對豐度，目標胚胎或母源基因組區的量首先由包括本文所述的那些的各種方法(例如，單分子測序，數字PCR，橋式PCR，乳劑PCR，納米串技術或aCGH)測量或定量。然後將此量與參照量比較。參照量可為量指示核酸總量，關聯母源樣品(例如，母源血)中胚胎或母源核酸的總量。在此情況中，胚胎或母源區的相對豐度一般測定為關聯DNA總量的百分率。在一些實施方式中，將胚胎基因組區和對應母源基因組區的量定量。胚胎基因組區的相對豐度可通過比較胚胎基因組區的量與對應母源區的量來測定。可將相對豐度與預定的閾值比較，以便測定是否胚胎基因組區區別表達。一般而言，在此情況中，預定的閾值指示關聯母源樣品中胚胎核酸和母源核酸之間的平均比。如果相對豐度以統計學置信在預定的閾值以上，胚胎基因組區被鑑定為過表達。在一些實施方式中，母源基因組區的相對豐度可通過比較母源基因組區的量與對應胚胎基因組區的量來測定。相對豐度可將比較與預定的閾值以便測定是否母源基因組區區別表達。一般而言，在此情況中，預定的閾值指示關聯母源樣品中母源核酸和胚胎核酸之間的平均比。如果相對豐度以統計學置信在預定的閾值以下，母源基因組區被鑑定為亞表達。在一些實施方式中，相對豐度可通過比較關聯母源樣品中胚胎或母源基因組區的定量的量與分別指示胚胎或母源基因組區的平均表達的參照量來測定。該平均表達可通過使用與目標區同時實施的相同的測定來定量知道不在母源樣品中過表達或亞表達的對照區的量來測定。在一些實施方式中，多對照區可定量及平均，以獲得指示平均表達的參照量。適合的參照量也可為歷史參照(即，自之前實施的測定的量或結果，或之前知道的量或結果)。在此情況中，如果定量的量相比參照量統計學地不同(例如，更大或更小)，目標胚胎或母源區被鑑定為區別表達(例如，過表達或亞表達)。在一些實施方式中，相對豐度可通過比較關聯母源樣品中胚胎或母源基因組區的定量的量與指示胚胎或母源基因組區的過表達的參照量來測定。該參照可通過使用與目標區同時實施的相同的測定來定量已知在母源樣品中過表達的對照區的量來測定。在一些實施方式中，多個過表達的對照區可定量及平均，以獲得指示過表達的參照量。適合的參照量也可為歷史參照(即，自之前實施的測定的量或結果，或之前知道的量或結果)。在此情況中，如果定量的量是以統計學置信基本上相同或大於參照量，目標胚胎或母源區被鑑定為過表達。在一些實施方式中，相對豐度可通過比較關聯母源樣品中胚胎或母源基因組區的定量的量與指示胚胎或母源基因組區的亞表達的參照量來測定。該參照可通過使用與目標區同時實施的相同的測定來定量已知在母源樣品中亞表達的對照區的量來測定。在一些實施方式中，多個亞表達的對照區可定量及平均，以獲得指示亞表達的參照量。適合的參照量也可為歷史參照(即，自之前實施的測定的量或結果，或之前知道的量或結果)。在此情況中，如果定量的量是以統計學置信基本上相同或小於參照量，目標胚胎或母源區被鑑定為亞表達。在一些實施方式中，測定每個體多態基因組區或座位的相對豐度，且可表示連續體模型(例如，線或曲線)。可將連續譜與分別指示胚胎或母源核酸的平均表達的基線比較，且任何以統計學置信自基線偏離的基因組區或座位可被鑑定為區別表達的(例如，過表達或亞表達的)。在一些實施方式中，指示在母源循環(例如，母源血)中胚胎核酸的平均表達的參照量可為約3%，5%，10%,15%，20%或25%。在一些實施方式中，指示母源循環(例如，母源血)中母源核酸的平均表達的參照量可為約97%，95%，90%,85%，80%或75%。在基因組區被鑑定為相比參照量過表達的或亞表達的一些實施方式中，測定基因組區的「過表達因數」或「亞表達因數」。例如，如果胚胎基因組區被測定為相比指示母源樣品中胚胎核酸的平均表達(例如，5%)的參照量過表達(例如，10%)，胚胎基因組區超過參照量的觀察的量的因數計算為「過表達因數」。在此情況中，過表達因數是2。一般而言，如以下描述或根據其他本領域知道的方法應用統計學測試，以測定是否量的差異或相似性是統計學地顯著。統計學分析一般而言，統計學地分析數據，以測定是否2值是相同或不同(例如，是否基因組區的量與參照量相同的或不同)。本領域建立各種統計學測試和統計學意義的量度，且可根據本發明使用。分析均勻地分布和/或推定為均勻地分布的數據的通常使用的統計學測試的非限制性例(例如，參數測試)包括Student氏t檢驗(包括1-樣品t檢驗，2_樣品t檢驗及匹配的配對t檢驗)和方差分析(AN0VA;單因素和2-因素或重複量度(例如，N-因素ANOVA))。分析不是均勻地分布的數據的通常使用的統計學測試的非限制性例包括WilcoxonRank-Sum測試和MannWhitneyU測試。嚴格度(例如，通過P-值和/或q_值的截止值，如下解釋)可根據標準設置，和/或可就給定數據組依經驗設置。要使用的統計學測試的選擇可依賴於一種或更多因素，包括但不限於數據分布，實施的比較的類型(例如，實驗數據與參照值對比2組實驗數據彼此)和樣品之間的關係(例如，匹配的對(諸如用匹配的對照的實驗樣品)對比無關係)。在一些實施方式中，使用多於一個統計學測試，例如，為確認目的。在一些實施方式中，使用適合於小樣品尺寸的統計學測試。在一些實施方式中，使用多(例如，多於2)組之間的關係的分析。例如，N-因素ANOVA測試(也被稱為重複的測量ANOVA測試)一般化Student氏t檢驗至多於2組。N-因素ANOVA測試可根據本發明的方法使用，用於更有效在多組之間比較。在一些實施方式中，將多測試修正應用於調整源於多統計學測試的P-值，以校正可自多測試出現的誤差(例如，增加的數的假陽性或顯著結果)。多測試修正一般涉及自重複多次的統計學測試再計算概率。在一些實施方式中，使用Bonferroni修正。多測試修正方法為本領域所知。對於該方法的回顧，見，例如，Noble,(2009)，NatureBiotechnology,27:1135-1137，整個其內容通過引用併入。在一些實施方式中，使用涉及2類別變量之間的關係的分析的統計學測試。例如，Fisher氏精確測試可用於精確地計算自無效假說的偏差的顯著性；Fisher氏精確測試可用於情況，其中樣品尺寸小。見,例如,Weisstein,EricW.,「Fisher’sExactTest,^romMathWorld—AffolframWebResource,在Wolfram,com網站可利用，整個內容通過引用在本文合併。一般使用統計學意義的2個指標來評價數據。P-值指示如果無效假說不是真，獲得觀察的值的概率。例如，無效假說可為給定胚胎基因組區具有平均表達。更低P-值指示統計學意義；即，無效假說不是真的且應拒絕的增加的似然性。Q-值指示當特定測試被認為顯著時，假髮現率，即發生的假陽性的比例的量度。如同P-值，更低q_值指示更大顯著性。在一些實施方式中，使用P-值截止值。在一些實施方式中，使用q_值截止值。在一些實施方式中，使用P-值和q_值截止值二者。在一些實施方式中，使用P〈0.05的P-值截止值。在一些實施方式中，使用更嚴格P-值截止值，例如，P〈0.01，p〈0.005，p〈0.001，等。在一些實施方式中，使用q〈0.2的q_值。在一些實施方式中，使用更嚴格q_值截止值例如，q〈0.1，p〈0.05，p〈0.01，等。p-值和q_值截止值的任何組合可用於使用截止值的實施方式，例如，p〈0.05與q〈0.2組合。在一些實施方式中，定量的數據首先在統計學分析之前標準化。一般而言，標準化是分離在重複的測量的數據中的統計學誤差的過程。標準化有時基於性質。分位數標準化，例如，是基於量度的量值(分位數)的標準化。在一些實施方式中，標準化指稱由共同變量的多組數據的區分，以便規避變量對數據的效應，由此允許成為待比較的數據組的特徵的基礎此允許待比較的不同尺度的數據，通過使它們至共同尺度。例如，胚胎或母源樣品中的母源基因組區的定量的量可相對樣品中基因組DNA的總量標準化，以規避原材料中量變異的效應。驗證和臨床應用在一些實施方式中，可在不同生物學個體之間比較區別表達的胚胎或母源基因組區。鑑定及確證一貫地過表達或亞表達的區。驗證可由相同的技術的重複，和/或由另外的技術進行。例如，單分子測序結果可，例如，由數字PCR或通過再測序核酸確認。再測序可由相同的方法和/或由其他方法，例如，Sanger測序實現。可計算各確證的區別表達的區的過表達或亞表達因數。可基於它們的染色體位置，及關聯的遺傳疾病，病症或病情為臨床應用鑑定確證的過表達或亞表達的胚胎或母源基因組區。在一些實施方式中，也提供區別表達的區的過表達或亞表達因數和/或DNA序列。在一些實施方式中，本發明提供記載與染色體位置，關聯的遺傳疾病，病症或病情相關的信息，確證的區別表達的胚胎或母源基因組區的過表達或亞表達因數和/或DNA序列的計算機可讀介質。確證的區別表達的胚胎或母源基因組區可用於開發或改善與任何區別表達的區關聯的任何基因組失常及關聯的遺傳疾病，病症和病情的非-侵襲性出生前診斷。如本文所用，遺傳失常可包括，但不限於，核酸鹼基取代，擴增，缺失，複製，轉位，拷貝數變異，非整倍性(例如，多倍性，三體性，等)和嵌合體。例如，母源循環中相對過表達的胚胎基因組區的表徵可提供本文所述的各種基因組失常的更穩健的分析，因此，提供關聯的遺傳疾病，病症或病情的更精確的出生前診斷。在一些實施方式中，母源循環中相對過表達的胚胎基因組區的表徵可用於開發用簡化的，最小或無富集或純化的胚胎DNA的非-侵襲性診斷測定。在一些實施方式中，母源循環中相對過表達的胚胎基因組區的表徵可用於檢測早期懷孕期間(例如，在妊娠的413周，49周或46周之間)的胚胎異常。在一些實施方式中，母源循環中在第13，14，15，16，18，21，22，X染色體或其任何組合上相對過表達的胚胎基因組區的表徵可用於檢測染色體異常包括但不限於結構異常，非整倍性(例如，多倍性，三體性，等)，嵌合體，突變及關聯的遺傳疾病，病症和病情包括但不限於Turner氏症候群，Down症候群(三體性21),Edward氏症候群(三體性18),Patau症候群(三體性13),三體性14，三體性15，三體性16，三體性22，三倍性，四倍性和性染色體異常包括但不限於XO,XXY，XYY和XXX。實施例實施例1:用於鑑定母源血中胚胎DNA的過表達的區的單分子測序以平均100x或更大基因組覆蓋對從自多個個體的母源血漿的無細胞的DNA實施高-通量單分子測序。將自母源樣品的核酸片段化及變性為單鏈。將多聚A尾加入各分子。然後將單核酸分子捕獲到流動池之內表面，各單分子捕獲到不同位置。通過使用各分子作為模板無擴增地進行測序反應。每次添加一個螢光-標記的核苷酸(dCTP，dGTP,dATP或dTTP)，及由DNA聚合酶合併到生長的互補鏈。洗滌出未合併的核苷酸。雷射用於在合併的標記的核苷酸上的激發的螢光團。在一或更多像中檢測及記錄得到的發射的信號，及信號位置。然後將合併的核苷酸的螢光標記物由將合併的核苷酸落在後的高度有效切割過程移出，然後將另一核苷酸加入持續循環。由此對各單分子跟蹤核苷酸併合，以測定各個體DNA分子的確切的序列。用5%的胚胎DNA級分，平均起來，95%的序列讀數預期來自母源核酸和5%的序列讀數預期來自胚胎核酸。實施來自胚胎或母源核酸的序列讀取計數的統計學分析，以鑑定在無細胞的胚胎DNA中過表達的區。例如,過表達的座位可在標位到該座位的基因組位置的100個總讀數中具有20個胚胎序列讀數和80個母源序列讀取。Fisher氏精確測試用於基於觀察的計數的相比預期的計數的P-值鑑定該區，用於給定平均胚胎級分。將多測試修正應用於增加此方法的特異性。然後將胚胎DNA過表達的區在不同生物學個體之間比較，且選擇最一貫地過表達的座位用於在數字PCR測定中或由其他手段驗證。實施例2:用於表徵和/或定量多態胚胎或母源基因組區的數字PCR採用數字PCR來表徵及定量多態胚胎或母源基因組區。將自最低限度稀釋的母源樣品的核酸片段化及變性為單鏈，然後將其擴增，以產生完全來源自一種模板的擴增子，且可用不同螢光團檢測，以區別及計數不同多態區(例如，胚胎對比母源區)。在此過程中，首先將自母源樣品製備的DNA以調整到獲得約平均每2孔一個模板的濃度在384-孔多-孔板上稀釋。對各SNP設計一對PCR引物和一對分子信標，分子信標分別在它們的5』和3』端具有螢光染料和猝滅劑。除了對應於SNP和螢光標記物(例如，綠色或紅色)的核苷酸之夕卜，兩個信標是相同的。與它們的互補核苷酸序列雜交之後，猝滅劑自螢光團遠離，導致增加的螢光。計算具有綠色或紅色螢光的2種等位基因-特異性信標的螢光強度的比，以測定各個體孔中的等位基因類型。用計數的數百或數千孔，可測定母源和胚胎(或父源)等位基因的相對豐度。如在實施例1中描述進行統計學分析。實施例3:用於表徵和/或定量胚胎或母源基因組區的橋式PCR在流動池中進行橋式PCR，以表徵和/或定量胚胎或母源基因組區。將DNA樣品隨機片段化，然後連接到通用適配體序列。流動池表面用對應於通用適配體序列的單鏈寡核苷酸包被。然後，當單鏈，適配體-連接的片段結合到暴露於用於基於聚合酶的延伸的試劑的流動池表面時，將具有通用端的片段在單反應中用單對的擴增引物擴增。引發隨連接到在表面的互補寡聚體的片段「橋」的游離的/遠端發生，導致許多拷貝的DNA樣品。採用由合成的測序，以對DNA樣品測序。特別是，使含有百萬的簇的流動池表面經歷用延伸及成像的自動化的循環，使用例如，Illumina’sSolexaSequencingTechnology測序。測序的各循環涉及合併單螢光核苷酸的步驟，之後是整個表面的高解析度成像。任何在背景以上的信號鑑定簇(或PCR集落)的物理位置，及螢光發射鑑定4種鹼基中的哪種在該位置合併。重複此循環，一次一個鹼基，產生各表示在特定簇的單鹼基延伸的一系列像。鹼基判定源於鑑定經時發射色彩的算法。由此，獲得可歸因於特定胚胎或母源基因組區的個體序列讀取計數。統計學分析如在實施例1中描述進行。實施例4:用於表徵和/或定量胚胎或母源基因組區的乳劑PCR乳劑PCR用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。用克隆擴增的DNA產生小珠，其中各珠含有自單分子模板由PCR產生的一種類型的擴增子。將用捕獲寡核苷酸包被的珠與具有互補銜接子或標記序列的核苷酸混合。將含有PCR的全部必需組分的水性混合物加結合引物的珠和模板DNA與油/去汙劑混合物一起攪拌，以產生微乳劑。水性隔室含有平均〈I模板分子和〈I珠。微乳劑如在常規PCR中一樣溫度循環。如果DNA模板和珠在單水性隔室中一起存在，珠結合的寡核苷酸作為擴增用引物。由各種材料製造的珠，例如，磁珠，塑料珠，金粒子，纖維素粒子，聚苯乙烯粒子等，及各種尺寸的珠用於乳劑PCR。適合的珠可為小，例如，I2，至幾百，例如，200IOOOiim直徑的尺寸範圍的微粒。在一些實施方式中，在本發明中採用可商購的控制的-孔隙玻璃(CPG)或聚苯乙烯支持物作為固相支持物。該支持物用鹼不穩定接頭和附接的初始核苷可利用，例如，AppliedBiosystems(FosterCity,Calif.)通過本領域知道的焦磷酸測序表徵含有克隆擴增的核酸的珠。由此獲得可歸因於胚胎或母源基因組區的序列讀取計數。適合的測序機包括454LifeSciences’sGenomeSequencerFLX0統計學分析如在實施例1中描述進行。實施例5:用於表徵和/或定量胚胎或母源基因組區的用標條碼的探針的單分子雜交將用標條碼的探針的單分子雜交，如在本領域知道，用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。因此，分子條碼和單分子成像對於在單反應中無擴增地檢測及計數特定核酸靶是有用的。將各色彩-編碼的條碼附接於對應於目標基因組區的單靶-特異性探針。2種探針(即，所謂的「報告子」和「捕獲」探針)用於雜交各個體靶核酸。報告子探針攜帶信號，及捕獲探針允許待固定的複合物，用於數據收集。在雜交之後，移出過量探針，及為數據收集由IlCounter分析系統數字分析儀(NanostringTechnologies,SeattleWA)分析固定的探針/靶複合物。就各靶分子(例如，目標胚胎或母源基因組區)計數及列表色碼。統計學分析如在實施例1中描述進行。實施例6:用於表徵和/或定量胚胎或母源基因組區的半導體測序半導體測序用於表徵及定量胚胎或母源基因組區。將自母源樣品的樣品DNA片段化及變性為具有約IOObp的單鏈。庫通過合併由具有適配體序列的設計的PCR引物合併的雙向的側接適配體來構建。通過使用乳劑PCR克隆擴增庫片段，以形成用模板DNA包被的粒子。將粒子沉積在合併電荷傳感器的大規模並行陣列上，以檢測在DNA複製期間質子的實時釋放。進而大規模並行陣列在DNA聚合酶的存在下，在對於DNA複製適合的條件下與各脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)依次接觸。dNTP各併合到生長的雙聯DNA導致質子釋放，導致由電荷傳感器可檢測的電荷變化。在大規模並行陣列中各孔的電荷變化與特定dNTP的存在的關聯提供DNA樣品的序列。統計學分析如在實施例1中描述進行。其他實施方式通過考慮本文公開的本發明的說明書或實踐，本發明的其他實施方式會對於本領域技術人員而言是顯而易見的。本說明書和實施例僅旨在例示，本發明的實際範圍由以下權利要求指示。·參考文獻的合併本申請中引用的全部出版物和專利文獻如各個體出版物或專利文獻的內容併入本文相同的程度通過弓I用以它們的整體併入本文。權利要求1.鑑定母源樣品中的區別表達的胚胎或母源基因組區的方法，包括下列步驟定量存在於母源樣品中的胚胎或母源基因組區；測定相比參照量的胚胎或母源基因組區的相對豐度，由此測定是否胚胎或母源基因組區在母源樣品中區別表達；其中胚胎或母源基因組區不對應於非整倍性區。2.權利要求1的方法，其中參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的平均表達。3.權利要求2的方法，其中測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信不同於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中區別表達。4.權利要求1的方法，其中參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的過表達。5.權利要求4的方法，其中測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信基本上相同於或大於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中過表達。6.權利要求1的方法，其中參照量指示母源樣品中胚胎或母源核酸的亞表達。7.權利要求6的方法，其中測定相對豐度的步驟包括比較定量的量與參照量，而且其中如果定量的量以統計學置信基本上相同於或小於參照量，胚胎或母源基因組區被鑑定為在母源樣品中亞表達。8.權利要求1的方法，其中方法定量胚胎基因組區。9.權利要求8的方法，其中參照量指示母源樣品中胚胎核酸的平均表達。10.權利要求9的方法，其中胚胎核酸的平均表達是約5%。11.權利要求8的方法，其中如果定量的量在參照量以上，胚胎基因組區被鑑定為在母源樣品中過表達。12.權利要求1的方法，其中方法定量母源基因組區。13.權利要求12的方法，其中參照量指示母源樣品中母源核酸的平均表達。14.權利要求13的方法，其中母源核酸的平均表達是約95%。15.權利要求12的方法，其中如果定量的量在參照量以下，母源基因組區被鑑定為在母源樣品中亞表達。16.權利要求1的方法，其中定量步驟包括定量胚胎基因組區和對應母源基因組區。17.權利要求16的方法，其中測定步驟包括通過比較胚胎基因組區的定量的量與對應母源基因組區的定量的量來測定胚胎基因組區的相對豐度。18.權利要求1的方法，其中胚胎基因組區自對應母源基因組區特殊地可檢測。19.權利要求1的方法，其中胚胎基因組區包含父源地貢獻的序列。20.權利要求18的方法，其中胚胎基因組區包含不同於對應母源基因組區的序列。21.權利要求20的方法，其中胚胎基因組區包含至少一個不同於對應母源基因組區多態核苷酸。22.權利要求18的方法，其中胚胎基因組區包含不同於對應母源基因組區的甲基化模式。23.權利要求18的方法，其中胚胎基因組區相比對應母源基因組區包含拷貝數變異(CNV)024.權利要求1的方法，其中方法同時定量多個胚胎或母源基因組區。25.權利要求1的方法，其中方法還包括首先自母源樣品製備總DNA的步驟。26.權利要求1的方法，其中方法還包括首先自母源樣品製備無細胞DNA的步驟。27.權利要求1的方法，其中方法還包括首先產生包含待定量的胚胎或母源基因組區的核酸片段的步驟。28.權利要求1的方法，其中母源樣品選自細胞，組織，全血，血漿，血清，尿，糞便，唾液，臍帶血，絨毛膜絨毛樣品，絨毛膜絨毛樣品培養物，羊水，羊水培養物，經子宮頸灌洗液，及其組合。29.權利要求28的方法，其中母源樣品是母源血。30.權利要求1的方法，其中母源樣品從一個個體得到。31.權利要求1的方法，其中母源樣品從多個個體得到。32.權利要求1的方法，其中定量步驟包括DNA測序步驟。33.權利要求32的方法，其中DNA測序步驟包括高-通量單分子測序步驟。34.權利要求32的方法，其中DNA測序步驟包括無偏的DNA測序步驟。35.權利要求32的方法，其中DNA測序步驟覆蓋大於100個基因組當量。36.權利要求32的方法，其中DNA測序步驟包括用光信號標記胚胎或母源基因組區的步驟。37.權利要求36的方法，其中光信號選自螢光和/或發光信號。38.權利要求37的方法，其中螢光信號由花青苷-3和/或花青苷-5產生。39.權利要求32的方法，其中方法還包括在測序步驟之前將包含胚胎或母源基因組區的核酸分子捕獲到固體表面的步驟。40.權利要求32的方法，其中定量步驟包括獲得可歸因於胚胎或母源基因組區的個體序列讀取計數。41.權利要求40的方法，其中定量步驟還包括比較可歸因於胚胎基因組區的個體序列讀取計數與可歸因於對應母源基因組區的個體序列讀取計數。42.權利要求1的方法，其中定量步驟包括實施數字PCR的步驟。43.權利要求1的方法，其中定量步驟包括實施橋式PCR的步驟。44.權利要求1的方法，其中定量步驟包括使用經與胚胎或母源基因組區特異性結合的納米報告子標記的探針雜交個體核酸分子的步驟。45.權利要求1的方法，其中定量步驟包括實施基於陣列的比較性基因組雜交(aCGH)的步驟。46.權利要求45的方法，其中aCGH步驟使用與胚胎或母源基因組區特異性結合的探針。47.權利要求46的方法，其中探針用光信號標記。48.權利要求47的方法，其中光信號選自螢光和/或發光信號。49.權利要求47的方法，其中aCGH步驟包括測定可歸因於胚胎或母源基因組區的信號水平。50.權利要求1的方法，其中統計學置信通過N-因素ANOVA，Student氏t檢驗或Fisher氏精確測試測定。51.權利要求1的方法，其中多測試修正在統計學置信上實施。52.權利要求1的方法，其中方法還包括測定胚胎基因組區的過表達因數。53.權利要求1的方法，其中方法還包括在不同個體間比較鑑定的區別表達的胚胎或母源基因組區。54.權利要求1的方法，其中方法還包括由數字PCR或再測序確認鑑定的區別表達的胚胎或母源基因組區。55.非-侵襲性診斷的方法，其包括表徵通過使用權利要求1的方法鑑定的過表達的胚胎基因組區的步驟。56.鑑定在母源樣品中通常過表達的胚胎基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的胚胎基因組區及對應母源基因組區；測定相比對應母源基因組區的胚胎基因組區的相對豐度；以及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以上，將胚胎基因組區鑑定為在母源樣品中過表達，其中胚胎基因組區不是非整倍性區。57.鑑定在母源樣品中通常亞表達的母源基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的母源基因組區及對應胚胎基因組區；測定相比對應胚胎基因組區的母源基因組區的相對豐度；以及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以下，將母源基因組區鑑定為在母源樣品中亞表達，其中對應胚胎基因組區不是非整倍性區。58.鑑定在母源樣品中通常過表達的胚胎基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的胚胎基因組區；測定相比參照的胚胎基因組區的相對豐度；以及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以上，將胚胎基因組區鑑定為在母源樣品中過表達，其中胚胎基因組區不是非整倍性區。59.權利要求58的方法，其中參照指示母源樣品中胚胎核酸的平均表達。60.鑑定在母源樣品中通常亞表達的母源基因組區的方法，包括下列步驟表徵母源樣品中的母源基因組區；測定相比參照的母源基因組區的相對豐度；以及如果以統計學置信測定的相對豐度在預定的閾值以下，將母源基因組區鑑定為在母源樣品中亞表達，其中母源基因組區不對應於非整倍性區。61.權利要求60的方法，其中參照指示母源樣品中母源核酸的平均表達。全文摘要本發明提供鑑定和表徵母源循環中區別表達的胚胎或母源基因組區的新方法。本發明的母源循環中過表達的胚胎基因組區的鑑定允許無需富集或純化而胚胎DNA的精確的分析，其提供更簡單的，更精確的和有效的早期懷孕中出生前診斷。本發明對於早期懷孕期間期間(例如,頭三個月期間)非侵襲出生前診斷是特別有用的。文檔編號C12Q1/68GK103069006SQ201180035771公開日2013年4月24日申請日期2011年7月22日優先權日2010年7月23日發明者T·斯固爾,V·R·埃克美弗申請人:艾索特裡克斯遺傳實驗室有限責任公司